CN103319710A - 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 - Google Patents
聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103319710A CN103319710A CN2013102230198A CN201310223019A CN103319710A CN 103319710 A CN103319710 A CN 103319710A CN 2013102230198 A CN2013102230198 A CN 2013102230198A CN 201310223019 A CN201310223019 A CN 201310223019A CN 103319710 A CN103319710 A CN 103319710A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liposome
- oxazoline
- ethyl
- poly
- fluorexon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开一种理化性质稳定且成本低的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法，聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物的通式如下：
式中：n为1-500的整数；R1为甲基或羟基；g为醚键或酯键；R2为胆固醇、胆固醇甲酰氯、胆固醇半琥珀酸酯、α-生育酚或α-生育酚半琥珀酸酯。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种理化性质稳定且成本低的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法。
背景技术
脂质体是一种理想的药物递送系统，由类脂质（磷脂）、胆固醇及附加剂构成。所采用的磷脂包括天然磷脂和合成磷脂二类，天然磷脂以卵磷脂（磷脂酰胆碱，PC）为主，合成磷脂主要有DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）、DPPE（二棕榈酰磷脂酰乙醇胺）、DSPC（二硬脂酰磷脂酰胆碱）等。胆固醇可以阻止磷脂凝集成晶体结构，同时胆固醇及其衍生物具有调节脂质体膜流动性的作用：低于相变温度时，可使膜排列的有序性降低，膜流动性增高；高于相变温度时，可增加膜排列的有序性，膜流动性降低。也有的以α-生育酚及其衍生物替代胆固醇，调节脂质体膜流动性，同时α-生育酚有利于增加烃链的倾斜角度，可逐步降低磷脂从凝胶态到液晶态的温度，从而抑制脂质体中包封药物的外泄。
传统pH敏感脂质体（pH-sensitive liposomes, PSL）在血浆中极不稳定，不能有效地将内容物运送至靶部位，因此，提高PSL的稳定性成为关键性问题。利用PEG修饰，虽然能够提高PSL的稳定性，但通常会令PSL对下降的pH失去应答，导致pH敏感性的丧失，同时由于PEG链的空间位阻作用，还会阻碍载有基因或活性蛋白分子的阳离子脂质体与靶细胞相互作用，抑制靶细胞对脂质体的内吞和摄取作用，即使进入细胞以后，PEG-脂质体也很难与核内体膜融合将药物释放到胞浆，严重限制了PEG-脂质体特别是PEG修饰PSL的研究和发展。
聚（2-乙基-2-噁唑啉）（poly(2-ethyl-oxazoline)，PEtOz）是一种高分子长链聚合物，具有高度水溶性和柔顺性，生物相容性好，已通过美国FDA认证。中国专利申请号为201110009564.8的发明专利申请，公开了一种“聚合物修饰的脂质材料及其用途”，其目的是提供一种pH敏感型且具有肿瘤靶向性能的药物载体。虽然专利申请说明书多次提及该发明是以聚合物修饰的磷脂类物质，但所公开的具体技术方案只是生产一端为叠氮、一端为氨基的聚（2-乙基-2-恶唑啉），同时以端炔基的羧酸与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Distearoyl phosphatidyl ethanolamine，DSPE）反应，通过羧酸与胺的缩合酰化反应，生成端炔基的DSPE，最后使两产物反应得到PEtOz -DSPE。DSPE是一种合成磷脂，生产过程复杂，成本较高，这也是一般不以DSPE作为脂质体用磷脂的主要原因。
胆固醇、α-生育酚及其衍生物是脂质体脂质双分子层的主要组成部分，与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺相比，具有来源广泛、理化性质稳定及价格低廉等优点，但是迄今为止还未有关于以聚（2-乙基-2-恶唑啉）偶联胆固醇、α-生育酚及其衍生物产品及制备方法的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种理化性质稳定且成本低的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物，其特征在于通式如下：
式中：
n为1-500的整数；
R1为甲基或羟基；
g为醚键或酯键；
R2为胆固醇、胆固醇甲酰氯、胆固醇半琥珀酸酯、α-生育酚或α-生育酚半琥珀酸酯。
一种上述的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：在避光的容器中加入端基为甲基和羟基的聚（2-乙基-2-恶唑啉）及R2，聚（2-乙基-2-恶唑啉）与R2的摩尔比为1：1.2-10，在氮气保护下以反应物5-50体积倍量的二氯甲烷为反应溶剂，以三乙胺和4-二甲基氨基吡啶为催化剂，室温反应2-72 h，旋蒸除去有机溶剂，得到粗产物；将得到的粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸清洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为1-20：1，收集洗脱液，旋蒸得到白色粉末状的聚合物。
