CN105131039A - 一种喜树碱类磷脂化合物、其药物组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种喜树碱类磷脂化合物其制备方法及药物组合物与用途。药物组合物为喜树碱类磷脂化合物或喜树碱类磷脂化合物和药效学上可接受的载体的组合药用组合物，是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂。该药物组合物是喜树碱类磷脂化合物或喜树碱类磷脂化合物和助剂制成的脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米。该喜树碱类磷脂化合物或喜树碱类磷脂化合物脂质体可以快速释放出活性喜树碱类化合物原药，具有强烈抗肿瘤作用。该喜树碱类磷脂化合物及其脂质体纳米颗粒可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂，毒性低，可用于各种肿瘤高效治疗。
Description
技术领域
本发明是一种具有抗肿瘤作用的喜树碱类磷脂化合物及其药物组合物与用途，涉及医药技术领域。
背景技术
喜树碱(Camptothecin，CPT)和10-羟基喜树碱(HCPT)是从我国珙桐科落叶植物喜树的种子或根皮中提取的一种生物碱，具有较强的细胞毒活性，可用于治疗多种恶性肿瘤，如胃癌、肝癌、膀胱癌和白血病等。10-羟基喜树碱的化学结构与喜树碱(CPT)相似，仅第10位碳原子上的氢为羟基(-OH)所取代，是CPT的天然衍生物。
科学家发现喜树碱类化合物独特的抗癌机制：通过形成喜树碱-拓扑异构酶I-DNA稳定的三联体络合物，使DNA双螺旋结构破裂后不能复制。喜树碱类化合物是最经典的TopoI的特异性抑制剂。TopoI已成为设计新型抗癌药物的最热门靶点之一。TopoI抑制剂被美国国立癌症研究所(NCI)药物机制分析网络系统列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一。
HCPT的主要作用是抑制DNA合成。研究表明，DNA拓朴异构酶I(TopoisomeraseI)是羟基喜树碱类药物的作用靶点，拓朴异构酶I可使DNA双链的螺旋解开，并使一条链暂时断开，通过断开的缺口完成一次解旋，断链又联结起来，它们抑制酶DNA拓朴构酶I是通过捕获“酶-DNA复合物”(可切断的复合物)而实现的，使酶与DNA断裂复合物稳定，从而干扰DNA复制，起到抗肿瘤作用。HCPT亦是细胞周期特异性药物，主要作用于S期，对G2-M边界亦有延缓作用。较高浓度时，可抑制核分裂，阻止细胞进入分裂期。HCPT具有比CPT更强的细胞毒活性，可用于治疗多种恶性肿瘤，如大肠癌等。
CPT、HCPT及其类似物等在发挥其抗肿瘤活性的同时还产生骨髓抑制、呕吐和腹泻等严重副作用。HCPT及其类似物用于肿瘤治疗的最大缺陷是水溶性差，难以获得高浓度的溶液。为了改善CPT、HCPT的缺陷，许多研究机构和企业对喜树碱的化学结构进行了改性，合成了数百种喜树碱衍生物。至今已经有2种喜树碱衍生物被批准用于临床肿瘤治疗，分别是伊立替康irinotecan和拓扑替康topotecan，但是其水溶性仍然较低。
由于喜树碱、10-羟基喜树碱是未经修饰的天然产物，毒性较大，抗肿瘤活性低，限制了它们在临床的应用；再者，病人长期使用这些药物易产生耐药性，迫切需要提高喜树碱类似物的水溶性，寻找高效低毒的喜树碱类抗肿瘤药物。
因此，有必要通过对喜树碱类似物进行结构修饰，以达到提高药物溶解性、靶向性，防止内酯开环，提高疗效，降低毒性的目的。
脂质体是一种具有靶向给药功能的新型药物制剂，在抗癌药物研究领域具有极其广泛的应用。磷脂是构成脂质体的主要化学成分，由具有磷酸相连的取代基因构成的亲水头和长烃基链构成的疏水尾组成。当分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，形成脂质体。作为载体时，疏水性药物通常在脂质体的双脂质层中，亲水性药物在脂质体内的水相中。由于脂质体膜的流动性，导致药物易于渗漏出来，使包裹的药物难以发挥良好的药效。将药物分子通过共价键结合到磷脂分子结构中构成前药，可以避免药物渗漏。磷脂前药分子通过使药物活性基团与磷脂之间的共价键断裂，缓慢释放药物。由于前药分子释放药物的速度太慢，导致药效下降。
将CPT、HCPT及其类似物原药与亲水性基团共价连接进行结构修改成为前药，可以改善水溶性，开发新型的脂质体药物释放系统，用于CPT、HCPT及其类似物的释放。CPT、HCPT及其类似物的药理活性决定于内酯结构和20位羟基，属于抗肿瘤活性必须保留的结构部分。Wall认为20位羟基对于喜树碱类化合物抗癌活性是绝对需要的(Wall，Me.；Wani，MC，；Annu.Rev.Phannaeol.Toxieol.1977，17(1)，11)。但是，化学修饰20位羟基或者化学修饰后不能快速释放20位羟基将导致抗肿瘤活性的消失或下降。有研究显示，喜树碱类化合物20位羟基酯化后导致对DNA拓朴异构酶I(TopoisomeraseI)没有抑制活性(Hertzberg.RR；Holden，KG；J.Med.Chem.1989，32(4)，715)。另一方面，前药分子能否快速释放出原药，决定于原药与修饰基团之间的链接基团，不能快速断裂的链接基团导致药物释放速度太慢，难以达到有效药物浓度。
因此，有必要进行结构设计，在保证不影响20位羟基活性结构或者可以快速释放20位羟基活性结构的情况下，开发新的CPT、HCPT及其类似物的脂质体药物释放系统。此外，为了使药物快速释放处出来，有必要进行间隔基团的修饰。
本发明利用2分子的喜树碱类似物作为疏水尾，通过易降解的间隔臂与磷脂亲水头通过共价键相连，制备磷脂化合物，可以使喜树碱类似物的20位羟基保持不被修饰或者可以使喜树碱类似物修饰后的20位羟基快速裸露出来，快速释放出喜树碱类似物药物；本发明的羟基喜树碱类磷脂化合物的溶解性显著优于羟基喜树碱及其衍生物；本发明将羟基喜树碱类磷脂化合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，具有靶向性特点，用于肿瘤治疗。这种羟基喜树碱类磷脂化合物纳米颗粒不仅是一种前药，也是羟基喜树碱类药物全新的药物释放载体，具有靶向功能；本发明的喜树碱类磷脂化合物及其脂质体，经酶、谷胱甘肽等降解，快速释放出高浓度的保持20位羟基和内酯活性结构不变的喜树碱类化合物原药，发挥强烈抗肿瘤作用。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种喜树碱类化合物20位羟基活性结构裸露或快速释放出20位羟基活性结构的喜树碱类磷脂化合物，同时基于该喜树碱类磷脂化合物的药物组合物，以及该喜树碱类磷脂化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术方案：为了对化合物命名和定位，定义喜树碱各原子的位置如下：
本发明涉及的所有喜树碱类似物或其磷脂化合物的母环均按照式(A)中的位置进行定义，且20位碳原子为S构型。
本发明的喜树碱类磷脂化合物，为下列结构式结构式(1)、(2)或(3)的化合物，或所述结构式(1)、(2)、(3)的化合物分别与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：
式(1)、(2)、(3)中，X、Y、Z是间隔臂，X、Y是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基或碳原子数为2～20的不含杂原子的亚烷烃基/亚烯烃基；Z是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基；
L是2-氨基-2-羧基乙基、2-氨基乙基、2-三甲基胺基乙基阳离子、2、3-二羟基丙基、、分子量为200-4000的不含靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基或分子量为200-4000的端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基。
式(1)、(2)、(3)中，R7、R9、R10、R11和R12均为以下任一种基团：氢、卤素、羟基、C1-C6的直链或支链的烷基/烷氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C6的直链或支链的卤代烷基/卤代烷氧基、C1-C6的直链或支链烷基的三取代硅烷基、C1-C6的直链或支链烯烃基、甲醛基、C1-C6的直链或支链烷基酯基、C1-C6的直链或支链烷基羰基、C1-C6的直链或支链的羟基烷基、C1-C6的直链或支链烷氧基亚甲基、苯氧基亚甲基、苯甲酯基亚甲基、二甲胺基甲基、二甲基胺基乙基、具有哌嗪结构的取代基、具有结构的取代基、具有-CH2NR13R14结构的取代基，所述-CH2NR13R14中，R13和R14均为C1-C6的直链烷基、C1-C6的支链烷基。
进一步的，本发明的喜树碱类磷脂化合物中，端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基中，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽中的任一种。
