TW201515661A - 生醫組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種生醫組合物，包括：一透明質酸；一經修飾之組胺酸；以及一聚合物或C4-C20烷類，其中該經修飾之組胺酸，與該聚合物或C4-C20烷類，接枝於該透明質酸之至少一個一級羥基上以與該透明質酸形成一透明質酸衍生物，且其中該經修飾之組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0-40%。

Description

生醫組合物
本發明係關於一種生醫組合物，且特別關於一種生醫組合物，其包含一透明質酸衍生物，具有接枝於至少一個一級羥基的經修飾組胺酸。
目前已上市的奈米載體抗癌藥物皆有藥物釋放率太慢的問題，使得其雖然可以降低抗癌藥物的副作用，但並無法明顯提高藥物的治療效果。
而由於腫瘤組織與發炎組織由於其新生血管較不完整，因此造成經由細胞代謝的產物無法順利排至全身血液循環，所以此類組織的酸鹼值較一般正常組織來的低，約6.8-7.2左右。此外，胞內的核內體(endosome)與溶酶體(lysosome)環境的酸鹼值約為pH 4.0-6.5左右，若能調控奈米載體在這些環性下能夠快速釋放，將可解決現有藥物載體藥物釋放率太低的問題；同時針對某些生技類藥物如胜肽、蛋白質、與基因片段等，將這類生技藥物於核內體中釋放至細胞質中，而不被傳送至溶酶體中分解，也將能提升此類藥物的活性。
透明質酸是一種由雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙醯葡糖胺所組成高分子的聚合物。於透明質酸中，D-葡萄糖醛酸及N-乙醯葡糖胺之間是藉由β-1,3-配糖鍵來鍵結，而雙糖單 位之間則藉由β-1,4-配糖鍵來鍵結。一般而言，透明質酸的分子量從5千到2千萬道爾頓。商品化之透明質酸一般為其鈉鹽，即透明質酸鈉(Sodium hyaluronate)。
而天然透明質酸為水溶性高分子，具有多種適宜作為藥物載體的優良特性，例如，生物相容性，非免疫原性，在體內可由酶作用而天然降解，並攜帶大量的-OH、-COOH和-CH，OH等多種功能基團，可進行共價修飾。因此，由上述可知，透明質酸可作為優良之藥物載體。
目前亟需，生物相容性高，且可將其設計在適合之環境下才快速釋放藥物之新穎藥物傳送系統。
本發明提供一種生醫組合物，包括：一透明質酸；一經修飾之組胺酸；以及一聚合物或C4-C20烷類，其中該經修飾之組胺酸，與該聚合物或C4-C20烷類，接枝於該透明質酸之至少一個一級羥基上以與該透明質酸形成一透明質酸衍生物，且其中該經修飾之組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0-40%。
第1A圖顯示HA16k-g-40%BocHis材料在pH 7.4之臨界微胞濃度結果。
第1B圖顯示HA16k-g-40%BocHis材料在pH 5.0之臨界微胞濃度結果。
第2A圖顯示HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH 7.4 之臨界微胞濃度結果。
第2B圖顯示HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH 5.0之臨界微胞濃度結果。
第3圖顯示以雷射光散射粒徑分析儀測定HA16k-g-40%BocHis材料於pH 8、pH 7.4、pH 6.5、pH 6和pH 5下所形成之微胞粒徑的結果。
第4圖顯示透明質酸衍生物的理論解離方程式。
第5圖顯示透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(配方DHC1902)之穿透式電子顯微鏡照片。
第6圖顯示將配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體在pH 7.4與pH 5.0進行累計藥物釋放分析的結果。
第7圖顯示將配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體以及阿黴素與微脂體包覆之阿黴素以U87MC細胞進行細胞毒性分析的結果。
第8圖顯示LC-MS/MS分析配方DHC2101與DHC2501所分別形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體與阿黴素於大鼠中之血液濃度的結果。
第9圖顯示測定以配方DHC2101所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(5mg阿黴素/kg)、配方DHC2501所分別形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(5mg阿黴素/kg)或PBS處理經U87-MG人類多型性神經膠母細胞瘤細胞株植入之裸小鼠之腫瘤大小的結果。
第10圖顯示透明質酸/DACHPt(PtHC101)與透明質酸衍生 物/DACHPt奈米複合載體(PtHC305)之穿透式電子顯微鏡照片。
第11圖顯示將配方PtHC101所形成之透明質酸/DACHPt奈米複合載體、配方PtHC201、PtHC301與PtHC401所分別形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體在pH 7.4進行累計藥物釋放分析的結果。
第12圖顯示以感應偶合電漿-原子放射光譜分析益鉑樂(oxaliplatin)、配方PtHC101所形成之透明質酸/DACHPt奈米複合載體、配方PtHC305與配方PtHC603所分別形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體於大鼠中之血液濃度的結果。以及第13圖顯示測定以與配方PtHC604所形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體(2mg Pt/kg)、益鉑樂(2mg Pt/kg)或10%蔗糖處理經HT-29人類大腸癌細胞株植入之裸小鼠之腫瘤大小的結果。
在本發明一實施例中，本發明提供一包含透明質酸衍生物的生醫組合物。
本發明生醫組合物可包括，但不限於，透明質酸、一經修飾之組胺酸，以及一聚合物或C4-C20烷類，其中上述經修飾之組胺酸，與上述聚合物或C4-C20烷類，接枝於透明質酸之至少一個一級羥基上，且其中經修飾之組胺酸與一聚合物或C4-C20烷類與該透明質酸形成一透明質酸衍生物。
上述經修飾之組胺酸對透明質酸之接枝率可為約 1-100%，然需注意的是，上述聚合物與C4-C20烷類對透明質酸之接枝率則為約0-40%。因此，可以瞭解的是，上述透明質酸衍生物為可具有或不具有聚合物或C4-C20烷類接枝於其上。換言之，本發明之生醫組合物為，視需要而定包括聚合物或C4-C20烷類。