一种上述的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：在避光的容器中加入端基为甲基和羟基的聚（2-乙基-2-恶唑啉）及R2，聚（2-乙基-2-恶唑啉）与R2的摩尔比为1：1.2-10，以4-二甲基氨基吡啶为催化剂，以反应物5-50体积倍量的二氯甲烷为反应溶剂，加入二环己基碳二亚胺，过滤，得到粗产物溶液，所述粗产物溶液经减压除去反应溶剂后，得到粗产物；得到的粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸清洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为1-20：1，收集洗脱液，旋蒸得到白色粉末状的聚合物。
本发明是以胆固醇、α-生育酚及其衍生物作为与聚（2-乙基-2-恶唑啉）偶联的脂质部分，与磷脂、胆固醇等构成PEtOz修饰脂质体，可有效提高纳米制剂（药物）进入肿瘤组织的量，彻底根除肿瘤细胞，原理如下：①由于PEtOz具有亲水性及柔顺性，本发明修饰于纳米制剂表面可以避免其被血浆中的调理素识别进而被MPS吞噬，延长制剂体内循环时间；②通过增强的渗透与滞留（Enhanced permeability and retention effect，EPR）效应，本发明修饰纳米制剂在肿瘤组织蓄积；③聚集于肿瘤组织的由主动靶向配体或抗体修饰的制剂具有肿瘤细胞亲和性，介导制剂进入肿瘤细胞；④纳米制剂进入肿瘤细胞后，在核内体低pH条件下，PEtOz诱导纳米制剂与核内体膜融合或使核内体去稳定化，直接释放药物进入胞浆，促使细胞的凋亡，也就是通过长循环-EPR效应-主动靶向-pH-敏感性的协同作用提高药物的抗肿瘤效果并降低毒副作用。因胆固醇、α-生育酚及其衍生物与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）相比，具有来源广泛、理化性质稳定、价格低廉等优点，使得本发明的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物与现有的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-DSPE相比，具有原料来源广泛、成本低的优点。同时，由于胆固醇和α-生育酚是脂质体脂质双分子层的主要组成部分，以这两种脂质及衍生物为端基能够实现靶向材料的脂质衍生化，且可以很好地与制剂的脂质层锚合。另外，本发明的制备方法可将PEtOz与胆固醇、α-生育酚及其衍生物在特定条件下（反应溶剂、催化剂等）直接偶联，无需通过端炔基的羧酸等间接反应，减少反应程序、缩短反应时间，不但提高了工作效率，也进一步降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯红外光谱图。
图2是本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯氢谱图。
图3是本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯红外光谱图。
图4是本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯氢谱图。
图5是本发明实施例3聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯红外光谱图。
图6是本发明实施例3聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯氢谱图。
图7是普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体高斯粒径分布对比图。
图8 是普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在3 mM氯化钙溶液中不同时间的浊度变化曲线（n=3）。
图9 普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在pH=7.4PBS释放介质中累积释放曲线（n=3）。
图10是普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在大鼠体内的药代动力学曲线（n=3）。
图11是37℃时，普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在不同pH缓冲溶液中孵育不同时间后钙黄绿素的释放率（n=3）。
图12是流式细胞仪分析HeLa细胞摄取普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体计数图。
图13是激光共聚焦显微镜观察细胞摄取普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体镜下图。
图14是MTT法测定普通阿霉素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的阿霉素脂质体的细胞毒性分析图。
图15 不同pH条件（37℃，孵育1h）普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体诱导红细胞血红素释放曲线（n=3）。
图16是普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在90%人血浆中的释放效果图。
图17是普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体的钙离子稳定性示意图。
图18 是不同pH条件下普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体吸光度值随时间变化示意图。
具体实施方式
实施例1：
