CN114288278A - 一种载药微藻、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载药微藻、制备方法及其应用。该载药微藻以钝顶螺旋藻为药物载体，通过一步法，直接装载药物姜黄素制备而成。该方法简易可行、绿色安全、载药量大、载药效率高。该载药微藻经口服后在肠道部位逐渐降解，并缓慢释放药物，显著提高肠道的药物浓度。口服该载药微藻制剂能结合放疗和化疗，协同抑制肿瘤，并能有效预防肠道组织的辐射损伤；此外，口服该载药微藻能有效减轻溃疡性结肠炎的炎症反应；该载药微藻在荧光成像方面表现优异，能够实现药物在体内的无创跟踪和实时监测；该载药微藻可经过胃肠道降解，表现出良好的生物可降解性；本发明在利用生物活性材料实现肠道相关疾病的口服药物递送和成像引导治疗上具有广阔的应用前景。

Description

一种载药微藻、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种载姜黄素钝顶螺旋藻、制备方法及其应用。

背景技术

口服给药仍然是治疗胃肠道疾病首选和最通用的给药途径，主要是由于口服给药方式的安全性及患者依从性高，且口服药物便于生产、存储和运输。然而，口服药物仍面临许多挑战，包括口服药物易在胃酸环境中降解，以及许多药物在肠道中的滞留性差和生物利用度低等。为了提高口服给药的效率，目前研究了各种药物载体来设计新型口服给药系统，如脂质体、树枝状聚合物、胶束、聚合物偶联物、聚合物纳米粒子、硅或碳材料以及金属和磁性纳米粒子。通常，需要进行复杂的设计思路和繁琐的合成方法来调整上述药物载体的化学和物理特性，从而实现载药系统的多功能性，并应用于药物递送和疾病治疗诊断。这也导致如技术挑战、高制造成本和低制造效率等主要问题。更重要的是，将这些化学合成材料转化为临床应用的可行性受到了生物降解性不足、稳定性低和体内非特异性毒性的严重限制。因此，如何开发合理、有效、生物相容性好的多功能口服递送途径或系统，来提高口服药物的疗效及发挥胃肠道疾病的诊疗作用，是口服药物递送一个亟待解决的关键问题。

基于此，以天然生物材料构建的药物递送系统用于口服治疗胃肠道疾病存在极大前景。微藻，作为一种天然生物材料，在自然界中具有丰富的生物资源，目前已在食品、医药、水产养殖、能源、农业、环保等领域展现出重要的应用价值。其中，本发明中使用到的钝顶螺旋藻具有极高的营养成分，如丰富藻蓝蛋白、类胡萝卜素和多糖等，已被开发口服营养膳食补充剂。不仅如此，钝顶螺旋藻在生理环境中具有生物降解性，为其在应用于生物医学领域提供了一定的生物安全性。已有研究表明，钝顶螺旋藻带有负电荷的表面可通过静电吸附作用装载带正电荷的小分子药物，并且其细胞膜上连续的水通道和连接孔(14-16nm)也允许小分子通过并进入膜内。检索国内外有口服给药系统设计及胃肠道疾病治疗的文献和专利结果表明：目前还没有发现基于载姜黄素钝顶螺旋藻口服制剂及其应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天然环保、简易可行、易规模化的载药微藻、制备方法及其在治疗肠道疾病等中的应用，该方法制得的载姜黄素钝顶螺旋藻可在口服后，保护药物进入肠道，并随胃肠道的消化逐渐分裂降解，同时缓慢释放药物，显著提高药物的口服利用度，提高结肠癌及结肠炎的治疗效果，避免全身不良反应，为构建多功能口服载药系统的研究提供了新的思路和方法。

本发明采用的技术方案具体如下：

一种载药微藻，所述载药微藻由钝顶螺旋藻和负载于钝顶螺旋藻中的姜黄素组成。

进一步地，所述姜黄素负载率大于80％。

一种上述载药微藻的制备方法，具体为：

将姜黄素溶液加入超纯水悬浮的钝顶螺旋藻藻液，避光搅拌孵育，利用微藻的活性表面将姜黄素负载进钝顶螺旋藻后，分离沉淀获得载药微藻。

进一步地，所述的超纯水悬浮的钝顶螺旋藻藻液及所述的姜黄素溶液，配比范围为50-500μg/mL:20-2000μg/mL。

本发明所述的载药微藻，具有高载药效率、高载药量、高生物安全性，极大地提高了载药系统在生物体内的利用效率和生物相容性，能作为包括降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等姜黄素具有的功能性口服药物递送系统用于疾病治疗；其中，螺旋藻载体中固有的叶绿素具有天然荧光特性，可实现口服后的胃肠道荧光成像，无需任何额外的荧光标记即可实现体内的无创追踪，即：可作为造影剂用于胃肠道的荧光成像。

