CN104548109B - 生物医学组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物医学组合物，包括：透明质酸；经修饰的组氨酸；以及聚合物或C4‑C20烷类，其中该经修饰的组氨酸与该聚合物或C4‑C20烷类，接枝于该透明质酸的至少一个伯羟基(primary hydroxyl group)上，以与该透明质酸形成透明质酸衍生物，且其中该经修饰的组氨酸的接枝率为约1‑100%，而该聚合物或C4‑C20烷类的接枝率为约0‑40%。

Description

生物医学组合物
技术领域
本发明涉及一种生物医学组合物，且特别涉及一种生物医学组合物 (biomedicalcomposition)，其包含透明质酸衍生物，具有接枝于至少一个伯羟基(primary hydroxylgroup)的经修饰组氨 酸。
背景技术
目前已上市的纳米载体抗癌药物皆有药物释放率太慢的问题，使得其虽然可以降低抗癌药物的副作用，但并无法明显提高药物的治疗效果。
而由于肿瘤组织与发炎组织由于其新生血管较不完整，因此造成经由细胞代谢的产物无法顺利排至全身血液循环，所以此类组织的酸碱值较一般正常组织来的低，约6.8-7.2左右。此外，胞内的核内体(endosome)与溶酶体 (lysosome)环境的酸碱值约为pH4.0-6.5左右，若能调控纳米载体在这些环性下能够快速释放，将可解决现有药物载体药物释放率太低的问题；同时针对某些生物技术类药物如胜肽、蛋白质、与基因片段等，将这类生物技术药物于核内体中释放至细胞质中，而不被传送至溶酶体中分解，也将能提升此类药物的活性。
透明质酸是一种由双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺所组成高分子的聚合物。于透明质酸中，D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间是藉由β -1,3-配糖键来键结，而双糖单位之间则藉由β-1,4-配糖键来键结。一般而言，透明质酸的分子量从5千到2千万道尔顿。商品化的透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠(Sodium hyaluronate)。
而天然透明质酸为水溶性高分子，具有多种适宜作为药物载体的优良特性，例如，生物兼容性，非免疫原性，在体内可由酶作用而天然降解，并携带大量的-OH、-COOH和-CH，OH等多种功能基团，可进行共价修饰。因此，由上述可知，透明质酸可作为优良的药物载体。
目前亟需，生物兼容性高，且可将其设计在适合的环境下才快速释放药物的新颖药物传送系统。
发明内容
本发明提供一种生物医学组合物，包括：透明质酸；经修饰的组氨 酸；以及聚合物或C4-C20烷类，其中该经修饰的组氨 酸，与该聚合物或C4-C20烷类，接枝于该透明质酸的至少一个伯羟基(primary hydroxyl group)上以与该透明质酸形成透明质酸衍生物，且其中该经修饰的组氨 酸的接枝率为约 1-100%，而该聚合物或C4-C20烷类的接枝率为约0-40%。
附图说明
图1A示出了HA16k-g-40%BocHis材料在pH7.4的临界微胞浓度结果。
图1B示出了HA16k-g-40%BocHis材料在pH5.0的临界微胞浓度结果。
图2A示出了HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH7.4的临界微胞浓度结果。
图2B示出了HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH5.0的临界微胞浓度结果。
图3示出了以激光散射粒径分析仪测定HA16k-g-40%BocHis材料于pH 8、pH7.4、pH6.5、pH6和pH5下所形成的微胞粒径的结果。
图4示出了透明质酸衍生物的理论解离方程式。
图5示出了透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体(配方DHC1902)的穿透式电子显微镜照片。
图6示出了将配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体在pH7.4与pH5.0进行累计药物释放分析的结果。
图7示出了将配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体以及阿霉素与微脂体包覆的阿霉素以U87MC细胞进行细胞毒性分析的结果。
图8示出了LC-MS/MS分析配方DHC2101与DHC2501所分别形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体与阿霉素于大鼠中的血液浓度的结果。
图9示出了测定以配方DHC2101所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体(5mg阿霉素/kg)、配方DHC2501所分别形成的透明质酸衍生物/ 阿霉素纳米复合载体(5mg阿霉素/kg)或PBS处理经U87-MG人类多型性神经胶母细胞瘤细胞株植入的裸小鼠的肿瘤大小的结果。
图10示出了透明质酸/DACHPt(PtHC101)与透明质酸衍生物/DACHPt 纳米复合载体(PtHC305)的穿透式电子显微镜照片。
图11示出了将配方PtHC101所形成的透明质酸/DACHPt纳米复合载体、配方PtHC201、PtHC301与PtHC401所分别形成的透明质酸衍生物 /DACHPt纳米复合载体在pH7.4进行累计药物释放分析的结果。
图12示出了以感应偶合电浆-原子放射光谱(Inductively coupled plasma withatomic emission spectroscopy,ICP-AES)分析奥沙利铂(oxaliplatin)、配方 PtHC101所形成的透明质酸/DACHPt纳米复合载体、配方PtHC305与配方 PtHC603所分别形成的透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体于大鼠中的血液浓度的结果。以及
图13示出了测定以与配方PtHC604所形成的透明质酸衍生物/DACHPt 纳米复合载体(2mg Pt/kg)、奥沙利铂(2mg Pt/kg)或10%蔗糖处理经HT-29 人类大肠癌细胞株植入的裸小鼠的肿瘤大小的结果。
具体实施方式
在本发明一实施例中，本发明提供一包含透明质酸衍生物的生物医学组合物。
本发明生物医学组合物可包括，但不限于，透明质酸、经修饰的组氨 酸，以及聚合物或C4-C20烷类，其中上述经修饰的组氨 酸，与上述聚合物或C4-C20烷类，接枝于透明质酸的至少一个伯羟基上，且其中经修饰的组氨 酸与聚合物或C4-C20烷类与该透明质酸形成透明质酸衍生物。
上述经修饰的组氨 酸对透明质酸的接枝率可为约1-100%，然需注意的是，上述聚合物与C4-C20烷类对透明质酸的接枝率则为约0-40%。因此，可以了解的是，上述透明质酸衍生物为可具有或不具有聚合物或C4-C20烷类接枝于其上。换言的，本发明的生物医学组合物为，视需要而定包括聚合物或 C4-C20烷类。