取胆固醇半琥珀酸酯（1 mmol）、端基为甲基和羟基、分子量为5000的聚（2-乙基-2-恶唑啉）（1 mmol）和4-二甲基氨基吡啶（0.83 mmol）放入避光圆底烧瓶，以20 ml CH2Cl2为反应溶剂，冰水浴搅拌10 min，加入二环己基碳二亚胺（0.05 mmol），室温反应12 h，抽滤，得到粗产物溶液，所述粗产物溶液经减压除去反应溶剂后，得到粗产物；得到粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为10：1，产品上样量为1 ml，收集洗脱液旋蒸，得到白色粉末状的聚合物，即聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯（PEtOz5000-CHEMS）。结构式如下：
式中：
n为50；
R1为甲基；
g为羧酸酯键；
R2为胆固醇半琥珀酸酯。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯红外图如图1所示：
IR：1714 cm-1（酯羰基C=O）, 1625 cm-1（羰基，C=O），1571 cm-1（-NH），合成产物具有明显的酯羰基特征峰，聚（2-乙基-2-恶唑啉)羟基伸缩振动峰消失，除此之外合成产物具备聚(2-乙基-2-恶唑啉)和胆固醇半琥珀酸酯的基本特征峰。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯氢谱图如图2所示：
1H NMR(CDCl3，δ ppm)：0.6782(s, 3H, H-4)，0.860(d, 3H, H-1)，0.8732(d, 3H, H-2), 0.9209(d, 3H, H-3), 1.0086(s, 3H, H-5), 2.34(d, 2H, H-7, 8), 3.50(t, 3H, H-9, 10), 5.352(s, 1H, H-6)。
图1、图2表明：所得产物即为设计的目标产物聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯。
实施例2：
将端基为甲基和羟基、分子量为2000的的聚（2-乙基-2-恶唑啉）（0.8 mmol）放入避光的三颈瓶中，N2条件下加入4-二甲基氨基吡啶（0.4 mmol）和三乙胺（1.08 mmol），缓慢滴加含有1.2 mmol胆固醇甲酰氯的二氯甲烷溶液20 ml，室温反应24 h，旋蒸除去有机溶剂，得到粗产物；将得到的粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸清洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为5：1，产品上样量为1 ml，收集洗脱液，旋蒸得到白色粉末状的聚合物，聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯（PEtOz2000-CHMC）。结构式如下：
式中：
n为20；
R1为甲基和羟基；
g为碳酸酯键；
R2为胆固醇甲酰氯。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯红外图如图3所示：
IR：1732 cm-1（酯羰基，C=O），1628 cm-1（羰基，C=O），1576 cm-1（-NH），由于共轭作用，酯基上的羰基峰向低波数移动，合成的产物具备聚(2-乙基-2-恶唑啉)和胆固醇甲酰氯的基本特征峰。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯氢谱图如图4所示：
1H NMR(CDCl3, δ ppm)：0.68(s, 3H, H-4), 0.861(d, 3H, H-1), 0.87(d, 3H, H-2), 0.923(d, 3H, H-3), 1.009(s, 3H, H-5), 2.50(s, 3H, H-9), 3.52(d, 2H, H-7, 8), 5.356(s, 1H, H-6)。
图3、图4表明：所得产物即为设计的目标产物聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯。
实施例3
将端基为甲基和羟基、分子量为2000的聚（2-乙基-2-恶唑啉）（0.8 mmol）放入避光的三颈瓶中，N2条件下加入4-二甲基氨基吡啶（0.36 mmol），将1 mmol α生育酚半琥珀酸酯，以20 ml二氯甲烷为反应溶剂，冰水浴搅拌15 min后加入1 mmol二环己基碳二亚胺，室温反应12 h，抽滤，得到粗产物溶液，所述粗产物溶液经减压除去反应溶剂后，得到粗产物；得到粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为5：1，产品上样量为1 ml，收集洗脱液旋蒸，得到白色粉末状的聚合物，即聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯（PEtOz -THS）。
结构式如下：
式中：
n为20；
R1为甲基和羟基；
g为羧酸酯键；
R2为α生育酚半琥珀酸酯。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯红外图如图5所示：
IR：1748 cm-1和 1705cm-1（酯羰基，C=O），1646 cm-1（羰基，C=O），1550 cm-1（-NH）。合成的产物具备聚(2-乙基-2-恶唑啉)和α生育酚半琥珀酸酯的基本特征峰。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯氢谱图如图5所示：
1H NMR(CDCl3, δ ppm)：0.87(s, 3H, H-5), 1.04(d, 3H, H-1, H-2), 1.12(d, 3H, H-3, H-4), 2.008(s, 3H, H-6), 2.013(s, 3H, H-7), 2.081(s, 3H, H-8), 2.76 (d, 2H, H-9, H-10), 3.452(d, 2H, H-11, H-12)。
