WO2018124423A1 - 플라스미드 디엔에이 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

플라스미드 디엔에이 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

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WO2018124423A1
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plasmid dna
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cationic
group
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최정우
김상훈
남혜영
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주식회사 삼양바이오팜
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for efficiently delivering plasmid DNA and a preparation method thereof, and more particularly, to plasmid DNA as an active ingredient; Peptides, cationic compounds comprising a nuclear placement signal (NLS) sequence or RGD peptide sequence; And an amphiphilic block copolymer, wherein the plasmid DNA binds to a peptide to form a complex with the cationic compound, and the complex is encapsulated inside a nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer. It relates to a DNA-containing pharmaceutical composition and a method for producing the same.
  • Gene therapy is a therapeutic technology that inserts genes to replace abnormal genes that cause disease in the cells and tissues of patients or genes that help to treat diseases. Research of means of delivery is underway.
  • the key elements of gene therapy are genes (or transporters) that can deliver therapeutic genes and therapeutic genes to the human body safely and efficiently. Safe gene delivery is a delivery system that effectively delivers therapeutic genes to target organs and allows them to be accepted without rejection by appropriate cells, resulting in protein expression, resulting in the desired therapeutic effect.
  • Gene carriers or systems are sometimes referred to using the term 1 vector 1 .
  • the carrier is largely a viral carrier using adenovirus or retrovirus. It is divided into non-viral carriers using cationic lipids and cationic polymers.
  • Non-viral carriers are inferior in efficiency to viral carriers, but have the advantages of low side effects in terms of in vivo safety and low production cost in terms of economy.
  • the most representative of the non-viral carriers are cationic lipids and cationic lipids using cationic lipids and polycat ion polymers and nucleic acids. These cationic lipids or polycationic polymers have been studied in that they form complexes through electrostatic interactions with nucleic acids to stabilize nucleic acids and increase intracellular delivery. However, the use of the necessary amount to achieve a severity effect, but less than the viral carrier, caused severe toxicity, resulting in inappropriate use as a drug.
  • nucleic acid delivery technology that can reduce the toxicity by minimizing the amount of cationic polymers or cationic lipids that can cause toxicity, while being stable in the blood and body fluids, can be delivered intracellularly to obtain a more effective effect This is necessary.
  • amphiphilic block copolymers can solubilize hydrophobic poorly soluble drugs by forming hydrophobic polymer nanoparticles therein, while hydrophilic drugs such as nucleic acids that contain anions can be encapsulated within the polymer nanoparticles. Therefore, it is not suitable for delivery of these nucleic acids.
  • the present inventors form a complex by the electrostatic interaction of the nucleic acid and the cationic compound, the complex is a nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer
  • Nucleic acid delivery compositions and various methods of preparation have been disclosed for encapsulation therein.
  • the plasmid DNA drug having a large size of 30,000 base pairs or more is characterized by a significant decrease in efficiency when introduced into a cell using a non-viral carrier. The reason is that plasmid DNA requires transfer to the nucleus in order to express the protein.
  • a large nucleic acid decreases the gene transfer effect and reduces the therapeutic effect because the nucleic acid drug in the cytoplasm to the nucleus is significantly reduced.
  • formulation preparation methods for enhancing the delivery capacity of such nucleic acid delivery compositions and the stability of plasmid DNA.
  • the present inventors have made intensive efforts to increase the delivery efficiency of plasmid DNA.
  • plasmid DNA having a size of 30, 000 or more base pairs with a peptide including a nuclear batch signal (NLS) sequence or an RGD peptide sequence
  • NLS nuclear batch signal
  • RGD RGD peptide sequence
  • one example of the present invention is to provide a pharmaceutical composition capable of effectively delivering plasmid DNA into the body.
  • Another example is to provide a method for preparing a pharmaceutical composition capable of effectively delivering such plasmid DNA into the body.
  • the composition according to the present invention can increase the stability of the plasmid DNA in the blood or body fluid by separating the plasmid DNA from the outside using a cationic compound and an amphiphilic block polymer.
  • the composition of the present invention can efficiently deliver the plasmid DNA into the cell by femide function.
  • the amphiphilic polymer is excellent in biodegradability and biocompatibility.
  • Figure 2 is a result of treating the polymer particles prepared by the production method of Comparative Examples 1 and 1-8 using GFP pDNA to confirm the intracellular delivery capacity of the polymer nanoparticle transporter according to the present invention, GFP
  • the fluorescence shown by the expression of (green fluorescent protein) is a photograph measured by a fluorescence microscope.
  • Example 8 As a result of processing the cells prepared polymer nanoparticles by the manufacturing method, it is a graph showing the expression rate of luciferase (luci ferase).
  • Figure 3a shows the delivery expression rate of the polymer nanoparticles prepared by the preparation method of Example 8 into the cancer cells SK-Mel and Hctll6
  • Figure 3b is in the ⁇ ⁇ 080 and Miapaca2 of the polymer nanoparticles prepared by the preparation method of Example 8 Delivery expression rate
  • Figure 3c is a graph showing the delivery expression rate of A549 and HepG2 of the polymer nanoparticles prepared by the preparation method of Example 8.
  • the composition according to the present invention is a composition for delivering a plasmid DNA comprising a nanoparticle structure, comprising a plasmid DNA, a nuclear batch signal (NLS) sequence or an RGD peptide sequence in a nanoparticle structure of an amphiphilic block copolymer. It has a structure containing a complex of a peptide and a bivalent compound, as an active ingredient
  • NLS nuclear batch signal
  • RGD RGD peptide sequence
  • the plasmid DNA binds to the peptide to form a complex with the cationic compound, and the complex formed as described above is It is characterized in that it is enclosed in the nanoparticle structure of the amphiphilic block copolymer.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a fusion lipid.