在一实施例中，经修饰的组氨 酸的接枝率为约1-100%，而该聚合物或 C4-C20烷类的接枝率为0，即，上述透明质酸衍生物为不具有聚合物或C4-C20烷类接枝于其上。于此实施例中，上述透明质酸衍生物的示例分子式可如以下方式(I)所示，但不限于此：
R1可为经修饰的组氨 酸。而a可为约15-1200的正整数，但不限于此。
在另一实施例中，上述透明质酸衍生物为具有聚合物或C4-C20烷类接枝于其上，而于此实施例中经修饰的组氨 酸的接枝率可为约1-100%，而该聚合物或C4-C20烷类的接枝率可为1-40%。于此实施例中，上述透明质酸衍生物的示例分子式可如以下方式(II)所示，但不限于此：
R1可为经修饰的组氨 酸，又R2可为聚合物或C4-C20烷类。此外，p与q 为正整数，且p与q的比值可介于0.1-100之间，但不限于此。在一实施例中，p与q的比值可介于0.1-20之间。
在一实施例中，于其上接枝上述经修饰的组氨 酸与上述聚合物或C4-C20烷类的上述透明质酸的至少一个伯羟基，可包括，羟基，其位于上述透明质酸中的至少一个双糖单位的N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上，但不限于此。
在一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述透明质酸的分子量为约7,000-500,000。在另一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述透明质酸的分子量为约7,000-350,000。
于本发明生物医学组合物中，适合的经修饰的组氨 酸的例子可包括，例如Boc-组氨 酸(Boc-histidine)、Cbz-组氨 酸(Cbz-histidine)、Fmoc-组氨 酸 (Fmoc-histidine)与Ac-组氨 酸(Ac-histidine)等，但不限于此。
另外，于本发明生物医学组合物中，聚合物可包括聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)、聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(poly lactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acido,PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)等，但不限于此。
再者，于本发明生物医学组合物中，C4-C20烷类的例子可包括，但不限于、C5H11、C7H15或C9H19、C11H23等。
在一实施例中，于本发明生物医学组合物中，经修饰的组氨 酸可为Boc- 组氨酸。又，于一特定实施例中，Boc-组氨 酸的接枝率可为约1-100%，而聚合物或C4-C20烷类的接枝率则为约0。
又于一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述聚合物可为聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量可为约300-10000。而于此实施例中，聚乙二醇的接枝率可为约1-40%。于一特定实施例中，于本发明生物医学组合物中，经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，上述聚合物可为聚乙二醇，且其中Boc-组胺酸的接枝率为约1-80%，而聚乙二醇的接枝率为约1-30%。
于一实施例中，于本发明生物医学组合物中，C4-C20烷类可为C11H23，而于此实施例中，C11H23的接枝率可为约1-40%。于一特定实施例中，于本发明生物医学组合物中，经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，C4-C20烷类为 C11H23，且其中Boc-组氨 酸的接枝率为约1-80%，而C11H23烷的接枝率为约 1-30%。
此外，于本发明生物医学组合物中，由经修饰的组氨 酸与透明质酸所形成或由经修饰的组氨 酸及聚合物或C4-C20烷类与透明质酸所形成的上述透明质酸衍生物的分子量可为约7,000-1,500,000。在一实施例中，上述透明质酸衍生物的分子量可为约7,000-1,200,000。在另一实施例中，上述透明质酸衍生物的分子量可为约7,000-800,000。在又另一实施例中，上述透明质酸衍生物的分子量可为约7,000-600,000。
在本发明另一实施例中，上述本发明生物医学组合物还可更包括在水中带正电的活性成分。于此实施例中，上述在水中带正电的活性成分与上述透明质酸衍生物的羧基正负电相吸，又，利用修饰于透明质酸上的组氨 酸衍生物产生的疏水作用力可使活性成分聚集，进而使上述在水中带正电的活性成分包覆于上述透明质酸衍生物中。
在一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述透明质酸衍生物与上述在水中带正电的活性成分的重量比为约1.25:1-50:1。在一实施例中，上述透明质酸衍生物与上述在水中带正电的活性成分的重量比为约1.25:1-25:1。在另一实施例中，上述透明质酸衍生物与上述在水中带正电的活性成分的重量比为约2:1-25:1。在又另一实施例中，上述透明质酸衍生物与上述在水中带正电的活性成分的重量比为约2:1-10:1。
上述在水中带正电的活性成分可包括一药物(如抗生素、铂金类药物等)、核苷酸物质、胜肽或蛋白质等，但不限于此。
在一实施例中，在水中带正电的活性成分的例子可包括，但不限于阿霉素(doxorubicin)、依立替康(irinotecan)、庆大霉素(gentamicin)、铂金化合物等。
铂金化合物的例子，可包括，但不限于，(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂 (Dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum,DACHPt)、顺铂(cisplatin)或奥沙利铂(oxaliplatin)等。
于一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述经修饰的组氨 酸可为Boc-组氨酸，而上述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为约0，即，上述透明质酸衍生物为仅具有Boc-组氨酸接枝于其上，且在水中带正电的活性成分可为阿霉素、依立替康、庆大霉素或铂金化合物(如，(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂)。于此实施例中，上述经修饰的组氨 酸所接枝于其上的上述透明质酸的至少一个伯羟基，可包括，羟基，其位于上述透明质酸的至少一双糖单位的 N-乙酰葡糖胺的第5个碳上的羟基，但不限于此。又于此实施例中，Boc- 组氨 酸的接枝率可为约1-100%，而透明质酸衍生物与在水中带正电的活性成分的重量比可为约1.25:1-25:1。