图5、图6表明：所得产物即为设计的目标产物聚（2-乙基-2-恶唑啉）-α生育酚半琥珀酸酯。
实验例1：普通钙黄绿素脂质体及本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体的制备
（1）普通钙黄绿素脂质体的制备
按现有技术方法，将96 mg大豆磷脂（S75）与48 mg胆固醇溶于6 ml乙醚中，加入2 ml钙黄绿素溶液（60 mM），密闭条件下水浴超声得到均匀乳状液为止，将混合物室温条件减压旋转蒸发，随着溶剂蒸发混合物形成凝胶，达到某一临界点时凝胶塌陷，出现水混悬液即停止，加入适量水化介质，继续减压旋转蒸发30 min以除尽有机溶剂，得到大多室脂质体进行探头超声，得到的脂质体依次通过0.45 μm、0.22 μm的微孔滤膜整粒。
（2）聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯胶束的制备
将实施例2所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯溶于氯仿中，茄形瓶中37 ℃减压旋转蒸发1 h除去有机溶剂，然后加入37 ℃预热的0.01 M PBS水化，手摇得到聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯胶束，0.22 μm微孔滤膜整粒。
（3）聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体的制备
将以上得到的普通钙黄绿素脂质体与聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯胶束按摩尔比为20:1混合，室温条件下混合搅拌1 h，得到聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体。
所得聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体的包封率为（10.9±0.8）%（n=3）。以动态光散射技术的Nicomp 380粒径测定仪测脂质体粒径见图7。图7中（A）是普通钙黄绿素脂质体高斯粒径分布图，（B）是聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体高斯粒径分布图。
采用NICOMP 380 Zeta电位测定仪测定脂质体的Zeta电位，如表1。
表1 脂质体的zeta电位
| 脂质体 | 粒径（nm） | Zeta 电位（mV） |
| 普通钙黄绿素脂质体 | 120.3±8.5 | -23.8±2.5 |
| PEtOz -钙黄绿素脂质体 | 134.8±9.2 | -17.7±1.8 |
通过对比可以看出：制备的脂质体的粒径均小于150 nm，聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰使脂质体的粒径略有增加。两种脂质体表面都是带有负电荷的，经聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰后脂质体的Zeta电位绝对值降低，此结果与PEG修饰脂质体类似。
实验例2：
普通钙黄绿素脂质体和本发明实施例2聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰钙黄绿素脂质体的钙离子稳定性考察
分别将200 μl普通钙黄绿素脂质体和PEtOz -CHMC修饰钙黄绿素脂质体以3 mM氯化钙稀释至5 ml，37℃孵育，不同时间测定混合液450 nm处的吸光度AT。分别取200 μl脂质体以蒸馏水稀释至5 ml，紫外可见-分光光度计450 nm处测定吸光度，作为A0。计算浊度变化率：浊度变化率（%）=(AT-A0)/AT×100%。 以浊度变化率-时间作图，如图8所示。由图8可知，在3 mM氯化钙溶液中，随着孵育时间的延长，普通钙黄绿素脂质体的浊度变化比较明显，当孵育时间为24 h时，普通脂质体的浊度变化率可达（50.1±3.3）%，虽然PEtOz -CHMC修饰钙黄绿素脂质体随时间增加浊度变化率也有所增加，但是显著低于普通钙黄绿素脂质体的变化。说明PEtOz -CHMC修饰钙黄绿素脂质体具有良好的抗钙离子诱导脂质体聚集的作用，即PEtOz -CHMC能够保护脂质体，使其具有较好的稳定性。
实验例3：缓冲溶液中普通钙黄绿素脂质体和PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体的体外释放
将1 ml除去外水相钙黄绿素的普通脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体置于透析袋中，于250 ml的PBS缓冲液释放介质中37 ℃孵育，不同时间取3 ml释放介质，同时补充等量介质，荧光分光光度计（Ex=490 nm，Em=512 nm）测定样品的荧光强度，计算钙黄绿素的累计释放度，如图9所示。
由图9可以看出：普通钙黄绿素脂质体在缓冲溶液中的稳定性较差，钙黄绿素释放很快，随着时间的延长，普通钙黄绿素脂质体的钙黄绿素释放越来越多。而PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体钙黄绿素释放率始终低于普通钙黄绿素脂质体，表明经PEtOz-CHMC修饰的脂质体具有较好的体外稳定性。
实验例4：普通钙黄绿素脂质体和PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体在大鼠体内的药代动力学
