CN102258470A - 盐酸阿霉素纳米脂质体制剂的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及盐酸阿霉素或阿霉素的纳米脂质体制备方法，主要由阿霉素、蛋黄卵磷脂、胆固醇、抗氧化剂、缓冲剂、糖、注射用水等组成，该制备工艺包括空白脂质体、阿霉素纳米脂质体的制备及其工艺优化过程等步骤。本发明制备的冻干粉包封率高，稳定性好，其制备工艺简单易行。

Description

盐酸阿霉素纳米脂质体制剂的制备

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及盐酸阿霉素或阿霉素的纳米脂质体制备方法。

背景技术

阿霉素的分子结构式如下所示：

阿霉素(以下简称DOX)，别名羟柔红霉素、羟正丁霉素、多柔比星，是临床常用的蒽环类抗恶性肿瘤抗生素，抗肿瘤谱广、活性强、疗效好，其作用机制主要是DOX分子嵌入DNA，抑制核酸的合成^[1]。DOX对机体可产生广泛的生物化学效应，因此被广泛用于治疗急性白血病，非何杰金氏淋巴瘤，乳腺癌，小细胞型肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌以及肉瘤等多种恶性肿瘤^[2]。但是该药静脉注射后，毒副作用大，除骨髓抑制，胃肠道毒性以及脱发外，还可引起严重的心脏毒性，表现为各种心率失常，累积量大时可发生不可逆的心肌损伤乃至充血性心力衰竭^[3-4]，且分子结构不稳定，易发生水解、光解等变化，降低了疗效，这些毒副作用使DOX-HCL的临床应用受到了很大限制。

为克服上述缺点，人们一直在寻找降低抗肿瘤药物DOX-HCL不良反应的有效方法，如改变药物剂型。脂质体是磷脂双分子层液晶膜形成的微囊泡，具有良好的靶向性、选择性和通透性，能降低不良反应，提高抗肿瘤药物的疗效，是目前较为理想的抗肿瘤药物载体。

脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质体膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能^[5-8]，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性^[9-16]。70年代中期开始，就有人研究用脂质体作为蒽环类抗癌药的有效载体。80年代末期已开始进行临床实验，初步结果表明DOX-HCL经脂质体包封后，剂量可以加大，毒性作用减少，半衰期明显延长，抗癌作用并不减弱反而增强。DOX-HCL被包裹在脂质体的内部，起到隔离和保护的作用，克服了现有阿霉素制剂体内循环时间短、用药量大、过敏反应严重等缺点。

目前国际上有三种脂质体盐酸阿霉素产品在市场上销售，分别为美国AlzaPharmaceuticals医药公司研制的DOXIL和CAELYX，美国伊兰医药公司(BlanPharmaceuticals，Inc.)的Myocet。其中DOXIL和CAELYX是运用“隐形”(stealth)技术将盐酸阿霉素包裹在脂质体微粒中，同时在每个脂质体微粒表面再包裹上聚乙二醇(PEG)以进一步延长其在体内循环半衰期，在血液循环中存留时间较普通脂质体长，故又名“长循环脂质体”，其主要成分为MPEG-DSPE(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt)。目前只有美国、日本等少数国家能够生产，但我国尚无上市的白行研制和生产的脂质体盐酸阿霉素产品，患者只能使用进口产品。据美国Sigma公司报价，1mgMPEG-DSPE为24.10美元，若进口此种原料制备阿霉素脂质体，一支阿霉素脂质体注射剂，约人民币6000元，不适合我国国情，患者也无法承担如此昂贵的医药费用。

国内外已有研究结果表明，有三个因素对提高盐酸阿霉素脂质体药效和降低毒副作用有重要的影响：一是脂质体的粒径和均匀度；二是形成脂质体的脂质和脂质体内所包裹药物的化学降解程度；三是脂质体药物中非包裹药物的存在量，也即药物在脂质体中包裹率的控制和非包裹物的去除技术。

