CN114126589A

CN114126589A - 脂质体阿霉素制剂、用于制备脂质体阿霉素制剂的方法和脂质体阿霉素制剂作为药物的用途

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Publication number: CN114126589A
Application number: CN202080051763.2A
Authority: CN
Inventors: S·J·哈布赫尔; P·哈布赫尔; C·马蒂厄; P·布绍尔
Original assignee: Yinnong Medika Holding Co ltd
Current assignee: Yinnong Medika Holding Co ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-03-01
Also published as: WO2020254633A1; EP3986380A1; US20220265556A1; MX2021016043A; AU2020295730A1; EP3753549A1; JP2022537363A; CA3143443A1; BR112021025686A2

Abstract

本发明涉及一种脂质体阿霉素制剂、一种用于制备脂质体阿霉素制剂的方法和一种用于用作药物、特别是用于治疗癌症、子宫平滑肌肉瘤和附件皮肤癌的药物的脂质体阿霉素制剂。

Description

脂质体阿霉素制剂、用于制备脂质体阿霉素制剂的方法和脂质体阿霉素制剂作为药物的用途

本发明涉及一种脂质体阿霉素(doxorubicin)制剂、一种用于制备脂质体阿霉素制剂的方法和一种用作药物的脂质体阿霉素制剂。

脂质体是具有至少一个脂质双层的球形囊泡。脂质体也可以是其中一个囊泡含有一个或多个更小的囊泡的多囊泡脂质体。脂质体具有被呈脂质双层形式的疏水膜包围的水溶液核。

已经提出脂质体用于多种药物、特别是肠胃外给药的那些的药物递送的用途。脂质体具有通过限制血流中游离药物的浓度而在延长的时间段内提供给予的药物的受控“贮库”释放，并减少药物的副作用的潜力。脂质体还可以以治疗上有利的方式改变药物的组织分布和摄取，并且可以通过实现较不频繁的药物给予来增加治疗的便利性。例如，脂质体可以将包封的活性组分直接运送至疾病位点，包括肿瘤细胞和炎症位点。活性组分可以在治疗位点处从脂质体直接释放。因此，允许较低剂量的活性组分，并且由此限制副作用。

脂质体可以将活性组分转移至作用位点。由于脂质体膜在结构上类似于生物膜，脂质体可以与细胞膜融合。融合后，可以将脂质体内容物排入到活性组分可以起作用的细胞中。使用脂质体作为药物载体系统可以减少与各种活性组分的给予有关的副作用以及与活性组分的高全身吸收有关的副作用。活性组分可以在期望靶位处累积。脂质体双层的组分可以在肝脏和/或脾脏中代谢。

治疗癌症的药物递送系统的开发是特别重要的，因为癌症治疗中的药剂经常是细胞抑制性的或细胞毒性的。期望防止它们释放到健康组织中。

脂质体组合物已经被成功地用于递送包封的治疗剂。例如，

(在欧洲，

)是PEG化的脂质体制剂，包括用于治疗癌症，诸如卵巢癌的包封的阿霉素。可以使用跨膜离子梯度将弱两亲性碱，像阿霉素装载到脂质体中(参见例如，Nichols等人(1976)Biochim.Biophys.Acta 455:269-271；Cramer等人(1977)Biochemical andBiophysical Research Communications 75(2):295-301)。该装载方法，一般称为远程装载(remote loading)，通常涉及具有可电离胺基团的药物，通过将其添加至脂质体的悬浮液中而将其装载，将脂质体制备成具有内部较低/外部较高的离子梯度，经常为pH梯度。

一旦脂质体具有外渗到间质组织液中的装载药物PLD(PEG化脂质体阿霉素)，就几乎不知晓确定药物释放的过程。据信，保留药物的铵/质子梯度的逐渐丧失、磷脂酶对脂质体磷脂的酶促分解和/或清除剂巨噬细胞的胞吞作用可能有助于药物释放(Barenholz,(2012)J Control Release.160(2):117-34)。

脂质体包封的阿霉素已被证明在癌症的治疗中是有效的。然而，肿瘤累积、细胞毒性和肿瘤重量减少的效率可以进一步得到改善。

脂质体包封的阿霉素已被证明比未包封的阿霉素具有更低的心脏毒性。然而，本领域已知的脂质体包封的阿霉素引起严重的副作用，诸如掌跖感觉丧失性红斑(PPE)，更通常称为手足综合征(参见例如，Gabizon等人(1994)Cancer Research 54:987-992；Solomon等人(2008)Clinical Lymphoma and melanoma 1:21-32)。PPE导致皮肤发红、触痛和剥落，这会是不舒服的并且甚至是疼痛的。在每4周50mg/m剂量的临床测试中，50.6％的用

治疗的患者出现手足综合征。与相同治疗方案中的游离阿霉素相比，该副作用的普遍存在限制可以给予的

剂量。另外，本领域已知的脂质体包封的阿霉素持续引起血液学副作用，诸如嗜中性白细胞减少症。

从Hong等人(Clin Cancer Res(1999)5:3645-3652)和US9895313已知某些装载阿霉素的脂质体。然而，这些脂质体是通过不同的制造方法获得的，即分别通过薄膜水合和挤出的组合获得的，以及通过将水混溶性有机溶剂中的脂质溶液与水溶液在特别设计的多端口混合腔室中混合获得的。根据Hong的脂质体制备说明书进行的对比测试表明，不能再现65nm至75nm的所指示的粒径。相反，获得约114nm的粒度。此外，关于脂质体的圆度、它们的尺寸分布或其中装载的阿霉素晶体的形状和尺寸，这两个公开内容均未提及。然而，用于制备所研究的脂质体的说明书指示250mM的硫酸铵浓度，根据Wei等人的出版物(Wei等人(2018)ACS Omega 3:2508-2517)这指向具有明显纵横比的脂质体。根据同一出版物，需要200mM的最小脂质体内硫酸铵浓度以支持在PEG化的脂质体阿霉素(PLD)中稳定的纳米晶化，由此缺乏这样的晶体或包含结晶度差的晶体的PLD显示出阿霉素快速、双相释放。

因此，仍然需要用于递送阿霉素的化学上和物理上稳定的脂质体制剂，其具有改善的肿瘤累积、细胞毒性和肿瘤重量减轻效率。还仍然需要减少不希望的副作用，诸如PPE，而不损害治疗功效。此外，需要用于制备合适的脂质体制剂的有效、可靠且有成本效益的方法。

因此，本发明的目的是解决这些需要并提供用于治疗癌症的改善的脂质体阿霉素制剂。本发明的另一目的是提供一种制备这样的脂质体阿霉素制剂的方法，并提供这样的脂质体阿霉素作为药物的用途。