雄性Wistar大鼠6只，随机分成2组，分别尾静脉注射普通钙黄绿素脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体，按磷脂浓度25 μmol/kg计算注射量，于给药后不同时间眼眶取血，计算血浆中钙黄绿素的含量，以血浆中钙黄绿素剩余百分率与时间作图，如图10所示。由图10可知：普通钙黄绿素脂质体进入大鼠体内，迅速自血浆内消除，1 h后已经检测不到药量。PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体明显改变了脂质体的血浆分布，在大鼠体内循环时间显著延长。
实验例5：普通钙黄绿素脂质体和PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体在不同pH缓冲溶液中的释放
利用葡聚糖凝胶除去普通钙黄绿素脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体悬液中未被包封的钙黄绿素，以150倍量不同pH的缓冲溶液稀释脂质体，孵育不同时间后，于荧光分光度计测定荧光强度，计算钙黄绿素释放率，如图11所示，（A）普通钙黄绿素脂质体（B）PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体。由图11可知，低pH可以诱导PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体膜不稳定释放内容物，且pH越低，内容物释放越多，证明PEtOz-CHMC赋予脂质体良好的pH敏感性。
实验例6：普通钙黄绿素脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体不同pH细胞摄取情况
HeLa细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO2及饱和湿度环境下培养，待细胞生长状态良好时进行传代。以pH 7.4和6.0的无血清DMEM培养液培养细胞，分别加入普通钙黄绿素脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体，37℃孵育（1h和4h），弃去培养液，以预冷的PBS吹洗细胞3次，收取PBS清洗液置于离心管中，胰酶溶液消化贴壁，消化液收集于离心管中，1000 g/min离心5 min收集细胞弃去上清液，重新加入PBS（300-500 μL）分散细胞，流式细胞仪（Ex=490 nm，Em=512 nm）计数分析，计数细胞量为10000个，结果见图12。图12中（A）空白对照，1 h；（B）空白对照，4h；（C）普通脂质体1h，pH 7.4；（D）普通脂质体4h，pH 7.4；（E）普通脂质体1h，pH 6.4；（F）普通脂质体4h，pH 6.4；（G）PEtOz-脂质体1h，pH 7.4；（H）PEtOz-脂质体4h，pH 7.4；（M）PEtOz-脂质体1h，pH 6.4；（N）PEtOz-脂质体4h，pH 6.4。
结果表明：普通钙黄绿素脂质体在pH 7.4和pH6.4的细胞摄取量并无明显的区别，PEtOz-脂质体pH 6.4的细胞摄取量显著高于pH 7.4时的摄取量；随着培养时间的延长，普通钙黄绿素脂质体和PEtOz-脂质体进入细胞的量均有所增加，PEtOz-脂质体的细胞摄取率均显著高于普通脂质体。合成PEtOz-脂质不但不会阻碍脂质体被细胞摄取，反而对脂质体的细胞摄取有一定的促进作用，可以弥补PEG应用于纳米制剂时抑制细胞摄取的严重缺陷。
实验例7：激光共聚焦分析普通钙黄绿素脂质体和PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体体内细胞摄取情况
选择对数生长期并且状态良好的HeLa细胞进行实验，将细胞接种于盖有盖玻片的六孔板中（1×105），细胞培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后，换无血清培养液孵育10min，加入PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体和普通钙黄绿素脂质体（磷脂最终浓度为50μmol/L），37℃和4℃孵育培养4h后将培养液小心吸出，以预冷的PBS轻轻冲洗细胞除去未与细胞牢固结合的脂质体3次。每孔加2 ml DMEM培养液配制溶酶体染色剂（50 nM）染色60 min，PBS清洗2次，以DAPI染核15 min后PBS清洗2次，加入细胞固定液（2 ml/孔），放入培养箱10 min，固定细胞。载玻片滴入50 μl防淬灭液，将已固定好细胞的盖玻片用尖头镊子小心夹出，制成装片，用滤纸吸干多余液体。利用封片胶封片，低温4℃保存，以上过程应尽量避光进行，置于激光共聚焦显微镜(ECLIPSE-Ti激光扫描共聚焦显微镜，Nikon公司，日本)下观测（2000倍左右），并拍摄记录。
激光扫描共聚焦照片如图13所示：图中（A）PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体（B）普通钙黄绿素脂质体；绿色代表钙黄绿素，蓝色代表细胞核，红色代表溶酶体。由图13可知，普通钙黄绿素脂质体进入细胞后主要集中在溶酶体中，而PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体分布在整个细胞质中，说明PEtOz2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体经内吞作用进入细胞后，在核内体的低pH环境诱导下，脂质体膜与核内体膜融合，直接释放大部分药物至细胞浆，成功实现了核内体逃逸，避免进入溶酶体。结果充分说明PEtOz 2000-CHMC修饰钙黄绿素脂质体具有pH敏感性，其良好的核内体逃逸特性可以避免药物在溶酶体发生降解。
实验例8： MTT法测定DOX脂质体细胞毒性