到目前为止已研制出多种制备盐酸阿霉素脂质体的方法，有薄膜分散法、注入法、乳化法、逆向蒸发法及冷冻干燥法等多种，但是常规方法制备盐酸阿霉素脂质体的包封率难以达到60％，我们按照常规方法做的盐酸阿霉素脂质体包封率才40％左右，而阿霉素原料药的较贵，如果按照常规的方法生产盐酸阿霉素脂质体，成本高，制剂价格自然不低，病人无法承担。为了解决包封率的问题，后来有人利用pH梯度法和硫酸铵梯度法载药，虽然在包封率可以达到90％以上，但是操作比较麻烦。所谓pH梯度法即在操作过程中，按照常规方法制备空白脂质体，然后调节pH载药。首先以较低或较高的pH缓冲液水化脂质，制备脂质体(所得脂质体内外水相的pH值一致)。随后用较高或较低的pH缓冲液调节或置换上述的脂质体外水相至所需pH值。从而造成脂质体内外水相的pH值差，产生pH梯度.一般常用pH 4.0的0.3mol/L檬酸缓冲液水化脂质，制备脂质体。用NaOH、Na₂CO₃或者Na₂HPO₄，调节pH值至7.0～7.8。鉴于NaOH碱度太高.会对药物和磷脂的稳定性有影响，而Na₂CO₃产生CO₂，使药物损失，给操作带来麻烦的缺点。以Na₂HPO₄调节脂质体外水相pH值，按pH梯度法制备ADML.包封率最高可达96.3％。而硫酸铵梯度法则是以硫酸铵溶液为水化介质按照常规的方法制备空白脂质体，然后在装于透析袋中，封牢两端，置于盛有生理盐水的锥形瓶中，室温下透析，使脂质体内外形成硫酸铵梯度。于透析后脂质体中加入盐酸阿霉素溶液，以生理盐水调整脂质体溶液中盐酸阿霉素浓度，置37℃水浴保温15min即得。以上两种方法操作步骤多，时间长，不易控制。

纳米药物的研究是药物研究中一个很有生命力的新方向^[17-18]，药物主要通过包封和吸附等方法载入纳米药物载体中。纳米技术用于药物研究，国外已进行了多年的工作，其粒径范围较宽，多在100-1000nm范围，称为纳米胶束或纳米胶囊。由于纳米药物的粒径比毛细血管直径(6-8μm)还小，因而可以比较容易进入人体的各种组织器官中进行控制释放，大幅度提高药物的生物利用度[19-21]。

将药物制成纳米缓释系统，即将纳米级化疗药物负载于可降解或不可降解的赋性剂，具有保护药物活性，使药物避免肝首过效应、通过人体BBB屏障，增加药物稳定性、改变药物在体内的分布，增加药物在靶器官的积累、降低药物的系统分布、提高治疗指数、减少毒副作用等优点^[22-24]。因此将阿霉素制备成粒径为80-100nm的药物，然后包裹于脂质体内可以克服常规化疗时，化疗药物难以在肿瘤内部达到有效浓度，并且全身分布易引发系统性毒副反应的缺点。本发明研制的新型抗肿瘤化疗药物阿霉素纳米脂质体，改变了现有化疗药物的剂型和药代动力学特性，使之以较适宜的方式作用于肿瘤组织，是提高肿瘤化疗的主要方案。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种阿霉素纳米脂质体制剂及其制备方法。

本发明中一种阿霉素纳米脂质体，包括阿霉素和脂质，所述阿霉素为盐酸阿霉素；所述脂质包括蛋黄卵磷脂和胆固醇，所述阿霉素和脂质的用量按质量比：阿霉素∶脂质＝1∶5～1∶100；蛋黄卵磷脂和胆固醇的摩尔比为1∶1～15∶1。

本发明中一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，采用乙醇注入-pH梯度法、逆向蒸发-pH梯度法或薄膜分散-pH梯度法将阿霉素载于脂质溶液中；其中所述的：

a  乙醇注入-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、0.1g～2.0g表面活性剂、1.0g～50.0g蛋黄卵磷脂溶于无水乙醇形成浓度为0.1％-5％(W/V)的脂质溶液，0.1g～10.0g的盐酸阿霉素溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中，在50-60℃恒温水浴，高速搅拌条件下，用注射针将脂质溶液注入含盐酸阿霉素的pH为2.0-4.0的酸溶液中，搅拌28-32min，加碱溶液调pH至6.8-7.2，继续搅拌13-17min，透析除去游离盐酸阿霉素，加0.5g～80.0g冻干保护剂，冷冻干燥，即得阿霉素纳米脂质体冻干粉；

b  逆向蒸发-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、1.0g～50.0g蛋黄卵磷脂溶于氯仿和乙醚形成浓度为0.1％-5％(W/V)的脂质溶液，0.1g～10.0g的盐酸阿霉素和0.1g～2.0g的表面活性剂溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中形成水相，将水相加入到脂质溶液中，脂质溶液与水相比例为15∶1-1∶1，超声形成W/O型乳剂，旋转蒸发除去有机溶剂在瓶壁上形成凝胶，继续旋转至凝胶脱落形成脂质体，加碱溶液调pH至6.8-7.2，继续搅拌13-17min，探头超声，形成纳米脂质体，透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，冷冻干燥，即得阿霉素纳米脂质体冻干粉；

c  薄膜分散-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、1.0g～50.0g蛋黄卵磷脂溶于氯仿形成浓度为0.1％-5％(W/V)的脂质溶液。0.1g～10.0g的盐酸阿霉素和0.1g～2.0g的表面活性剂溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中为水化介质，取脂质溶液置烧瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，加水化介质，继续旋转至形成均匀脂质体混悬液，加碱溶液调pH至6.8-7.2，继续搅拌13-17min，探头超声，形成纳米脂质体，透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，冷冻干燥，即得阿霉素纳米脂质体冻干粉。