进一步的，本发明的喜树碱类磷脂化合物中，所述抗衡离子是一种阳离子，或一种阳离子和一种阴离子的组合。
本发明化合物可以异构体的形式存在，而且通常所述的“本发明化合物”包括该化合物的异构体。本发明化合物可存在不对称中心具有S构型或R构型，本发明包括所有可能的立体异构体以及两种或多种异构体的混合物。
本发明的药物组合物包括上述的喜树碱类磷脂化合物或所述的喜树碱类磷脂化合物与药效学上可接受的载体。
本发明还涉及含有作为活性成份的本发明化合物或本发明化合物和常规药物助剂的药物组合物，该组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
通常本发明药物组合物含有0.1-100重量％的本发明化合物。
本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
进一步的，由本发明化合物制成脂质体纳米颗粒，颗粒粒径10-1000纳米，还包括助剂。由本发明化合物和助剂制成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米，使用的助剂是磷脂、聚乙二醇磷脂(聚乙二醇分子量400-3000)、含靶向基团的聚乙二醇磷脂或胆固醇中的一种或多种。靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽。
本发明的药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明化合物表现良好的抗肿瘤活性。试验表明本发明化合物的体内毒性，小于10-羟基喜树碱。从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明化合物脂质体纳米颗粒表现良好的抗肿瘤活性。试验表明本发明化合物的体内毒性远小于10-羟基喜树碱。
本发明的喜树碱类磷脂化合物脂质体纳米颗粒的制备方法，是由本发明化合物喜树碱类磷脂化合物或本发明化合物与助剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法、或高压均质法等方法制备。
本发明利用2分子的喜树碱类似物作为疏水尾和磷脂亲水头通过共价键相连，制备喜树碱类磷脂化合物，溶解性显著优于喜树碱类似物；
本发明的喜树碱类磷脂化合物，抗肿瘤活性显著优于20位羟基被酯键取代而不能快速释放的喜树碱类磷脂化合物；
本发明利用2分子的喜树碱类似物作为疏水尾和磷脂亲水头通过间隔臂共价相连，制备喜树碱类磷脂化合物，在多肽酶、谷胱甘肽作用下，快速降解释放出20位羟基活性结构裸露的喜树碱类化合物原药；本发明的喜树碱类磷脂化合物溶解性显著优于喜树碱类似物；本发明将喜树碱类磷脂化合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，用于肿瘤治疗。这种脂质体纳米颗粒不仅是一种前药，也是喜树碱类药物全新的药物释放载体，具有靶向功能；本发明的喜树碱类磷脂化合物及其脂质体纳米颗粒，具有靶向功能，经酶等降解快速释放药物，发挥药效，具有低毒副作用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明的喜树碱类磷脂化合物，为下列结构式结构式(1)、(2)、(3)的化合物或所述结构式(1)、(2)、(3)的化合物与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：
式(1)、(2)、(3)中，X、Y、Z是间隔臂，X、Y是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基或碳原子数为2～20的不含杂原子的亚烷烃基/亚烯烃基；Z是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基；L是2-氨基-2-羧基乙基、2-氨基乙基、2-三甲基胺基乙基阳离子、2、3-二羟基丙基、分子量为200-4000的N-聚乙二醇-氨基乙基或端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽。
式(1)、(2)、(3)中，R7、R9、R10、R11和R12均为以下任一种基团：氢、卤素、羟基、C1-C6的直链或支链的烷基/烷氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C6的直链或支链的卤代烷基/卤代烷氧基、C1-C6的直链或支链烷基的三取代硅烷基、C1-C6的直链或支链烯烃基、甲醛基、C1-C6的直链或支链烷基酯基、C1-C6的直链或支链烷基羰基、C1-C6的直链或支链的羟基烷基、C1-C6的直链或支链烷氧基亚甲基、苯氧基亚甲基、苯甲酯基亚甲基、二甲胺基甲基、二甲基胺基乙基、具有哌嗪结构的取代基、具有结构的取代基、具有-CH2NR13R14结构的取代基，所述-CH2NR13R14中，R13和R14为C1-C6的直链烷基、C1-C6的支链烷基；20位碳原子为S构型。
本发明的喜树碱类磷脂化合物式(1)、(2)结构中的20位羟基没有被酯化，保留了20位羟基的活性结构；
本发明的喜树碱类磷脂化合物结构式(3)中的间隔臂易于断裂，可以快速释放出20位羟基活性结构裸露的喜树碱类化合物原药；
本发明的喜树碱类磷脂化合物结构式(1)、(2)、(3)中的间隔臂易于断裂，可以快速释放出20位羟基活性结构裸露的喜树碱类化合物原药，具有低毒性；
本发明的喜树碱类磷脂化合物式(1)、(2)结构中的20位羟基没有被酯化，本发明的喜树碱类磷脂化合物结构式(1)、(2)、(3)中的间隔臂易于断裂，抗肿瘤活性优于20位羟基被酯化但不能快速释放20位羟基活性结构的喜树碱类磷脂化合物；
本发明的喜树碱类磷脂化合物，结构式(1)、(2)、(3)中喜树碱类似物通过间隔臂与磷脂亲水头相连，该间隔臂在谷胱甘肽或多肽酶等存在下，可以快速断裂，快速释放出活性药物喜树碱类似物，一分子喜树碱类磷脂化合物释放出两个分子喜树碱类似物，对人肝肿瘤细胞有强烈杀灭作用；
本发明的喜树碱类磷脂化合物中，喜树碱类似物取代基具有疏水作用，相互协同，直接构成稳定的脂质体，是脂质体结构的一部分，克服了通用脂质体包裹疏水药物时药物易于泄漏的缺点，同时提高药物包裹的效率，具有低毒性；
本发明的喜树碱类磷脂化合物结构式(1)、(2)、(3)中间隔臂具有增强疏水尾部药物疏水性的协同作用，对喜树碱类磷脂化合物的自组装成脂质体纳米颗粒非常有利，形成稳定的脂质体颗粒，从而延长喜树碱或类似物药物的释放和抗肿瘤作用时间；
本发明的喜树碱类磷脂化合物组装成脂质体，由于脂质体的保护作用，喜树碱类化合物的活性内酯环结构不易遭到破坏，一分子喜树碱类磷脂化合物释放出两个分子喜树碱类似物，并保持活性结构，从而使喜树碱类磷脂化合物的抗肿瘤药效达到喜树碱类似物的2倍以上；
本发明的喜树碱类磷脂化合物及其脂质体纳米颗粒是全新的喜树碱类药物的前药，也是药物载体，具有靶向功能，经酶等快速降解发挥药效，并具有低毒副作用；
本发明的羟基喜树碱类磷脂化合物组装成稳定的脂质体纳米颗粒，具有与细胞类似的膜结构，易于被细胞摄入，使羟基喜树碱类磷脂化合物通过脂质体形式进入细胞内，并释放出20位羟基活性结构裸露的喜树碱类化合物原药，发挥更强的药效；
本发明的喜树碱类磷脂化合物或其与磷脂助剂等组成的复合体系可以采用简单工艺，如薄膜法等非常容易地组装成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米；
本发明的喜树碱类磷脂化合物的间隔臂被肿瘤细胞内高浓度酯酶、谷胱甘肽、多肽酶或低pH值微环境快速降解，快速释放出20位羟基裸露的活性药物分子，具有增强药物抗肿瘤作用的功能；
本发明的喜树碱类磷脂化合物或喜树碱类磷脂化合物脂质体可以快速释放出保持20位羟基和内酯活性结构裸露的喜树碱类化合物原药，具有强烈抗肿瘤作用；
本发明的喜树碱类磷脂化合物结构式(1)、(2)、(3)中，L是分子量为200-4000的端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基，该喜树碱类磷脂化合物组装成的脂质体表面有靶向基团，具有主动靶向作用；本发明的喜树碱类磷脂化合物与含有靶向基团的磷脂共组装成的脂质体表面有靶向基团，具有主动靶向作用；
本发明的化合物或本发明的化合物和常规药物载体的药物组合物，含有0.1-100重量％的本发明化合物，具有优异的抗肿瘤活性，对人肝肿瘤细胞有强烈杀灭作用。
附图说明
图1为双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱合成路线图
图2为双(羟基喜树碱-10-二甘醇酸)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图3双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰胆碱合成路线图
图4为双(羟基喜树碱-10-碳酸酯-丁酰)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图5为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱合成路线图。