进一步地，本发明所述的载药微藻，可根据肿瘤患者及肠炎患者的早期成像诊断，来进行不同剂量的给药。所述的姜黄素钝顶螺旋藻作为医学成像造影剂和口服药物的给药剂量和浓度，可由临床医生例行确定。用药方案取决于各种因素，例如肿瘤或炎症病灶是分散还是局部，患者的健康程度、性别及年龄等。通过参照其他造影剂和口服药物的用药方案，本领域技术人员能够确定本发明药物的最佳有效剂量及浓度。

本发明所述的载药微藻还可以应用于腹/盆部肿瘤放疗前的肠道辐射防护；结肠癌的放疗/化疗协同肿瘤治疗；炎症性肠病治疗等。

本发明的有益效果是，以钝顶螺旋藻作为口服药物的载体，具有商业化及临床转化的巨大潜力。本发明中使用一步法将小分子药物姜黄素装载入螺旋藻中，显示出了较高的载药效率，且所述的原料简易可得，绿色环保，制备方法简单。

在口服治疗应用方面，本发明中载姜黄素钝顶螺旋藻具有微米级别尺寸，其螺旋形态易被肠绒毛所捕获，能够实现在肠道部位的长时间滞留。此外，该微藻载体能明显促进姜黄素的吸收，提高其生物利用度。同时，螺旋藻载体中固有的叶绿素具有天然荧光特性，可实现口服后的胃肠道荧光成像，无需任何额外的荧光标记即可实现体内的无创追踪。该药物递送系统具有高载药效率、良好药物缓释性和生物安全性，能有效地实现荧光成像引导下结肠癌和结肠炎的精准治疗。

附图说明

图1为钝顶螺旋藻明场(Bright-field)及荧光场(Fluorescence)下的光学显微镜图片及扫描电镜(SEM)图片；

图2为不同物料比下钝顶螺旋藻载姜黄素的载药效率统计图；

图3为载姜黄素钝顶螺旋藻制剂经人工胃液(SGF，a)和人工肠液(SIF，b)处理后不同时间点下的药物释放曲线图；

图4为载姜黄素钝顶螺旋藻制剂经小鼠口服后，利用小动物活体成像仪得到注射前后不同时间点小鼠胃肠道的荧光信号图；

图5载姜黄素钝顶螺旋藻制剂经小鼠口服后，在消化道内的形态变化(明场显微镜、荧光场显微镜和扫描电镜图片)。

图6为载姜黄素钝顶螺旋藻制剂、姜黄素、钝顶螺旋藻对X线腹部照射所致的小肠隐窝增殖受损的防护作用(Ki67免疫组化染色)对比图。

图7为载姜黄素钝顶螺旋藻制剂、姜黄素、钝顶螺旋藻对盲肠原位结肠癌放疗/化疗协同治疗后的肿瘤体积和重量结果对比图(**，p值＜0.01；***，p值＜0.001)。图中，a为带肿瘤盲肠组织的离体照片，b为肿瘤的重量统计图。

图8为载姜黄素钝顶螺旋藻制剂、姜黄素、钝顶螺旋藻对DSS诱导的溃疡性结肠炎治疗后的直肠出血情况和结肠长度(5个重复)对比图。

图9为连续口服载姜黄素钝顶螺旋藻制剂、姜黄素、钝顶螺旋藻30天后的血常规(WBC，白细胞；RBC，红细胞；HGB，血红蛋白；MCH，平均红细胞血红蛋白量；MCHC，平均红细胞血红蛋白浓度；MCV，平均细胞体积；PLT，血小板；HCT，血细胞比容)和血生化指标(ALT，丙氨酸转移酶；AST，天冬氨酸转移酶；BUN，尿素氮；CREA，血肌酐)检测结果对比图。

具体实施方式

下文将结合以下附图和实施例进一步说明本发明，但本发明不局限于以下实施例。

实施例1.载姜黄素钝顶螺旋藻制剂SP@Curcumin的合成

取7份每份为500μg(干重)的钝顶螺旋藻(SP)分别悬浮于10mL超纯水中，对应缓慢加入浓度分别为25,50,100,200,400,800,1600μg/mL的1mL姜黄素(Curcumin)溶液，在室温180rpm下避光缓慢搅拌12h；最后，将混合液在4500rpm下离心10min，弃去上清液，沉淀用超纯水悬浮，得到载姜黄素钝顶螺旋藻(SP@Curcumin)。不同姜黄素/螺旋藻物料比下的载药效率，通过利用紫外-可见吸收光谱获得的姜黄素标准曲线以及不同上清液的吸光度来进行计算。计算不同姜黄素/螺旋藻物料比下的载药效率，结果参照图2，可见当姜黄素/螺旋藻物料比大于0.4下，螺旋藻载姜黄素的载药效率均在80％以上。

实施例2.体外药物释放性能检测

使用紫外-可见吸收光谱对SP@Curcumin(负载率86.6％)在37℃含胃蛋白酶(Pepsin)的SGF和37℃含胰酶(Trypsin)的SIF中的释放曲线进行测试；SP@Curcumin在SGF条件下，短时间内仅释放少量药物，0.5h仅释放8％的药物。在SIF条件下，8h释放药物达66％，结果参照图3。