在本发明中一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，是在通N₂保护下进行的。所述酸为柠檬酸和乳酸；所述碱为碳酸钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠；当盐酸阿霉素1.0g，蛋黄卵磷脂10.0g，胆固醇5.0g，维生素E 0.25g，表面活性剂10.0g，酸32.0g，碱154.0g，冻干保护剂50g时为较适宜的配比；所述蛋黄卵磷脂∶维生素E＝10∶1～40∶1；所述冻干保护剂的浓度为5％；所述表面活性剂为F68、吐温-80、PVP、PVA、PEG₂₀₀₀和PEG₄₀₀₀；所述超声强度为50W～500W，超声时间为1min～20min，超声间隔为5s/5s～45s/45s。

本发明的有益效果是：(1)本发明将常规方法和pH梯度结合起来，包封率可达96％，粒径分散比较均匀，且比常规方法耗时少，节省成本，便于大规模生产；(2)本发明在制备的过程中加入了PVP、PEG、PVA等高分子表面活性剂，增加了脂质体的稳定性；(3)本发明加入的高分子表面活性剂在体内有一定的长循环作用，可以延长脂质体的半衰期，使得药物在体内的作用时间延长，减少了病人的给药剂量，增加了病人的顺应性。

附图说明

图-1是盐酸阿霉素纳米脂质体扫描电镜图；从图中可以看出所有粒子均较为均匀，且大小分布较均匀。粒径200nm以内。

图-2是盐酸阿霉素纳米脂质体的粒径分布图；动态激光光散射测定的粒径基本上呈窄峰分布，粒径集中在100-200nm之间。

图-3是盐酸阿霉素纳米脂质体体外释放图：从图中可以看出盐酸阿霉素纳米脂质体具有缓释作用，12h后持续缓慢释放，体外释放达到平台期。

具体实施方式

实施例1

本发明提供的一种盐酸阿霉素纳米脂质体是通过以下措施来实现。

a  醇注入-pH梯度法：

处方：酸阿霉素                    1.0g

      蛋黄卵磷脂                  10.0g

      胆固醇                      5.0g

      乙醇                        200mL

      维生素E                     0.25g

      柠檬酸                      32.0g

      磷酸氢二钠                  154.0g

      吐温-80                     10.0g

      葡萄糖                      50.0g

      注射用水                    1000mL

制备工艺如下：

蛋黄卵磷脂、胆固醇、维生素E、乳化剂溶于无水乙醇形成脂质溶液，盐酸阿霉素溶于柠檬酸溶液中，在55℃恒温水浴，通N₂备用，高速搅拌条件下，用注射针将脂质溶液注入含盐酸阿霉素的柠檬酸溶液中，用热乙醇洗涤烧杯，将剩余的脂质溶液一并注入，搅拌30min，加磷酸氢二钠调pH至7.0，继续搅拌15min，取出，透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，过滤除菌，分装，冷冻干燥，既得阿霉素纳米脂质体冻干粉。

b逆向蒸发-pH梯度法：

处方：盐酸阿霉素                       1.0g

      蛋黄卵磷脂                       10.0g

      胆固醇                           5.0g

      氯仿                             500mL

      乙醚                             500mL

      维生素E                          0.25g

      柠檬酸                           32.0g

      磷酸氢二钠                       154.0g

      吐温-80                          10.0g

      葡萄糖                           50.0g

      注射用水                         1000mL

制备工艺如下：

蛋黄卵磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿和乙醚/甲醇(2∶1)形成脂质溶液，盐酸阿霉素和吐温-80溶于柠檬酸溶液中为水相，将水相加入到脂质溶液中，超声形成W/O型乳剂，旋转蒸发除去有机溶剂在瓶壁上形成凝胶，继续旋转至凝胶脱落形成脂质体，加磷酸氢二钠调pH至7.0，继续搅拌15min取出，探头超声，形成纳米脂质体透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，过滤除菌，分装，冷冻干燥，既得阿霉素纳米脂质体冻干粉。

c薄膜分散-pH梯度法：

处方：盐酸阿霉素                     1.0g

      蛋黄卵磷脂                     10.0g

      胆固醇                         5.0g

      氯仿                           500mL

      维生素E                        0.25g

      柠檬酸                         32.0g

      磷酸氢二钠                     154.0g

      吐温-80                        10.0g

      葡萄糖                         50.0g

      注射用水                       1000mL

制备工艺如下：

蛋黄卵磷脂、胆固醇和维生素E溶于氯仿形成脂质溶液，盐酸阿霉素和吐温-80溶于柠檬酸溶液中为水化介质，取脂质溶液置烧瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，加水化介质，继续旋转至形成均匀脂质体混悬液。加磷酸氢二钠调pH至7.0，继续搅拌15min取出，探头超声，形成纳米脂质体透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，过滤除菌，分装，冷冻干燥，既得阿霉素纳米脂质体冻干粉。