于另一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨酸，而上述聚合物为聚乙二醇，且在水中带正电的活性成分为阿霉素、依立替康、庆大霉素或铂金化合物(如，(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂)。于此实施例中，上述经修饰的组氨 酸所接枝于其上的上述透明质酸的至少一个伯羟基，可包括，羟基，其位于上述透明质酸中的至少一个双糖单位的 N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上，但不限于此。又于此实施例中，Boc-组胺酸的接枝率可为约1-80%，聚乙二醇的接枝率为1-30%，而透明质酸衍生物与在水中带正电的活性成分的重量比可为约3:1-50:1。
在又另一实施例中，于本发明生物医学组合物中，上述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，而上述C4-C20烷类为C11H23，且在水中带正电的活性成分为阿霉素或(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂。于此实施例中，上述经修饰的组胺酸所接枝于其上的上述透明质酸的至少一个伯羟基，可包括，羟基，其位于上述透明质酸的至少一双糖单位的N-乙酰葡糖胺的第5个碳上的羟基，但不限于此。又于此实施例中，Boc-组氨 酸的接枝率可为约1-80%，C11H23的接枝率为1-30%，而透明质酸衍生物与在水中带正电的活性成分的重量比可为约2.5:1-4:1。
此外，若于本发明生物医学组合物中所包含的在水中带正电的活性成分为药物，则本发明生物医学组合物可为医药组合物或可为药物释放系统(drug delivery system)。
上述药物释放系统可为微胞形式，而上述微胞的粒径可为约100-1000 nm。在一实施例中上述微胞的粒径可为约100-800nm。在另一实施例中，上述微胞的粒径可为约100-500nm。在又另一实施例中，上述微胞的粒径可为约100-300nm。
上述医药组合物给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalation spray) 或藉由植入贮存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下 (subcutaneous)、皮内(intracutaneous)、静脉内(intravenous)、肌肉内 (intramuscular)、关节内(intraarticular)、动脉(intraarterial)、滑囊(腔)内 (intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内 (intralesional)注射以及灌注技术。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配制成剂型(dosage form)。
口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。
实施例
1.透明质酸衍生物的制备
A.接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物(HA-g-BocHis)的制备
(a)接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的合成机制
接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的合成机制如下方式(III)所示：
(b)接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法
接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法如下所述：
(1)将HA-TBA(1当量，根据计算于透明质酸上的伯羟基来计算)于真空室温干燥16小时，快速秤取所需量并置于夹层式玻璃反应槽中，且于夹层式玻璃反应槽中架设机械搅拌装置，之后将夹层式玻璃反应槽真空除气30 分钟。
(2)回填氮气，加入无水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)以形成一混合物，于玻璃反应槽夹层通入45±5℃循环水，将混合物以转速250rpm搅拌4小时至完全溶解备用。
(3)秤取Boc-His-OH及DMAP于双颈瓶抽真空5分钟后通入氮气，加入0.5M Boc-His-OH均匀搅拌30分钟，取EDC·HCl固体快速倒入双颈瓶，于35±5℃反应4小时以活化Boc-His-OH。
(4)将活化后的Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕动泵以流速25 mL/分钟转移至玻璃反应槽中。加料完成后，提高机械搅拌转速至300rpm 反应30分钟，使整体溶液快速均匀混合，再将机械搅拌转速降至250rpm 持续反应24小时。
(5)反应自然回到室温后，装于透析袋(Spectra/4Dialysis Membrane,MWCO:12-14,000,Flat Width:75mm)。
(6)以45±5℃的DMAc(20X DMAc体积)连续透析40小时，并于第16 小时更换透析液。
(7)转置于25±5℃的去离子水(100X DMAc体积)连续透析72小时，于第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小时更新透析液。
(8)取长60cm、直径5cm的玻璃层析管柱，并以玻璃棉塞住下方出口。取钠离子交换树脂(ROHM HAAS,食品级，520g)加去离子水(200mL)搅拌均匀后倒入层析管柱中，并以每次200mL去离子水清洗管柱中的树脂，清洗五次以上，直至管柱流出液体为透明无色，完成清洗钠离子交换树脂。
(9)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉过滤除去微量果冻状固体，收集滤液，以流速150～200mL/小时通过钠离子交换树脂(以一支钠离子交换树脂管柱处理15g HA16k-TBA计算所需管柱数量)，待HA水溶液完全进入树脂后，再以去离子水(200mL)冲提管柱3次，洗出残留于树脂上的HA材料，得到HA-g-BocHis水溶液。
(10)真空浓缩(<1mmHg，30±5℃)至浓度约为3wt%的水溶液，确认溶液pH值后置于-20℃使其结冰。
(11)利用冷冻干燥法移除水份，得到完全干燥的HA-g-BocHis材料。
根据上述的制备方法，调整HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP的当量比，即可得到不同BocHis接枝率的HA-g-BocHis材料。以不同的HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP的当量比所获得的不同BocHis接枝率的 HA-g-BocHis材料的接枝率与产率如表1所示。