通过具有根据独立权利要求的特征的脂质体阿霉素制剂、用于制备脂质体阿霉素制剂的方法和脂质体阿霉素制剂作为药物的用途已经解决了该问题。

本发明涉及一种脂质体阿霉素制剂，其中该脂质体的脂质双层至少包含

-磷脂酰胆碱，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；

-胆固醇；

-聚乙二醇-脂质缀合物，优选DSPE-PEG 2000；

其中

-脂质体具有通过DLS测量的30至70nm、优选40至65nm的平均直径；或

-脂质体具有基于低温TEM(Cryo-TEM)获得的图像测量的20至50nm、优选30至40nm的平均直径。

“脂质体阿霉素制剂”意指包含包封在脂质体中的阿霉素的组合物。特别地，该制剂包含盐酸阿霉素。阿霉素是本领域熟知的用于治疗癌症的蒽环类拓扑异构酶(anthracycline topoisomerase)II抑制剂。化学名称是(8S,10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃糖基)氧基]-8-羟乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-萘并萘二酮盐酸盐。用脂质体阿霉素制剂可治疗的疾病是癌症类型，包括急性白血病、乳腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和肉瘤。特别优选地，药物用于治疗转移性乳腺癌、晚期卵巢癌、卡波西肉瘤和多发性骨髓瘤。

确定稳定性以及药物从脂质体释放的位置和速率的主要因素是脂质体脂膜组成。其他因素是组合物中脂质体的尺寸和形貌以及包封在脂质体中的阿霉素晶体的形貌。

出于本发明的目的，脂质双层中的磷脂酰胆碱可以是DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC和DEPC中的任一种或其混合物。最优选的是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

基本上基于完全氢化的大豆磷脂酰胆碱HSPC。HSPC具有以下结构式：

其中m、n＝14或16。由天然产品(大豆)获得的HSPC在结构上不如完全合成的分子均匀。因此，当在脂质双层中排列时，HSPC更不适于脂肪酸链的致密填积，因此更不适合形成期望尺寸的脂质体。这同样适用于脂质体制剂，其中脂质双层中磷脂的量由不同磷脂酰胆碱的混合物，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)的混合物形成。因此，对于本发明的目的特别优选的是，用于脂质双层的磷脂酰胆碱(PC)的总量包含至少95重量％、优选至少99重量％并且更优选100重量％的DSPC。

除了磷脂酰胆碱之外还包含胆固醇的脂质体具有改善的循环寿命、药代动力学和治疗特性。它们是生物可相容的和生物可降解的。

聚乙二醇-脂质缀合物优选是甲氧基聚乙二醇(MPEG)、更具体是N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺钠盐，MPEG2000-DSPE)。已知基于聚乙二醇(PEG)缀合的脂质的膜表面修饰可以改善血液循环能力，例如通过避免脂质体被肝脏和脾脏中的吞噬细胞捕获。

本发明的脂质体阿霉素制剂中的脂质体具有通过动态光散射DLS测量的30至70nm、优选40至65nm的平均直径，和/或所述脂质体具有通过低温TEM测量的20至50nm、优选30至40nm的平均直径。

“通过动态光散射测量的”(DLS)意指对具有20至30mg/ml的脂质浓度的样品进行DLS，将所述样品在PBS或MQ H₂O中1/19稀释以达到约6的仪器中衰减因子。在25℃和0°散射角下，在Malvern Zetasizer Nano装置上测量DLS。用来自Malvern的Zetasizer软件(7.11版本)进行仪器控制和数据分析。使用斯托克斯-爱因斯坦方程确定粒度(流体动力学直径)：

其中k是玻尔兹曼常数；T是绝对温度；η是分散剂粘度并且D是扩散系数。用Zetasizer软件确定粘度并且粘度是0.8872cP。分散剂折射率是1.330。通过用适当的算法拟合自相关函数获得D。累积量分析是分析由DLS实验产生的自相关函数的简单方法，并产生平均粒度(Z-ave)和多分散性指数(PDI)。ISO 13321(1996)和ISO 22412(2008)中定义了计算。来自DLS实验的第一级结果是粒度的强度分布。强度分布根据散射强度自然地加权。粒度分布显示为由粒子散射的光的相对强度(在Y轴上)相对于对数间隔的各种粒度等级(在X轴上)的图。使用具有10mm的路径长度的透明一次性zeta池(zeta cell)进行测量。

“基于低温TEM获得的图像测量的”意指使样品经受低温透射电子显微镜检查。将脂质体样品适当稀释、玻璃化并用200kV的加速电压在载网(方华膜和碳(Formvar andCarbon))上制备。用低温TEM JEOL JEM-2100F、TVIPS TemCam F415MP相机以20'000×；40'000×；80'000×放大倍数获取图像。通过使用Vironova分析仪软件(Vironova，瑞典)的半自动图像处理进行粒子识别和粒度测定。简言之，导入一系列相同放大倍数的随机图像。仅检测完全位于图像边界内并具有明显膜的脂质体粒子。分析所识别的对象的球形直径、圆度、单层度(unilamellarity)。用相同的阈值和设置对所有图像进行批处理，每个样品累积超过5至18个图像，对应于1560至1178的被分析粒子数目。平均值具有约10nm的标准偏差。

通常但不是必须地，本发明制剂中的脂质体将落入通过两种方法测量的尺寸的数值范围内。通过低温TEM测量的直径尺寸通常低于通过DLS测量的直径尺寸。除其他因素之外，这是由于PEG链在低温TEM图像中不可见，并且流体动力学半径对DLS有影响但对低温TEM成像没有影响。

与现有技术的公开内容相反，现在已经出乎意料地发现，本文所公开的脂质体阿霉素制剂在显著更低的脂质体内硫酸铵浓度下已经展现出稳定且特别均匀形成的阿霉素晶体纤维。

不希望受理论束缚，目前认为更高浓度的硫酸铵使得更多的阿霉素可被装载，导致脂质体内更大的阿霉素晶体。由于它们的尺寸和刚性，这些阿霉素晶体使脂质体的内部膨胀，这最终导致脂质体明显偏离完美球形形状。粒子的膨胀不同还分别表现为长轴和短轴的出现，这可以例如在这样的聚乙二醇化的脂质体阿霉素粒子的低温透射电子显微镜(低温TEM)图像中观察到。当然，还可知，这样的粒子不具有高度均匀性的特征，即窄的粒度分布和/或高度的圆度。然而，这些性质对本文所公开的脂质体阿霉素制剂的药代动力学和副作用特性具有积极影响，如将在下面更详细地描述的。

已经成功地表明，所述组成和所示尺寸的本发明脂质体比本领域已知的那些更稳定。与其更大的对应物相比，这样的小直径的脂质体较不快速地且以较低的程度被调理，并且被网状内皮系统较不快速地清除。另外，更大的脂质体更可能与其他脂质体或粒子融合或相互作用。

因此，根据本发明的脂质体阿霉素制剂已被证明在预防肿瘤生长方面更有效。它们在肿瘤中提供更高的阿霉素累积，并且更容易在肝脏中累积和清除。它们在体外试验中也具有更高的细胞毒性。与

制剂相比，根据本发明的脂质体阿霉素制剂显示较不显著的血清渗漏，同时具有良好的细胞摄取。人的血清半衰期显著高于本领域已知的脂质体阿霉素制剂的血清半衰期。对于在相关靶区域中的给定剂量，该制剂提供更高的药物暴露。通过使用本发明的制剂而不是