在一實施例中，經修飾之組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為0，即，上述透明質酸衍生物為不具有聚合物或C4-C20烷類接枝於其上。於此實施例中，上述透明質酸衍生物之示例分子式可如以下方式(I)所示，但不限於此：
R1可為經修飾之組胺酸。而a可為約15-1200之正整數，但不限於此。
在另一實施例中，上述透明質酸衍生物為具有聚合物或C4-C20烷類接枝於其上，而於此實施例中經修飾之組胺酸之接枝率可為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率可為1-40%。於此實施例中，上述透明質酸衍生物之示例分子 式可如以下方式(II)所示，但不限於此：
R1可為經修飾之組胺酸，又R2可為聚合物或C4-C20烷類。此外，p與q為正整數，且p與q之比值可介於0.1-100之間，但不限於此。在一實施例中，p與q之比值可介於0.1-20之間。
在一實施例中，於其上接枝上述經修飾之組胺酸與上述聚合物或C4-C20烷類之上述透明質酸的至少一個一級羥基，可包括，一羥基，其位於上述透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上，但不限於此。
在一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述透明質酸之分子量為約7,000-500,000。在另一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述透明質酸之分子量為約7,000-350,000。
於本發明生醫組合物中，適合之經修飾之組胺酸的例子可包括，例如Boc-組胺酸(Boc-histidine)、Cbz-組胺酸(Cbz-histidine)、Fmoc-組胺酸(Fmoc-histidine)與Ac-組胺酸(Ac-histidine)等，但不限於此。
另外，於本發明生醫組合物中，聚合物可包括聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚己內酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸(poly lactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acido,PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)等，但不限於此。
再者，於本發明生醫組合物中，C4-C20烷類的例子可包括，但不限於、C5H11、C7H15或C9H19、C11H23等。
在一實施例中，於本發明生醫組合物中，經修飾之組胺酸可為Boc-組胺酸。又，於一特定實施例中，Boc-組胺酸之接枝率可為約1-100%，而聚合物或C4-C20烷類之接枝率則為約0。
又於一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述聚合物可為聚乙二醇，其中聚乙二醇之分子量可為約300-10000。而於此實施例中，聚乙二醇之接枝率可為約1-40%。於一特定實施例中，於本發明生醫組合物中，經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，上述聚合物可為聚乙二醇，且其中Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，而聚乙二醇之接枝率為約1-30%。
於一實施例中，於本發明生醫組合物中，C4-C20烷類可為C11H23，而於此實施例中，C11H23之接枝率可為約1-40%。於一特定實施例中，於本發明生醫組合物中，經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，C4-C20烷類為C11H23，且其中Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，而C11H23烷之接枝率為約1-30%。
此外，於本發明生醫組合物中，由經修飾之組胺酸與透明質酸所形成或由經修飾之組胺酸及聚合物或C4-C20烷 類與透明質酸所形成之上述透明質酸衍生物的分子量可為約7,000-1,500,000。在一實施例中，上述透明質酸衍生物之分子量可為約7,000-1,200,000。在另一實施例中，上述透明質酸衍生物之分子量可為約7,000-800,000。在又另一實施例中，上述透明質酸衍生物之分子量可為約7,000-600,000。
在本發明另一實施例中，上述本發明生醫組合物 還可更包括一在水中帶正電之活性成分。於此實施例中，上述在水中帶正電之活性成分與上述透明質酸衍生物之羧基正負電相吸，又，利用修飾於透明質酸上的組胺酸衍生物產生的疏水作用力可使活性成分聚集，進而使上述在水中帶正電之活性成分包覆於上述透明質酸衍生物中。
在一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述透 明質酸衍生物與上述在水中帶正電之活性成分之重量比為約1.25：1-50：1。在一實施例中，上述透明質酸衍生物與上述在水中帶正電之活性成分之重量比為約1.25：1-25：1。在另一實施例中，上述透明質酸衍生物與上述在水中帶正電之活性成分之重量比為約2：1-25：1。在又另一實施例中，上述透明質酸衍生物與上述在水中帶正電之活性成分之重量比為約2：1-10：1。
上述在水中帶正電之活性成分可包括一藥物(如 抗生素、鉑金類藥物等)、核苷酸物質、胜肽或蛋白質等，但不限於此。
在一實施例中，在水中帶正電之活性成分的例子 可包括，但不限於阿黴素(doxorubicin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、紫菌素(gentamicin)、鉑金化合物等。
鉑金化合物的例子，可包括，但不限於，(1,2-二 氨基環己烷)二氯化鉑(Dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum,DACHPt)、順鉑(cisplatin)或益樂鉑(oxaliplatin)等。