  • the composition can be used as a composition for delivery of plasmid DNA contained as an active ingredient.
  • step (b) dissolving the amphiphilic block copolymer in an organic solvent and mixing it with the solution obtained in step (a).
  • step (a) is performed in order to prepare a complex of a peptide and a cationic compound comprising a plasmid DNA, a nuclear batch signal (NLS) sequence or an RGD peptide sequence. Dissolved in a solvent and mixed to produce a monophase system.
  • step (a) the plasmid DNA dissolved in the aqueous solvent is first bound to a peptide comprising a nuclear batch signal (NLS) sequence or an RGD peptide sequence, and then the cationic compound is in the form of nanoparticles by electrostatic interaction. It is complexed with plasmid DNA and peptides.
  • the aqueous solvent used in this step may be distilled water, water for injection, or a buffer, and the preferred complete solution may be Phosphate buf fered sal ine.
  • the mixing ratio between the plasmid DNA and the aqueous solution in which the cationic compound is dissolved is no particular limitation on the mixing ratio between the plasmid DNA and the aqueous solution in which the cationic compound is dissolved.
  • the ratio of the aqueous solution of the cationic compound to the aqueous solution of the cationic compound (cationic compound solution / plasmid DNA solution) on a volume basis is 1 to 30, More specifically, it may be 2 to 10, but is not limited thereto.
  • the aqueous solutions are mixed through suitable mixing means known in the art, and examples of such a method include an ultrasonic grinder and the like.
  • the plasmid DNA used in the step (a) is an active ingredient of the composition finally prepared.
  • the plasmid DNA and “may have one or more functional group selected from carboxyl group, phosphate group and sulfate group the group consisting of.
  • the plasmid DNA is one or more nucleic acids having a large size of 30, 000 base pairs, preferably 34, 000 base pairs or more and 42, 000 base pairs or less.
  • the plasmid DNA may be chemically modified or modified at its backbone, sugar or base for the purpose of increasing blood stability or weakening immune response. Specifically, a portion of the phosphodiester bond of the nucleic acid is replaced by a phosphorothioate or boranophosphate bond, or a methyl group, methoxy at the 2'-0H position of some ribose base. It may include one or more modified nucleotides in which various functional groups, such as ethyl group and fluorine, are introduced.
  • one or more ends of the plasmid DNA may be modified with one or more selected from the group consisting of cholester, tocope and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms.
  • it may be modified at the 5 'end, or 3 1 end, or both ends of the sense and / or antisense strand, preferably at the end of the sense strand.
  • the cholester, tocope and fatty acids having 10 to 24 carbon atoms include cholester, tocope and each analog, derivative, and metabolite of fatty acid.
  • the plasmid DNA expresses several kinds of therapeutic genes. It is not limited to specific molecular weight, protein, bioactivity or therapeutic areas.
  • the plasmid DNA is preferably included in 0.001 to 10% by weight, specifically 0.01 to 5% by weight, based on the weight of the total composition to be prepared. If the content of the plasmid DNA is less than 0.001% by weight, the amount of the carrier used is higher than that of the drug, which may have side effects caused by the carrier. And, if it exceeds 10% by weight, the size of the nanoparticles is too large to reduce the stability of the nanoparticles and there is a fear that the loss rate during filter sterilization increases.
  • Peptide can be used identically to “polypeptide”, “oligopeptide” and “protein” and is not limited to a specific molecular weight, peptide sequence or length, bioactivity or therapeutic field.
  • the peptide may covalently bind a DNA binding group, for example polyamine, specifically spermine, to enhance binding capacity with plasmid DNA. That is, the peptide covalent conjugate may be a conjugate of peptide and spermine.
  • Peptides may have a nuclear local ion signal (KNLS) that has the ability to deliver large plasmid DNA into the nucleus. It is a sequence found in proteins targeted to the nucleus, and is characterized by the fact that when the sequence is removed from the protein, it remains in the cytoplasm.
  • KNLS nuclear local ion signal
  • Nuclear holes responsible for material entry into the nucleus have a mechanism to recognize the NLS, which enhances its ability to deliver to the nucleus.
  • spermine can be used to maximize gene transfer efficiency.
  • a DNA-spermine conjugate is formed, and one complex conjugate can be incorporated into the nanoparticle structure.
  • sequences that can be used in the present invention are shown in Table 1 below.
  • linkers that combine spermine and peptide are SMCC (succinimidyl 4 ⁇ (N-ma leimi dome thy 1) eye 1 ohexane-1 -car boxy late), SMPB (succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate),
  • GMBS N-Y-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester
  • NLS-SP Peptide SMPB-Spermine GYGPKKKRKVGGC 1
  • Tat-C (X) n—peptide-0 () n RKK R0RR PP0C 4 (X RGD (i.e.
  • the peptide may be used in a weight ratio of 0.01 to 5 relative to the weight of the plasmid DNA.
  • the cationic compound and the plasmid DNA are bound by electrostatic interaction in the water phase to form a complex.
  • the cationic compound may be a type of lipid capable of forming a complex by electrostatic interaction with the plasmid DNA and dissolving in an aqueous phase.
  • the cationic compound includes all types of compounds capable of forming a complex by electrostatic interaction with plasmid DNA, and may be, for example, a lipid and a polymer type.