取对数生长期的HeLa细胞，以pH 7.4和6.5的培养基分别将其接种于两个96孔板上（5×104），待完全贴壁生长24 h后，加入不同浓度普通阿霉素脂质体、PEtOz 2000-CHMC修饰阿霉素脂质体，培养24 h后倾去培养液，PBS清洗细胞2次，每孔加入100 μl培养液，然后加入MTT溶液（5mg/ml）10 μl，4 h后倾去培养液，加入150 μl DMSO，放入酶标仪震荡溶解结晶后，利用酶标仪于492 nm处测定OD值，计算各浓度的细胞存活率，结果如图14。由图14可知：不同培养环境对于普通脂质体组而言细胞作用无明显区别。但对于PEtOz-脂质体而言，pH为6.5时的细胞作用强于正常培养环境的细胞作用（P<0.01），说明低pH条件可能会促进PEtOz-脂质体更多地进入细胞，进而使DOX更好地发挥细胞毒作用。不同培养环境条件下，普通阿霉素脂质体组的细胞存活率均比PEtOz 2000-CHMC修饰阿霉素脂质体组高（P<0.01），进一步证明了PEtOz脂质的修饰会促进脂质体的细胞摄取
实验例9：普通钙黄绿素脂质体与PEtOz 2000-CHMC修饰的钙黄绿素脂质体不同pH条件下诱导红细胞血红素释放
分别配制阴性对照、阳性对照、平行对照及实验组样品，配制方法如下：
阴性对照：4ml不同pH缓冲溶液+500 μl10%新鲜人血红细胞混悬液+500μl生理盐水；
阳性对照：4.45ml缓冲溶液+500 μl10%新鲜人血红细胞混悬液+50μl10%Triton X-100溶液；
平行对照：4ml不同pH缓冲溶液+500 μl 10%新鲜人血红细胞混悬液+500μl普通钙黄绿素脂质体；
实验组：4ml不同pH缓冲溶液+500 μl10%新鲜人血红细胞混悬液+500μl聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体；
将试验样品37℃恒温孵育1 h，1368 g离心10 min，分别取等量上清液，加入100 μl 10%Triton X-100破乳以消除脂质体的干扰，于紫外可见分光光度计407 nm处测定吸光度，考察血红素释放情况，结果如图15所示。由图15可知，阳性对照组在不同pH条件下吸光度值均可达到最大，表明血红细胞完全破裂，血红素全部释放出来；与其他组相比，阴性对照组在不同pH条件下吸光度值均最小，表明血红细胞基本完好，血红素几乎没有释放；阳性对照组和阴性对照组的吸光度值几乎不随pH的变化而变化，表明阴性对照组和阳性对照组血红素的释放与pH无关。平行对照组在不同pH的吸光度与阴性对照无明显差异（P＞0.05），说明普通钙黄绿素脂质体几乎未与血红细胞膜发生融合，且随pH的变化，平行对照组的吸光度并未改变。与阴性对照组相比，实验组的血红素释放均有明显的增加，且随着pH的变化发生明显的改变。pH为7.4时，实验组血红素释放与阴性对照组和平行对照组无明显差异（P>0.05），pH为6.4时，实验组血红素的释放已经接近阳性对照组，说明聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇氯甲酸酯修饰的钙黄绿素脂质体在酸性条件下与红细胞膜发生一定程度的融合，导致血红素释放。
实验例10：普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体的体外释放
分别取1.0 ml普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体，与含90%人血浆的缓冲溶液混合，加至预处理过的透析袋（截留分子量1.2至2.4万）中，夹好后置于盛有缓冲溶液的烧杯内，于37 ℃水浴条件下恒速搅拌，分别于不同时间吸取透析液，同时补入等量缓冲溶液。于可见分光光度计485 nm处测定其吸光度A，计算透析液中的药物浓度C，并计算其累计释放率，绘制释放曲线图，如图16。由图16可知，聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体稳定性增强。
实验例11：普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体的钙离子稳定性
取普通钙黄绿素脂质体与本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体各0.1 ml，以不同浓度（2 mM、4 mM、6 mM）CaCl2溶液稀释相同倍数，37℃孵育，不同时间取样，于450 nm波长处分光光度计测定吸光度变化，如图17所示，其中A为普通钙黄绿素脂质体，B为PEtOz-CHEMS修饰钙黄绿素脂质体。由图17可知：普通钙黄绿素脂质体在低浓度（2 mM）CaCl2溶液中孵育30min吸光度变化就非常明显，而PEtOz-CHEMS修饰钙黄绿素脂质体在低浓度（2 mM）CaCl2溶液中孵育30min吸光度基本无变化，在较高浓度（4 mM、6 mM）CaCl2溶液条件下孵育，普通钙黄绿素脂质体的吸光度在较短时间内变化非常明显，而PEtOz-CHEMS修饰钙黄绿素脂质体基本无变化或变化较小。由此说明，PEtOz-CHEMS修饰钙黄绿素脂质体稳定性明显增强。
实验例12：本发明实施例1聚（2-乙基-2-恶唑啉）-胆固醇半琥珀酸酯修饰的钙黄绿素脂质体的pH敏感性
取PEtOz-CHEMS修饰脂质体0.1 ml，以不同pH（7.4、6.4、5.4、4.4）的缓冲溶液稀释，37℃孵育，不同时间取样，可见分光光度计于450 nm波长处测定吸光度，PEtOz-CHEMS修饰脂质体吸光度值随时间变化如图18所示。由图18可知，PEtOz-CHEMS修饰脂质体在pH 7.4的条件下吸光度随时间延长基本无变化， pH值越低，吸光度变化越明显，PEtOz-CHEMS修饰脂质体表现出非常明显的pH敏感性。
通过实验例1~12可以看出，本发明以来源广泛、理化性质稳定、价格低廉的胆固醇、α-生育酚及其衍生物作为与聚（2-乙基-2-恶唑啉）偶联的脂质部分，所生产的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质体衍生物在理化性质等于或优于现有聚（2-乙基-2-恶唑啉）-DSPE的前提下，成本大幅度降低。
Claims (3)
1.一种聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物，其特征在于通式如下：
式中：
n为1-500的整数；
R1为甲基或羟基；
g为醚键或酯键；