於一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述經 修飾之組胺酸可為Boc-組胺酸，而上述聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0，即，上述透明質酸衍生物為僅具有Boc-組胺酸接枝於其上，且在水中帶正電之活性成分可為阿黴素、愛萊諾迪肯、紫菌素或鉑金化合物(如，(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑)。於此實施例中，上述經修飾之組胺酸所接枝於其上的上述透明質酸的至少一個一級羥基，可包括，一羥基，其位於上述透明質酸之至少一雙糖單位的N-乙醯葡糖胺之第5個碳上的羥基，但不限於此。又於此實施例中，Boc-組胺酸之接枝率可為約1-100%，而透明質酸衍生物與在水中帶正電之活性成分之重量比可為約1.25：1-25：1。
於另一實施例中，於本發明生醫組合物中，上述 經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，而上述聚合物或C4-C20烷類為聚乙二醇，且在水中帶正電之活性成分為阿黴素、愛萊諾迪肯、紫菌素或鉑金化合物(如，(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑)。 於此實施例中，上述經修飾之組胺酸所接枝於其上的上述透明質酸的至少一個一級羥基，可包括，一羥基，其位於上述透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上，但不限於此。又於此實施例中，Boc-組胺酸之接枝率可為約1-80%，聚乙二醇之接枝率為1-30%，而透明質酸衍生物與在水中帶正電之活性成分之重量比可為約3：1-50：1。
在又另一實施例中，於本發明生醫組合物中，上 述經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，而上述聚合物或C4-C20烷類為C11H23，且在水中帶正電之活性成分為阿黴素或(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑。於此實施例中，上述經修飾之組胺酸所接枝於其上的上述透明質酸的至少一個一級羥基，可包括，一羥基，其位於上述透明質酸之至少一雙糖單位的N-乙醯葡糖胺之第5個碳上的羥基，但不限於此。又於此實施例中，Boc-組胺酸之接枝率可為約1-80%，C11H23之接枝率為1-30%，而透明質酸衍生物與在水中帶正電之活性成分之重量比可為約2.5：1-4：1。
此外，若於本發明生醫組合物中所包含之在水中 帶正電之活性成分為一藥物，則本發明生醫組合物可為一醫藥組合物或可為一藥物釋放系統(drug delivery system)。
上述藥物釋放系統可為一微胞形式，而上述微胞 之粒徑可為約100-1000nm。在一實施例中上述微胞之粒徑可為約100-800nm。在另一實施例中，上述微胞之粒徑可為約100-500nm。在又另一實施例中，上述微胞之粒徑可為約100-300nm。
上述醫藥組合物給藥可以口服、非口服、經由吸 入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)、蜘蛛膜下 腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配製成劑型(dosage form)。
口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
實施例
1.透明質酸衍生物之製備
A.接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物(HA-g-BocHis)之製備
(a)接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的合成機制
接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的合成機制如下方式(III)所示：
Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP=11當量/1當量/1當量
(b)接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法
接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法如下所述：
(1)將HA-TBA(1當量，根據計算於透明質酸上之一級羥基來計算)於真空室溫乾燥16小時，快速秤取所需量並置於夾層式玻璃反應槽中，且於夾層式玻璃反應槽中架設機械攪拌裝置，之後將夾層式玻璃反應槽真空除氣30分鐘。
(2)回填氮氣，加入無水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)以形成一混合物，於玻璃反應槽夾層通入45±5℃循環水，將混合物以轉速250rpm攪拌4小時至完全溶解備用。
(3)秤取Boc-His-OH及DMAP於雙頸瓶抽真空5分鐘後通入氮氣，加入0.5M Boc-His-OH均勻攪拌30分鐘，取EDC．HCl固體快速倒入雙頸瓶，於35±5℃反應4小時以活化Boc-His-OH。
(4)將活化後之Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕動幫浦以流速25mL/分鐘轉移至玻璃反應槽中。加料完成後，提高機械攪拌轉速至300rpm反應30分鐘，使整體溶液快速均勻混合，再將機械攪拌轉速降至250rpm持續反應24小時。
(5)反應自然回到室溫後，裝於透析袋(Spectra/Por®4 Dialysis Membrane,MWCO：12-14,000,Flat Width：75mm)。
(6)以45±5℃之DMAc(20X DMAc體積)連續透析40小時，並於第16小時更換透析液。
(7)轉置於25±5℃之去離子水(100X DMAc體積)連續透 析72小時，於第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小時更新透析液。
(8)取長60cm、直徑5cm之玻璃層析管柱，並以玻璃棉塞住下方出口。取鈉離子交換樹脂(ROHM HAAS，食品級，520g)加去離子水(200mL)攪拌均勻後倒入層析管柱中，並以每次200mL去離子水清洗管柱中的樹脂，清洗五次以上，直至管柱流出液體為透明無色，完成清洗鈉離子交換樹脂。
(9)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉過濾除去微量果凍狀固體，收集濾液，以流速150~200mL/小時通過鈉離子交換樹脂(以一支鈉離子交換樹脂管柱處理15g HA16k-TBA計算所需管柱數量)，待HA水溶液完全進入樹脂後，再以去離子水(200mL)沖提管柱3次，洗出殘留於樹脂上之HA材料，得到HA-g-BocHis水溶液。