可以显著降低副作用，诸如PPE和嗜中性白血球减少症。

优点、改善的功效和副作用的减少将在后文的实施例部分中显示。

优选的是，在根据如以上所描述的脂质体阿霉素制剂中，其中脂质双层基本上由合成磷脂酰胆碱、优选结构上均一类型的合成磷脂酰胆碱，胆固醇和DSPE-PEG组成。特别优选的是，脂质双层基本上由1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇和DSPE-PEG组成。特别地，至少95重量％、优选至少99重量％、更优选100％的脂质双层仅由合成磷脂酰胆碱、优选结构上均一类型的合成磷脂酰胆碱，胆固醇和DSPE-PEG组成。如以上已描述的，均匀的脂质双层组成有利于脂肪酸部分的致密填积。因此，均匀的脂质双层改善囊泡的稳定性。

优选地，制剂中的脂质体的脂质双层中磷脂酰胆碱与胆固醇的重量比率是50：50至70：30、优选55：45至65：35、更优选60：40。

优选的是，在脂质体阿霉素制剂中，脂质体具有基于低温TEM获得的图像测量的至少0.99的平均相对圆度，并且其中

-第10百分位数至少是0.98；

-优选地，其中第5百分位数至少是0.98，

-更优选地，其中第5百分位数至少是0.98，并且第2百分位数至少是0.96。

如以上所描述的测定脂质体的囊泡形貌(参见“基于低温TEM获得的图像测量的”)。如根据以下式计算圆度：

制剂中脂质体的高平均圆度值进一步支持囊泡的稳定性并减少阿霉素治疗的副作用，诸如PPE和嗜中性白细胞减少症。不受这样的理论的束缚，椭球形形状与尺寸和脂质组成一起可能使药物产品在非靶向位置过早释放。这样的椭球形形状是批准的

药物产品的特征。

在优选实施方案中，脂质体阿霉素制剂具有通过DLS测量的≤0.15、优选≤0.10、更优选≤0.09的多分散性指数。因此，这样的脂质体基本上是单分散的。如以上所描述的进行测量(参见“通过动态光散射测量的”)。≤0.15的多分散性指数优于本领域已知的脂质体制剂的多分散性指数。本领域已知的通过挤出、均化和超声处理过程可获得的脂质体制剂通常显示出0.2至0.4的多分散性指数(Gim Ming Ong等人,Evaluation of ExtrusionTechnique for Nanosizing Liposomes,Pharmaceutics 2016(8)36,第5页)。基本上单分散的脂质体制剂对于再现性目的、工业规模生产是有益的，并且符合上市许可要求。

优选地，脂质体是单层的并且拥有一个内腔室。根据本发明的脂质体制剂的脂质体优选至少90％的程度、更优选至少97％的程度是单层的。脂质体分散体的均匀尺寸、圆度和单层度提供受控的和工业上规模化的制造方法。

在如以上所描述的制剂中，聚乙二醇-脂质缀合物、优选DSPE-PEG，可以基本上仅位于脂质双层的外层上。

在本发明的上下文中，“基本上仅在外层上”是指在制剂中的脂质体的脂质双层的内层中，聚乙二醇-脂质缀合物、优选DSPE-PEG的量小于0.1摩尔％、优选甚至小于0.01摩尔％并且更优选0.0摩尔％。可以通过应用如后文所描述的后修饰PEG化方法确保基本不存在聚乙二醇-脂质缀合物。

位于脂质体内表面上的PEG-脂质是不起作用的，其不必要地扩大脂质体的尺寸，并且它们的水解产物可能引起膜渗透性的增加。

优选的是，聚乙二醇-脂质缀合物、优选DPE-PEG在脂质双层中的相对量是至少2摩尔％、优选至少3摩尔％、更优选4摩尔％至6摩尔％。在内层基本上不含聚乙二醇-脂质缀合物的情况下，这导致制剂中脂质体的外层上聚乙二醇-脂质缀合物、优选DSPE-PEG的相对量高达12摩尔％。已证明在外表面中包含高相对量的聚乙二醇-脂质缀合物是有效的，以便进一步改善囊泡的血液循环稳定性和生物相容性。发现表面修饰的脂质体不太可能被代谢或清除。

应当注意，在脂质双层中具有相对高量的聚乙二醇-脂质缀合物的脂质体阿霉素制剂并且其中聚乙二醇-脂质缀合物、优选DSPE-PEG基本上仅位于脂质双层的外层上，其自身构成有利的构思，与脂质体的尺寸和形貌无关。因此，该方面可与上述描述组合应用，但其也可独自应用。

因此，本发明的方面涉及一种脂质体阿霉素制剂，其中该脂质体的脂质双层至少包含

-磷脂酰胆碱，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

-胆固醇；

-聚乙二醇-脂质缀合物，优选DSPE-PEG 2000；

其中聚乙二醇-脂质缀合物在脂质双层中的相对量是至少2摩尔％、优选至少3摩尔％、更优选4摩尔％至6摩尔％，并且其中聚乙二醇-脂质缀合物基本上仅位于脂质双层的外层上。

还优选的是在如前面段落中所描述的脂质双层中、基本上仅在脂质双层的外层上具有相对高量的聚乙二醇-脂质缀合物，并且另外具有如本说明书中所描述的任何其他特征或有利特征的组合、特别是关于脂质体的尺寸和/或形貌的(多个)特征的脂质体阿霉素制剂。

在本发明的优选实施方案中，在从制造起6个月、优选12个月的储存期之后，根据本发明的脂质体阿霉素制剂中的脂质体的平均直径是通过动态光散射测量的30至70nm、优选40至65nm；和/或所述脂质体的平均直径是基于低温-TEM获得的图像测量的20至50nm，优选30至40nm。

特别优选的是，在从制造起6个月之后、优选12个月之后，制剂中的脂质体的平均直径基本上与制造之后即刻制剂中的脂质体的平均直径相同。在从制造起12个月内，通过DLS测量的直径变化不大于±5nm，优选不大于±2nm，特别优选不大于±1nm。通过DLS测量的多分散性指数变化不大于±0.05，优选不大于±0.02，特别优选不大于±0.01。

因此，根据本发明的脂质体特别稳定。脂质体的尺寸的可控性和寿命对于制造、储存、保存期和患者安全性建议是有益的。

制剂可以具有0.01至0.10、优选0.03至0.07的药物与总脂质重量比。相比之下，

中的总脂质含量是接近16mg/mL，并且2mg/mL是阿霉素浓度。这导致

的药物与脂质的比率是0.138：1(重量：重量)。更低的药物与脂质比率的优点是脂质体可以制成更小的且更具球形。这样的形貌进一步有助于减少副作用。尽管如此，如将在实施例部分显示的，患者在给定剂量下的药物暴露被维持或甚至增加。

优选的是，包封的阿霉素晶体具有15至40nm、优选18至37nm、更优选25至35nm的平均长度，和/或5至15nm、优选6至12nm、更优选7至11nm的平均晶体宽度。晶体长度和宽度由通过低温TEM获得的一组高放大倍数图像手动测量。与本领域已知的类似组合物相比，所述尺寸小。

进一步优选的是，包封的阿霉素具有1至6、优选2至5、更优选3至4的每个脂质体纤维平均数。纤维的数目由通过低温TEM获得的一组高放大倍数图像手动确定。可以得出每个晶体的单根纤维的数目(高密度节点)。注意，阿霉素晶体具有螺旋构象并且每个转角(turn)的单根纤维的数目可能变化。阿霉素晶体的每个转角取一个测量值以便提供准确的表示。与本领域已知的类似组合物相比，所述数目小。