  • Cationic lipids include, for example, but are not limited to, ⁇ , ⁇ -dioleoyl- ⁇ , ⁇ -dimethylammonium chloride (D0DAC), ⁇ , ⁇ -distearyl— ⁇ , ⁇ -dimethylammonium bromide (DDAB ),
  • TAP 1, 2-diacyl-3-trimethylammonium-propane
  • DAP 1, 2—diacyl-3-dimethylammoniumpropane
  • Cholesteryloxypropane-1-amine (COPA), N— ( ⁇ '-aminoethane) carbamoylpropanoic tocope (AC-tocope) and ⁇ - ( ⁇ '-methylaminoethane) carbamoyl Propanoic Tocope may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of (MC-tocopherol).
  • MC-tocopherol aminoethane
  • the cationic lipid is
  • the cationic lipid may be a lipid type having several functional groups capable of representing a cation in an aqueous solution per molecule. Specifically, ⁇ , ⁇ -dieleyl - ⁇ , ⁇ -dimethylammonium chloride (D0DAC), ⁇ , ⁇ - distearyl - ⁇ , ⁇ -dimethylammonium bromide (DDAB),
  • D0DAC ⁇ -dieleyl - ⁇
  • DDAB ⁇ -dimethylammonium bromide
  • TAP 1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane
  • DAP 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane
  • the cationic lipid may be a cationic lipid in which a saturated or unsaturated hydrocarbon having 11 to 25 carbon atoms is bonded to an amine functional group of 1 to 12 oligoalkyleneamines.
  • the cationic lipid is represented by the following Chemical Formula 1 It can be expressed as.
  • n, m and 1 are each 0 to 12
  • a, b and c are each 1 to 6
  • Rl, R2 and R3 are each independently hydrogen or carbon number 11 to 25 Saturated and unsaturated hydrocarbons, at least one of R 1, R 2 and R 3 is a saturated and unsaturated hydrocarbon having 11 to 25 carbon atoms.
  • n, m, and 1 are independently 0 to 7, and 1 ⁇ n + m + 1 ⁇ 7.
  • a, b and c may be 2 to 4.
  • Rl, R2 and R3 are each independently lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, arachidyl, behenyl, Hgnoceryl, cerotyl, myristoleyl, palmitoleyl, sapienyl, oleyl, linoleyl, arachido May be selected from the group consisting of arachidyl, aicolet] eicosapentaenyl, erucyl, docosahexaenyl, and cerotyl.
  • cationic lipids include monooleoyl triethylene tetramide, dioleyl triethylene tetramide, trioleyl triethylene tetramide,
  • Tetraoleoyltriethylenetetramide monolinoleoyltetraethylene pentamide, dilinoleylyltetraethylenepentamide, trilinoleyl tetraethylenepentamide, tetralinoleyltetraethylenepentamide, pentalinoleyltetraethylenepentamide Amide, monomyrileleoyldiethylenetriamide, dimyrioleoleyldiethylenetriamide, monooleoylpentaethylene nucleamide, dioleoylpentaethylenenucleide, trioleylpentaethylene It may be one or more selected from the group consisting of nucleamide, tetraoleoyl pentaethylene nucleamide, pentaoleyl ylpentaethylene nucleamide and nucleooleyl pentaethylene nucleamide.
  • cationic polymers include chitosan, glycol chitosan, protamine, polylysine, polyarginine, polyamidoamine (PAMAM), and polyethylenimine.
  • PI high molecular polyethyleneimine
  • PVA polyamine and polyvinylamine
  • it may be one or more selected from the group consisting of high molecular polyethyleneimine (PEI), polyamine and polyvinylamine (PVA).
  • Cationic compounds used in the present invention may be used from 0.01 to 50% by weight, specifically 0.1 to 10% by weight. If the content of the cationic compound is less than 0.01% by weight, it is not a sufficient amount to form a complex with the plasmid DNA-peptide, and if the content exceeds 50% by weight 3 ⁇ 4>, the size of the nanoparticles is so large that the stability of the nanoparticles There is a fear that the loss rate increases when the filter is sterilized.
  • the cationic compound and the plasmid DNA-peptide bind through an electrostatic interaction in the water phase to form a complex.
  • the ratio of the charge amount of the cationic compound (N) and the plasmid DNA (P) is from 0.01 to 128 It is specifically, 0.5-64, More specifically, it is 1-32, More specifically, it is 1-24, Most preferably, it is 6-24. If the ratio (N / P) is less than 0.1, the cationic compound does not sufficiently bind with the plasmid DNA. Therefore, the ratio should be at least 0.1 so that the cationic compound and the plasmid DNA may be sufficiently charged by electrostatic bonding. It is advantageous to be able to form a complex comprising a plasmid DNA of. On the other hand, if the ratio (N / P) exceeds 128, It may be toxic, so it is better to set it to 128 or less.
  • step (b) is mixed with the amphiphilic block copolymer solution dissolved in the organic solvent and the solution obtained in step (a) to form a complex with the plasmid DNA-cationic compound in the form of nanoparticles. It is encapsulated in the nanoparticle structure formed by the amphiphilic block copolymer.
  • the amphiphilic block copolymer is dissolved in an organic solvent, wherein the organic solvent used is acetone, ethanol, methanol, methylene chloride, chloroform, dioxane, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, ethyl acetate and acetic acid.
  • It may be one or more selected from the group consisting of. Preferably it may be at least one selected from the group consisting of ethanol, dimethyl sulfoxide, ethyl acetate and acetic acid.
  • the amount of the organic solvent used is not particularly limited and may be appropriately adjusted for dissolution of the amphiphilic block copolymer.