表1：以不同的HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP的当量比所获得的 HA-g-BocHis材料的接枝率与产率
B.接枝Boc组氨 酸与聚乙二醇的透明质酸衍生物 (HA-g-(BocHis-co-SAmPEG))的制备
(a)接枝Boc组氨 酸与聚乙二醇的透明质酸衍生物的合成机制
接枝Boc组氨 酸与聚乙二醇的透明质酸衍生物的合成机制如下方式(IV) 所示：
(b)接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法
接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法如下所述：
(1)将HA-TBA(1当量，根据计算于透明质酸上的伯羟基来计算)于真空室温干燥16小时，快速秤取所需量并置于夹层式玻璃反应槽中，且于夹层式玻璃反应槽中架设机械搅拌装置，之后将夹层式玻璃反应槽真空除气30 分钟。
(2)回填氮气，加入无水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)以形成一混合物，于玻璃反应槽夹层通入45±5℃循环水，将混合物以转速250rpm搅拌4小时至完全溶解备用。
(3)秤取Boc-His-OH及DMAP于双颈瓶抽真空5分钟后通入氮气，加入DMAc(0.5Mfor Boc-His-OH)均匀搅拌30分钟，取EDC·HCl固体快速倒入双颈瓶，于35±5℃反应4小时以活化Boc-His-OH。
(4)将活化后的Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕动泵以流速1mL/ 分钟转移至玻璃反应槽中，加料完成后，提高机械搅拌转速至300rpm反应 30分钟，使整体溶液快速均匀混合，再将机械搅拌转速降至250rpm持续反应24小时。
(5)秤取mPEG-SA-COOH于双颈瓶，抽真空5分钟后通入氮气，加入 DMAc(0.1M formPEG1900-SA-COOH)于50±5℃搅拌10分钟使的均匀溶解，降温至30℃，加入DMAP搅拌10分钟，取EDC·HCl固体快速倒入双颈瓶，于35±5℃反应4小时以活化mPEG-SA-COOH。
(6)将活化后的mPEG-SA-COL(L=leaving group)溶液用蠕动泵以流速 1mL/min转移至玻璃反应槽中，加料完成后，提高机械搅拌转速至300rpm 反应30分钟，使整体溶液快速均匀混合，再将机械搅拌转速降至250rpm 持续反应40小时。
(7)反应自然回到室温后，装于透析袋(Spectra/4Dialysis Membrane,MWCO:12-14,000,Flat Width:75mm)。
(8)以45±5℃的DMAc(20X DMAc体积)连续透析40小时，并于第16 小时更换透析液。
(9)转置于25±5℃的去离子水(100X DMAc体积)连续透析72小时，于第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小时更新透析液。
(10)取长60cm、直径5cm的玻璃层析管柱，并以玻璃棉塞住下方出口。取钠离子交换树脂(ROHM HAAS,食品级,520g)加去离子水(200mL) 搅拌均匀后倒入层析管柱中，并以每次200mL去离子水清洗管柱中的树脂，清洗五次以上，直至管柱流出液体为透明无色，完成清洗钠离子交换树脂。
(11)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉过滤除去微量果冻状固体，收集滤液，以流速150～200mL/小时通过钠离子交换树脂(以一支钠离子交换树脂管柱处理15g HA16k-TBA计算所需管柱数量)，待HA水溶液完全进入树脂后，再以去离子水(200mL)冲提管柱3次，洗出残留于树脂上的HA材料，得到HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)水溶液。
(12)真空浓缩(<1mmHg,30±5℃)至完全干燥，取出固体产物，置于圆型滤筒，氮气下以二氯甲烷连续萃洗6小时(循环冷却水温度5℃)，取出固体使残留二氯甲烷自然挥发干燥，加入去离子水均匀溶解成浓度约为3wt% 的水溶液，确认溶液pH值后置于-20℃使其结冰。
(13)利用冷冻干燥法移除水份，得到完全干燥的 HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料。
根据上述的制备方法，调整HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP与HA /mPEG-SA-COOH/EDC·HCl/DMAP的当量比，即可得到不同BocHis与PEG接枝率的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料。以不同的 HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP与HA/mPEG-SA-COOH/EDC·HCl/DMAP 的当量比所获得的不同BocHis与PEG接枝率的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG) 材料的接枝率与产率如表2所示。
表2：以不同的HA/Boc-His-OH/EDC·HCl/DMAP与HA/ mPEG-SA-COOH/EDC·HCl/DMAP的当量所获得的 HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料的接枝率与产率
aBoc-His-L和mPEG1900-SA-COL是以快速进料(25mL/min)与 HA-TBA混合。
bBoc-His-L和mPEG1900-SA-COL是以慢速进料(1mL分钟)与 HA-TBA混合。
C.接枝Boc组氨 酸与C11H23的透明质酸衍生物(HA-g-(BocHis-co-C11)) 的制备
(a)接枝Boc组氨 酸与C11H23的透明质酸衍生物的合成机制
接枝Boc组氨 酸与C11H23的透明质酸衍生物的合成机制如下方式(V)所示：
(b)接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法
接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的制备方法如下所述：
(1)将HA-TBA(1当量，根据计算于透明质酸上的伯羟基来计算)于真空室温干燥16小时，快速秤取所需量并置于夹层式玻璃反应槽中，且于夹层式玻璃反应槽中架设机械搅拌装置，之后将夹层式玻璃反应槽真空除气30 分钟。
(2)回填氮气，加入无水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)，于玻璃反应槽夹层通入45±5℃循环水，以转速250rpm搅拌4小时至完全溶解备用。