R2为胆固醇、胆固醇甲酰氯、胆固醇半琥珀酸酯、α-生育酚或α-生育酚半琥珀酸酯。
2. 一种如权利要求1所述的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：在避光的容器中加入端基为甲基和羟基的聚（2-乙基-2-恶唑啉）及R2，聚（2-乙基-2-恶唑啉）与R2的摩尔比为1：1.2-10，在氮气保护下以反应物5-50体积倍量的二氯甲烷为反应溶剂，以三乙胺和4-二甲基氨基吡啶为催化剂，室温反应2-72 h，旋蒸除去有机溶剂，得到粗产物；将得到的粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸清洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为1-20：1，收集洗脱液，旋蒸得到白色粉末状的聚合物。
3. 一种如权利要求1所述的聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：在避光的容器中加入端基为甲基和羟基的聚（2-乙基-2-恶唑啉）及R2，聚（2-乙基-2-恶唑啉）与R2的摩尔比为1：1.2-10，以4-二甲基氨基吡啶为催化剂，以反应物5-50体积倍量的二氯甲烷为反应溶剂，加入二环己基碳二亚胺，过滤，得到粗产物溶液，所述粗产物溶液经减压除去反应溶剂后，得到粗产物；得到的粗产物分别以水、饱和氯化钠和1.0 M盐酸清洗除去副产物，无水硫酸镁进行干燥；采用柱层析进行分离提纯，以石油醚湿法上柱，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇混合溶液，二氯甲烷与甲醇的体积比为1-20：1，收集洗脱液，旋蒸得到白色粉末状的聚合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102230198A CN103319710A (zh) | 2013-06-06 | 2013-06-06 | 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102230198A CN103319710A (zh) | 2013-06-06 | 2013-06-06 | 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103319710A true CN103319710A (zh) | 2013-09-25 |
Family
ID=49188787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013102230198A Pending CN103319710A (zh) | 2013-06-06 | 2013-06-06 | 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103319710A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110862536A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-06 | 辽宁师范大学 | 一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途 |
| CN112618487A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-04-09 | 西安医学院 | 一种血栓靶向长循环聚阳离子胶束及其制备方法和应用 |
| CN114940756A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 北京清科胜因生物科技有限公司 | 一种聚（2-噁唑啉）脂质与脂质纳米颗粒及应用 |
| WO2023247064A1 (de) * | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Next Generation Pharma Polymers Gmbh | Poly(oxazolin)- und poly(oxazin)-basierte lipide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102604083A (zh) * | 2011-01-18 | 2012-07-25 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 聚合物修饰的脂质材料及其用途 |
-
2013
- 2013-06-06 CN CN2013102230198A patent/CN103319710A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102604083A (zh) * | 2011-01-18 | 2012-07-25 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 聚合物修饰的脂质材料及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 于涛: "PEOZ的合成及其修饰Cu-ZnSOD模拟物脂质体的初步研究", 《中国学位论文全文数据库》, 26 April 2013 (2013-04-26), pages 15 - 21 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110862536A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-06 | 辽宁师范大学 | 一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途 |
