CN109044991B - 巨噬细胞载药制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种巨噬细胞载药制剂及其制备方法。一种巨噬细胞载药制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将抗肿瘤药物溶解在溶剂中，配制成抗肿瘤药物溶液；(2)将巨噬细胞悬浮于质量百分比为(5±1)％的葡萄糖溶液中，得到巨噬细胞悬液；(3)将抗肿瘤药物溶液加入巨噬细胞悬液中，混匀；(4)培养1.5‑3.5小时后，离心，收集细胞沉淀，获得巨噬细胞载药制剂。本发明的巨噬细胞载药制剂包封率高、载药细胞活力持续时间长、且能缓慢释放药物，具有良好的肿瘤靶向和抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向递药制剂，特别是涉及一种巨噬细胞载药制剂及其制备方法。
背景技术
机体循环系统中的各种细胞具有不同的生理功能，这些功能包括：持久的血液循环寿命、对内源性物质和代谢物的转运能力、对炎症部位的趋向性、穿过脂性生物膜屏障、在血液与组织间相互迁移、归巢或迁移到特定病理环境的能力等，这些功能正在成为其作为药物载体的优良条件。目前研究的细胞载体有红细胞、免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞)和干细胞等。然而对于大规模的生产和使用，红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和干细胞的来源和制备过程是阻碍其应用的主要问题。同时，大多数细胞载体都存在包封率低，制备工艺复杂、制备过程耗时长、生物活性低等缺陷。
巨噬细胞来源广、制备工艺相对成熟，还具有肿瘤归巢性和生物相容性，已经成为癌症治疗的新策略。然而，巨噬细胞载药制剂仍然具药物包封率低以及载药后活力维持时间短等缺点，其在肿瘤治疗领域的应用因此受到了极大地阻碍。中国药典规定，产品化制剂的包封率必须大于80％。目前已报道的巨噬细胞载药制剂的药物包封率仅为13.8％，远远低于中国药典规定的标准。因此，寻找一种能够制备高包封率和细胞活力维持时间长的巨噬细胞载药制剂的制备方法具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明提供一种巨噬细胞载药制剂的制备方法，该方法所制备得到的巨噬细胞载药制剂具有较高的药物包封率、持久的生物活力。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种巨噬细胞载药制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将抗肿瘤药物溶解在溶剂中，配制成抗肿瘤药物溶液；
(2)将巨噬细胞悬浮于质量百分比为(5±1)％的葡萄糖溶液中，得到巨噬细胞悬液；
(3)将抗肿瘤药物溶液加入巨噬细胞悬液中，混匀；
(4)培养1.5-3.5小时后，离心，收集细胞沉淀，获得巨噬细胞载药制剂。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述巨噬细胞悬液的密度为5×105-1×106个/mL。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述抗肿瘤药物溶液的浓度为2mmol/L-4mmol/L；步骤(3)中，所述抗肿瘤药物溶液与巨噬细胞悬液的体积比为1:0.8-1.2。
在其中一个实施例中，所述抗肿瘤药物溶液与巨噬细胞悬液的体积比为1:1。
在其中一个实施例中，步骤(4)中，所述培养时间为(2±0.5)小时。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，所述溶剂为二甲基亚砜。
在其中一个实施例中，所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物或水溶性抗肿瘤药物。
在其中一个实施例中，所述巨噬细胞为M1型。
本发明的另一目的是提供一种上述方法制备的巨噬细胞载药制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的发明人在研究巨噬细胞载药制剂时发现，当药物以游离状态进入巨噬细胞时，制备过程中的待载药物浓度、巨噬细胞悬液的密度、待载药物与巨噬细胞悬液的比例，对于药物包封率、以及载药后的细胞活力有重要影响。本发明的巨噬细胞与抗肿瘤药物在质量百分比为(5±1)％的葡萄糖溶液中培养1.5-3.5小时后，药物即能够以游离的形式快速分布于巨噬细胞中，所得到的巨噬细胞载药制剂的包封率能达到83.371％，符合中国药典对产品化制剂的包封率的要求。此外，本发明所制备的巨噬细胞载药制剂能稳定缓慢释放药物，释放时间可维持高达96小时；载药后巨噬细胞载体可在72小时内保持活力。
(2)本发明的巨噬细胞载药制剂具有良好的肿瘤抑制作用。例如，当所述负载的药物为脂溶性阿霉素时，在荷瘤鼠模型中，本发明的巨噬细胞载药制剂能有效的抑制肿瘤生长和延长荷瘤裸鼠生存率，具有比上市药品阿霉素脂质体更好的抗肿瘤活性。
(3)进一步地，本发明的发明人在研究中发现，当巨噬细胞为M1型时，具有更优的药物包封率和细胞活力。在上述巨噬细胞载药系统中，如果选择使用巨噬细胞的M1型时，可促进分泌促炎因子和趋化因子来发挥抗肿瘤效果。此外，还可促进将肿瘤抗原提呈给其他免疫细胞，发挥免疫监视的功能，而此同时，载药中的M1型巨噬细胞还可进一步刺激周围巨噬细胞，将其激化为M1型，进而又帮助免疫系统发挥抗癌效果。
附图说明