晶体的尺寸小和每个晶体纤维的数目低的优点是脂质体可以制成更小的且更具球形。这样的形貌进一步有助于减少副作用。尽管如此，如将在实施例部分显示的，患者在给定剂量下的药物暴露被维持或甚至增加。

应当注意，在脂质体中具有相对小的包封的阿霉素晶体的纤维宽度和长度的脂质体阿霉素制剂自身构成有利的构思，与脂质体的尺寸和形貌无关。

因此，本发明一方面涉及脂质体阿霉素制剂，其可与上述描述组合应用，但也可独自应用，其中脂质体的脂质双层至少包含

-磷脂酰胆碱，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。

-胆固醇；

-聚乙二醇-脂质缀合物，优选DSPE-PEG 2000；

其中包封的阿霉素晶体具有5至15nm、优选6至12nm、更优选7至11nm的平均纤维宽度，和/或15至40nm、优选18至37nm、更优选25至35nm的平均纤维长度。

还优选的是如前面段落中所描述的具有相对小的纤维宽度和长度，并且另外具有本说明书中所描述的任何其他特征或有利特征的组合、特别是关于脂质体的尺寸和/或形貌的(多个)特征的脂质体阿霉素制剂。

优选的是，将制剂分散在HEPES缓冲的溶液中，优选以10mM的浓度将制剂分散在HEPES缓冲的溶液中，从而提供6.8的pH值。溶液可以含有0.9％NaCl。将本领域已知的脂质体制剂分散在基于组氨酸和糖基(sugar groups)(myocet乳糖，doxil蔗糖)的缓冲溶液中。在该实施方案中，制剂可以不含蔗糖，因此降低了生物负载的风险。制造后还可进行无菌过滤。如将在以下解释的，该方面有助于有成本效益的制备。

可以将除阿霉素以外的活性组分包封在制剂中。例如，可以包含或包封在释放后显示协同效应的活性组分。至少一种活性组分也可以包含在脂质体双层中，并且另外的至少一种活性组分可以包封在同一脂质体中。术语“活性组分”可以包括药理学活性药物以及前药。前药是给药之后代谢成药理学活性药物的药物或化合物。

活性组分可以选自小的或大的有机或无机分子、核酸、核酸类似物和衍生物、肽、拟肽、蛋白质、抗体及其抗原结合片段、单糖、二糖、三糖、寡糖、脂质、糖胺聚糖、由生物材料制成的提取物、及其任意组合。

脂质体本身也可以是装载和未装载的活性组分。

根据本发明的另一方面，其可与上述描述组合应用，但也可独自应用，特别有利的是将脂质体多西他赛制剂与脂质体阿霉素制剂一起给药。多西他赛是用于治疗癌症，特别是乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃腺癌、头颈癌的化疗药物。多西他赛以名称Taxotere出售，其在溶剂中含有作为三水合物的多西他赛。多西他赛的化学名称是[(1S,2S,3R,4S,7R,9S,10S,12R,15S)-4-乙酰氧基-1,9,12-三羟基-15-[(2R,3S)-2-羟基-3-[(2-甲基丙-2-基)氧基羰基氨基]-3-苯基丙酰基]氧基-10,14,17,17-四甲基-11-氧代-6-氧杂四环[11.3.1.03,10.04,7]十七烷-13-烯-2-基]苯甲酸酯。

本领域已经建议将阿霉素和多西他赛联合给药用于治疗某些种类的癌症。然而，本发明人现在已经发现脂质体阿霉素制剂和脂质体多西他赛制剂的联合给药具有积极的效果。此外，已经发现当给予其中单一脂质体同时包含两种药物物质的脂质体制剂时，这样的效果甚至更显著。在这样的实施方案中，单一脂质体将亲水性阿霉素包封在其内部水性腔室中，而具有疏水性质的多西他赛位于脂质双层的层之间。

因此，特别优选的是，如果脂质体阿霉素制剂包含单一脂质体，其

-在水性内部腔室中包含阿霉素；和

-在脂质双层中包含多西他赛。

特别优选的是，制剂基本上由单一脂质体组成，该脂质体在其水性内部腔室中包含阿霉素并且在其脂质双层中包含多西他赛，即其中具有组合的活性物质的脂质体的量是至少80％、优选至少90％。

优选的是，包含单一脂质体的脂质体阿霉素制剂具有如本文所描述的有利性质，即尺寸、圆度、双层组成、稳定性、表面修饰等，该单一脂质体在水性内部腔室中包含阿霉素并且在脂质双层中包含多西他赛。还优选的是，这样的脂质体阿霉素制剂用作药物，优选用作治疗本文所述医学病症的药物。然而，应当注意，阿霉素和多西他赛在单一脂质体中的组合自身是有利的构思。

本发明的另外的方面是一种用于制备脂质体、优选如先前所描述的脂质体的方法。方法包括以下步骤：

a)提供在有机溶剂中的磷脂酰胆碱、优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇，

b)添加含水液体，

c)通过超声处理使脂质体形成，

d)任选地：通过过滤分离脂质体，

e)通过PEG化修饰脂质体，

f)将阿霉素装载到脂质体中，优选地通过远程装载技术将阿霉素装载到脂质体中；

其特征在于进行步骤c)，使得

-脂质体具有由动态光散射测量的30至70nm、优选40至65nm的平均直径；和/或

-脂质体具有由低温TEM测量的20至50nm、优选30至40nm的平均直径。

通过该方法，可以获得具有大大提高的稳定性值、大大提高的生物利用度和降低的毒性的脂质体。以温和的超声处理方法制造空脂质体，在该方法中脂质自然地变成脂质体。即使不添加稳定剂，脂质体也以其天然形状在长时间段内保持稳定。已经在不同的时间点测量了脂质体的尺寸分布并且其基本上保持恒定。也证明小尺寸是随时间恒定的。

优选地，步骤a)中使用的有机溶剂选自：乙醇、甲醇、氯仿及其混合物。最优选地，使用高纯度的有机溶剂，例如绝对值>99.99％的乙醇或甲醇。甚至更优选地，不需要薄膜水合。

所使用的脂质在这些有机溶剂中显示出良好的溶解性。通过使用具有高纯度的有机溶剂，避免了脂质体被杂质污染。

在步骤b)中使用的含水液体可以选自：水、缓冲水溶液、甘氨酸水溶液。优选地，可以使用具有生理盐浓度的缓冲水溶液，例如PBS(10mM磷酸盐，pH 7.2-7.4，0.9％NaCl)。还可以使用以下缓冲水溶液：150mM硫酸铵、150nm乙酸钙、150mM乙酸镁、150mM乙酸锰、150mM氯化铁、或150mM硫酸铜。

优选的是，使用硫酸铵水溶液，优选140至160mM硫酸铵水溶液，更优选150mM硫酸铵水溶液。所示数值范围内的浓度实现步骤f)中的受控远程装载，并且适合递送具有0.01至0.1、优选0.04至0.6的药物与总脂质重量比的脂质体阿霉素制剂。可以提供生理盐浓度，使得脂质体的内部类似于体内的生理条件。