通过以上方法制备的盐酸阿霉素纳米脂质体包封率可达96％，粒径分散比较均匀，粒径在200nm左右(如图-1，图-2)。脂质体的稳定性比较好，冻干粉保存未有渗漏。实验中加入的高分子表面活性剂在体内有一定的长循环作用，在体外释放实验中可以看出阿霉素纳米脂质体有一定的缓释作用(图-3)，延长脂质体的半衰期，普通的盐酸阿霉素在体内的半衰期为8min，用脂质体包裹盐酸阿霉素后盐酸阿霉素的半衰期延长，使得药物在体内的作用时间延长，减少了病人的给药剂量，增加了病人的顺应性。

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Claims (9)

1.一种阿霉素纳米脂质体，包括阿霉素和脂质，所述阿霉素为盐酸阿霉素；所述脂质包括蛋黄卵磷脂和胆固醇，所述阿霉素和脂质的用量按质量比：阿霉素∶脂质＝1∶5～1∶100；蛋黄卵磷脂和胆固醇的摩尔比为1∶1～15∶1。

2.一种制备权利要求1所述阿霉素纳米脂质体的方法，其特征在于，采用乙醇注入-pH梯度法、逆向蒸发-pH梯度法或薄膜分散-pH梯度法将阿霉素载于脂质体中；其中所述的：

a  乙醇注入-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、0.1g～2.0g表面活性剂、1.0g～50.0g蛋黄卵磷脂于无水乙醇形成浓度为0.1％-5％(W/V)脂质溶液，0.1g～10.0g的盐酸阿霉素溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中，在50-60℃恒温水浴，高速搅拌条件下，用注射针将脂质溶液注入含盐酸阿霉素的pH为2.0～4.0的酸溶液中，搅拌28-32min，加碱溶液调pH至6.8-7.2，继续搅拌13-17min，透析除去游离盐酸阿霉素，加0.5g～80.0g冻干保护剂，冷冻干燥，即得阿霉素纳米脂质体冻干粉；

b  逆向蒸发-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、1.0g～50.0g的蛋黄卵磷脂溶于氯仿和乙醚形成浓度为0.1％-5％(W/V)的脂质溶液，0.1g～10.0g的盐酸阿霉素和0.1g～2.0g的表面活性剂溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中为水相，将水相加入到脂质溶液中，脂质溶液与水相比例为15∶1～1∶1，超声形成W/O型乳剂，旋转蒸发除去有机溶剂在瓶壁上形成凝胶，继续旋转至凝胶脱落形成脂质体，加碱溶液调pH至6.8～7.2，继续搅拌13～17min，探头超声，形成纳米脂质体，透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，冷冻干燥，即得阿霉素纳米脂质体冻干粉；

c  薄膜分散-pH梯度法：1.0g～50.0g胆固醇、0.5g～2.0g维生素E、1.0g～50.0g蛋黄卵磷脂溶于氯仿形成浓度为0.1％-5％(W/V)的脂质溶液。0.1g～10.0g的盐酸阿霉素和0.1g～2.0g的表面活性剂溶于pH 2.0～4.0的酸溶液中为水化介质，取脂质溶液置烧瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，加水化介质，继续旋转至形成均匀脂质体混悬液，加碱调pH至6.8～7.2，继续搅拌13～17min，探头超声，形成纳米脂质体，透析除去游离盐酸阿霉素，加冻干保护剂，冷冻干燥，既得阿霉素纳米脂质体冻干粉。

3.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于所述酸选自柠檬酸或乳酸；碱选碳酸钠、磷酸氢二钠或氢氧化钠。

4.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于所述盐酸阿霉素1.0g，蛋黄卵磷脂40.0g，胆固醇5.0g，维生素E 0.25g，表面活性剂10.0g，酸32.0g，碱154.0g，冻干保护剂50g。

5.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于制备是在通N₂保护下进行的。

6.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于蛋黄卵磷脂∶维生素E＝10∶1～40∶1。

7.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于冻干保护剂浓度为5％。

8.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于所述表面活性剂选自F68、吐温-80、PVP、PVA、PEG₂₀₀₀和PEG₄₀₀₀。

9.根据权利要求2所述的一种阿霉素纳米脂质体的制备方法，其特征在于超声强度为50W～500W，超声时间为1min～20min，超声间隔为5s/5s～45s/45s。

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