图1为巨噬细胞(M1)和巨噬细胞载药制剂(M1-Dox)的粒径图。
图2为巨噬细胞载药制剂的药物释放曲线。
图3为巨噬细胞载药制剂对卵巢癌细胞的趋向曲线。
图4为巨噬细胞载药制剂对正常卵巢细胞的趋向曲线。
图5为巨噬细胞载药制剂和市售的药品阿霉素脂质体在卵巢癌晚期模型鼠的体内分布情况。
图6为巨噬细胞载药制剂、市售的药品阿霉素脂质体和游离药物对卵巢癌晚期模型鼠进行治疗后各组肿瘤重量定量图。
图7为巨噬细胞载药制剂、市售的药品阿霉素脂质体和游离药物对卵巢癌晚期模型鼠进行治疗后的各组Kaplan–Meier存活曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、巨噬细胞载药制剂的制备
实施例1：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐(购自大连美仑生物技术有限公司)于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将1.630mg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)RAW264.7细胞(购自中山大学动物实验中心)在含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司)中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS(购自美国Sigma-Aldrich公司)and 2ng/mL IFNγ(购自美国PeproTech公司)的完全培养基(即：含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司))。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
实施例2：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将2.445mg阿霉素粉末溶于1mlDMSO中，配成4.5mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS and 2ng/mL IFNγ的完全培养基。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入4.5μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
实施例3：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐(购自大连美仑生物技术有限公司)于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将0.815mg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中，配成1.5mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS and 2ng/mL IFNγ的完全培养基。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入1.5μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
实施例4：负载阿霉素的M0型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜。
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色。
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末。
(5)将1.630mg阿霉素粉末溶于DMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M0型巨噬细胞制备：
RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。离心收集细胞待单层细胞片层达到80％汇合度时，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M0型巨噬细胞的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M0型巨噬细胞。
实施例5：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐(购自大连美仑生物技术有限公司)于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将1.630mg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)THP1人源巨噬细胞(购自中山大学动物实验中心)在含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司)中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS(购自美国Sigma-Aldrich公司)and 2ng/mL IFNγ(购自美国PeproTech公司)的完全培养基(即：含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司))。