步骤c)中的超声处理优选采用至少60μm的振幅进行并且进行至少1小时。超声处理可以进行至多24小时。

如果有的话，分离步骤d)可以通过离心；过滤；场流分级(FFF)；透析；色谱法，优选凝胶渗透色谱法实现。

将脂质体与液体混合物的其余物质，诸如有机溶剂、盐和/或洗涤剂分离。

脂质体分布优选至少95％是单层的并且优选至少97％是单层的，更优选至少98％是单层的。优选地，脂质体具有通过低温TEM测量的至少0.99的平均相对圆度，其中第10百分位数至少是0.98；优选地，其中第5百分位数至少是0.98。甚至更优选地，其中第5百分位数至少是0.98并且第2百分位数至少是0.96。如以上所描述的测量单层度和圆度两者。在根据本发明的脂质体制剂中，通过低温透射电子显微检查测量的球形脂质体与破碎粒子和/或聚集体的以重量％计的比率高于9：1。

在步骤e)中，通过PEG化修饰脂质体分散体。

“PEG化”意指作为后修饰方法进行的聚乙二醇修饰。传统上，将磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-脂质溶解在相同的混合物中以产生粗脂质体，随后通过挤出减小其尺寸。该方法称为预修饰方法。相反，当应用后修饰方法时，在溶剂中制备由磷脂酰胆碱和胆固醇组成的裸脂质体，并且然后通过合适的(多个)膜挤出。在后修饰方法的变型中，在接近脂质体组分的熔融温度的温度下将PEG衍生的磷脂添加至预形成的脂质体的稀释悬浮液中。该技术也称为“后插入”，其中PEG衍生的磷脂的插入主要由膜脂质和PEG衍生的磷脂的疏水部分的疏水相互作用驱动。优选的是，在60℃至70℃、优选在65℃下进行PEG化。该方法详细描述于Nakamura,K.；Comparative studies of polyethylene glycol-modified liposomesprepared using different PEG-modification methods；Biochim Biophys Acta,1818(2012)2801-2807中。优选使用DSPE-MPEG 2000。在后修饰方法的另一变型中，脂质体表面的PEG修饰通过共价连接含有反应性基团的PEG部分实现，所述反应性基团可以与存在于脂质体成分上的互补反应性基团反应。用于将诸如PEG的部分偶联到预先形成的脂质体表面的各种不同方法是已知的，包括通过戊二醛使伯胺交联、形成羰基-胺键、通过活化酯与伯胺反应形成酰胺键、形成二硫键、通过马来酰亚胺-硫醇加成反应形成硫酯键、以及形成肼键。另外，存在多种双正交方法，诸如通常以术语“点击”化学总结的那些，其实现化学选择性、在含水介质中的温和反应条件、以及在很少或没有副产物情况下的良好收率。已用于修饰脂质体表面的点击化学反应的实例包括铜(I)-催化的Huisgen 1,3-偶极环加成(CuAAC)、环张力促进的无铜点击反应、Staudinger连接反应、以及四嗪/反式-环辛烯逆电子需求狄尔斯-阿德耳环加成(IEDDA)，如Nag,O.K.；Surface Engineering of Liposomesfor Stealth Behavior；Pharmaceutics；5(2013)542-569中详细描述的。在两种变型中，仅在脂质体形成/最小化步骤之后添加PEG-脂质，优选在水溶液中添加。因此，产生了PEG化的脂质体，其中DSPE-PEG基本上仅位于脂质双层的外层上。

该方法的优点是产生具有小于50nm的平均直径和更高圆度的小的均匀脂质体，其具有更高的稳定倾向。本发明的另外的相关方面是降低制造成本、减少制造步骤的数量，这有利于大规模生产。

在步骤f)中，通过远程装载技术将阿霉素装载到脂质体中。

“远程装载”意指用于将阿霉素装载到脂质体内水相中的方法。将远程装载施用至已形成的脂质体。在这样的脂质体制剂中，建立硫酸铵的跨膜梯度，其中脂质体的水性内部中的[(NH4)₂SO₄]浓度大大超过外部介质中的[(NH₄)2SO₄]浓度。该梯度用作将两亲性弱碱药物，诸如阿霉素跨过脂质体双层转移的驱动力，在脂质体双层中它们形成晶体样沉淀物。该方法最初由Barenholz开发并且是本领域公知的(参见Barenholz,Y.C.；

—Thefirst FDA-approved nano-drug:Lessons learned；J.Control.Release 2012,160,117–134)。

优选的是该方法不包含任何挤出步骤并且不包含任何薄膜水合步骤。

“挤出”意指用于制备脂质体的常规技术，其中使脂质体制剂通过限定孔径的膜。挤出方法作为选择用于脂质体制备的方法已经在本领域中讨论(Gim Ming Ong等人,Evaluation of Extrusion Technique for Nanosizing Liposomes,Pharmaceutics 2016(8)36；Perrie等人,Manufacturing Methods for Liposome Adjuvants,in；VaccineAdjuvants:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.1494,2017)。然而，挤出步骤是昂贵的并且得到较差的囊泡形貌值，导致较低质量的脂质体。

“薄膜水合”意指用于制备脂质体的常规方法，涉及例如在圆底烧瓶中通过去除有机溶剂制备薄脂质膜的步骤。然后在添加和搅拌分散介质后形成非均相脂质体。薄膜水合之后通常是通过聚碳酸酯膜挤出，以便获得更小脂质体的更均匀制剂。薄膜水合甚至比挤出更昂贵。

已经发现，与通过常规技术可获得的脂质体相比，通过根据本发明的超声处理制备的脂质体制剂的多分散性更小、更稳定和更不易降解。另外，与由挤出方法得到的脂质体相比，脂质体具有减小的直径和更高的圆度。

优选的是，如以上所描述的方法的步骤之后是再一个步骤g)。步骤g)包括通过过滤除菌。

“通过过滤除菌”意指使最终的脂质体制剂通过具有≤0.22μm的孔径的无菌过滤器，以便保留潜在的杂质和细菌生物体。

通过过滤除菌实现脂质体阿霉素制剂的符合GMP的制造，其中在无菌过滤之前的步骤不一定需要在无菌条件下进行。这是特别有成本效益的。然而，为了实现通过过滤除菌，先决条件是将制剂分散在不含糖基团的储存缓冲溶液中，诸如HEPES缓冲的溶液中的分散体。

如先前所描述的脂质体阿霉素制剂可以用作药物，特别是用于治疗癌症、更特别是用于治疗实体瘤、转移性乳腺癌、晚期卵巢癌、卡波西肉瘤和多发性骨髓瘤的药物。

如先前所描述的脂质体阿霉素制剂可以特别用于治疗子宫平滑肌肉瘤。

如先前所描述的脂质体阿霉素制剂可以特别用于治疗附件皮肤癌。

治疗癌症的脂质体阿霉素制剂可以静脉内给予。

对于静脉内注射，脂质体可以以溶解或悬浮形式存在。制剂的量可以在每m²(体表)1至100ml范围内，并且是剂量依赖性的。可注射溶液可以包含另外的成分，诸如稳定剂。它还可以包含生理上相容的成分，诸如盐，特别是氯化钠或醇，优选乙醇。