图6为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-GFQGVQFAGF)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图7为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰甘油的合成路线图
图8为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺化合物的合成路线图
图9为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇的合成路线图9
图10为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺N-聚乙二醇-叶酸化合物的合成路线图
图11为双(羟基喜树碱-10-己二酰)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图12为双(7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图13为双(9-二甲氨基甲基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图14为双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱的合成路线图
图15为双(喜树碱-7-亚甲基-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物的合成路线图
图16为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物脂质体的粒径分布示意图
图17为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇脂质体纳米颗粒的形态(透射电镜图)
图18为双(羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇脂质体的抗肿瘤活性和毒性。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明的所涉及的一种喜树碱类磷脂化合物，为下列结构式结构式(1)、(2)或(3)的化合物，或所述结构式(1)、(2)、(3)的化合物分别与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：
式(1)、(2)、(3)中，X、Y、Z是间隔臂，X、Y是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基或碳原子数为2～20的不含杂原子的亚烷烃基/亚烯烃基；Z是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基；L是2-氨基-2-羧基乙基、2-氨基乙基、2-三甲基胺基乙基阳离子、2、3-二羟基丙基、分子量为200-4000的N-聚乙二醇-氨基乙基或端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽的一种或多种。
式(1)、(2)、(3)中，R7、R9、R10、R11和R12均为以下任一种基团：氢、卤素、羟基、C1-C6的直链或支链的烷基/烷氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C6的直链或支链的卤代烷基/卤代烷氧基、C1-C6的直链或支链烷基的三取代硅烷基、C1-C6的直链或支链烯烃基、甲醛基、C1-C6的直链或支链烷基酯基、C1-C6的直链或支链烷基羰基、C1-C6的直链或支链的羟基烷基、C1-C6的直链或支链烷氧基亚甲基、苯氧基亚甲基、苯甲酯基亚甲基、二甲胺基甲基、二甲基胺基乙基、具有哌嗪结构的取代基、具有结构的取代基、具有-CH2NR13R14结构的取代基，所述-CH2NR13R14中，R13和R14为C1-C6的直链烷基、C1-C6的支链烷基；式(1)中，20位碳原子为S构型。
所述间隔臂是碳原子数为1～20的直链或支链的亚烷烃基/亚烯烃基或碳原子数为6～10的芳烃基；所述间隔臂含有二硫键、肽键、亚胺键、β-巯基丙酸酯键、乙缩醛键、原酸酯键、乙二醇二琥珀酸酯键或偶氮键；所述间隔臂含有多肽结构。
所述抗衡离子是一种阳离子，或一种阳离子和一种阴离子的组合。阳离子是质子、钠离子、钾离子、钙离子、铁离子、镁离子、铵离子、锌离子，阴离子是氯离子、硫酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子、羧酸根离子、碳酸根离子、溴离子、磷酸根离子、甲酸根、乙酸根、柠檬酸更、乳酸根、富马酸根、酒石酸根、葡萄糖酸根离子。
本发明的药物组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
本发明的药物组合物，是粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒，由具有结构式(1)结构的喜树碱类磷脂化合物自组装构成。
由具有结构式(1)、(2)、(3)结构的喜树碱类磷脂化合物与磷脂或靶向磷脂共同自组装构成粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽中的一种或多种。
本发明的喜树碱类磷脂化合物在制备抗肿瘤药物中的应用其特征在于，该方法将所述喜树碱类磷脂或其在药学上可接受的盐，与药效学上可接受的载体制备成药剂。可将本发明化合物或本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当的施用形式或剂量形式。通常本发明药物组合物含有0.1-100重量％的本发明化合物。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以是液体剂型、固体剂型、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
本发明的药物组合物，是粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒，由具有通式(1)结构的喜树碱类磷脂化合物自组装构成。
由本发明化合物和助剂制成脂质体纳米颗粒，粒径10-1000纳米。助剂是磷脂、聚乙二醇化磷脂(聚乙二醇分子量200-4000)、靶向聚乙二醇化磷脂(聚乙二醇分子量200-4000)胆固醇中的一种或多种，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽的一种或多种。
从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明化合物表现优异的抗肿瘤活性。试验表明，本发明化合物的体内毒性小于原药。从体外抗肿瘤活性筛选来看，本发明化合物脂质体纳米颗粒表现优异的抗肿瘤活性。试验表明，本发明化合物的脂质体体内毒性远小于喜树碱类似物。
本发明的喜树碱类磷脂化合物脂质体纳米颗粒的制备方法，是由本发明喜树碱类磷脂化合物或本发明化合物与助剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法、或高压均质法等方法制备。
本发明利用2分子的抗肿瘤药物与间隔臂相连作为疏水尾和磷脂亲水头通过共价键相连，制备喜树碱类磷脂化合物，溶解性显著优于抗肿瘤药物10-羟基喜树碱类化合物。
本发明利用2分子的喜树碱类似物作为疏水尾和磷脂亲水头通过共价键相连，制备喜树碱类磷脂化合物，溶解性优于喜树碱类似物，优于20位羟基被酯化的喜树碱类似物；本发明将喜树碱类磷脂化合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，具有可形成液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂的特性，用于肿瘤治疗。
本发明的喜树碱类磷脂化合物，其间隔臂含有二硫键、腙键、肽键、原酸酯键、乙二醇二琥珀酸酯键，在谷胱甘肽或多肽酶等存在下，快速断裂，快速释放出活性药物羟基喜树碱或其类似物，一分子10-羟基喜树碱类磷脂化合物快速释放出两个分子的喜树碱类化合物，增强喜树碱类化合物的抗肿瘤药效，达到原药的2倍以上，发挥增强抗肿瘤作用的功能。
本发明的喜树碱类磷脂化合物式(1)、(2)、(3)中药物取代基和疏水间隔臂组合实现优异的协同疏水作用，构成稳定的脂质体，发挥协同稳定作用，克服了通用脂质体包裹疏水药物时药物易于泄漏的缺点，提高药物包裹的效率，同时使抗肿瘤药物磷脂化合物易于通过脂质体形式摄入细胞内，发挥药效。
本发明将喜树碱类磷脂化合物制备成纳米颗粒，具有脂质体的特性，具有可形成液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂的特性，用于肿瘤治疗。