  • amphiphilic block copolymer may be an A-B type block copolymer including a hydrophilic A block and a hydrophobic B block.
  • the hydrophobic B block in the aqueous phase, the hydrophobic B block forms a core (inner wall) and the hydrophilic A block forms a shell (outer wall) of the core-shell type polymer carrier to regulate the distribution in the body or the carrier cell
  • the effect delivered to the inside can be improved.
  • the functional group or ligand may be one or more selected from the group consisting of monosaccharides, polysaccharides, vitamins, peptides, proteins and antibodies to cell surface receptors.
  • the functional group or ligand is aniamide (ani samide), vitamin B9 (folic acid), vitamin B12, vitamin A, galactose, lactose, mannose, hyaluronic acid, RGD peptide, NGR peptide, transferrin, transferrin receptor It may be at least one selected from the group consisting of antibodies and the like.
  • the hydrophobic B block may be at least one selected from the group consisting of polyesters, polyanhydrides, polyamino acids, polyorthoesters, and polyphosphazines as biocompatible biodegradable polymers. More specifically, the hydrophobic B block is polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, polydioxane-, 2-one, copolymer of polylactide and glycolide, polylactide and polydioxane-2- Copolymer of one, It may be at least one selected from the group consisting of a copolymer of polylactide and polycaprotone and a copolymer of polyglycolide and polycaprolactone.
  • the hydrophobic B block may have a number average molecular weight of 50 to 50, 000 Daltons, more specifically, 200 to 20, 000 Daltons, more specifically 1, 000 to 5,000 Daltons have.
  • tocopherol, cholesterol, or 10 to 24 carbon atoms of the C10 may be chemically bonded to the hydroxyl group at the end of the hydrophobic block.
  • the content of the amphiphilic block copolymer comprising the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is 40 to 99.98 weight%, specifically 85 to 99.8 weight%, more specifically based on the total dry weight of the composition As for 90 to 99.8 weight% is good.
  • the content of the amphiphilic block copolymer is less than 40% by weight, the size of the nanoparticles is too large, which may reduce the stability of the nanoparticles and increase the loss rate when sterilizing the filter, and may be incorporated when the content exceeds 99.98 weight 3 ⁇ 4>.
  • the amount of plasmid DNA present is too small.
  • the composition ratio of the hydrophilic block (A) and the hydrophobic block (B) is based on the copolymer weight, the hydrophilic block (A) is 40 to 70 weight 3 ⁇ 4>, specifically, 50 To 60% by weight. If the ratio of the hydrophilic block (A) is less than 40% by weight, since the polymer has low solubility in water and difficult to form nanoparticles, the hydrophilic block has a solubility in water that is coherent to form nanoparticles. It is preferable that the ratio (A) is 40% by weight or more.
  • the ratio of the hydrophilic block (A) is preferably 70% by weight or less.
  • the step (b) may further include mixing and dissolving the fusion lipid in an organic solvent.
  • the fusion lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopheres.
  • the phospholipid may be at least one selected from the group consisting of phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylcholine (PC), and phosphatidic acid.
  • the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidic acid may be in the form combined with one or two C10-24 fatty acids.
  • the cholesters and tocopheres include analogs, derivatives, and metabolites of cholesterol and tocopherol.
  • the fusion lipids include dilauuroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphat idylethanolamine, and dipalmitoyl phosphat idylethanolamine, distearoyl.
  • the fusion lipid is dioleoyl phosphat idyl ethanol amine (DOPE), dipalmitooleyl phosphocholine (l, 2-dipa nitoleoyl-sn-glycero-3-phosphochol ine , DPPC), dioleoylphosphocholine
  • DOPE dioleoyl phosphat idyl ethanol amine
  • DPPC dipalmitooleyl phosphocholine
  • the method for producing a composition for plasmid DNA delivery according to the present invention may further comprise the following steps.
  • step (c) removing the organic solvent from the mixture obtained in step (b).
  • the polymer nanoparticles aqueous solution is removed by removing the organic solvent from the complex including the stabilized nanoparticles prepared in step (b), for example, by evaporation of the organic solvent.
  • the manufacturing method of the present invention is the above step After (c), may further comprise a step of lyophilizing by adding a lyophilization aid.
  • the manufacturing method of the present invention the step
  • the method may further include sterilizing the aqueous polymer nanoparticle solution obtained in step (c) with a sterile filter.
  • the lyophilization aid used in the present invention allows the lyophilized composition to maintain a cake form or uniformly dissolves quickly in the process of lyophilizing the amphiphilic block copolymer composition and then reconstructing it (reconst i tut ion). It is added to help, specifically, may be one or more selected from the group consisting of lactose, manny, sorbbi and sucrose.
  • the content of the lyophilization aid is 1 to 90% by weight, more specifically 10 to 60% by weight based on the total dry weight of the lyophilized composition.
  • plasmid DNA and peptide are combined in an aqueous phase, and a cationic compound is formed in a single phase of an aqueous phase to effectively form a nanoparticle-type complex by electrostatic bonding.
  • a manufacturing method is not only environmentally friendly because it uses relatively little organic solvent, and prevents the cationic compound from sticking to a manufacturing apparatus, a container, etc. at the stage after the formation of the complex, thereby changing the composition ratio, thereby maintaining reproducibility. It is very easy to convert plasmid DNA into hydrophobic drug particles through complex formation, which facilitates mass production.
  • the present invention relates to a composition for delivering plasmid DNA containing the polymer nanoparticles prepared by the above production method will be.
