CN104382918B - 一种用于肿瘤局部注射的阿霉素脂质体温敏凝胶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿霉素脂质体温敏凝胶及其制备方法，所述阿霉素脂质体温敏凝胶由如下重量份数的组分组成的：阿霉素或阿霉素盐酸盐1～3份、大豆磷脂10～30份、胆固醇2～8份、硫酸铵5～20份、2‑羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖10～40份、甘油磷酸钠40～120份、溶媒500～1500份；本发明阿霉素脂质体温敏凝胶在用于肿瘤局部注射时，提高了阿霉素制剂的抗肿瘤效果，减少了给药次数，并降低其全身性毒副作用；并且，温敏凝胶的性质较为稳定，不易受环境pH值和离子强度的影响。
Description
(一)技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于肿瘤局部注射的阿霉素脂质体温敏凝胶及其制备方法。
(二)背景技术
抗肿瘤药物特别是细胞毒类药物由于缺乏选择性，采用常规途径给药治疗时，常会出现很大的系统毒性，给患者带来了很大的损害，甚至使很多患者因无法承受其系统毒性而被迫中断化疗。而采用肿瘤部位注射给药，可显著提高肿瘤局部的药物浓度，降低抗肿瘤药物的系统毒性，从而获得良好的抗肿瘤效果。由于肿瘤局部给药操作麻烦，技术要求高，不适合于频繁用药，故要求所注射的药物剂型应具有良好的缓释效果。为了满足这一要求，本发明采用新型的壳聚糖温敏凝胶作为给药载体，将室温下呈液态的含药凝胶注入肿瘤部位，使其在体温条件下快速变成固态凝胶缓慢释放药物，从而使药物能长期发挥局部治疗作用。同时为了减少游离药物被吸收进入血管而产生系统毒性，本发明将药物制成脂质体，再分散于温凝敏胶中，从多种途径来提高肿瘤部位的药物浓度，降低全身性毒副作用，以获得更好的抗肿瘤治疗效果。
温敏凝胶是指一类能够随着温度的改变而发生溶胶-凝胶变化的新型原位凝胶。在实际应用中可利用人体温度与环境温度的差异，使其既能以溶液形式给药，又可在生理温度下形成凝胶，而不需要有机溶剂、聚合交联试剂以及其他外在因素触发胶凝，不仅制备简单，使用方便，具有高度亲水的三维网络结构及良好的组织相容性，而且与用药部位尤其是粘膜亲和性好、滞留时间长，已成为药剂学领域的一个研究热点。在注射或口服给药以及眼、鼻、直肠等粘膜给药领域有广泛的应用前景。作为抗肿瘤药物的给药载体，温敏凝胶可使药物长时间地存在于肿瘤局部，具有良好的靶向性和缓释性，能显著提高药物的抗肿瘤效果且降低药物的系统毒性，因此，受到了国内外学者的广泛关注。其中用于瘤内注射的紫杉醇温敏原位凝胶产品的II期临床试验取得了良好的效果。
目前报道的可用于制备药用温敏凝胶的材料很多，根据来源不同可分为天然的聚合物和人工合成的高聚物，其中以人工合成的聚氧乙烯醚和聚丙烯酰胺研究最多。泊洛沙姆407是目前研究最多也最为深入的温敏凝胶材料，具有生物相容性好、毒性低、性质稳定、与其他化学试剂良好的配伍性、增溶作用和延迟药物释放的优点。但是，泊洛沙姆407在体内并不能降解，对脂质的代谢有潜在的影响，并且它只有在高浓度时(一般为20％～30％)才能显现出较好的温敏性能，从而使得其应用受到了严重的限制。聚N-异丙基丙烯酰胺具有良好的温度敏感特性，在体温附近可从溶胶状态转变成性能良好的凝胶，但是其不能生物降解，且缺乏足够的安全性数据，与临床实际应用还有很大的距离。天然来源的纤维素类和多糖在体内可被生物降解，具有很高的安全性，但常因为胶凝温度不适而难以有效地应用。为了解决这一问题，许多学者通过结构修饰或优化混合体系来改善天然存在的高分子材料的温敏性能，获得了一些可喜的进展，其中以壳聚糖温敏凝胶最受关注。壳聚糖由于具有来源广泛、易再生、可降解等性能，一直是生物材料研究的热点。制备壳聚糖温敏凝胶的手段主要有两种——在壳聚糖上接枝温敏性的高分子或者与其他的物质共混。