(10)真空濃縮(<1mmHg，30±5℃)至濃度約為3wt%之水溶液，確認溶液pH值後置於-20℃使其結冰。
(11)利用冷凍乾燥法移除水份，得到完全乾燥的HA-g-BocHis材料。
根據上述之製備方法，調整HA/Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP之當量比，即可得到不同BocHis接枝率的HA-g-BocHis材料。以不同之HA/Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP之當量比所獲得之不同BocHis接枝率的HA-g-BocHis材料的接枝率與產率如表1所示。
B.接枝Boc組胺酸與聚乙二醇之透明質酸衍生物(HA-g-(BocHis-co-SAmPEG))之製備
(a)接枝Boc組胺酸與聚乙二醇之透明質酸衍生物的合成機制
接枝Boc組胺酸與聚乙二醇之透明質酸衍生物的合成機制如下方式(IV)所示：
Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP=1.2當量/1當量/1當量
mPEG1900-SA-COOH/EDC．HCl/DMAP=0.24當量/0.2當量/0.2當量
HA16k-g-(BocHis-co-SAmPEG1900)共聚合物R=H、BocHis或SAmPEG1900式(IV)
(b)接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法如下所述：
(1)將HA-TBA(1當量，根據計算於透明質酸上之一級羥基來計算)於真空室溫乾燥16小時，快速秤取所需量並置於夾層式玻璃反應槽中，且於夾層式玻璃反應槽中架設機械攪拌裝置，之後將夾層式玻璃反應槽真空除氣30分鐘。
(2)回填氮氣，加入無水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)以形成一混合物，於玻璃反應槽夾層通入45±5℃循環水，將混合物以轉速250rpm攪拌4小時至完全溶解備用。
(3)秤取Boc-His-OH及DMAP於雙頸瓶抽真空5分鐘後通入氮氣，加入DMAc(0.5M for Boc-His-OH)均勻攪拌30分鐘，取EDC．HCl固體快速倒入雙頸瓶，於35±5℃反應4小時以活化Boc-His-OH。
(4)將活化後之Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕動幫浦以流速1mL/分鐘轉移至玻璃反應槽中，加料完成後，提高機械攪拌轉速至300rpm反應30分鐘，使整體溶液快速均勻混合，再將機械攪拌轉速降至250rpm持續反應24小時。
(5)秤取mPEG-SA-COOH於雙頸瓶，抽真空5分鐘後通入氮氣，加入DMAc(0.1M for mPEG1900-SA-COOH)於50 ±5℃攪拌10分鐘使之均勻溶解，降溫至30℃，加入DMAP攪拌10分鐘，取EDC．HCl固體快速倒入雙頸瓶，於35±5℃反應4小時以活化mPEG-SA-COOH。
(6)將活化後之mPEG-SA-COL(L=leaving group)溶液用蠕動幫浦以流速1mL/min轉移至玻璃反應槽中，加料完成後，提高機械攪拌轉速至300rpm反應30分鐘，使整體溶液快速均勻混合，再將機械攪拌轉速降至250rpm持續反應40小時。
(7)反應自然回到室溫後，裝於透析袋(Spectra/Por®4 Dialysis Membrane,MWCO：12-14,000,Flat Width：75mm)。
(8)以45±5℃之DMAc(20X DMAc體積)連續透析40小時，並於第16小時更換透析液。
(9)轉置於25±5℃之去離子水(100X DMAc體積)連續透析72小時，於第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小時更新透析液。
(10)取長60cm、直徑5cm之玻璃層析管柱，並以玻璃棉塞住下方出口。取鈉離子交換樹脂(ROHM HAAS，食品級，520g)加去離子水(200mL)攪拌均勻後倒入層析管柱中，並以每次200mL去離子水清洗管柱中的樹脂，清洗五次以上，直至管柱流出液體為透明無色，完成清洗鈉離子交換樹脂。
(11)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉過濾除去微量果凍狀固體，收集濾液，以流速150~200mL/小時通過鈉離子 交換樹脂(以一支鈉離子交換樹脂管柱處理15g HA16k-TBA計算所需管柱數量)，待HA水溶液完全進入樹脂後，再以去離子水(200mL)沖提管柱3次，洗出殘留於樹脂上之HA材料，得到HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)水溶液。
(12)真空濃縮(<1mmHg,30±5℃)至完全乾燥，取出固體產物，置於圓型濾筒，氮氣下以二氯甲烷連續萃洗6小時(循環冷卻水溫度5℃)，取出固體使殘留二氯甲烷自然揮發乾燥，加入去離子水均勻溶解成濃度約為3wt%之水溶液，確認溶液pH值後置於-20℃使其結冰。
(13)利用冷凍乾燥法移除水份，得到完全乾燥的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料。
根據上述之製備方法，調整HA/Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP與HA/mPEG-SA-COOH/EDC．HCl/DMAP之當量比，即可得到不同BocHis與PEG接枝率的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料。以不同之HA/Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP與HA/mPEG-SA-COOH/EDC．HCl/DMAP之當量比所獲得之不同BocHis與PEG接枝率的HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料的接枝率與產率如表2所示。
表2、以不同之HA/Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP與HA/mPEG-SA-COOH/EDC．HCl/DMAP之當量所獲得之HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料的接枝率與產率
C.接枝Boc組胺酸與C11H23之透明質酸衍生物(HA-g-(BocHis-co-C11))之製備
(a)接枝Boc組胺酸與C11H23之透明質酸衍生物的合成機制