本发明的喜树碱类磷脂化合物脂质体纳米颗粒的制备方法，是由本发明化合物喜树碱类磷脂化合物或本发明化合物与助剂的混合物，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法、或高压均质法等方法制备。
以下为制备过程中使用的部分试剂代号：
DMAP4-二甲氨基吡啶
CDIN，N′-羰基二咪唑
DMSO二甲亚砜
GPC磷酰胆碱甘油
DBU1，5-二氮杂二环[5.4.0]十一-5-烯
EDCIN，N′-硫代羰基二咪唑
HOBT1-羟基苯并三唑
EDC1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
NHSN-羟基琥珀酰亚胺
(BOC)2O二碳酸二叔丁酯
TFA三氟乙酸
DMF二甲基甲酰胺
DMSO二甲亚砜
Cbz苄氧羰基
Bn卞基
BOC叔丁氧羰基
TEA三乙胺
Gly甘氨酸
GFLG甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酸
GFQGVQFAGF甘氨酰-苯丙氨酰-谷氨酰-甘氨酰-颉氨酰-谷氨酰-苯丙氨酰-丙氨酰-甘氨酰-苯丙氨酸
下述通过实施例进一步说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
对照例：
双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱的合成
10-羟基喜树碱0.6g、乙酸酐1g、DMAP1g、溶于30mL三氯甲烷中，40℃反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤，取滤饼；加甲醇溶解，4℃放置12h，过滤，取滤饼，干燥，得到10-羟基喜树碱-20-乙酸酯0.45g。
10-羟基喜树碱-20-乙酸酯0.4g、二硫代二乙酸酐1g溶于10mL吡啶，室温反应12h；旋蒸除溶剂，稀盐酸洗涤三遍，过滤，滤饼溶于10mL甲醇，4℃放置12h，过滤，取滤饼，干燥，得中间产物羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸单酯0.34g。中间产物羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸单酯0.3g溶于10mLDMSO，加入CDI0.3g，活化1h，加入GPC0.15g和DBU0.3g，室温反应3h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱0.21g。1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ7.93-7.44(8H，m)，6.23(2H，s)，4.69-4.43(7H，m)，3.61(2H，t)，3.43(4H，s)，3.22(9H，s)，3.09(4H，s)，2.68-2.52(8H，m)，2.14(6H，s)，1.65(4H，m)，1.05(6H，t)。[M+H]+m/z，1235.35。
实施例1
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图1)
10-羟基喜树碱1g、二硫代二乙酸酐2g溶于30mL吡啶中，40℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸单酯0.81g。
中间产物羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸单酯0.8g溶于20mLDMSO，加入CDI0.6g，活化1h，加入GPC0.4g和DBU0.6g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得到产物双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物0.56g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.75(4H，s)，4.64-3.77(11H，m)，3.52-3.50(8H，d)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1279.29。
实施例2
双(羟基喜树碱-10-二甘醇酸)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图2)
10-羟基喜树碱1g、二甘醇酐3g溶于30mL吡啶中，40℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物羟基喜树碱-10-二甘醇酸单酯0.85g。取中间产物羟基喜树碱-10-二甘醇酸单酯0.8g，溶于20mLDMSO，加入CDI0.8g，活化1h，加入GPC0.4g和DBU0.8g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-二甘醇酸)磷脂酰胆碱化合物0.51g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.75(4H，s)，4.64-3.77(19H，m)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1183.03。
实施例3：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图3)
10-羟基喜树碱1g、琥珀酸酐1.5g溶于30mL吡啶中，40℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.75g。中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.7g溶于20mLDMF中，加入0.5gCDI和0.5gTEA，活化1h，然后加入甘氨酸1.0g，室温反应24h，反应液用柱色谱分离，得到羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酸0.53g。上述产物溶于10mL二甲亚砜中，加入CDI0.6g，活化1h，加入GPC0.25g和DBU0.6g，室温反应24h，冷乙醚中析出沉淀，柱层析分离得到双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰胆碱0.32g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.75(4H，s)，4.64-3.77(15H，m)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，2.62-2.52(8H，m)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1265.15。
实施例4
双(羟基喜树碱-10-碳酸酯-丁酸)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图4)
羟基丁酸1g，溶于无水三氯甲烷中，加入三乙胺1g，0℃下加入特丁基二甲基氯硅烷1g，反应3h，水洗，得到4-特丁基二甲基硅氧基-丁酸0.8g。4-特丁基二甲基硅氧基-丁酸0.8g溶于15mLDMSO，加入CDI0.8g，加入GPC0.4g和DBU0.8g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，产物在DMF中用四丁基氟化铵处理脱去保护基，经柱层析纯化得到双(羟基丁酸)磷脂酰胆碱0.65g。
双(羟基丁酸)磷脂酰胆碱0.4g溶于20mL三氯甲烷中，加入三乙胺0.6g，加入三光气0.3g，室温下反应6h，旋蒸除溶剂，固体溶于10mLDMSO，加入三乙胺0.3g，加入10-羟基喜树碱0.6g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-碳酸酯-丁酸)磷脂酰胆碱化合物0.31g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.01-6.96(10H，m)，6.51(2H，s)，4.75-3.77(19H，m)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，2.25(4H，t)，1.96-1.87(8H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1211.21。
实施例5：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图5)