本发明的另外的方面是通过如先前所描述的方法可获得的如先前所描述的脂质体。

将通过以下实施例进一步解释本发明。实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。

图1a/1b：通过低温TEM测量的根据本发明的脂质体阿霉素制剂的形貌和尺寸分布；

图2a/2b：通过低温TEM测量的

制剂的形貌和尺寸分布；

图3：通过DLS测量的根据本发明的脂质体阿霉素制剂的不同实施方案的尺寸分布，与

制剂相比较；

图4a-4b：通过低温TEM测量的根据本发明的脂质体阿霉素制剂(4a)的圆度分布，与

制剂(4b)相比较；

图5a-5c：通过低温TEM测量的根据本发明的阿霉素晶体(5a，5b)的宽度测量值，与

制剂(5c)相比；

图6a-6c：通过低温TEM测量的根据本发明的阿霉素晶体(6a，6b)的长度测量值，与

制剂(5c)相比；

图7a-7b：按等级排列的每个脂质体中阿霉素纤维的计数；图7a表示根据本发明的阿霉素制剂；图7b

制剂，基于低温TEM成像测量的；

图8：三种比较的给予的制剂CALYX、TLD-1、游离DXR的阿霉素随时间在肝脏和肿瘤中的累积；

图9：基于MTS吸收的三种比较的阿霉素制剂CALYX、TLD-1、游离DXR的体外细胞毒性研究；

图10a-10c：基于荧光素酶发光的三种比较的阿霉素制剂CALYX、TLD-1、游离DXR的体外细胞毒性研究；

图11在给予根据实施例1的脂质体阿霉素制剂下，对随时间肿瘤生长(MDA-MB231)的对比研究的结果；

图12a-b：在给予根据实施例1的脂质体阿霉素制剂下，对随时间肿瘤生长(A2780)的对比研究的结果；

图13：在给予根据实施例1的脂质体阿霉素制剂下，对随时间肿瘤生长(4T1)的对比研究的结果；

图14：包括根据实施例1的阿霉素制剂的三种比较的阿霉素制剂在小鼠中的体内存活研究的结果。

图15a-b：根据实施例1的脂质体阿霉素制剂随时间(12个月)的稳定性测量的尺寸和多分散性结果。

实施例1：TLD-1的制备

以60：40重量比提供1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和胆固醇并溶解在绝对值>99.99％的乙醇中。使溶液在150mM硫酸铵的无菌水水溶液中在68℃下水合。将溶液用60μm的振幅超声处理24小时以产生粗脂质体。然后将PSPE-MPEG 2000水溶液添加至脂质体悬浮液中并加热至65℃持续30分钟，以产生具有5摩尔％的期望PEG-脂质量的PEG化脂质体，对应于在脂质双层的外层中10摩尔％的PEG-脂质量。通过远程装载技术进行阿霉素HCl向脂质体中的装载，以获得0.05的DXR/总脂质重量比。通过重力沉淀和过滤去除未装载的DXR。通过切向流过滤洗涤脂质体分散体并进行缓冲液交换，以获得脂质体在含有0.9重量％NaCl的10mM HEPES缓冲的溶液中的分散体。

如该实施例中所描述的获得的脂质体阿霉素在后文可以称为“TLD”、“TLD-1”或“Talidox”。

无论何时将游离阿霉素作为对比制剂施用，这在实施例和附图中可以称为“Doxo”、“DXR”、“DX”、“阿霉素”。

对比实施例

购买市售

对于低温TEM测量，将

在HEPES缓冲液(NaCl，pH6.8)中稀释10×。

实施例2：尺寸测量

通过低温TEM和DLS进行通过上述方法获得的脂质体的尺寸测量，并将结果与市售

制剂的相应测量进行比较。

图1a显示根据实施例1获得的制剂的高放大倍数(80000×)代表性图像。图1b显示测量的尺寸分布直方图。图2a显示对比

制剂的高放大倍数(80000×)代表性图像。图2b显示测量的尺寸分布直方图。

如下进行低温TEM测量：使根据实施例1和对比实施例的脂质体样品玻璃化。用200kV的加速电压在载网(方华膜和碳(Formvar and Carbon))上制备样品。用低温TEMJEOL JEM-2100F装置和TVIPS TemCam F415MP相机以40000×放大倍数获取图像。通过使用Vironova分析仪软件(Vironova，瑞典)的半自动图像处理进行粒子识别和粒度测定。简言之，导入一系列相同放大倍数的随机图像。仅检测完全位于图像边界内并具有明显膜的脂质体粒子。分析所识别的对象的球形直径、圆度、单层度(unilamellarity)。用相同的阈值和设置对所有图像进行批处理，对于每个样品累积超过5至18个图像，对应于1560至1178的被分析的粒子数目。平均值具有约10nm的标准偏差。

图1b显示根据实施例1的脂质体制剂的尺寸分布。分析的图像的数目是5。分析的粒子的数目是1560。平均直径是35.61nm，并且标准偏差是7.42nm。测量的最小直径是24.81nm，测量的最大直径是103.35nm。均匀性Z-检验给出1.01的采样均匀性的量度，表明包括在分析中的所有图像均含有具有相同平均尺寸的粒子群。

图2b显示根据对比实施例的脂质体制剂的尺寸分布。分析的图像的数目是18。分析的粒子的数目是1178。平均直径是70.26nm，并且标准偏差是13.41nm。测量的最小直径是32.52nm，测量的最大直径是159.09nm。均匀性Z-检验给出3.15的采样均匀性的量度，表明不是所有包括在分析中的图像均含有具有相同平均尺寸的粒子群。

根据实施例1的脂质体制剂在低温TEM分析中进一步显示破碎粒子的数目<10％，并且无粒子聚集也无团聚。

图3显示根据实施例1和对比实施例的脂质体制剂的通过动态光散射(DLS)测量的尺寸。将两个样品在PBS或MQ H2O中稀释10倍，并在Zetasizer装置上通过Malvern在25℃和0°散射角下测量。TLD-1(根据实施例1)具有60.5(±4.7nm)nm的平均直径和0.084±0.038的多分散性指数。在DLS-测量中，

具有85.0nm的平均直径。应当注意，由于PEG化的表面不能被低温TEM检测到，因此通过动态光散射测量的值略微高于通过低温TEM成像可获得的值，而其作为脂质体的流体动力学半径的一部分被包括在DLS中。

实施例3：圆度测量

根据实施例1和对比实施例的脂质体制剂的圆度通过低温TEM测量。实施例1的结果呈现于图4a中，并且对比实施例的结果呈现于图4b中。如早前所描述的进行样品制备和测量。

对于实施例1，粒子的平均圆度是0.99，具有0.03％的相对标准误差以及0.01的平均标准偏差。第50百分位数测量为1.00，第10百分位数测量为0.98，第5百分位数测量为0.98，以及第2百分位数测量为0.96。均匀性Z-检验给出1.19的采样均匀性的量度，表明所有包括在分析中的图像均含有具有相同平均尺寸的粒子群。

对于对比实施例，粒子的平均圆度是0.99，具有0.06％的相对标准误差以及0.02的平均标准偏差。第50百分位数测量为1.00，第10百分位数测量为0.97，第5百分位数测量为0.95，以及第2百分位数测量为0.92。均匀性Z-检验给出6.10的采样均匀性的量度，表明不是所有包括在分析中的图像均含有具有相同平均尺寸的粒子群。