早在20世纪80年代Allan Hoffman等就成功地在壳聚糖上接枝了不同分子量的PEO-PPO-PEO得到了不同凝胶温度的产物，Chen等也合成了壳聚糖与温度敏感的PNIPAM的接枝材料，但是这些合成工艺较为复杂，且接枝片段不可降解，因此与聚氧乙烯醚和聚丙烯酰胺等材料相比并无太多优势(Chen,J.P.and T.H.Cheng(2006)."Thermo-responsive chitosan-graft-poly(N-isopropylacrylamide)injectable hydrogel for cultivation of chondrocytesand meniscus cells."Macromol Biosci 6(12):1026-39)。2000年Chenite等研究发现壳聚糖溶液与甘油磷酸钠混合可获得性能良好的温敏性水凝胶，使得壳聚糖温敏凝胶的制备非常简便，因此受到了国内外学者的普遍欢迎，使得壳聚糖成为目前研究最多的天然来源的温敏凝胶材料。但是壳聚糖水溶性差，一般要求pH5.5以下才能溶解，且制得的温敏凝胶易受pH值和系统中其它离子的影响。本发明采用了新型的水溶性壳聚糖衍生物——2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖为基质制备温敏凝胶，消除了壳聚糖溶解时的pH值依赖性，并使制得凝胶性质稳定，不易受体系和环境的影响。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种含有阿霉素脂质体的壳聚糖温敏凝胶制剂，所述制剂可以液体的形式贮存和给药，注入肿瘤体内迅速形成凝胶，在肿瘤局部缓慢释放阿霉素，提高阿霉素的抗肿瘤效果，并采用脂质体包载阿霉素，防止游离阿霉素通过肿瘤部位血管吸收、分布至其它部位，进一步降低阿霉素的系统毒性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种阿霉素脂质体温敏凝胶，由如下重量份数的组分组成的：
其中，所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液。
进一步，优选所述阿霉素脂质体温敏凝胶由如下重量份数的组分组成的：
本发明还提供了一种所述阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，所述制备方法按如下步骤进行：
(1)空白脂质体的制备：将大豆磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中，旋转蒸发减压蒸除乙醇成膜，加硫酸铵浓度为0.1～0.3mol·L-1的硫酸铵水溶液水化，经探头超声或挤压过膜，然后透析除去外水相的硫酸铵，最后通过添加溶媒调节混合液中大豆磷脂的终浓度为1wt％～5wt％，即得空白脂质体；所述大豆磷脂与胆固醇、硫酸铵的投料质量比为1：0.25～0.5：0.3～1；所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液；
(2)主动载药制备阿霉素脂质体：将步骤(1)所得空白脂质体、阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液混合均匀，在40～60℃孵育20～60min，即得阿霉素脂质体；所述阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液中，阿霉素或阿霉素盐酸盐的浓度为10～30mg·mL-1；所述阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液与空白脂质体的体积比为1：4～10；
(3)阿霉素脂质体温敏凝胶的制备：将2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖加水溶胀并溶解后配制成2wt％～5wt％的水溶液，再加入步骤(2)所得阿霉素脂质体搅拌混匀，滴加甘油磷酸钠浓度为40wt％～60wt％的甘油磷酸钠水溶液，滴加完后搅拌混匀即得阿霉素脂质体温敏凝胶；所述阿霉素脂质体与2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖水溶液、甘油磷酸钠水溶液的体积比为1：0.5～2.5：0.25～1。