  • the plasmid DNA-peptide and the cationic compound are bonded to each other through an electrostatic interaction to form a (plasmid DNA-peptide) -cationic compound complex, and the complex is an amphiphilic block polymer.
  • the polymer nanoparticle structure encapsulated in the nanoparticle structure formed by the is produced.
  • the approximate structure of the polymer nanoparticle transporter produced by the production method of the present invention is shown in FIG. Matters relating to the plasmid DNA, peptide, cationic compound, amphiphilic block polymer, etc. which are components of the composition are the same as those described in the preparation method according to the present invention.
  • composition according to the present invention may further comprise a fusion lipid, which is also the same as described in the preparation method according to the present invention.
  • the particle size of the nanoparticles in the composition 10 to 300 nm, more preferably 10 to 100 nm.
  • the standard charge of the nanoparticle particles is -20 to 20 mV, more preferably -10 to 10 mV. The particle size and standard charge are most preferred in terms of the stability of the nanoparticle structure and the content of constituents and the absorption and stability of the plasmid DNA in the body.
  • composition containing the anion plasmid DNA-cationic compound complex encapsulated in the amphiphilic block copolymer nanoparticle structure according to the present invention can be administered through a route of administration such as blood vessel, muscle, subcutaneous, oral, bone, transdermal or topical tissue. And may be formulated into a variety of oral or parenteral formulations to suit this route of administration.
  • the oral dosage preparations may include tablets, capsules, powder preparations, liquids, and the like, and parenteral dosage preparations may include various preparations such as eye drops and injections.
  • the composition may be an injection preparation.
  • composition according to the present invention when lyophilizing the composition according to the present invention, it may be prepared in the form of an injectable preparation by reconstitution with distilled water for injection, 0, 9% saline and 5% dextrose aqueous solution.
  • injectable preparation by reconstitution with distilled water for injection, 0, 9% saline and 5% dextrose aqueous solution.
  • Plasmid DNA with 35, 000 base pairs (hereinafter referred to as 'GFP pDNA') 2 / which expresses GFP (Green Fluorescence Protein) 2 / is converted into 4.35 in distilled water and dioTETA 21 in dilute water or 100 mM sodium acetate complete solution (pH 4.2)
  • the solution dissolved in 21 ⁇ was dissolved in 100 ⁇ distilled water, DOPE 11.57 / g dissolved in ethyl acetate 11.57 ⁇ , mPEG-PLA-tocopherol 40 // g dissolved in ethyl acetate 0.8 ⁇ in order
  • the mixture was further mixed for 10 minutes in a bath (bath type).
  • the prepared emulsion was placed in a 1-neck back flask, and distilled under reduced pressure in a rotary evaporator to selectively remove ethyl acetate, thereby containing pDNA / dioTETA / mPEG-PLA-tocopherol (2k—1.7k) / DOPE-containing composition.
  • the prepared composition was filtered with 0.45 urn hydrophi lic fiter and then stored at 4 ° C. Afterwards, 10X PBS was mixed to IX in the final volume.
  • the composition obtained in Comparative Example 1 is shown in Table 2 below (Comparative Example 1).
  • Example 1-2 Plasmid DNA I Peptide I 1,6-Dioleoyl triethylenetetramide (di o-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k-1 .7k) / Dioleylphosphatidyl-ethanolamine (DOPE) Containing Composition
  • the containing composition was prepared.
  • the prepared composition was filtered with 0.45 urn hydrophi lic fiter and then stored at 4 ° C. Afterwards, 10X PBS was mixed to IX in the final volume.
  • pDNAp I dioTETA / mPEG-PLA-tocofe (2k-1.7k) / DOPE-containing composition was prepared in the same manner as in Example 1 with different ratios of dioTETA to mPEG-PLA tocope.
  • the compositions obtained in Examples 1 and 2 are shown in Table 3 below.
  • Example 3-8 pDNA I Peptide I 1,6-Dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocophere (2k-1.7k) / dialleylphosphatidyl-ethanolamine (DOPE) Contains composition
  • compositions obtained in Examples 3 to 8 are shown in Table 4 below.
  • compositions obtained in Examples 9 to 12 are shown in Table 5 below.
  • Example 13-15 pDNA / Peptide I 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) / mPEXr-PLA tocope (2k-1.7k) Idioleylphosphatidyl-ethane to amine (DOPE ) Preparation of containing composition
  • the containing composition was prepared.
  • the prepared composition was filtered with a 0.45 urn hydrophilic filter and stored at 4 ° C. Afterwards, 10X PBS was mixed in a final volume to IX.
  • pDNAp I dioTETA / mPEG-PLA-tocope was prepared by differentiating the NLS sequence using SMCC as a linker in Spermine. (2k-1.7k) / DOPE containing composition was prepared. Compositions obtained in Examples 13 to 15 are shown in Table 6 below.
  • the size and surface charge of the dioTETA / pDNA (N / P ratio), mPEG—PLA-tocope (2k-1.7k) and DOPE amount to determine whether the nanoparticles were formed.
  • Dynamic light scattering (I) LS The particle size and surface charge were measured using dynami c light scattering method. Specifically, He-Ne laser was used as a light source, and MALVERN's Zetasi zer Nano ZS90 instrument was operated according to the manual.
  • GFP pDNA was prepared in Comparative Example 1 and Examples 1 to 8 using pDNA / 1, 6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k-1.7k) I dioleylphosphatidyl Ethanolamine (DOPE), pDNA I peptide I 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k-1.7k) I dioleylphosphatidyl-ethanolamine (DOPE) was prepared and treated with polymer nanoparticles in 293 cells. Then, the intracellular delivery ability of the polymer nanoparticles was measured by measuring the fluorescence represented by the expression of GFP protein.