(3)秤取Boc-His-OH(1.1当量)及DMAP(1当量)于双颈瓶抽真空5分钟后通入氮气，加入0.5M Boc-His-OH均匀搅拌30分钟，取EDC·HCl固体(1 当量)快速倒入双颈瓶，于35±5℃反应4小时以活化Boc-His-OH。
(4)将活化后的Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕动泵以流速25 mL/分钟转移至玻璃反应槽中，加料完成后，提高机械搅拌转速至300rpm 反应30分钟，使整体溶液快速均匀混合，再将机械搅拌转速降至250rpm 持续反应24小时。
(5)秤取n-C11H23-COOH(0.165当量)及DMAP(0.15当量)于双颈瓶抽真空5分钟后通入氮气，加入0.5M Boc-His-OH均匀搅拌30分钟，取EDC·HCl 固体(0.15当量)快速倒入双颈瓶，于35±5℃反应4小时以活化 n-C11H23-COOH。
(6)将活化后的n-C11H23-COL(L=leaving group)溶液用蠕动泵以流速25 mL/分钟转移至玻璃反应槽中，加料完成后，提高机械搅拌转速至300rpm 反应30分钟，使整体溶液快速均匀混合，再将机械搅拌转速降至250rpm 持续反应40小时。
(7)反应自然回到室温后，装于透析袋(Spectra/4Dialysis Membrane,MWCO:12-14,000,Flat Width:75mm)。
(8)以45±5℃的DMAc(20X DMAc体积)连续透析40小时，并于第 16小时更换透析液。
(9)转置于25±5℃的去离子水(100X DMAc体积)连续透析72小时，于第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小时更新透析液。
(10)取长60cm、直径5cm的玻璃层析管柱，并以玻璃棉塞住下方出口。取钠离子交换树脂(ROHM HAAS,食品级,520g)加去离子水(200mL) 搅拌均匀后倒入层析管柱中，并以每次200mL去离子水清洗管柱中的树脂，清洗五次以上，直至管柱流出液体为透明无色，完成清洗钠离子交换树脂。
(11)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉过滤除去微量果冻状固体，收集滤液，以流速150～200mL/小时通过钠离子交换树脂(以一支钠离子交换树脂管柱处理15g HA16k-TBA计算所需管柱数量)，待HA水溶液完全进入树脂后，再以去离子水(200mL)冲提管柱3次，洗出残留于树脂上的HA材料，得到HA-g-(BocHis-co-C11)水溶液。
(12)真空浓缩(<1mmHg,30±5℃)至浓度约为3wt%的水溶液，确认溶液pH值后置于-20℃使其结冰。
13.利用冷冻干燥法移除水份，得到完全干燥的 HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料，产率62%。
2.Histidine-based HA材料的酸碱应答性质分析
A.临界微胞浓度(critical micelle concentration,CMC)
当材料在水中浓度高于临界微胞浓度时即会形成微胞，而由于焦油脑 (pyrene)具有对于微环境亲疏水变化敏感的特性，因此当微胞材料在水中浓度高于其临界微胞浓度时，焦油脑荧光放光强度会急遽增强。于本实验中，根据上述焦油脑的特性，来测微胞材料的临界浓度。测试方法如下所述。
将各测试样品配制成1mg/mL水溶液，并以对半稀释法将各样品配制成具有以下各浓度的水溶液4.5mL，而上述浓度由小至大分别为：(1)0.00195 mg/mL；(2)0.00391mg/mL；(3)0.00781mg/mL；(4)0.01563mg/mL；(5) 0.03125mg/mL；(6)0.0625mg/mL；(7)0.125mg/mL；(8)0.25mg/mL；(9)0.5 mg/mL；与(10)1mg/mL。之后将15μl的1.8X10-4M焦油脑丙酮溶液分别加入上述10个样品溶液中，混合均匀后避光静置至隔天。然后将溶液于室温抽真空20分钟，使丙酮挥发后测定焦油脑荧光放光强度以测定样本的临界微胞浓度。
于荧光强度测定方面，设定激发波长为339nm，放光光谱扫描360～500 nm，并以最大放光波长Imax(即I379nm)的放光强度对材料浓度log值作图，即可求得微胞材料的临界微胞浓度。
(1)接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物的临界浓度
将上方获得的接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物，HA16k-g-40%BocHis 材料，以上述方法来测定临界微胞浓度。
结果显示BocHis的疏水性质提供材料在水溶液中形成微胞的可能。又， HA16k-g-40%BocHis材料在pH8.0、7.4、6.5、6.0与5.0的临界微胞浓度分别为0.11、0.10、0.10、0.11、0.18mg/mL(n=2)(参见表3)，而上述结果证实HA16k-g-40%BocHis材料的微胞结构在酸性环境较不稳定。而 HA16k-g-40%BocHis材料在pH7.4与5.0的临界微胞浓度测定图分别如图1A与图1B所示。
表3：HA16k-g-40%BocHis材料在不同值环境的的临界微胞浓度
pH 临界微胞浓度(mg/mL)
8.0 0.11±0.01
7.4 0.10±0.01
6.5 0.10±0.01
6.0 0.11±0.01
5.0 0.18±0.01
(2)接枝Boc组氨 酸与C11H23的透明质酸衍生物的临界浓度
将上方获得的接枝Boc组氨 酸的透明质酸衍生物， HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料，以上述方法来测定临界微胞浓度。
HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH7.4与5.0的临界微胞浓度分别为0.12与0.18mg/mL(参见表4)，而上述结果证实 HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料微胞结构在酸性环境较不稳定，与上述 HA16k-g-40%BocHis材料结果一致。而HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH7.4与5.0的临界微胞浓度测定图分别如图2A与图2B所示。
表4：HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)在不同值环境的的临界微胞浓度
pH 临界微胞浓度(mg/mL)
7.4 0.12±0.01
5.0 0.18±0.01
B.微胞粒径
将HA16k-g-40%BocHis材料分别溶解于pH8、pH7.4、pH6.5、pH6和 pH5的PBS缓冲溶液。接着将pyrene分别加入含HA16k-g-40%BocHis材料的上述PBS缓冲溶液中并与其混合后静置。然后将所获得的溶液经0.45μm 过滤膜过滤后再静置约3小时。的后以激光散射粒径分析仪测得各pH下的微胞粒径。结果如图3所示。