本发明所述的阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，推荐步骤(1)中所述无水乙醇的体积用量以大豆磷脂的质量计为10～100mL/g。
本发明步骤(1)所述空白脂质体的制备，也可采用如下方法：将大豆磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中形成混合液，将所得混合液缓慢注入硫酸铵浓度为0.1～0.3mol·L-1的硫酸铵水溶液中后，加热除去乙醇，再经探头超声，最后采用葡聚糖凝胶过柱法去除外水相中的硫酸铵，用溶媒洗脱，收集含脂质体的洗脱液，合并所得洗脱液，最后通过添加溶媒调节合并的洗脱液中大豆磷脂的终浓度为1wt％～5wt％，即得空白脂质体；所述大豆磷脂与胆固醇、硫酸铵的投料质量比为1：0.25～0.5：0.3～1；所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液。其中，推荐所述无水乙醇的体积用量以大豆磷脂的质量计为10～100mL/g。本发明制得的阿霉素脂质体温敏凝胶为红色液体，在25℃以下24h内不会成凝胶，而在体温37℃环境下不到5min既能形成凝胶。
本发明所述的阿霉素脂质体温敏凝胶可用于肿瘤局部注射。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)提高阿霉素制剂的抗肿瘤效果，减少给药次数，并降低其全身性毒副作用；(2)温敏凝胶的性质较为稳定，不易受环境pH值和离子强度的影响。
(四)附图说明
图1是实施例1制备的阿霉素脂质体温敏凝胶在室温(左)和体温(37℃，右)下的外观照片；
图2是实施例1制备的阿霉素脂质体温敏凝胶与其他阿霉素制剂的体外释放曲线；
图3是实施例1制备的阿霉素脂质体温敏凝胶与其他阿霉素制剂治疗荷瘤小鼠的生存曲线；
图4是实施例1制备的阿霉素脂质体温敏凝胶与其他阿霉素制剂治疗荷瘤小鼠的体重变化。
(五)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1阿霉素脂质体温敏凝胶的制备(薄膜分散法制备脂质体)
(1)空白脂质体的制备
脂质体的制备采用硫酸铵梯度法：取大豆磷脂500mg、胆固醇125mg，溶于30mL无水乙醇，置于旋转蒸发仪上37℃减压旋转蒸发除去乙醇，加8mL0.3mol·L-1硫酸铵水溶液水化2h，400w功率下探头超声90次(工作5s，间歇5s)。将制得的脂质体装于截留分子量为14000Da的透析袋中，置于1000mL 0.9wt％的氯化钠中透析24h，取出脂质体，加0.9wt％的氯化钠溶液定容至10mL，即得空白脂质体。
(2)阿霉素脂质体的制备
盐酸阿霉素加水溶解配制成20mg·mL-1的水溶液，与上述空白脂质体按体积比1:4混合，摇匀，40℃孵育30min，即得阿霉素脂质体。
(3)阿霉素脂质体温敏凝胶的制备
2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖加水溶胀并溶解配制成5wt％的水溶液，按3:2的体积比加入阿霉素脂质体，搅拌10min使其混合均匀得混合液，逐滴加入所述混合液1/5体积的56wt％甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀后，4℃贮藏备用。
按上述方法制得的阿霉素脂质体温敏凝胶体系在室温和37℃条件下的外观如图1所示，从图中可看出，在室温条件下凝胶体系为流动性良好的液体，而在37℃条件下该体系则变为非流动性的凝胶。
实施例2：阿霉素脂质体温敏凝胶的制备(乙醇注入法制备脂质体)
(1)空白脂质体的制备