  • pDNA / 1, 6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k-1.7k) I dioleylphosphati
  • Luci ferase pDNA was prepared in Example 8 using pDNA / 1,6-dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k-1.7k). Dioleylphosphatidyl-ethane to amine (DOPE), pDNA I Peptide I 1,6-Dioleoyl triethylenetetramide (dio-TETA) I mPEG-PLA tocope (2k_1.7k) I Dioleylphosphatidyl-ethanolamine (DOPE) was prepared. Lucif erase pDNA was also prepared by combining lipofectamine 3000 with l (ug): 3 (ul).
  • lxlO 4 cancer cells Four hundred different types of lxlO 4 cancer cells (SK-Mel, HT1080, A549, Hctll6, Miapaca2, HepG2) were dispensed in 96 well cell culture plates, and after 24 hours, 50, 100 ng of pDNA was obtained in the presence of 5% serum. Treated for hours. Again after 24 hours, Luciferase luminescence was observed through Luciferase analyzer. The measurement results are shown in FIGS. 3A to 3C. The control group was treated only with phosphate buffered saline.

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Abstract

유효성분으로서 플라스미드 DNA; 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드; 양이온성 화합물; 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 함유 약제학적 조성물과 그 제조방법이 개시된다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
플라스미드 디엔에이 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법
【기술분야】
본 발명은 플라스미드 DNA를 효율적으로 전달하기 위한 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서， 보다 상세하게는, 유효성분으로서 플라스미드 DNA; 핵 배치 신호 (NLS ; Nuc lear Local i zat ion Signal )서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드, 양이온성 화합물; 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며， 상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 화합물과 복합체를 형성하고， 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA 함유 약제학적 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.
【배경기술】
DNA 재조합 기술의 발달로 외래의 핵산을 세포 내 또는 동물 수준의 시험 내에서 발현시키는 기술이 상용화되었으며, 이 같은 기술을 이용하여 원하는 유전자의 발현， 억제， 재조합 단백질의 대량 생산， 결실되거나 존재하지 않는 유전자의 교체 또는 활성화 등 다양한 활용이 가능하게 되었다. 유전자 치료란 환자의 세포， 조직에서 질환을 유발하는 비정상 유전자를 대체할 유전자나 질병을 치료하는데 도움이 되는 유전자를 삽입하는 치료기술로서 이는 질병의 새로운 치료 방법으로서 제시되어 지난 십 수년간 다양한 방법의 유전자 전달 수단의 연구가 이루어지고 있다. 유전자 치료의 핵심적인 요소는 치료 효과를 나타내는 치료 유전자와 치료 유전자를 안전하고 효율적으로 인체에 전달해 줄 수 있는 유전자 전달체 (또는 전달 물질)이다. 안전한 유전자 전달체란 치료 유전자를 표적기관에 효과적으로 전달하는 것과 그 유전자가 적당한 세포에 거부반응 없이 받아들여져 단백질 발현을 일으켜 목적으로 하는 치료 효과를 나타낼 수 있게 해주는 전달 시스템이다. 유전자 전달체 또는 시스템은 경우에 따라 1백터1라는 용어를 사용하여 지칭되기도 한다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체파 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다.
바이러스성 전달체의 경우는 비특이적 면역 반웅 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서， 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는， 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고， 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
비바이러스성 전달체중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체 ( l ipoplex) 및 폴리양이은성 (polycat ion) 고분자와 핵산의 복합체 (polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는， 핵산과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 핵산을 안정화시키고， 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나， 층분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만， 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 따라서， 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서， 혈중 및 체액 내에서 안정하고， 세포 내 전달이 가능하여 층분한 효과를 얻을 수 있는 핵산 전달 기술의 개발이 필요하다.
한편， 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 나노입자의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다 (한국등록특허 제 0180334호) . 그러나， 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 나노입자를 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만， 음이온을 뛰는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 나노입자 내부에 봉입할 수 없으므로， 이들 핵산의 전달에는 적당하지 않다. 이에， 본 발명자들은 핵산과 양이온성 화합물의 정전기적 상호작용에 의한 복합체를 형성하여 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되도록 하는 핵산 전달 조성물 및 다양한 제조 방법을 개시한 바 있다. 또한 30 , 000 염기쌍 이상의 크기가 큰 플라스미드 DNA 약물의 경우 비바이러스성 전달체를 이용하여 세포 내 도입시킬 때 그 효율이 현저히 감소하는 특징이 있다. 그 이유는 플라스미드 DNA가 단백질을 발현하기 위해서는 핵으로의 이동이 필요한데 핵산의 크기가 크면 핵으로의 세포질에 있는 핵산 약물의 핵으로의 이동능이 현저히 감소되기 때문에 유전자 전달 효을이 낮아 치료 효과가 감소한다는 단점이 있다. 따라서， 여전히 이러한 핵산 전달 조성물의 전달능 및 플라스미드 DNA의 안정성 강화를 위한 제형 제조 방법의 개선이 필요하다.