因此，市售的

在制剂中显示更低的圆度。例如，

中10％的脂质体具有仅0.97和更低的圆度。

根据实施例1的脂质体制剂在低温TEM测量中进一步显示至少80％的填充率(用阿霉素填充)和98％的单层度率。

实施例4：晶体尺寸和每个晶体的纤维数目

根据实施例1和对比实施例的脂质体制剂的尺寸通过低温TEM测量。实施例1的宽度测量的结果呈现于图5a和图5b中，并且对比实施例的宽度测量的结果呈现于图5c中。实施例1的长度测量的结果呈现于图6a和图6b中，并且对比实施例的长度测量的结果呈现于图6c中。如早前所描述的进行样品制备和测量。晶体长度和宽度由通过低温TEM获得的一组高放大倍数图像手动测量。

对于实施例1，平均晶体宽度是9.57nm，具有2.78nm的标准偏差(测量次数：140；分析12幅图像)，并且平均晶体长度是27.36nm，具有9.15nm的标准偏差(测量次数：289；分析5幅图像)。对于对比实施例，平均晶体宽度是17.45nm，具有4.60nm的标准偏差(测量次数：60；分析21幅图像)，并且平均晶体长度是47.77nm，具有15.33nm的标准偏差(测量次数：105；分析5幅图像)。

每个脂质体的纤维量由通过低温TEM获得的一组高放大倍数图像确定。可以手动得出每个脂质体的单根纤维的数目(高密度节点)。由于阿霉素晶体具有螺旋构象并且每个转角的单根纤维的数目可能变化，因此每个转角取一个测量值，以便提供准确的表示。

对于实施例1，等级比率显示在图7a中。对于对比实施例，等级比率显示在图7b中。x轴显示等级数目(1至12)，其中等级数目指示阿霉素晶体中单根纤维的数目。

在实施例1中，每个晶体有3根纤维的数目是最常见的构象。未观察到具有1、7或更多个单根纤维的晶体。数据集中所有阿霉素晶体的单根纤维之间的平均距离测量为2.6nm。

在对比实施例中，每个晶体有7根纤维的数目是最常见的构象。未观察到具有1、2、3和12或更多个单根纤维的晶体。数据集中所有阿霉素晶体的单根纤维之间的平均距离测量为2.7nm。

因此，市售的

在制剂中显示更低的圆度。例如，

中10％的脂质体具有仅0.97和更低的圆度。

实施例5：小鼠中的肿瘤累积

将根据实施例1的脂质体阿霉素制剂(“TLD-1”)、市售

(“CAELYX”)和游离阿霉素(Adriblastin；“游离阿霉素”)以3.5mg/kg的量给予小鼠(无胸腺裸-Foxn1^nu小鼠)。4h或16h之后，处死小鼠以便使用HPLC分析检测总阿霉素量。

图8显示三种比较的给予的制剂在肝脏和肿瘤中随时间阿霉素累积。柱表示平均值和标准偏差(n＝3)。

肿瘤中TLD-1累积是游离阿霉素的累积的约4倍，并且是

的两倍。CAELYX与TLD-1之间长达16小时的血清半衰期相当。然而，TLD-1的肝脏累积和清除更有效。

实施例6：体外细胞毒性

在96孔板(100ml/孔)中在以10000个细胞/ml接种的A2780细胞中测量TLD-1、CAELYX和游离阿霉素(“DX”)的体外细胞毒性。接种之后24小时，用不同浓度的阿霉素制剂处理细胞。

图9显示向细胞中添加10、50、100、500、1000、5000和10000ng/ml的浓度的结果。处理之后72小时，添加MTS比色分析组分((3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)“MTS”)用于活细胞染色。再过3小时之后，测量吸光度。可以看出，对于任何施用的浓度，用TLD-1处理的样品的吸光度明显低于用CAELYX处理的样品的吸光度。因此，TLD-1的细胞毒性更高并且更类似于游离阿霉素。

图10a至10c显示添加5、50、500、5000、25000和50000ng/ml的浓度的结果。在荧光素酶底物的存在下处理细胞，并随时间(处理之后6、24、48、73小时)测量活细胞的发光。由图中可以看出，48小时之后用TLD-1处理的样品的发光明显低于用CAELYX处理的样品的发光。72小时之后效果甚至更显著。因此，TLD-1的细胞毒性更高并且更类似于游离阿霉素。

血清渗漏研究：进行实验以评估TLD-1和

随时间释放游离阿霉素到RPMI(细胞培养基)+/-10％FCS培养基中的程度。TLD-1和CAELYX分别在RPMI培养基+/-10％FBS中在37℃下在金属珠浴中避光孵育72h之后，测量所述培养基中的游离阿霉素。通过HPLC尺寸排阻色谱法在478nm下检测游离和脂质体阿霉素(由此避免来自蛋白质的背景吸收)。脂质体阿霉素复合成聚集体，并且因此比游离阿霉素峰出现得更晚。后者通过与游离DX(adriblastin)对照样品的值比较而被识别。进行峰曲线下面积的对比分析(脂质体阿霉素相对于游离阿霉素)。实验揭示，当在37℃下在用于体外实验的培养基中激发72h时，TLD-1和Caelyx两者均保持稳定。对于孵育的TLD-1，溶液中游离DX的百分比低于4％，并且对于孵育的

溶液中游离DX的百分比低于6％。一般而言，TLD-1渗漏低于Caelyx渗漏。这表明在体外细胞毒性分析中看到的增强的效果是由于增加的细胞摄取，而不是由于游离的阿霉素渗漏到培养基中。

实施例7：肿瘤生长

通过向小鼠给予安慰剂制剂、TLD-1和CAELYX并通过随时间测量对肿瘤尺寸的影响测定对肿瘤生长的体内作用。

图11显示这样的测试的结果。将空脂质体、游离阿霉素、

和TLD-1定期给予至带有注射的MDA-MB231细胞系的小鼠(5只小鼠/制剂)。每个箭头指示剂量为3.5mg/kg体重的注射。在治疗开始之后3天，TLD-1的作用(以肿瘤重量生长测量的，μg)明显优于

的作用，并且在26天内保持显著。

图12a和12b显示另一类似测试设置的结果。将PBS、游离阿霉素、

和TLD-1定期给予至带有注射的A2780细胞系的小鼠(5只小鼠/制剂)。对于图12a，给予与实施例1中的制剂类似的制剂，然而，与实施例1不同，超声处理仅在达到86.78nm的平均脂质体直径和0.117的多分散性指数的条件下进行，两者均通过DLS测量。对于图12b，给予根据实施例1的制剂、具有通过DLS测量的64.87nm的平均直径和0.168的多分散性指数的脂质体。每个箭头指示剂量为3.5mg/kg体重的注射。虽然在图12a中所呈现的测试中，发现具有在规格(>70nm)之外的平均直径的TLD-1对肿瘤生长的作用与用

的治疗相比变劣，但是在处理开始之后19天之后，根据规格的TLD-1的作用已经明显优于Caelyx的作用，并且在另外12天内保持显著(以肿瘤重量生长测量，μg)。

图13显示另一类似测试设置的结果。向植入了4T1肿瘤的小鼠定期给予生理盐水、

和TLD(5只小鼠/制剂)。在处理开始之后12天，TLD-1的作用明显优于Caelyx的作用(以肿瘤尺寸生长测量的，mm³)。

图14显示分别用生理盐水、

或TLD-1治疗的小鼠的体内存活研究(根据实施例1，5只小鼠/制剂)。60％的用TLD-1治疗的小鼠存活直至第30天，并且40％的小鼠存活直至第34天。相反，100％的用