接枝Boc組胺酸與C11H23之透明質酸衍生物的合成機制如下方式(V)所示：
Boc-His-OH/EDC．HCl/DMAP=1.2當量/1當量/1當量
n-C11H23-COOH/EDC．HCl/DMAP=0.24當量/0.2當量/0.2當量
(b)接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法
接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的製備方法如下所述：
(1)將HA-TBA(1當量，根據計算於透明質酸上之一級羥基來計算)於真空室溫乾燥16小時，快速秤取所需量並置於夾層式玻璃反應槽中，且於夾層式玻璃反應槽中架設機械攪拌裝置，之後將夾層式玻璃反應槽真空除氣30分鐘。
(2)回填氮氣，加入無水DMAc(10mL/g HA16k-TBA)，於玻璃反應槽夾層通入45±5℃循環水，以轉速250rpm攪拌4小時至完全溶解備用。
(3)秤取Boc-His-OH(1.1當量)及DMAP(1當量)於雙頸瓶抽真空5分鐘後通入氮氣，加入0.5M Boc-His-OH均 勻攪拌30分鐘，取EDC．HCl固體(1當量)快速倒入雙頸瓶，於35±5℃反應4小時以活化Boc-His-OH。
(4)將活化後之Boc-His-L(L=leaving group)溶液用蠕動幫浦以流速25mL/分鐘轉移至玻璃反應槽中，加料完成後，提高機械攪拌轉速至300rpm反應30分鐘，使整體溶液快速均勻混合，再將機械攪拌轉速降至250rpm持續反應24小時。
(5)秤取n-C11H23-COOH(0.165當量)及DMAP(0.15當量)於雙頸瓶抽真空5分鐘後通入氮氣，加入0.5M Boc-His-OH均勻攪拌30分鐘，取EDC．HCl固體(0.15當量)快速倒入雙頸瓶，於35±5℃反應4小時以活化n-C11H23-COOH。
(6)將活化後之n-C11H23-COL(L=leaving group)溶液用蠕動幫浦以流速25mL/分鐘轉移至玻璃反應槽中，加料完成後，提高機械攪拌轉速至300rpm反應30分鐘，使整體溶液快速均勻混合，再將機械攪拌轉速降至250rpm持續反應40小時。
(7)反應自然回到室溫後，裝於透析袋(Spectra/Por®4 Dialysis Membrane,MWCO：12-14,000,Flat Width：75mm)。
(8)以45±5℃之DMAc(20X DMAc體積)連續透析40小時，並於第16小時更換透析液。
(9)轉置於25±5℃之去離子水(100X DMAc體積)連續透析72小時，於第2、5、8、24、26、29、32、48、50、53、56小時更新透析液。
(10)取長60cm、直徑5cm之玻璃層析管柱，並以玻璃棉塞住下方出口。取鈉離子交換樹脂(ROHM HAAS，食品級，520g)加去離子水(200mL)攪拌均勻後倒入層析管柱中，並以每次200mL去離子水清洗管柱中的樹脂，清洗五次以上，直至管柱流出液體為透明無色，完成清洗鈉離子交換樹脂。
(11)收集透析袋中水溶液，以玻璃棉過濾除去微量果凍狀固體，收集濾液，以流速150~200mL/小時通過鈉離子交換樹脂(以一支鈉離子交換樹脂管柱處理15g HA16k-TBA計算所需管柱數量)，待HA水溶液完全進入樹脂後，再以去離子水(200mL)沖提管柱3次，洗出殘留於樹脂上之HA材料，得到HA-g-(BocHis-co-C11)水溶液。
(12)真空濃縮(<1mmHg,30±5℃)至濃度約為3wt%之水溶液，確認溶液pH值後置於-20℃使其結冰。
13.利用冷凍乾燥法移除水份，得到完全乾燥的HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料，產率62%。
2. Histidine-based HA材料之酸鹼應答性質分析
A.臨界微胞濃度(critical micelle concentration,CMC)
當材料在水中濃度高於臨界微胞濃度時即會形成微胞，而由於焦油腦(pyrene)具有對於微環境親疏水變化敏感的特性，因此當微胞材料在水中濃度高於其臨界微胞濃度時，焦油腦螢光放光強度會急遽增強。於本實驗中，根據上述焦油腦的特性，來測微胞材料的臨界濃度。測試方法如下所述。
將各測試樣品配製成1mg/mL水溶液，並以對半稀 釋法將各樣品配製成具有以下各濃度之水溶液4.5mL，而上述濃度由小至大分別為：(1)0.00195mg/mL；(2)0.00391mg/mL；(3)0.00781mg/mL；(4)0.01563mg/mL；(5)0.03125mg/mL；(6)0.0625mg/mL；(7)0.125mg/mL；(8)0.25mg/mL；(9)0.5mg/mL；與(10)1mg/mL。之後將15μl之1.8X10-4M焦油腦丙酮溶液分別加入上述10個樣品溶液中，混合均勻後避光靜置至隔天。然後將溶液於室溫抽真空20分鐘，使丙酮揮發後測定焦油腦螢光放光強度以測定樣本之臨界微胞濃度。
於螢光強度測定方面，設定激發波長為339nm， 放光光譜掃描360~500nm，並以最大放光波長Imax(即I379nm)之放光強度對材料濃度log值作圖，即可求得微胞材料之臨界微胞濃度。
(1)接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物的臨界濃度
將上方獲得之接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生 物，HA16k-g-40%BocHis材料，以上述方法來測定臨界微胞濃度。
結果顯示BocHis之疏水性質提供材料在水溶液中 形成微胞的可能。又，HA16k-g-40%BocHis材料在pH 8.0、7.4、6.5、6.0與5.0之臨界微胞濃度分別為0.11、0.10、0.10、0.11、0.18mg/mL(n=2)(參見表3)，而上述結果證實HA16k-g-40%BocHis材料的微胞結構在酸性環境較不穩定。而HA16k-g-40%BocHis材料在pH 7.4與5.0之臨界微胞濃度測定圖分別如第1A圖與第1B圖所示。
(2)接枝Boc組胺酸與C11H23之透明質酸衍生物的臨界濃度
將上方獲得之接枝Boc組胺酸之透明質酸衍生物，HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料，以上述方法來測定臨界微胞濃度。
HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH 7.4與5.0之臨界微胞濃度分別為0.12與0.18mg/mL(參見表4)，而上述結果證實HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料微胞結構在酸性環境較不穩定，與上述HA16k-g-40%BocHis材料結果一致。而HA16k-g-(45%BocHis-co-12%C11)材料在pH 7.4與5.0之臨界微胞濃度測定圖分別如第2A圖與第2B圖所示。