【발명의ᅵ상세한 설명】
【기술적 과제】
이러한 배경하에서， 본 발명자들은 플라스미드 DNA의 전달 효율 증가를 위하여 예의 노력한 결과， 30 , 000 염기쌍 이상의 크기를 갖는 플라스미드 DNA를 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드와 결합시킨 후 증류수 혹은 산성 용매에 용해시킨 양이온성 화합물을 흔합하여 단일상 시스템 (monophase system)하에서 복합체를 형성시켜 이를 고분자 나노입자 내에 봉입하는 경우， 플라스미드 DNA의 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에， 본 발명의 일례는 플라스미드 DNA를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 예는 상기와 같은 플라스미드 DNA를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 조성물은 양이온성 화합물과 양친성 블록 고분자를 사용하여 플라스미드 DNA를 외부로부터 격리시킴에 따라 플라스미드 DNA의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 또한， 본 발명의 조성물은 플라스미드 DNA를 펨티드 기능에 의해 세포 내에 효율적으로 전달할 수 있다ᅳ 또한， 상기 양친성 고분자는 생분해성 및 생체 적합성이 우수하다. 【도면의 간단한 설명】 도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 고분자 나노입자 전달체의 세포내 전달 능력을 확인하기 위하여 GFP pDNA를 사용하여 비교예 1 및 실시예 1-8의 제조방법으로 제조한 고분자 입자를 세포에 처리한 결과， GFP (녹색형광단백질)의 발현으로 나타나는 형광을 형광 현미경으로 측정한 사진이다.
도 3a 내지 c는 본 발명에 따른 고분자 나노입자 전달체의 세포내 전달 능력을 확인하기 위하여 루시퍼라아제 ( luci f erase) pDNA를 사용하여 각각 리포펙타민 ( l ipofectamine) 3000과 결합 및 실시예 8의 제조방법으로 고분자 나노입자를 제조한 것을 세포에 처리한 결과， 루시퍼라아제 ( luci ferase)의 발현율을 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 3a는 실시예 8의 제조방법으로 제조된 고분자 나노입자의 암세포 SK-Mel 및 Hctll6 내로의 전달 발현율， 도 3b는 실시예 8의 제조방법으로 제조된 고분자 나노입자의 ΗΊΊ080 및 Miapaca2 내로의 전달 발현율， 도 3c는 실시예 8의 제조방법으로 제조된 고분자 나노입자의 A549 및 HepG2 내로의 전달 발현율을 나타낸 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
아하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
구체적으로， 본 발명에 따른 조성물은， 나노입자 구조체를 포함하는 플라스미드 DNA 전달용 조성물로， 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조체에 플라스미드 DNA, 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 및 양이은성 화합물의 복합체가 포함된 구조를 가지며， 유효성분으로서
플라스미드 DNA;
핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드; 양이온성 화합물; 및
양친성 블록 공중합체 ;
를 포함하며， 상기 플라스미드 DNA는 상기 펩티드와 결합하여 상기 양이온성 화합물과 복합체를 형성하고， 이와 같이 형성된 복합체가 상기 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 구체예에서， 상기 약학적 조성물은 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 유효성분으로 함유된 플라스미드 DNA의 전달용 조성물로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 제조 방법은
(a) 플라스미드 DNA , 양이온성 화합물， 및 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 각각을 수성 용매에 용해시켜 흔합하는 단계 ; 및
(b) 양친성 블록 공중합체를 유기용매에 용해시키고， 이를 단계 (a)에서 얻어진 용액과 흔합하는 단계. 이하， 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 단계 (a)는 플라스미드 DNA , 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 및 양이온성 화합물의 복합체를 제조하기 위해， 상기 성분들을 각각 수상， 즉 수성 용매에 용해시켜 흔합하여 단일상 시스템 (monophase syst em)을 제조하는 단계이다.
상기 (a) 단계에서， 수성 용매에 용해된 플라스미드 DNA는 핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드와 먼저 결합되고， 이후 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 나노입자 형태의 플라스미드 DNA 및 펩티드와 복합체를 이룬다. 상기 단계에서 사용되는 수성 용매는 증류수， 주사용수, 또는 완충액일 수 있고， 바람직한 완층액은 인산완층액 (Phosphate buf fered sal ine)일 수 있다. 상기 플라스미드 DNA와 양이온성 화합물이 각각 용해된 수용액간의 흔합비율은 특별한 한정은 없으며， 예컨대 부피 기준으로 플라스미드 DNA수용액 대비 양이은성 화합물 수용액의 비율 (양이온성 화합물 수용액 /플라스미드 DNA수용액)이 1 내지 30， 보다 구체적으로 2 내지 10 일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 수용액들은 당업계에 알려진 적절한 흔합 수단을 통해 흔합되는데, 이러한 방법의 예로서， 초음파 분쇄기 등을 들 수 있다. 상기 단계 (a)에서 사용되는 플라스미드 DNA는 최종적으로 제조되는 조성물의 유효성분이다. 구체적인 일 양태로서， 상기 플라스미드 DNA는， 카르복시기， 포스페이트기 및 설페이트기로 구성된 군으로부터 선택되는 '하나 이상의 작용기를 가질 수 있다.
또한， 상기 플라스미드 DNA는 30 , 000 염기쌍， 바람직하게는 34, 000 염기쌍 이상 42 , 000 염기쌍 이하의 크기가 큰 하나 이상의 핵산이다. 나아가， 상기 플라스미드 DNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반웅을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본 (backbone) , 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로， 핵산의 포스포다이에스테르 (phosphodi ester ) 결합의 일부를 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 대체하거나， 일부 리보오스 염기의 2 ' -0H 위치에 메틸기， 메록시에틸기， 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한， 상기 플라스미드 DNA의 하나 이상의 말단은 콜레스테를， 토코페를 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 예를 들어， 센스 및 /또는 안티센스 가닥의 5 ' 말단， 또는 31 말단， 또는 양 말단에 수식될 수 있으며， 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다.