取大豆磷脂300mg、胆固醇75mg，溶于10mL无水乙醇中。另取0.1mol L-1硫酸铵水溶液20mL加热至60℃，在磁力搅拌下，缓慢注入脂质乙醇溶液，恒温搅拌2h，挥尽乙醇，400w功率下探头超声180次(工作5s，间歇5s)，得脂质体。将脂质体上样于Sephadex G50葡聚糖凝胶柱，用10wt％蔗糖洗脱，收集脂质体洗脱液，加10wt％蔗糖定容至10mL，即得空白脂质体。
(2)阿霉素脂质体的制备
取所得空白脂质体与1mL 30mg·mL阿霉素水溶液混合，摇匀，40℃孵育30min，即得阿霉素脂质体。
(3)阿霉素脂质体温敏凝胶的制备
将阿霉素脂质体与2倍体积量的3wt％2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖水溶液混合均匀得到混合液，滴加所述混合液1/5体积量的56wt％甘油磷酸钠水溶液，搅拌均匀，即得阿霉素脂质体温敏凝胶。
实施例3温敏性能考察
采用试管倾斜法测定阿霉素脂质体温敏凝胶体系的温敏性能。将上述实施例1制得的阿霉素脂质体温敏凝胶溶液加入玻璃试管，放在37℃的恒温水浴锅内，玻璃管内插入固定温度计，直接测量混合体系的温度，并观察胶凝情况。当温度计内的温度上升至35℃开始计时，将试管倾斜90°，试管内的液面在30s内不发生移动，则停止计时，所记录的时间即为胶凝时间。结果发现，阿霉素脂质体温敏凝胶体系的胶凝时间为4.00±0.18min，与空白脂质体温敏凝胶体系的胶凝时间(3.16±0.29min)和不含脂质体的空白温敏凝胶体系的胶囊时间(3.25±0.37min)无明显差别。
实施例4药物包封率测定
取2mg·mL-1阿霉素脂质体和阿霉素脂质体温敏凝胶(按实施例1方法制得)各1mL，用生理盐水稀释至15mL，4×104r/min超速离心4h。以生理盐水为对照，用紫外分光光度计测定上清液在490nm波长处的吸光度，计算上清液中的药物浓度，与药物总浓度比较，计算药物包封率，结果发现温敏凝胶中阿霉素的包封率为92.12±5.60％，与脂质体中的阿霉素包封率91.15±0.32％无明显区别，表明凝胶体系不会破坏脂质体降低药物的包封率。
实施例5体外释放
取浓度为2mg/mL的阿霉素脂质体、阿霉素与壳聚糖混合液、阿霉素脂质体温敏凝胶(按实施例1方法制得)各2mL，放入透析袋内，两端用夹子封口，37℃孵育15min，将透析袋放入含200mL生理盐水(0.03wt％叠氮化钠)的三角瓶中，然后放置在37℃空气摇床内，100r/min。按时间点，每次取样3mL，同时补加3mL同温度的生理盐水；取出的样品经3000r/min离心10min，HPLC测定上清液中的阿霉素浓度，计算各样品的体外药物释放曲线，结果见图2。从图中可看出，阿霉素与壳聚糖的混合液能快速地从透析袋中释放出来，将阿霉素制成脂质体后其体外释药速率显著降低，再将脂质体制成温敏凝胶其释放进一步降低，表现出了良好的缓释性能。
实施例6动物抑瘤实验
ICR小鼠腹腔注射0.1mL小鼠肝癌细胞株H22(每只接种1.8×106个细胞)，记为第0天。第1天将荷瘤小鼠随机分为生理盐水组、空白凝胶组、游离阿霉素组、阿霉素脂质体组、阿霉素脂质体温敏凝胶(按实施例1方法制得)组共5组，每组10只；各组均腹腔注射0.2mL液体，其中阿霉素的浓度为2mg/mL。每天严密观察各组实验动物生物学行为，记录体重变化，准确计数动物死亡数目，计算中位生存时间、平均生存时间和生命延长率，并描绘生存曲线。
结果发现，生理盐水组从第14天开始出现老鼠死亡，到第18天所有的老鼠全部死亡，平均存活时间为16.1d；空白凝胶组从第11天开始老鼠死亡，到第22天全部死亡，平均存活时间为14.5d；阿霉素溶液组从第6天开始出现死亡，到60天还有一只存活，平均存活时间为25.5d；阿霉素脂质体组从第16天开始出现死亡，到60天还有一只老鼠存活，平均存活时间为27.2d；而阿霉素脂质体温敏凝胶组从第20天才开始出现老鼠死亡，到60天还有两只老鼠存活，平均存活时间为35d，生命延长率为117.4％，详见表1和图3。
表1各组荷瘤小鼠的生存时间(n＝10)
*长期存活者者：存活时间超过60d。