B.微胞粒徑
將HA16k-g-40%BocHis材料分別溶解於pH 8、pH 7.4、pH 6.5、pH 6和pH 5之PBS緩衝溶液。接著將pyrene分別加入含HA16k-g-40%BocHis材料之上述PBS緩衝溶液中並與其混合後靜置。然後將所獲得之溶液經0.45μm過濾膜過濾後再靜置約3小時。之後以雷射光散射粒徑分析儀測得各pH下的微胞粒徑。結果如第3圖所示。
根據第3圖可知，材料在pH 8.0→6.0過程，粒徑分布朝向遞增趨勢。
C. pKa電位滴定
本發明之透明質酸衍生物的理論解離方程式如第4圖所示。將不同接枝率之HA-g-BocHis與不同接枝率之HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料進行pKa電位滴定，結果如表5所示。
根據表5可知，HA-g-BocHis與HA-g-(BocHis-co-SAmPEG)材料皆具有兩個pKa值，其一為HA-COOH之pKa1及His之pKa2，而此說明材料在pH 2.5~4.5與pH 6~8將因質子化或去質子化而發生電荷性質之改變。
3.製備透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體
將透明質酸衍生物與藥物溶液(阿黴素(doxorubicin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、紫菌素(gentamicin)或DACHPt)以磁石攪拌反應4-72小時以形成一混合物並使藥物被包覆於透明質酸衍生物以形成透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體中。將上述混合物倒入MWCO 3,500的透析袋中對水進行透析24小時以移除未包覆於透明質酸衍生物中的藥物，並將在藉此獲得的溶液中所形成之透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體進行粒徑配方性質分析。
由不同透明質酸衍生物與阿黴素所形成之複合載體的配方如表6所示、由不同透明質酸衍生物與愛萊諾迪肯所形成之複合載體的配方如表7所示、由不同透明質酸衍生物與紫菌素所形成之複合載體的配方如表8所示，而由不同透明質酸衍生物與DACHPt所形成之複合載體的配方如表9所示。
表7、由不同透明質酸衍生物與愛萊諾迪肯所形成之複合載體的配方
4.透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體之特性分析
A.透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體
(1)穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)
將透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(配方編號DHC1902)以穿透式電子顯微鏡進行觀察並照相，結果如第5圖所示。
由第5圖可得知，透明質酸衍生物可良好包覆阿黴素並形成微胞。
(2)pH值對於藥物釋放之影響
分別將配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體在pH 7.4與pH 5.0進行累計藥物釋放分析，結果如第6圖所示。而累計藥物釋放分析之詳細實驗方法如下所述。
將500μl之配方置入透析袋(MWCO 3.5kD)中。之 後將透析袋兩端開口以透析夾固定，並放入瓶中，且將透析外液加入瓶中。透析外液為15ml的不同pH值PBS中(pH 7.4或pH 5.0)。將樣品瓶放置恆溫震盪器37℃進行藥物釋放，於每個取樣時間點分別取出透析外液並以激發波長500nm/發射波長560nm來測定藥物釋放量。
由第6圖可得知，配方DHC2101與配方DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體，相較於在pH 7.4，皆在pH 5.0下具有較高之藥物累計釋放率(大於2.5倍)。
(3)細胞毒性分析
將配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體以及阿黴素與微脂體包覆之阿黴素(DO101)以U87MC細胞進行細胞毒性分析，並計算出配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體以及阿黴素與微脂體包覆之阿黴素(DO101)的IC50。結果如第7圖與表10所示。細胞毒性分析之詳細實驗方法如下所述。
將U87細胞以1×104細胞/孔的密度接種於96-孔培養盤中，並放置於37℃、5% CO2培養箱中培養1天。之後，將舊培養液從培養盤取出並將100μL、50μM、10μM、2μM、0.4μM、80nM、16nM以及3.2nM的阿黴素、DO101、DHC2101或DHC2501分別加入培養盤中作用48小時。接著從培養盤取出舊培養液並以培養液洗滌三次。取出舊培養液後，將100μL、0.5mg/mL MTT試劑加入培養盤中，並將培養盤於37℃作用4小時。然後取出舊培養液並加入100μL之0.1N HCl/異丙醇於 培養盤中以溶解沉澱物。最後，將培養盤放置於酵素免疫分析儀(ELISA reader)中偵測其在波長570nm的吸收值，並以下方所示公式換算為細胞活率(cell viability)。
細胞存活率(cell viability)(%)=樣本強度/控制組強度×100%
根據第7圖與表10可知，配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體的細胞毒殺效果與阿黴素相當。由此可知，藥物並不會因被包覆而無法釋放，且配方DHC2101與DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體明顯優於對照組-微脂體包覆之阿黴素(DO101)的細胞毒殺效果。
(4)於大鼠血液中透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體所釋放之藥物的濃度分析
將大鼠分組，分別給予3mg/kg的配方DHC2101所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體、DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體或阿黴素，在5分鐘、30分鐘，1小時、2小時、4小時、8小時與24小時下抽取血液樣品，並以LC-MS/MS來分析血漿中阿黴素的濃度。結果如第8圖所示。