根据图3可知，材料在pH8.0→6.0过程，粒径分布朝向递增趋势。
C.pKa电位滴定
本发明的透明质酸衍生物的理论解离方程式如图4所示。将不同接枝率的HA-g-BocHis与不同接枝率的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料进行pKa 电位滴定，结果如表5所示。
表5：不同接枝率的HA-g-BocHis材料与不同接枝率的 HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料进行pKa电位滴定的结果
根据表5可知，HA-g-BocHis与HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料皆具有两个pKa值，其一为HA-COOH的pKa1及His的pKa2，而此说明材料在 pH2.5～4.5与pH6～8将因质子化或去质子化而发生电荷性质的改变。
3.制备透明质酸衍生物/药物纳米复合载体
将透明质酸衍生物与药物溶液(阿霉素(doxorubicin)、依立替康 (irinotecan)、庆大霉素(gentamicin)或DACHPt)以磁石搅拌反应4-72小时以形成一混合物并使药物被包覆于透明质酸衍生物以形成透明质酸衍生物/药物纳米复合载体中。将上述混合物倒入MWCO3,500的透析袋中对水进行透析24小时以移除未包覆于透明质酸衍生物中的药物，并将在藉此获得的溶液中所形成的透明质酸衍生物/药物纳米复合载体进行粒径配方性质分析。
由不同透明质酸衍生物与阿霉素所形成的复合载体的配方如表6所示、由不同透明质酸衍生物与依立替康所形成的复合载体的配方如表7所示、由不同透明质酸衍生物与庆大霉素所形成的复合载体的配方如表8所示，而由不同透明质酸衍生物与DACHPt所形成的复合载体的配方如表9所示。
表6：由不同透明质酸衍生物与阿霉素所形成的复合载体的配方
表7:由不同透明质酸衍生物与依立替康所形成的复合载体的配方
表8:由不同透明质酸衍生物与庆大霉素所形成的复合载体的配方
表9:由不同透明质酸衍生物与DACHPt所形成的复合载体的配方
4.透明质酸衍生物/药物纳米复合载体的特性分析
A.透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体
(1)穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)
将透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体(配方编号DHC1902)以穿透式电子显微镜进行观察并照相，结果如图5所示。
由图5可得知，透明质酸衍生物可良好包覆阿霉素并形成微胞。
(2)pH值对于药物释放的影响
分别将配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体在pH7.4与pH5.0进行累计药物释放分析，结果如图6所示。而累计药物释放分析的详细实验方法如下所述。
将500μl的配方置入透析袋(MWCO3.5kD)中。之后将透析袋两端开口以透析夹固定，并放入瓶中，且将透析外液加入瓶中。透析外液为15ml的不同pH值PBS中(pH7.4或pH5.0)。将样品瓶放置恒温震荡器37℃进行药物释放，于每个取样时间点分别取出透析外液并以激发波长500nm/发射波长560nm来测定药物释放量。
由图6可得知，配方DHC2101与配方DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体，相较于在pH7.4，皆在pH5.0下具有较高的药物累计释放率(大于2.5倍)。
(3)细胞毒性分析
将配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体以及阿霉素与微脂体包覆的阿霉素(DO101)以U87MC细胞进行细胞毒性分析，并计算出配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/ 阿霉素纳米复合载体以及阿霉素与微脂体包覆的阿霉素(DO101)的IC50。结果如图7与表10所示。细胞毒性分析的详细实验方法如下所述。
将U87细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96-孔培养盘中，并放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养1天。之后，将旧培养液从培养盘取出并将100μL、 50μM、10μM、2μM、0.4μM、80nM、16nM以及3.2nM的阿霉素、DO101、 DHC2101或DHC2501分别加入培养盘中作用48小时。接着从培养盘取出旧培养液并以培养液洗涤三次。取出旧培养液后，将100μL、0.5mg/mLMTT 试剂加入培养盘中，并将培养盘于37℃作用4小时。然后取出旧培养液并加入100μL的0.1N HCl/异丙醇于培养盘中以溶解沉淀物。最后，将培养盘放置于酵素免疫分析仪(ELISAreader)中侦测其在波长570nm的吸收值，并以下方所示公式换算为细胞活率(cellviability)。
细胞存活率(cell viability)(%)=样本强度/控制组强度×100%
表10:配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体对U87MC细胞的IC50
配方 阿霉素 DO101 DHC2101 DHC2501
IC50(μM) 0.1 1.62 0.17 0.04
根据图7与表10可知，配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体的细胞毒杀效果与阿霉素相当。由此可知，药物并不会因被包覆而无法释放，且配方DHC2101与DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体明显优于对照组-微脂体包覆的阿霉素 (DO101)的细胞毒杀效果。
(4)于大鼠血液中透明质酸衍生物/药物纳米复合载体所释放的药物的浓度分析
将大鼠分组，分别给予3mg/kg的配方DHC2101所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体、DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体或阿霉素，在5分钟、30分钟，1小时、2小时、4小时、8小时与24小时下抽取血液样品，并以LC-MS/MS来分析血浆中阿霉素的浓度。结果如图8所示。
结果显示，藉由配方的保护，能够延长阿霉素在血液中的滞留时间。
(5)透明质酸衍生物/药物纳米复合载体对活体内的肿瘤的抑制分析