(3)继续培养48小时后，收集细胞悬液，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
实施例6：负载紫杉醇的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
紫杉醇原液的配置：
称取2.562mg紫杉醇粉末(购自大连美仑生物技术有限公司)溶于1mL DMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞制备：
(1)RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS and 2ng/mL IFNγ的完全培养基。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载紫杉醇的M1型巨噬细胞载药制剂：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol紫杉醇，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载紫杉醇的M1型巨噬细胞。
实施例7：负载顺铂的M1型巨噬细胞载药制剂
顺铂原液的配置：
称取0.894mg顺铂粉末(购自大连美仑生物技术有限公司)溶于1mL DMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞制备：
(1)RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS and 2ng/mL IFNγ的完全培养基。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载的M1型巨噬细胞：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol顺铂，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载顺铂的M1型巨噬细胞。
对比例1：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐(购自大连美仑生物技术有限公司)于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将1.630mg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)RAW264.7细胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS and 2ng/mL IFNγ的完全培养基。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于PBS缓冲液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
对比例2：负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备
脂溶性阿霉素的制备：
(1)称量20mg阿霉素盐酸盐(购自大连美仑生物技术有限公司)于100毫升圆底烧瓶，加入20mL二氯甲烷充分溶解。
(2)按照摩尔比1:3加入14.3mL的三乙胺，25℃搅拌过夜；
(3)24小时后收集产物，置于透析袋中透析，直至透析液澄清无色；
(4)收集透析袋中物质，将其冻干，得到深红色阿霉素粉末；
(5)将1.630mg阿霉素粉末溶于DMSO中，配成3mmol/L的终浓度。
M1型巨噬细胞的制备：
(1)RAW264.7细胞(购自中山大学动物实验中心)在含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司)中，37℃、5％CO2的培养条件下传代培养。
(2)传代24小时后，细胞培养基换为含0.5μg/mL LPS(购自美国Sigma-Aldrich公司)and 2ng/mL IFNγ(购自美国PeproTech公司)的完全培养基(即：含10％胎牛血清(购自美国Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司))。
(3)继续培养48小时后，轻轻吹打细胞使其悬浮，在1000rpm、5min的离心条件下收集细胞，重悬于质量百分比为5％的葡萄糖溶液中，并将细胞密度调整为1×106个/mL。
负载阿霉素的M1型巨噬细胞载药制剂的制备：
(1)将1mL细胞密度为1×106个/mL细胞悬液置于无菌离心管中，加入3μmol阿霉素，混匀。
(2)在37℃、5％CO2的培养箱中静置30分钟后，1000rpm转速下离心5min,收集细胞沉淀即为负载阿霉素的M1型巨噬细胞。
二、测定巨噬细胞载药制剂的粒径：
在500mL的样品分散器的烧杯里加入300mL的磷酸盐缓冲液，打开Mastersizer2000激光粒度仪(购自英国马尔文公司)的测试软件,启动手动测量。当提示加入样品时,向样品分散器的烧杯中缓慢加入巨噬细胞悬液,直至遮光度达到10％-20％。等待仪器测量结束,导出测量结果。
结果如附图1所示，显示巨噬细胞的平均粒径为10.031μm,巨噬细胞载药制剂的平均粒径为11.876μm，两者粒径差异不大。此现象表明载药前后，药物对巨噬细胞载体没有产生粒径上的影响。
三、测定实施例1-5、对比例1-2的巨噬细胞载药制剂的药物包封率和细胞活力