10-羟基喜树碱1g、琥珀酸酐1.5g溶于30mL吡啶中，50℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.82g。中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.8g溶于20mLDMF中，加入0.5gCDI和0.5gTEA，活化1h，然后加入N-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酸(GFLG)0.5g，室温反应24h，反应液用柱色谱分离，得到羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酸0.65g。产物溶于15mL二甲亚砜中，加入CDI0.6g，加入GPC0.3g和DBU0.6g，室温反应24h，冷乙醚中析出沉淀，柱层析分离得到双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰)磷脂酰胆碱0.45g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.08(26H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.92-4.09(19H，m)，3.97-3.05(19H，m)，2.51-2.45(4H，tt)，2.01-1.75(10H，m)，1.01-0.96(18H，m)。[M+H]+m/z，1899.93。
实施例6：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-GFQGVQFAGF)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图6)
10-羟基喜树碱1g、琥珀酸酐1.5g溶于30mL吡啶中，50℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.82g。中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.8g溶于20mLDMF中，加入0.8gCDI和0.5gTEA，活化1h，然后加入多肽N-甘氨酰-苯丙氨酰-谷氨酰-甘氨酰-颉氨酰-谷氨酰-苯丙氨酰-丙氨酰-甘氨酰-苯丙氨酸(GFQGVQFAGF)0.8g，室温反应24h，反应液用柱色谱分离，得到羟基喜树碱-10-琥珀酰-GFQGVQFAGF0.51g。产物溶于10mL二甲亚砜中，加入CDI0.5g，活化1h，加入GPC0.3g和DBU0.5g，室温反应24h，冷乙醚中析出沉淀，柱层析分离得到双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-GFQGVQFAGF)磷脂酰胆碱0.23g。
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-GFQGVQFAGF)磷脂酰胆碱溶于0.1M氯化钠水溶液中，冻干得到含有抗衡离子氯离子和钠离子的磷脂酰胆碱固体粉末。
实施例7：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰甘油的合成(合成路线见图7)
由实施例3的方法制备的中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酸1g、CDI0.5g溶于20mLDMSO中，室温反应1h，加入3-(4-甲氧基苄氧基)丙烷-1，2-二醇0.5g，DBU0.5g，室温反应12h，旋蒸干溶剂；加入稀醋酸，在Pd/C催化剂存在下通氢气，室温反应12h，除去溶剂，经柱色谱分离，得到中间产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)甘油酯0.78g。
取中间产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)甘油酯0.4g溶于20mL三氯甲烷，加入三氯氧磷0.6g，三乙胺0.8g，10℃反应4h，旋蒸干溶剂；加入无水甘油缩丙酮0.6g，三乙胺0.3g，三氯甲烷为反应溶剂，10℃反应24h，旋蒸干溶剂；加入异丙醇，醋酸水溶液，50℃反应24h，反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰甘油化合物0.31g。1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，4.75-4.16(15H，m)，3.77-3.39(7H，m)，2.62-2.52(8H，tt)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1254.07。
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰甘氨酰)磷脂酰甘油溶于0.01M的氢氧化钠水溶液中，冻干得到含有抗衡离子钠离子的磷脂酰甘油固体粉末。
实施例8：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺化合物的合成(合成路线见图8)
实施例7中的中间产双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)甘油酯0.3g溶于10mLDMSO中，加入三氯氧磷0.5g，三乙胺1.0g，10℃反应24h，旋蒸干溶剂；加入10mL三氯甲烷为反应溶剂，加入N-叔丁氧羰基-氨基乙醇0.6g，三乙胺0.6g，10℃反应24h，旋蒸干溶剂，柱色谱分离得到粗产物；滴加三氟乙酸TFA5mL，室温反应3h。所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺化合物0.21g。1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，4.75-4.16(17H，m)，3.77-3.52(4H，m)，2.62-2.52(8H，tt)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1223.06。
实施例9：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇的合成(合成路线见图9)
取mPEG(端羟基聚乙二醇单甲醚，平均分子量2000)0.5g溶于20mL三氯甲烷中，加入CDI0.2g，活化1h，加入实施例8中的双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺化合物0.1g，DBU0.2g，室温反应24h，反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺N-聚乙二醇0.08g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，4.75-4.16(15H，m)，3.65-3.54(？？H，m)，2.62-2.52(8H，tt)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。
实施例10：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺N-聚乙二醇-叶酸化合物的合成(合成路线见图10)
端羟基-N-BOC-氨基聚乙二醇(平均分子量2000)0.5g溶于20mL三氯甲烷中，加入CDI0.2g，活化1小时后，旋蒸除去溶剂，加入DMSO10mL，DBU0.2g，加入实施例8的双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺0.1g，室温反应12小时，柱色谱分离；然后，用TFA处理脱除聚氧乙烯端基保护基BOC，进行柱色谱纯化处理，得到端基为氨基的双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇。产物加入到5mLDMSO中，加入0.2gCDI和0.2gTEA，活化1h，加入叶酸0.3g，室温反应24小时，反应液经柱层析，得到产物双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺N-聚乙二醇-叶酸0.06g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ11.0(1H，s)，8.57-7.43(10H，m)，6.74-6.61(4H，s)，6.51(2H，s)，4.75-4.22(17H，m)，3.79-3.54(？？H，m)，2.62-2.52(8H，tt)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。
实施例11
双(羟基喜树碱-10-己二酰)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图11)
10-羟基喜树碱1g溶于30mL吡啶中，加入己二酸酐1.8g，50℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，柱层析分离得到中间产物羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.81g。