| CN110862536B (zh) * | 2019-11-29 | 2022-06-14 | 辽宁师范大学 | 一种pH敏感脂质材料及其制备方法和用途 |
| CN112618487A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-04-09 | 西安医学院 | 一种血栓靶向长循环聚阳离子胶束及其制备方法和应用 |
| CN114940756A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 北京清科胜因生物科技有限公司 | 一种聚（2-噁唑啉）脂质与脂质纳米颗粒及应用 |
| CN114940756B (zh) * | 2022-06-02 | 2023-11-07 | 北京清科胜因生物科技有限公司 | 一种聚（2-噁唑啉）脂质与脂质纳米颗粒及应用 |
| WO2023247064A1 (de) * | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Next Generation Pharma Polymers Gmbh | Poly(oxazolin)- und poly(oxazin)-basierte lipide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101791411B (zh) | 两亲性多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用 | |
| CN105283441B (zh) | 用于递送药剂的二硫化合物 | |
| CN103705940A (zh) | 一种天然活性药物-多糖靶向复合物的制备及其抗肿瘤的应用 | |
| KR102237234B1 (ko) | 간 표적성을 갖는 유전자/약물을 공동으로 운반하는 통합식 나노 시스템 및 이의 제조 방법 | |
| CN105999299B (zh) | 一种小分子胶束纳米载药系统及其制备方法与应用 | |
| CN107674210B (zh) | 三苯基膦-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用 | |
| CN110433292B (zh) | 一种双靶向材料及其在药物传递中的应用 | |
| CN104548109B (zh) | 生物医学组合物 | |
| CN108578711A (zh) | 一种乙酰化糖酯-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺共轭物及其制备方法与应用 | |
| Liu et al. | Development of octreotide-conjugated polymeric prodrug of bufalin for targeted delivery to somatostatin receptor 2 overexpressing breast cancer in vitro and in vivo | |
| CN103319710A (zh) | 聚（2-乙基-2-恶唑啉）-脂质衍生物及制备方法 | |
| CN109350598A (zh) | 糖-聚乙二醇-dspe偶联化合物及其制备方法和应用 | |
| CN102440961B (zh) | 一种具有酸敏亚表层的靶向聚合物胶束及其制备方法 | |
| CN107266384B (zh) | 基于2-氨基十六烷酸的n-羧基内酸酐单体和聚氨基酸及其制备方法 | |
| CN105860057A (zh) | 基于疏水功能性小分子-亲水聚氨基酸的生物可降解聚合物及其制备方法和应用 | |
| US10512605B2 (en) | Integrated nano system for liver-targeting co-delivery of genes/drugs and preparation method | |
| CN111001006A (zh) | 葫芦素b和氧化响应抗肿瘤前药共载仿生纳米粒 | |
| CN107375199A (zh) | 一种聚合氯喹的纳米凝胶递送系统及其制备方法 | |
| CN104774329B (zh) | 用于抗肿瘤药物递送的酸敏感高分子载体及制备方法和应用 | |
| CN104208704A (zh) | 一种pH敏感的碳纳米管靶向递药体系的制备方法 | |
| CN105055315A (zh) | 一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 | |
| CN110917139A (zh) | 多分枝生物素修饰的乳腺癌靶向脂质体的制备和应用 | |
| CN109010827A (zh) | 苯丁酸氮芥-聚多巴胺前药纳米粒子的抗肿瘤应用 | |
| CN110840844A (zh) | 生物素与葡萄糖共同修饰的乳腺癌靶向脂质体的制备和应用 | |
| CN110522923A (zh) | 果糖和rgd肽共修饰的双重靶向三阴性乳腺癌的脂质材料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Xu Huan Inventor after: Li Yan Inventor after: Ye Feifei Inventor after: Hu Meina Inventor after: Zhang Wei Inventor after: Yu Xiu Inventor before: Xu Huan |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: XU HUAN TO: XU HUAN LI YAN YE FEIFEI HU MEINA ZHANG WEI YU XIU |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130925 |