配制阿霉素浓度为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、0.1nM、0.01nM的巨噬细胞载药制剂溶液.利用紫外可见光谱仪(购自日本岛津公司)在190～700nm范围内对溶液进行波长扫描,然后在溶液吸收峰(481nm)处测定各溶液的吸光度,得到标准曲线为A＝0.0109+0.0261c,线性相关系数R2＝0.9999,其中A为吸光度,c为阿霉素浓度(nM)。准备三个1.5mL的EP管，管内置1.0mL密度为1×106个/mL细胞悬液，每管加入3μmol的药物。在37℃、5％CO2的培养箱中静置2小时后，1000rpm转速下离心5min。收集上清液于481nm处测紫外吸光度值，根据阿霉素的标准曲线算出未包载的游离阿霉素含量。包封率＝1-[M(游离阿霉素素)/3μmol]。
将巨噬细胞制剂以每孔100μL种于白色的96孔板里，在每个测试时间点取出细胞培养板在室温平衡10分钟，然后每孔加入100μL的CellTiter-LumiTM发光法检测试剂(购自中国碧云天公司)，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温孵育10分钟后，待发光信号趋于稳定后使用多功能酶标仪进行化学发光检测。相对细胞活力＝V(所测时间点细胞发光读数)/V(0时间点细胞发光读数)
实施例1-5、对比例1-2的药物包封率和细胞活力如表1所示。
表1
从实施例1-3可知，制备巨噬细胞载药载体的过程中，巨噬细胞载药制剂的包封率和细胞活力受待载药物量的影响。实施例2中，当巨噬细胞待载的药物量过多时(4.5μmol/1×106个)，巨噬细胞的活力大大下降，部分细胞死亡。实施例3中，当巨噬细胞待载的药物量过少时(1.5μmol/1×106个)，巨噬细胞药物负载量低至0.931μmol/1×106个细胞，将增加给药剂量和给药次数，增加用药成本。
从实施例1和实施例4可看出，当巨噬细胞为M1型时，具有更优的药物包封率和细胞活力。在本发明的巨噬细胞载药系统中，如果选择使用巨噬细胞的M1型时，可促进分泌促炎因子和趋化因子来发挥抗肿瘤效果。此外，还可促进将肿瘤抗原提呈给其他免疫细胞，发挥免疫监视的功能，而此同时，载药中的M1型巨噬细胞还可进一步刺激周围巨噬细胞，将其激化为M1型，进而又帮助免疫系统发挥抗癌效果。从实施例1和实施例5可看出，人源或者鼠源的巨噬细胞载药制剂的药物包封率、药物负载量、载药后细胞活力以及活力维持时间都没有明显区别，由此可知，巨噬细胞的来源对巨噬细胞载药制剂的整体制剂效果没有明显影响。
从实施例1和对比例1可知，巨噬细胞与药物混合后的培养液对最终制备得到的巨噬细胞载药制剂的包封率和活力也有较大的影响。当巨噬细胞悬浮于质量百分比为5％的葡萄糖溶液时，所得到的巨噬细胞载药制剂的包封率为83.371％，并在72h内维持良好的活力。而对比例1中，将巨噬细胞悬浮于PBS溶液中，所得到的巨噬细胞载药制剂包封率大幅度降低至30.219％，载药后的巨噬细胞活力维持时间下降到58小时。
从实施例1和对比例2可知，巨噬细胞和抗肿瘤药物混合后的培养时间对巨噬细胞载药制剂的包封率也有一定的影响。药物进入巨噬细胞不只是一个简单的快速混合过程，药物要均匀的分布于巨噬细胞中需要充足的时间。其中，游离的脂溶性抗癌药物可通过分子间的静电疏水作用进入巨噬细胞，游离的水溶性药物可由细胞内外渗透压差异及细胞的主动摄取能力进入巨噬细胞。在对比例2中，当培养时间仅为30分钟时，包封率仅28.122％，可见药物在此时间内不足以充分地分布于细胞中。而通过本发明的筛选发现，当培养时间为1.5-3.5h时，药物具有最大的包封率，超过此时间范围，包封率无明显增加。
四、测定巨噬细胞载药制剂的累积释放量：
配制阿霉素浓度为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、0.1nM、0.01nM的巨噬细胞载药制剂溶液.利用紫外可见光谱仪(购自日本岛津公司)在190～700nm范围内对溶液进行波长扫描,然后在溶液吸收峰(481nm)处测定各溶液的吸光度,得到标准曲线为A＝0.0109+0.0261c,线性相关系数R2＝0.9999,其中A为吸光度,c为阿霉素浓度(nM)。准备三个1.5mL的EP管，每管各400μL，含提前配置好的巨噬细胞载药制剂。在每个测定时间点，离心三管制剂溶液，1000rpm，3min，收集上清液于481nm处测紫外，往沉淀中加入新的400μL磷酸戊盐缓冲液。导出数据，根据阿霉素的标准曲线算出每个时间点游离阿霉素含量即为该时间点的阿霉素的释放量。
结果如附图2所示，显示随时间递进，巨噬细胞载药制剂内的药物稳定缓慢释放，96小时后，药物几乎释放完毕。此现象表明巨噬细胞载药制剂可缓慢释放，泄漏量低。
五、巨噬细胞载药制剂对肿瘤细胞的趋向性研究：
收取卵巢癌细胞SKOV3(购自中山大学动物中心)的培养上清和普通完全培养基，分别将其以每孔165μL的体积接种于RTCA系统的CIM-Plate 16孔板的下室(购自美国ACEA公司)。组装CIM-Plate 16孔板的上下室后，将1×104/ml的巨噬细胞接种在孔板上室。设定监控时长为24h，时间间隔为0.5h进行实时观察。随着时间的推移，通过RTCA系统动力学变化反应曲线反映各孔0～24h间巨噬细胞的趋向肿瘤微环境的状况。
结果如附图3所示，显示相对于普通培养基(0％TCS),巨噬细胞载药制剂对肿瘤细胞培养环境(100％TCS)具有明显趋向性，能够灵敏识别肿瘤细胞。(TCS:tumor cellculture supernatants肿瘤细胞培养上清)。此现象表明巨噬细胞载药制剂能够趋向肿瘤微环境。
六、巨噬细胞载药制剂对正常细胞的趋向性研究：