中间产物羟基喜树碱-10-己二酸单酯0.6g溶于15mLDMSO，加入CDI0.6g，活化1h，加入GPC0.3g和DBU0.5g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(羟基喜树碱-10-己二酰)磷脂酰胆碱化合物0.42g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.07-7.43(8H，m)，6.74(2H，s)，6.50(2H，s)，4.75(4H，s)，4.64-3.77(11H，m)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，2.25-2.23(8H，m)，1.87(4H，m)，1.68-1.56(8H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1207.11。
将双(羟基喜树碱-10-己二酰)磷脂酰胆碱化合物溶于0.1M氯化钠水溶液中，冻干，得到含有钠离子和氯离子的磷脂酰胆碱化合物盐固体粉末。
实施例12：
双(7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图12)
7-乙基-10-羟基喜树碱1.0g溶于30mL吡啶中，加入琥珀酸酐1.5g，50℃反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.82g。7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.6g溶于15mLDMSO，加入CDI0.6g，活化2h，加入GPC0.3g和DBU0.6g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物0.32g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.03-7.40(6H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.75(4H，s)，4.64-3.77(11H，m)，3.43(2H，t)，3.30(9H，s)，2.62-2.52(12H，m)，1.87(4H，m)，1.24(6H，t)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1207.15。
双(7-乙基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物溶于0.1M磷酸钠水溶液中，冻干得到含有抗衡离子钠离子和磷酸酸根的磷酸胆碱化合物固体粉末。
实施例13：
双(9-二甲氨基甲基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图13)
取9-二甲氨基甲基-10-羟基喜树碱(拓扑替康)0.5g溶于30mL吡啶中，加入琥珀酸酐1g，50度反应48h；旋蒸除溶剂，冷乙醚中析出沉淀，稀盐酸洗涤，得中间产物9-二甲氨基甲基-羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.35g。中间产物9-二甲氨基甲基-羟基喜树碱-10-琥珀酸单酯0.3g溶于10mLDMSO中，加入CDI0.3g，活化1h，加入GPC0.15g和DBU0.3g，室温反应24h，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(9-二甲氨基甲基-羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物0.21g。
1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ7.91-7.30(6H，m)，6.74(2H，s)，6.51(2H，s)，4.75-4.22(11H，m)，3.97-3.43(10H，m)，3.30(9H，s)，2.62-2.27(20H，m)，1.87(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1265.22。
实施例14：
双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱的合成(合成路线见图14)
喜树碱1g、二硫代二乙酸酐0.75g、DMAP0.2g、三乙胺0.2g溶于30mL三氯甲烷，回流反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤稀盐酸层，取滤饼；加甲醇溶解，4℃放置12h，过滤，取滤饼，干燥，得中间产物喜树碱-20-二硫代二乙酸单酯0.75g。中间产物0.5g溶于15mLDMSO，加入CDI0.5g，活化1h，加入GPC0.2g和DBU0.5g，室温反应，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物0.32g。1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.03-7.42(10H，m)，6.74(2H，s)，4.75-4.32(7H，m)，4.22(4H，s)，3.97-3.43(14H，m)，3.30(9H，s)，1.98(4H，m)，0.96(6H，s)。[M+H]+m/z，1247.30。
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱溶于0.1M氯化钠水溶液中，冻干得到含有抗衡离子氯离子和钠离子的磷脂酰胆碱固体粉末。
实施例15：
双(喜树碱-7-亚甲基-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物的合成(合成路线见图15)
在配有温度计和搅拌的100mL三口圆底烧瓶中加入15mL甲醇和12.5mL水，在冰浴冷却下加入6.5mL浓硫酸，然后加入0.5g(1.43mmol)喜树碱和0.4g(1.43mmol)硫酸亚铁七水合物，混合物搅拌5分钟后，控制温度在5C以下，缓慢滴加0.24mL(0.21mmol)30％的过氧化氢，溶液颜色逐渐变深，反应物在室温搅拌10小时后，倒入200mL水中，水相放置过夜，过滤，固体水洗，干燥得到黄色固体0.5g，粗品用DMF-乙酸乙酯重结晶得到0.3g7-羟甲基喜树碱，产率：55％，mp274-276℃。1HNMR(CDCl3，300MHz)：δ8.17(t，2H，Ar-H)，7.84(t，1H，Ar-H)，7.69(t，1H，Ar-H)，7.33(s，1H，Ar-H)，6.49(s，1H，20OH)，5.79(m，1H，7OH)，5.41d(d，4H，H17，7-CH2)，5.26(d，2H，H5)，1.86(m，2H，18-CH2)，0.87(t，3H，19-CH3)。
取7-羟甲基喜树碱0.3g，二硫代二乙酸酐2g，DMAP0.1g，三乙胺1g，加入二氯甲烷或三氯甲烷为反应溶剂，加入回流反应，反应12h；稀盐酸洗涤三遍，过滤稀盐酸层，取滤饼；加甲醇溶解，4℃放置12h，过滤，取滤饼，干燥，得中间产物喜树碱-7-亚甲基二硫代二乙酸单酯0.21g。中间产物0.22g溶于20mLDMSO中，加入CDI0.3g，活化1h，加入GPC0.1g和DBU0.2g室温反应，所得反应液通过柱层析纯化，得产物双(喜树碱-7-亚甲基-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱0.13g。1HNMR(500MHz，CD3OD∶CDCl31∶1)：δ8.03-7.41(8H，m)，6.25(2H，s)，5.34(4H，s)，4.64-4.32(3H，m)，3.97-3.43(16H，m)，3.30(9H，s)，3.22(4H，s)，1.75(4H，m)，0.96(6H，t)。[M+H]+m/z，1307.25。
实施例16：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的制备
取实施例1的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱1mmol，加入三氯甲烷20mL，60℃旋蒸干溶剂；加入20mLPBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果如下图16，平均粒径330nm。
实施例17：
双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的制备
由实施例14得到的双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物1mmol，加入三氯甲烷20mL，60℃旋蒸干溶剂；加入20mLPBS(pH＝7.4)60℃起膜，200nm滤膜过滤，得双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示平均粒径106nm。将双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒溶液冻干，得到粉状纳米颗粒。透射电镜测量纳米颗粒的形态如图17。