将U87-MG人类多型性神经胶母细胞瘤细胞株植入裸小鼠背部。待肿瘤大小达100-200mm3后，小鼠进行分组，每星期分别以尾静脉注射2次配方 DHC2101所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体(5mg阿霉素/kg)、DHC2501所形成的透明质酸衍生物/阿霉素纳米复合载体(5mg阿霉素/kg) 或PBS，共给药4剂，并定期量测肿瘤大小变化。结果如图9所示。
由图9可以得知，DHC2501配方具有较佳的肿瘤抑制效果。
A.透明质酸衍生物/(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂(DACHPt)纳米复合载体
(1)穿透式电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)
分别将透明质酸/DACHPt(PtHC101)与透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体(PtHC305)以穿透式电子显微镜进行观察并照相，结果如图10所示。
由图10可得知，透明质酸无法包覆DACHPt而形成微胞，而相对地，透明质酸衍生物则可良好包覆DACHPt并形成微胞。
(2)药物释放
分别将配方PtHC101所形成的透明质酸/DACHPt纳米复合载体，及配方PtHC201、PtHC301与PtHC401所分别形成的透明质酸衍生物/DACHPt 纳米复合载体在pH7.4进行累计药物释放分析，结果如图11所示。累计药物释放分析的详细实验方法如下所述。
将300μl的配方置入透析袋(MWCO3.5kD)中。之后将透析袋两端开口以透析夹固定，并放入瓶中，且将透析外液加入瓶中。透析外液为15ml PBS (pH7.4)。将样品瓶放置恒温震荡器37℃进行以使药物释放。于每个取样时间点分别取出透析外液500μl，并将取出透析外液的加入5ml去离子水稀释 11倍，之后，以感应偶合电浆-原子放射光谱(Inductivelycoupled plasma with atomic emission spectroscopy,ICP-AES)进行Pt浓度分析定量。
由图11可得知，随着各配方的透明质酸衍生物中的Boc-组氨 酸接枝量越高，透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体的整体药物释放百分比越低，而此显示材料导入Boc-组氨 酸的确会增加疏水性进而影响药物的释放比例。
(4)于大鼠血液中透明质酸衍生物/药物纳米复合载体所释放的药物的浓度分析
将大鼠分组，分别给予0.5mg/大鼠的奥沙利铂(oxaliplatin)、PtHC101、 PtHC305或PtHC603，在不同时间下抽取血液样品，并以感应偶合电浆-原子放射光谱分析血浆中Pt的浓度，并计算出各配方的初始血中药物浓度 (C0)、半衰期(T1/2)、曲线下积分面积(AUClast)、分布体积(Vz)、清除率(Cl) 值。结果如图12与表11所示。
表11
相较于奥沙利铂，透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体可明显降低 Pt的分布体积与清除率，因而可增加Pt在血浆中的AUC(奥沙利铂vs. PtHC305、PtHC603与PtHC101)。结果显示，藉由配方的保护，能够延长 Pt药物在血液中的滞留时间，且相较奥沙利铂，透明质酸衍生物/DACHPt 纳米复合载体于曲线下面积(AUC)约提高15-20倍。其中PtHC101配方为不含组氨 酸修饰的透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体，整体配方稳定性明显降低。
(5)透明质酸衍生物/药物纳米复合载体对活体内的肿瘤的抑制分析
将HT-29人类大肠癌细胞株植入裸小鼠背部。待肿瘤大小达100-200 mm3后，每星期分别将不同组别的小鼠以尾静脉注射2次配方PtHC604所形成的透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体(2mg Pt/kg)、奥沙利铂(2mg Pt/kg)或10%蔗糖，共给药6剂，并定期量测肿瘤大小变化及计算肿瘤成长抑制率(Tumor growth inhibition,TGI)，结果如图13所示。肿瘤成长抑制率的计算公式如下所示。
肿瘤成长抑制率TGI(%)=[1–(△药物处理组肿瘤体积/△载剂(vehicle) 组肿瘤体积)]×100。
由图13可以得知，配方PtHC604所形成的透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体具较佳抑制肿瘤生长能力。从第14天到第42天，给药配方 PtHC604所形成的透明质酸衍生物/DACHPt纳米复合载体的小鼠其肿瘤生长抑制率(TGI)为72±4%；相对的，给药奥沙利铂的小鼠肿瘤生长抑制率 (TGI)仅有42±8%，两者间具有统计差异(p<0.05)。而上述结果再次证明本申请案所制备的纳米载体具有较佳的抗肿瘤抑制效果。

Claims (37)

1.一种生物医学组合物，包括：
透明质酸；
经修饰的组氨 酸；以及
聚合物或C4-C20烷类，
其中所述经修饰的组氨 酸与所述聚合物或C4-C20烷类，接枝于所述透明质酸的至少一个伯羟基上，以与所述透明质酸形成透明质酸衍生物，
且其中所述经修饰的组氨 酸的接枝率为1～100％，而所述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为0～40％，
当所述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为0时，所述透明质酸衍生物的分子式如以下式(I)所示：
其中R1为经修饰的组氨 酸，a为15-1200的正整数。
2.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸的至少一个伯羟基位于所述透明质酸中的至少一个双糖单位的N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上。
3.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸分子量为7,000～500,000。
4.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸的接枝率为1～100％，而所述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为1-40％。
5.权利要求4所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸衍生物的分子式如以下式(II)所示：
其中R1为经修饰的组氨 酸，R2为聚合物或C4-C20烷类，p与q为正整数，且p与q的比值介于0.1-100之间。
6.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸选自Boc-组氨 酸、Cbz-组氨 酸、Fmoc-组氨 酸或Ac-组氨 酸。