治疗的组的小鼠在第26天已经死亡。

实施例8：其他研究

进行根据实施例1(TLD-1)的脂质体阿霉素制剂和

的其他对比研究。它们包括动物模型中的副作用研究和功效研究。对于实施例1，其还包括在人中的血清半衰期和曲线下面积(AUC)研究，以及副作用研究。

在人血清中已经进行血清半衰期研究：已经记录了Caelyx在人血清中具有74h的半衰期。目前，由5名患者估算TLD-1在人中的血清半衰期并且为约100h。此外，TLD-1的血清半衰期数据的曲线下面积(AUC)显示为大于相应剂量的

的血清半衰期数据的曲线下面积(AUC)，这意味着对于给定剂量实现更高的药物暴露。用TLD-1(30mg/m²)治疗的患者的药物暴露高于用

(37mg/m²)治疗的患者的药物暴露，尽管剂量不同。

已经在大鼠中进行副作用研究。在大鼠中进行的毒理学研究期间评估皮肤毒性并且特别是PPE(例如手足综合征)。即使在6mg/kg的高浓度下，通过给予TLD-1也不促成皮肤毒性并且特别是PPE(由于缺乏统计学显著差异而将雄性和雌性数据合并在一起)。类似地，在大鼠中进行的毒理学研究期间评估嗜中性白细胞减少症(通过嗜中性白细胞计数)。即使在6mg/kg的高浓度下，TLD-1给药后嗜中性白细胞计数变化不显著(由于缺乏统计学显著差异而将雄性和雌性数据合并在一起)。

实施例9：稳定性结果

图15a和15b显示通过DLS测量的根据本发明的脂质体制剂随时间的尺寸和多分散性稳定性。根据以上所描述的方法(实施例1)获得脂质体制剂。将脂质体制剂储存在6.5至6.8的pH值和4℃的温度下的HEPES缓冲的溶液中。从制造起12个月的时间段内，尺寸变化不高于±1nm。通过DLS测量的多分散性指数变化不高于±0.01。

实施例10：临床试验结果

目前正在进行临床研究，其中根据实施例1的脂质体阿霉素制剂(TLD-1)迄今为止已经用于十二名患有晚期实体瘤的患者(瑞士组(Swiss Group)，用于临床癌症研究；试验编号：SAKK 65/16)。试验设计为开放标签、单臂、多中心、首次人体、1期试验。该试验的主要目的是识别晚期实体瘤患者中TLD-1的最大耐受剂量(MTD)和推荐的2期剂量(RP2D)。该试验的进一步目的是评价TLD-1的安全性、初步抗肿瘤活性和药代动力学。

该研究的中期报告指出，TLD-1可以在患有晚期预先治疗的实体瘤的患者中每3周安全地给予至多45mg/m²的剂量。该剂量相比

较高，其中MTD是每4周50mg/m²。此外，TLD-1的不期望的副作用的数目和严重程度低于采用

具体地(TLD-1相对于

)，未观察到临床上明显的恶心(<8.3％相对于38.5％)、呕吐(<8.3％相对于24.3％)、脱发(0％相对于13.4％)、或心脏毒性，而骨髓抑制很少且程度轻微(8.3％相对于25.6％)。未报告未预期的毒性。

不限于此，推测与包括

的常规阿霉素脂质体制剂相比，用TLD-1观察到的更少副作用是由于给予至患者的装载阿霉素的脂质体相对小的脂质体尺寸和高度均匀性，特别是由于它们显著的圆度、低多分散性和脂质体中阿霉素晶体纤维的高度均匀性(长度和宽度)。

Claims

1.脂质体阿霉素制剂，其中所述脂质体的脂质双层至少包含

-磷脂酰胆碱，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；

-胆固醇；

-聚乙二醇-脂质缀合物，优选DSPE-PEG 2000；

其中

-所述脂质体具有由动态光散射测量的30至70nm、优选40至65nm的平均直径；和/或

-所述脂质体具有基于低温TEM获得的图像测量的20至50nm、优选30至40nm的平均直径。

2.根据权利要求1所述的脂质体阿霉素制剂，其中所述脂质双层基本上由合成磷脂酰胆碱、优选结构上均一类型的合成磷脂酰胆碱，胆固醇和DSPE-PEG组成。

3.根据前述权利要求中任一项所述的脂质体阿霉素制剂，其中所述脂质体具有由低温TEM测量的至少0.99的平均相对圆度，并且其中

-第10百分位数至少是0.98；

-优选地，其中第5百分位数至少是0.98；

4.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述聚乙二醇-脂质缀合物基本上仅位于所述脂质双层的外层上。

5.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中聚乙二醇-脂质缀合物在所述脂质双层中的相对量是至少2摩尔％、优选至少3摩尔％、更优选4摩尔％至6摩尔％。

6.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述药物与总脂质重量比是0.01至0.10、优选0.03至0.07。

7.根据前述权利要求中任一项所述的脂质体阿霉素制剂，其中包封的阿霉素晶体具有5至15nm、优选6至12nm、更优选7至11nm的平均纤维宽度，和/或15至40nm、优选18至37nm、更优选25至35nm的平均纤维长度。

8.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中将所述脂质体分散在HEPES缓冲的溶液中。

9.用于制备脂质体阿霉素制剂、优选根据前述权利要求中任一项所述的脂质体阿霉素制剂的方法，其包括以下步骤：

a)提供在有机溶剂中的磷脂酰胆碱，优选1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇，

b)添加含水液体，

c)通过超声处理使脂质体形成，

d)任选地：通过过滤分离脂质体，

e)通过PEG化修饰脂质体，

f)将阿霉素装载到所述脂质体中，优选地通过远程装载技术将阿霉素装载到所述脂质体中；

其特征在于进行步骤c)，使得

-所述脂质体具有通过动态光散射测量的30至70nm、优选40至65nm的平均直径；和/或

-所述脂质体具有通过低温TEM测量的20至50nm、优选30至40nm的平均直径。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法不包含任何挤出步骤或任何薄膜水合步骤。

11.根据权利要求9或10中任一项所述的方法，其中步骤f)之后是步骤

g)通过过滤除菌。

12.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其用作药物，特别是用于治疗癌症，更特别是用于治疗实体瘤、转移性乳腺癌、晚期卵巢癌、卡波西肉瘤和多发性骨髓瘤的药物。

13.根据权利要求12所述的制剂，其用作治疗子宫平滑肌肉瘤的药物。

14.根据权利要求12所述的制剂，其用作治疗附件皮肤癌的药物。

15.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其用于治疗根据权利要求12至14的医学适应症，其中所述治疗包括所述制剂的静脉内给药。

16.根据权利要求1至8之一所述的制剂，其通过根据权利要求9至11之一所述的方法可获得。

17.根据权利要求1至8中任一项所述的脂质体阿霉素制剂，其中所述脂质体阿霉素制剂具有通过DLS测量的≤0.15、优选≤0.10、更优选≤0.09的多分散性指数。