結果顯示，藉由配方的保護，能夠延長阿黴素在 血液中的滯留時間。
(5)透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體對活體內之腫瘤的抑制分析
將U87-MG人類多型性神經膠母細胞瘤細胞株植入裸小鼠背部。待腫瘤大小達100-200mm3後，小鼠進行分組，每星期分別以尾靜脈注射2次配方DHC2101所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(5mg阿黴素/kg)、DHC2501所形成之透明質酸衍生物/阿黴素奈米複合載體(5mg阿黴素/kg)或PBS，共給藥4劑，並定期量測腫瘤大小變化。結果如第9圖所示。
由第9圖可以得知，DHC2501配方具有較佳的腫瘤抑制效果。
A.透明質酸衍生物/(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑(DACHPt)奈米複合載體
(1)穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)
分別將透明質酸/DACHPt(PtHC101)與透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體(PtHC305)以穿透式電子顯微鏡進行觀察並照相，結果如第10圖所示。
由第10圖可得知，透明質酸無法包覆DACHPt而形成微胞，而相對地，透明質酸衍生物則可良好包覆DACHPt並形成微胞。
(2)藥物釋放
分別將配方PtHC101所形成之透明質酸/DACHPt 奈米複合載體，及配方PtHC201、PtHC301與PtHC401所分別形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體在pH 7.4進行累計藥物釋放分析，結果如第11圖所示。累計藥物釋放分析之詳細實驗方法如下所述。
將300μl之配方置入透析袋(MWCO 3.5kD)中。之 後將透析袋兩端開口以透析夾固定，並放入瓶中，且將透析外液加入瓶中。透析外液為15ml PBS(pH7.4)。將樣品瓶放置恆溫震盪器37℃進行以使藥物釋放。於每個取樣時間點分別取出透析外液500μl，並將取出透析外液之加入5ml去離子水稀釋11倍，之後，以感應偶合電漿-原子放射光譜(Inductively coupled plasma with atomic emission spectroscopy,ICP-AES)進行Pt濃度分析定量。
由第11圖可得知，隨著各配方之透明質酸衍生物中的Boc-組胺酸接枝量越高，透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體之整體藥物釋放百分比越低，而此顯示材料導入Boc-組胺酸的確會增加疏水性進而影響藥物之釋放比例。
(4)於大鼠血液中透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體所釋放之藥物的濃度分析
將大鼠分組，分別給予0.5mg/大鼠的益鉑樂(oxaliplatin)、PtHC101、PtHC305或PtHC603，在不同時間下抽取血液樣品，並以感應偶合電漿-原子放射光譜分析血漿中Pt的濃度，並計算出各配方之初始血中藥物濃度(C0)、半衰期(T1/2)、曲線下積分面積(AUClast)、分佈體積(Vz)、清除率(Cl)值。結果如第12圖與表11所示。
相較於益鉑樂，透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合 載體可明顯降低Pt的分布體積與清除率，因而可增加Pt在血漿中的AUC(益鉑樂vs.PtHC305、PtHC603與PtHC101)。結果顯示，藉由配方的保護，能夠延長Pt藥物在血液中的滯留時間，且相較益鉑樂，透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體於曲線下面積(AUC)約提高15-20倍。其中PtHC101配方為不含組胺酸修飾的透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體，整體配方穩定性明顯降低。
(5)透明質酸衍生物/藥物奈米複合載體對活體內 之腫瘤的抑制分析
將HT-29人類大腸癌細胞株植入裸小鼠背部。待腫 瘤大小達100-200mm3後，每星期分別將不同組別之小鼠以尾靜脈注射2次配方PtHC604所形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體(2mg Pt/kg)、益鉑樂(2mg Pt/kg)或10%蔗糖，共給藥6劑，並定期量測腫瘤大小變化及計算腫瘤成長抑制率(Tumor growth inhibition,TGI)，結果如第13圖所示。腫瘤成長抑制率之計算公式如下所示。
腫瘤成長抑制率TGI(%)=[1-(△藥物處理組腫瘤體積/△載劑(vehicle)組腫瘤體積)」×100。
由第13圖可以得知，配方PtHC604所形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體具較佳抑制腫瘤生長能力。從第14天到第42天，給藥配方PtHC604所形成之透明質酸衍生物/DACHPt奈米複合載體的小鼠其腫瘤生長抑制率(TGI)為72±4%；相對的，給藥益鉑樂的小鼠腫瘤生長抑制率(TGI)僅有42±8%，兩者間具有統計差異(p<0.05)。而上述結果再次證明本申請案所製備的奈米載體具有較佳的抗腫瘤抑制效果。

Claims (29)