7.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸。
8.权利要求7所述的生物医学组合物，其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～100％，而所述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为0。
9.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述聚合物选自聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸或聚乙烯吡咯烷酮。
10.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述聚合物为聚乙二醇。
11.权利要求10所述的生物医学组合物，其中所述聚乙二醇的接枝率为1～40％。
12.权利要求10所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，且其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～80％，而所述聚乙二醇的接枝率为1～30％。
13.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述C4-C20烷类选自C5H11、C7H15、C9H19或C11H23。
14.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述C4-C20烷类为C11H23。
15.权利要求14所述的生物医学组合物，其中所述C11H23的接枝率为1～40％。
16.权利要求14所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，且其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～80％，而所述C11H23的接枝率为1～30％。
17.权利要求1所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸衍生物的分子量为7,000-1,500,000。
18.权利要求1所述的生物医学组合物，更包括在水中带正电的活性成分，其中所述在水中带正电的活性成分与所述透明质酸衍生物的羧基正负电相吸，以使所述在水中带正电的活性成分包覆于所述透明质酸衍生物中。
19.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸衍生物与所述在水中带正电的活性成分的重量比为1.25:1-50:1。
20.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸衍生物与所述在水中带正电的活性成分的重量比为2:1～25:1。
21.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述在水中带正电的活性成分选自阿霉素、依立替康、庆大霉素或铂金化合物。
22.权利要求21所述的生物医学组合物，其中所述铂金化合物选自(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂、顺铂或奥沙利铂。
23.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，而所述聚合物或C4-C20烷类的接枝率为0，且该在水中带正电的活性成分为阿霉素、依立替康、庆大霉素或(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂。
24.权利要求23所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸的至少一个伯羟基位于所述透明质酸中的至少一个双糖单位的N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上。
25.权利要求23所述的生物医学组合物，其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～80％，而所述透明质酸衍生物与所述在水中带正电的活性成分的重量比为1.25:1～25:1。
26.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，而所述聚合物或C4-C20烷类为聚乙二醇，且所述在水中带正电的活性成分为阿霉素、依立替康、庆大霉素或(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂。
27.权利要求26所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸的至少一个伯羟基位于所述透明质酸中的至少一个双糖单位的N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上。
28.权利要求26所述的生物医学组合物，其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～80％，所述聚乙二醇的接枝率为1～30％，而所述透明质酸衍生物与所述在水中带正电的活性成分的重量比为3:1～50:1。
29.权利要求18所述的生物医学组合物，其中所述经修饰的组氨 酸为Boc-组氨 酸，而所述C4-C20烷类为C11H23，且所述在水中带正电的活性成分为阿霉素或(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂。
30.权利要求29所述的生物医学组合物，其中所述透明质酸的至少一个伯羟基位于所述透明质酸中的至少一个双糖单位的N-乙酰葡糖胺部分的第5个碳上。
31.权利要求29所述的生物医学组合物，其中所述Boc-组氨 酸的接枝率为1～80％，所述C11H23的接枝率为1～30％，而所述透明质酸衍生物与所述在水中带正电的活性成分的重量比为2.5:1～4:1。
32.权利要求18所述的生物医学组合物，其为药物释放系统。
33.权利要求32所述的生物医学组合物，其中所述药物释放系统为微胞形式，且所述微胞的粒径为100-1000nm。
34.权利要求1所述的生物医学组合物，其中以口服或非口服的方式来给药所述生物医学组合物。
35.权利要求34所述的生物医学组合物，其中所述非口服的方式选自皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉、滑囊(腔)内、胸骨内、蜘蛛膜下腔、疾病部位内注射、灌注技术、经由吸入喷雾或藉由植入贮存器。
36.权利要求34所述的生物医学组合物，其中所述口服的方式选自药锭、胶囊或分散液。
37.权利要求36所述的生物医学组合物，其中所述分散液选自乳剂、水性悬浮液或溶液。
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