实施例18：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物脂质体的制备
由实施例5得到的双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物0.3mmol，加入三氯甲烷10ml，60℃旋蒸干溶剂；加入10mlPBS(pH＝7.4)60℃起膜，得双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示，平均粒径154nm。
实施例19：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺N-聚乙二醇-叶酸化合物脂质体的制备
由实施例10得到的双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇-叶酸化合物0.3mmol，加入三氯甲烷10ml，60℃旋蒸干溶剂；加入10mlPBS(pH＝7.4)60℃起膜，得双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰)磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇-叶酸化合物脂质体纳米颗粒溶液。粒径分析结果显示平均粒径170nm。
实施例20：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体B的制备
实施例1的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物0.1mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC0.4mmol溶于10mL三氯甲烷，60℃旋蒸干溶剂；加入10mlPBS(pH＝7.4)60℃起膜，得双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体B纳米颗粒溶液。粒径分析显示平均粒径180nm。
实施例21：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体C的制备
取实施例1的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物0.1mmol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC0.3mmol，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG-叶酸(聚乙二醇分子量2000)0.1mmol，加入三氯甲烷10ml，60℃旋蒸干溶剂；加入10mlPBS(pH7.4)60℃起膜，得双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体C纳米颗粒溶液。粒径分析显示，平均粒径520nm。冷冻干燥，得到双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体C粉末状纳米颗粒。
实施例22：
双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物脂质体的体外降解试验
实施例18制备的0.1mmol双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒10mLPBS溶液中，分成2份，其中一份加入木瓜蛋白酶(papain)的PBS缓冲液0.5mL(酶浓度50mmol)，另一份加入PBS缓冲液，放置与培养箱中37℃下孵育，用高效液相色谱检测羟基喜树碱的含量(Agilent1100LC，Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长λ＝254nm；梯度淋洗：2-90％缓冲液B/A，流速1.0mL/min，缓冲液A：0.1％TFA的去离子水，缓冲液B：0.1％TFA的乙腈)。
结果表明，木瓜蛋白酶处理的脂质体溶液在6小时后释放出的10-羟基喜树碱药物达到总量的45％，15小时后释放出的10-羟基喜树碱达到75％；未经酶处理的脂质体溶液未检测出10-羟基喜树碱药物。可见，双(羟基喜树碱-10-琥珀酰-甘氨酰-苯丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰(GFLG))磷脂酰胆碱化合物脂质体具有酶降解性，快速释放出10-羟基喜树碱原药。
实施例23：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的体外降解试验
实施例16制备的0.1mmol双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒10mLPBS溶液中，分成2份，其中一份加入谷胱甘肽(GSH)的PBS缓冲液0.5mL(GSH浓度50mmol)，另一份加入PBS缓冲液，放置与培养箱中37℃下孵育，用高效液相色谱检测羟基喜树碱的含量(Agilent1100LC，Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长λ＝254nm；梯度淋洗：2-90％缓冲液B/A，流速1.0mL/min，缓冲液A：0.1％TFA的去离子水，缓冲液B：0.1％TFA的乙腈)。
结果表明，GSH处理的脂质体溶液在3小时后释放出10-羟基喜树碱药物达到总量的90％；未经GSH处理的脂质体溶液3小时后未检测出10-羟基喜树碱药物。可见，双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体具有GSH敏感性，可由细胞内的GSH控制释放10-羟基喜树碱原药。
实施例24：
双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的体外降解试验
实施例17制备的0.1mmol双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体纳米颗粒10mLPBS溶液中，分成2份，其中一份加入谷胱甘肽(GSH)的PBS缓冲液0.5mL(GSH浓度50mmol)，另一份加入PBS缓冲液，放置与培养箱中37℃下孵育，用高效液相色谱检测喜树碱的含量(Agilent1100LC，Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长λ＝254nm；梯度淋洗：2-90％缓冲液B/A，流速1.0mL/min，缓冲液A：0.1％TFA的去离子水，缓冲液B：0.1％TFA的乙腈)。
结果表明，GSH处理的双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体溶液在3小时后释放出喜树碱原药达到总量的93％；未经GSH处理的脂质体溶液3小时后未检测出喜树碱药物。可见，双(喜树碱-20-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体具有GSH敏感性，快速释放出20位羟基裸露的喜树碱原药。
实施例25：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱的模拟体内降解试验
实施例1制备的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱溶于5mLPBS溶液中，制成浓度为0.1mmol的溶液；对照例制备的双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-琥珀酰)磷脂酰胆碱化合物溶于5mLPBS溶液中，制成浓度为0.1mmol的溶液。
上述溶液中分别加入人分泌型磷脂酶A2(sPLA2)使其浓度约为200ng/L，37℃摇床中震摇24h，分别0、2、4、8、12、24h取点，用高效液相色谱检测10-羟基喜树碱的含量(Agilent1100LC，Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长λ＝254nm；梯度淋洗：2-90％缓冲液B/A，流速1.0mL/min，缓冲液A：0.1％TFA的去离子水，缓冲液B：0.1％TFA的乙腈)。
结果表明，酶处理的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱PBS溶液在8小时后释放出的10-羟基喜树碱药物达到总量的20％，24小时后释放出的10-羟基喜树碱达到65％；酶处理的双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱溶液在8小时后释放出的10-羟基喜树碱药物仅为总量的3％，24小时后释放出的10-羟基喜树碱达到10％。可见，双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱和双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱均能被sPLA2酶降解，但是前者释放出的是20位羟基裸露的10-羟基喜树碱原药，24小时达到65％，而后者释放的10-羟基喜树碱的量很少，主要是20羟基酯化的10-羟基喜树碱-20-乙酸酯。