各组小鼠的体重变化见图4所示，从中可看出，生理盐水组和空白凝胶组小鼠的体重显著增加，这是由于肿瘤细胞的过快增殖所致，而阿霉素制剂组的小鼠体重均有所下降，这可能是由于阿霉素的系统毒性所致，其中阿霉素溶液组的小鼠体重下降最大，表明阿霉素溶液的系统毒性较大，而阿霉素脂质体组合阿霉素脂质体温敏凝胶组的体重下降较小，表明其系统毒性较小。
Claims (6)
1.一种阿霉素脂质体温敏凝胶，其特征在于，所述阿霉素脂质体温敏凝胶是由如下重量份数的组分组成的：
其中，所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液。
2.如权利要求1所述的阿霉素脂质体温敏凝胶，其特征在于，所述阿霉素脂质体温敏凝胶是由如下重量份数的组分组成的：
3.一种阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法按如下步骤进行：
(1)空白脂质体的制备：将大豆磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中，旋转蒸发减压蒸除乙醇成膜，加硫酸铵浓度为0.1～0.3mol·L-1的硫酸铵水溶液水化，经探头超声或挤压过膜，然后透析除去外水相的硫酸铵，最后通过添加溶媒调节混合液中大豆磷脂的终浓度为1wt％～5wt％，即得空白脂质体；所述大豆磷脂与胆固醇、硫酸铵的投料质量比为1：0.25～0.5：0.3～1；所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液；
(2)主动载药制备阿霉素脂质体：将步骤(1)所得空白脂质体、阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液混合均匀，在40～60℃孵育20～60min，即得阿霉素脂质体；所述阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液中，阿霉素或阿霉素盐酸盐的浓度为10～30mg·mL-1；所述阿霉素或阿霉素盐酸盐的水溶液与空白脂质体的体积比为1∶4～10；
(3)阿霉素脂质体温敏凝胶的制备：将2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖加水溶胀并溶解配制成2wt％～5wt％的水溶液，再加入步骤(2)所得阿霉素脂质体搅拌混匀，滴加甘油磷酸钠浓度为40wt％～60wt％的甘油磷酸钠水溶液，滴加完后搅拌混匀即得阿霉素脂质体温敏凝胶；所述阿霉素脂质体与2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖水溶液、甘油磷酸钠水溶液的体积比为1∶0.5～2.5∶0.25～1。
4.如权利要求3所述的阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无水乙醇的体积用量以大豆磷脂的质量计为10～100mL/g。
5.如权利要求3所述的阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，其特征在于，将步骤(1)所述空白脂质体的制备方法替换为：将大豆磷脂和胆固醇溶于无水乙醇中形成混合液，将所得混合液缓慢注入硫酸铵浓度为0.1～0.3mol·L-1的硫酸铵水溶液中后，加热除去乙醇，再经探头超声，最后采用葡聚糖凝胶过柱法去除外水相中的硫酸铵，用溶媒洗脱，收集含脂质体的洗脱液，合并所得洗脱液，最后通过添加溶媒调节合并的洗脱液中大豆磷脂的终浓度为1wt％～5wt％，即得空白脂质体；所述大豆磷脂与胆固醇、硫酸铵的投料质量比为1∶0.25～0.5：0.3～1；所述溶媒为水、0.8wt％～0.9wt％氯化钠溶液或8wt％～10wt％蔗糖溶液。
6.如权利要求5所述的阿霉素脂质体温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述无水乙醇的体积用量以大豆磷脂的质量计为10～100mL/g。
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