  1. 一種生醫組合物，包括：一透明質酸；一經修飾之組胺酸；以及一聚合物或C4-C20烷類，其中該經修飾之組胺酸，與該聚合物或C4-C20烷類，接枝於該透明質酸之至少一個一級羥基上以與該透明質酸形成一透明質酸衍生物，且其中該經修飾之組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0-40%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該透明質酸之至少一個一級羥基，包括，一羥基，其位於該透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該透明質酸分子量為約7,000-500,000。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為0。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸包括Boc-組胺酸(Boc-histidine)、Cbz-組胺酸(Cbz-histidine)、Fmoc-組胺酸(Fmoc-histidine)或Ac-組胺酸(Ac-histidine)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之生醫組合物，其中該Boc-組胺酸之接枝率為約1-100%，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該聚合物包括聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(poly lactic acid,PLA)、聚乙醇酸(polyglycolic acido,PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該聚合物為聚乙二醇。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之生醫組合物，其中該聚乙二醇之接枝率為約1-40%。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，且其中該Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，而該聚乙二醇之接枝率為約1-30%。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該C4-C20烷類包括C5H11、C7H15、C9H19或C11H23。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該C4-C20烷類為C11H23。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之生醫組合物，其中該C11H23之接枝率為約1-40。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，且其中該Boc-組胺酸之接枝率為 約1-80%，而該C11H23之接枝率為約1-30%。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，其中該透明質酸衍生物的分子量為約7,000-1,500,000。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之生醫組合物，更包括一在水中帶正電之活性成分，其中該在水中帶正電之活性成分與該透明質酸衍生物之羧基正負電相吸，以使該在水中帶正電之活性成分包覆於該透明質酸衍生物中。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之生醫組合物，其中該透明質酸衍生物與該在水中帶正電之活性成分之重量比為約2：1-25：1。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之生醫組合物，其中該在水中帶正電之活性成分包括阿黴素(doxorubicin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、紫菌素(gentamicin)或鉑金化合物。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之生醫組合物，其中該鉑金化合物包括(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑(Dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum,DACHPt)、順鉑(cisplatin)或益樂鉑(oxaliplatin)。
  21. 如申請專利範圍第17項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，而該聚合物或C4-C20烷類之接枝率為約0，且該在水中帶正電之活性成分為阿黴素、愛萊諾迪肯、紫菌素或(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之生醫組合物，其中該透明質酸之至少一個一級羥基，包括，一羥基，其位於該透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上。
  23. 如申請專利範圍第21項所述之生醫組合物，其中該Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，而該透明質酸衍生物與該在水中帶正電之活性成分之重量比為約1.25：1-25：1。
  24. 如申請專利範圍第17項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，而該聚合物或C4-C20烷類為聚乙二醇，且該在水中帶正電之活性成分為阿黴素、愛萊諾迪肯、紫菌素或(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之生醫組合物，其中該透明質酸之至少一個一級羥基，包括，一羥基，其位於該透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之生醫組合物，其中該Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，該聚乙二醇之接枝率為1-30%，而該透明質酸衍生物與該在水中帶正電之活性成分之重量比為約3：1-50：1。
  27. 如申請專利範圍第17項所述之生醫組合物，其中該經修飾之組胺酸為Boc-組胺酸，而該聚合物或C4-C20烷類為C11H23，且該在水中帶正電之活性成分為阿黴素或(1,2-二氨基環己烷)二氯化鉑。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之生醫組合物其中該透明質酸之至少一個一級羥基，包括，一羥基，其位於該透明質酸中之至少一個雙糖單位的N-乙醯葡糖胺部分之第5個碳上。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之生醫組合物，其中該Boc-組胺酸之接枝率為約1-80%，該聚乙二醇之接枝率為1-30%，而該透明質酸衍生物與該在水中帶正電之活性成分之重量比為約2.5：1-4：1。
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