实施例3.荧光成像能力及体内分布

使用小动物活体成像仪对经SP@Curcumin灌胃给药后小鼠全身的荧光成像进行测试。将250μL负载率86.6％的SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到Balb/c裸鼠体内。经过不同时间后，用小动物活体成像仪分别获得小鼠全身的信号图。结果参照图4，相比注射前，注射SP@Curcumin后胃肠道部位的荧光信号快速增强，在24h后仍能在肠道部位检测到荧光信号，说明SP@Curcumin具有较好的肠道滞留能力，这可能是因为其螺旋形态(图1)易被肠绒毛所捕获，从而实现在肠道部位的长时间滞留。同时证明了SP@Curcumin可以作为体内荧光成像的显像剂。

实施例4.体内降解情况

将250μL SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到Balb/c裸鼠体内。2小时后取出小鼠胃肠道不同部位的内容物，用光学显微镜及扫描电镜观察其形态。结果参照图5，SP@Curcumin在胃部和十二指肠中仍能保持完整的螺旋形形态，到空肠开始破裂，在回肠和盲肠中碎成小块。当到达结肠时，完全破碎。说明SP@Curcumin在通过胃肠道环境后能逐渐发生降解，为其在肠道的药物释放及其在体内应用的安全性上提供了优势。

实施例5.肠道辐射保护性能

将250μL SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)、250μL SP(SP＝1.7mg/mL)、250μL Curcumin(curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到Balb/c小鼠体内。给药4h后，小鼠接受剂量为12Gy的X射线照射，辐照7天后取小鼠的回肠组织，5％甲醛固定后切片。回肠切片进行免疫组化(Ki67)染色，评估小肠的放射损伤程度(增殖隐窝)。结果参照图6，经SP@Curcumin预处理后的小鼠，具有最高的隐窝增殖活性。说明SP@Curcumin能减少高剂量辐射引起的肠道损伤，有效保护肠道。

实施例6.抗结肠癌性能

将CT26-Luc结肠癌细胞接种于Balb/c裸鼠的盲肠肠壁，构建盲肠原位结肠癌动物模型。造模一周后，将250μL SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)、250μL SP(SP＝1.7mg/mL)、250μL Curcumin(curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到荷瘤Balb/c裸鼠体内，给药4h后，小鼠接受剂量为12Gy的X射线照射。并在辐照后第3、6、9、12和15天，分别进行给药。在辐照后第15天，安乐死处死小鼠，取出肿瘤进行测量和称重。结果参照图7，经SP@Curcumin治疗组的小鼠，肿瘤体积和重量显著低于对照组(Control，盲肠原位结肠癌动物模型)及其他治疗组。说明SP@Curcumin具有良好的放疗/化疗协同效果，能有效抑制结肠肿瘤生长。

实施例7.抗结肠炎性能

以3％DSS水溶液喂养Balb/c白鼠10天，构建DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，分别在第4、7、10、13、16天将250μL SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)、250μL SP(SP＝1.7mg/mL)、250μL Curcumin(curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到Balb/c白鼠体内。在第16天，评价小鼠的直肠出血情况，安乐死处死小鼠，取出结肠进行测量。结果参照图8，经SP@Curcumin治疗组的小鼠，直肠出血情况轻微，结肠长度与正常组保持相近，显著优于其他处理组。说明SP@Curcumin具有良好的抗炎能力，能有效缓解结肠炎的炎症反应。

实施例8.口服安全性

将250μL SP@Curcumin(SP＝1.7mg/mL,curcumin＝1.2mg/mL)、250μL SP(SP＝1.7mg/mL)、250μL Curcumin(curcumin＝1.2mg/mL)经灌胃给药的方式注射到Balb/c白鼠体内。给药30天后，取小鼠血液进行检测血常规和血生化检测。结果参照图9，SP@Curcumin给药后，小鼠的主要血常规和血生化指标均在正常范围内，说明SP@Curcumin具有良好的口服安全性。

Claims (6)

1.一种载药微藻，其特征在于，所述载药微藻由钝顶螺旋藻和负载于钝顶螺旋藻中的姜黄素组成。

2.根据权利要求1所述的载药微藻，其特征在于，所述姜黄素负载率大于80％。

3.一种权利要求1-2任一项所述载药微藻的制备方法，其特征在于，具体为：

将姜黄素溶液加入超纯水悬浮的钝顶螺旋藻藻液，避光搅拌孵育，利用微藻的活性表面将姜黄素负载进钝顶螺旋藻后，分离沉淀获得载药微藻。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的超纯水悬浮的钝顶螺旋藻藻液及所述的姜黄素溶液，配比范围为50-500μg/mL:20-2000μg/mL。

5.一种权利要求1-2任一项所述载药微藻的应用，其特征在于，包括以下中的一种或多种：

(1)作为造影剂。

(2)制备口服药物。

(3)制备腹/盆部肿瘤放疗前的肠道辐射保护剂。

(4)制备结肠癌口服化疗药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服药物为结肠癌和/或结肠炎的口服药物。

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