药理实验
实验例26：
MTT法人癌细胞杀伤试验：双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的抗肿瘤活性
HepG2人肝肿瘤细胞以8×103个/孔的接种量接种于96孔培养板，5％CO2、37℃培养箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的实施例16的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体溶液、对照10-羟基喜树碱药物溶液(10-羟基喜树碱溶于生理盐水，微量DMSO助溶)、对照例双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体溶液(对照例的产物按照实施例16相同的方法制备)各100μL，使最终筛选的药物终浓度(按照羟基喜树碱结构单元的含量进行计算)分别为0.01、0.05、0.25、0.5、1μmol/mL，继续培养24h后；分别加入50μLMTT温育4h，弃去培养基，加入150μLDMSO，在平板摇床上摇匀，酶标仪495nm读板，根据测得的吸光度值计算细胞抑制率。数据表示为平均数±SD(n＝6)。
结果显示，对HepG2肿瘤细胞，双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体的致死率高于对照组10-羟基喜树碱原药，也高于双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体，显示前者优异的抗肿瘤活性。其中双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体的IC50(50％肿瘤细胞被杀死的药物浓度)为0.20μmol/mL，原药的IC50为0.45μmol/mL，双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体的IC50为0.50μmol/mL。
导致上述结果的原因是，双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体中喜树碱的活性结构20位羟基是裸露的，同时，该化合物中活性内酯结构位于脂质层，在进入细胞之前保持稳定而不开环，脂质体进入细胞后脂质体解体并释放出原药10-羟基喜树碱。对照组10-羟基喜树碱原药直接给药，在进入细胞之前内酯活性结构部分开环，活性下降，导致药效降低。双(羟基喜树碱-20-乙酸酯-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体进入细胞后，释放出20位羟基酯化的羟基喜树碱，药效低于直接释放10-羟基喜树碱的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱脂质体。
实验例27：
药物磷脂质体在小鼠体内毒性试验
动物：ICR小鼠，雄性，18-22g，购自维通利华实验动物技术有限责任公司。
实施例16的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体的体内毒性试验的结果(表1)表明，其最大耐受剂量大于220mg/kg，表明其毒性远小于10-羟基喜树碱原药。
表1小鼠体内毒性试验结果
实验例28：
双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体体内药效和毒性实验
裸鼠模型的制备：收集培养的HepG2细胞悬液，浓度为1×107个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。分组与给药：裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，肿瘤生长至75mm3时将动物随机分组。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。肿瘤体积(TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2(式3-2)，其中a、b分别表示长宽。
组别及给药方案：空白组：生理盐水，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。
对照组：10-羟基喜树碱溶于生理盐水(微量DMSO助溶，给药量30mg/kg)，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。
药物组：实施例16的双(羟基喜树碱-10-二硫代二乙酸)磷脂酰胆碱化合物脂质体溶液(给药量相当于10-羟基喜树碱30mg/kg)，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。期间，测量体重变化。
抗肿瘤活性和体重变化结果见图18。从抗肿瘤活性(图18a)来看，本发明磷脂脂质体具有很好的抑制肿瘤生长作用，且动物体重没有下降(图18b)，显示无毒性。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种喜树碱类磷脂化合物，其特征在于，该磷脂化合物为下列结构式(1)、(2)或(3)的化合物，或所述结构式(1)、(2)、(3)的化合物分别与抗衡离子所形成的在药学上可接受的盐：
式(1)、(2)、(3)中，X、Y、Z是间隔臂，X、Y是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基或碳原子数为2～20的不含杂原子的亚烷烃基/亚烯烃基；Z是以下任意一种：碳原子数为2～20的含有醚键的亚烷烃基、碳原子数为1～20的氧基亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有双硫键(-S-S-)的亚烷烃基、碳原子数为2～20的含有酯键的亚烷烃基、原子数为2～20的含有腙键的亚烷烃基、碳原子数为2～60的含有肽键的亚烷烃基；L是2-氨基-2-羧基乙基、2-氨基乙基、2-三甲基胺基乙基阳离子、2、3-二羟基丙基、分子量为200-4000的不含靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基或分子量为200-4000的端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基；
式(1)、(2)、(3)中，R7、R9、R10、R11和R12均为以下任一种基团：氢、卤素、羟基、C1-C6的直链或支链的烷基/烷氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C6的直链或支链的卤代烷基/卤代烷氧基、C1-C6的直链或支链烷基的三取代硅烷基、C1-C6的直链或支链烯烃基、甲醛基、C1-C6的直链或支链烷基酯基、C1-C6的直链或支链烷基羰基、C1-C6的直链或支链的羟基烷基、C1-C6的直链或支链烷氧基亚甲基、苯氧基亚甲基、苯甲酯基亚甲基、二甲胺基甲基、二甲基胺基乙基、具有哌嗪结构的取代基、具有结构的取代基、具有-CH2NR13R14结构的取代基，所述-CH2NR13R14结构中，R13和R14均为C1-C6的直链烷基、C1-C6的支链烷基。
2.根据权利要求1所述的喜树碱类磷脂化合物，其特征在于，所述端基为靶向基团的N-聚乙二醇-氨基乙基中，靶向基团是叶酸、半乳糖、多肽、抗体、抗体片段、透明质酸、无唾液酸糖蛋白、多糖、核酸和拟肽中的任一种。
3.根据权利要求1所述的喜树碱类磷脂化合物，其特征在于，所述抗衡离子是一种阳离子，或一种阳离子和一种阴离子的组合。
4.一种药物组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1、2或3所述的喜树碱类磷脂化合物或所述的喜树碱类磷脂化合物与药效学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，该组合物是液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，该组合物为粒径10-1000纳米的脂质体纳米颗粒，该药物组合物中还包括助剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的助剂是磷脂或胆固醇。
8.权利要求1、2或3所述喜树碱类磷脂化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该应用将所述紫杉醇类磷脂化合物或其在药学上可接受的盐，与药效学上可接受的载体制备成药剂。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20170915 |