收取正常卵巢细胞CHO(购自中山大学动物中心)的培养上清和普通完全培养基，分别将其以每孔165μL的体积接种于RTCA系统的CIM-Plate 16孔板的下室(购自美国ACEA公司)。组装CIM-Plate 16孔板的上下室后，将1×104/ml的巨噬细胞接种在孔板上室。设定监控时长为24h，时间间隔为0.5h进行实时观察。随着时间的推移，通过RTCA系统动力学变化反应曲线反映各孔0～24h间巨噬细胞的趋向肿瘤微环境的状况。
结果如附图4所示，显示相对于普通培养基(0％NCS),巨噬细胞载药制剂对正常细胞培养环境(100％NCS)不具有趋向性，不会识别并趋向肿瘤细胞。(NCS:normal cellculture supernatants正常细胞培养上清)。此现象表明巨噬细胞载药制剂不会趋向正常细胞环境。
七、巨噬细胞载药制剂与市售的药品阿霉素脂质体肿瘤靶向性对比研究：
收集处于对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3细胞，经裸鼠(购自中山大学动物中心)腹部注射卵巢癌细胞SKOV3 1×107/只，建立荷瘤鼠模型。造模两周后，将荷瘤裸鼠6只随机均分为两组：巨噬细胞载药制剂组和市售的药品阿霉素脂质体组。按照1×106个巨噬细胞加入5μL标记工作液DiD(购自美国Sigma-Aldrich公司)的比例向待标记细胞中加入标记工作液,37℃孵育5分钟。标记后的巨噬细胞和市售的药品阿霉素脂质体以腹腔注射的方式注射至荷瘤裸鼠(0.2m L/只)。24小时后，处死6只裸鼠，取动物的心、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、子宫卵巢在小动物活体成像仪(购自德国NightOWL公司)拍照成像，并对其进行定量分析。
结果如附图5所示，显示相对于市售的药品阿霉素脂质，巨噬细胞载药制剂在荷瘤小鼠体内的肿瘤组织分布更多，在肝脏等正常器官的分布也明显低于市售的药品阿霉素脂质体。此现象表明巨噬细胞载药制剂可将药物靶向递送到肿瘤部位，降低药物对其他组织的毒副作用。
八、巨噬细胞载药制剂与市售的药品阿霉素脂质体、游离阿霉素盐酸盐和空白生理盐水给药组的抗肿瘤活性研究：
建立荷瘤鼠模型。造模一周后，将荷瘤裸鼠24只随机均分为四组：巨噬细胞载药制剂组、市售的药品阿霉素脂质体组、游离药物组和空白给药组。巨噬细胞载药制剂组、市售的药品阿霉素脂质体组和游离药物组以阿霉素给药量为0.2mg/kg的剂量腹腔给药。空白给药组注射200μL的生理盐水。给药周期为21天，每三天给一次药。开始给药28天后，分别处死各组裸鼠，剥离肿瘤组织，滤纸吸干后称重。
结果如附图6所示，显示相对于市售的药品阿霉素脂质体组、游离药物组和空白给药组，巨噬细胞载药制剂组的肿瘤重量显著低于其他三组。此现象表明巨噬细胞载药制剂能有效的抑制肿瘤生长，比市售的药品阿霉素脂质体具有更好的抑制肿瘤的作用。
九、巨噬细胞载药制剂与市售的药品阿霉素脂质体、游离阿霉素盐酸盐和空白生理盐水给药组的对肿瘤模型鼠生存率影响研究：
建立荷瘤鼠模型。造模一周后，将荷瘤裸鼠24只随机均分为四组：巨噬细胞载药制剂组、市售的药品阿霉素脂质体组、游离药物组和空白给药组。巨噬细胞载药制剂组、市售的药品阿霉素脂质体组和游离药物组以阿霉素给药量为0.2mg/kg的剂量腹腔给药。空白给药组注射200μL的生理盐水。给药周期为21天，每三天给一次药。之后，每天观察各组裸鼠状态，记录其死亡时间。
结果如附图7所示，显示相对于市售的药品阿霉素脂质体组、游离药物组和空白给药组，巨噬细胞载药制剂组的裸鼠生存率显著高于其他三组(P<0.0001)。此现象表明巨噬细胞载药制剂能有效的延长荷瘤裸鼠生存率，比市售的药品阿霉素脂质体具有更好的抗肿瘤活性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将抗肿瘤药物溶解在溶剂中，配制成抗肿瘤药物溶液；
(2)将巨噬细胞悬浮于质量百分比为(5±1)％的葡萄糖溶液中，得到巨噬细胞悬液；
(3)将抗肿瘤药物溶液加入巨噬细胞悬液中，混匀；
(4)培养1.5-3.5小时后，离心，收集细胞沉淀，获得巨噬细胞载药制剂；
步骤(1)中，所述抗肿瘤药物溶液的浓度为2mmol/L-4mmol/L；
所述巨噬细胞为M1型。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述巨噬细胞悬液的密度为5×105-1×106个/mL。
3.根据权利要求2所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述抗肿瘤药物溶液与巨噬细胞悬液的体积比为1:0.8-1.2。
4.根据权利要求3所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物溶液与巨噬细胞悬液的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养时间为(2±0.5)小时。
6.根据权利要求1-5任一项所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂为二甲基亚砜。
7.根据权利要求1-5任一项所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物或水溶性抗肿瘤药物。
8.根据权利要求1-5任一项所述的巨噬细胞载药制剂的制备方法，其特征在于，所述的巨噬细胞来源为人源或鼠源。
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