상기 콜레스테를， 토코페를 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테를， 토코페를 및 지방산의 각 유사체， 유도체, 및 대사체가 포함된다.
상기 플라스미드 DNA는 여러 종류의 치료 유전자를 발현한다. 특정 분자량， 단백질， 생활성 또는 치료 분야에 국한되지 않는다.
본 발명에서 ,플라스미드 DNA는， 최종 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001내지 10중량 %， 구체적으로는 0.01내지 5중량 %로 포함되는 것이 좋다. 상기 플라스미드 DNA의 함량이 0.001 중량 % 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용아 있을 수 있고， 10 중량 %을 초과하면， 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
"펩티드" 는 "폴리펩티드 "， "올리고펩티드" 및 "단백질 "와 동일하게 사용될 수 있으며 특정 분자량， 펩티드 서열 또는 길이, 생활성 또는 치료분야에 국한되지 않는다. 상기 펩티드는 플라스미드 DNA와의 결합능 강화를 위해 DNA 결합 그룹， 예를 들어 폴리아민， 구체적으로 스퍼민 (spermine)을 공유결합시킬 수 있다. 즉， 펩티드 공유결합체는 펩티드와 스퍼민의 결합체일 수 있다. 펩티드는 크기가 큰 플라스미드 DNA를 핵으로 전달 시키는 능력을 갖는 nuclear local izat ion signaKNLS, 핵 배치 신호)을 가질 수 있다. 이는 핵으로 표적되는 단백질에서 발견되는 서열이고， 단백질에서 이 서열이 제거되면 세포질에 머물게 되는 특징을 갖고 있다. 핵으로의 물질 출입을 담당하는 핵공이 NLS를 인식하는 기작이 있어 핵으로의 전달능을 높인다. 하나의 나노입자 구조 안에 플라스미드 DNA와 펩티드를 넣어서 유전자 전달 효율을 극대화 하기 위하여 스퍼민을 이용할 수 있다. 스퍼민을 링커를 통해 펩티드 말단에 결합시켜 주면, DNA-스퍼민 결합체가 형성되고， 하나의 복합성 결합체가 나노입자 구조 안에 들어 가는 것이 가능하게 된다. 예를 들어， 본 발명에서 사용될 수 있는 서열은 다음 표 1과 같다. 스퍼민과 펩티드를 결합시켜주는 링커의 종류는 SMCC (succinimidyl 4ᅳ ( N-ma leimi dome thy 1 ) eye 1 ohexane- 1-car boxy late) , SMPB(succinimidyl 4-(p-maleimidophenyl )butyrate) ,
GMBS(N- Y -maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester) 등이 될 수 있다.
[표 1]
펩티드
펩티드의 펩티드의 o o 구조
아미노산 서열 서열번호
NLS-SP 펩티드— SMPB-스퍼민 GYGPKKKRKVGGC 1
Short NLS-SP 펩티드 -SMPB-스퍼민 PKKKRKVGGC 2
SP-NLS 스퍼민- SMPB-펩티드 CGYGPKKKRKVGG 3
Tat-C (X)n—펩티드 -0()n RKK R0RR PP0C 4 (X=RGD (즉,
Arg-Gly-Asp) , n=0 내지
2의 정수)
Tᅳ ant igen 스퍼민 -SMCC-펩티드 CPKKKRKVEDP 5
Myc 스퍼민 -SMCC-펩티드 CPAAKRVKLD 6 바람직하게， 본 발명에서， 상기 펩티드는， 플라스미드 DNA의 중량에 대비하여 0. 1 내지 5 중량비를 사용할 수 있다.
구체적인 일 양태에서， 상기 양이온성 화합물과 플라스미드 DNA는 수상에서 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성한다. 따라서， 상기 양이온성 화합물은, 플라스미드 DNA와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있으며 수상에 용해 가능한 형태의 지질 종류일 수 있다.
상기 양이온성 화합물은， 플라스미드 DNA와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어， 지질과 고분자 종류일 수 있다. 양이온성 지질은， 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나， Ν ,Ν-디올레일 -Ν,Ν-디메틸암모늄클로라이드 (D0DAC) , Ν,Ν-디스테아릴— Ν,Ν-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB) ,
N-( l-(2 , 3—디을레오일옥시)프로필 -Ν ,Ν,Ν-트리메틸암모늄클로라이드 (D0TAP) , Ν,Ν-디메틸 -(2，3-디올레오일옥시)프로필아민 (D0DMA) ,
Ν， Ν， Ν-트리메틸 -( 2 , 3-디을레오일옥시 )프로필아민 (D0TMA)，
1， 2-디아실 -3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP)，
1， 2—디아실 -3-디메틸암모늄ᅳ프로판 (DAP) ,
3베타 _[Ν-(Ν ' ,Ν' ,Ν ' -트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (TO콜레스테 를)，
3베타 - [N- (N '， N ' -디메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (DC—콜레스테롤)， 3베타 - [N- ( N ' -모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (MC-콜레스테롤)， 3베타 -[N- (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (AC-콜레스테를)，
콜레스테릴옥시프로판 -1-아민 (COPA) , N— (Ν ' -아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페를 (AC-토코페를) 및 Ν-(Ν ' -메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페를 (MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우， 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고， 보다 구체적으로는 분자당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다. 이에 따라， 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은
3베타 - [N- (N '， N ' , N ' -트리메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (TC-콜레스테 를), 3베타 [Ν-(Ν' ,Ν'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (DC-콜레스테롤)， 3베타 [Ν-(Ν'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (MC-콜레스테롤)，
3베타 [N- (아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (AC-콜레스테롤)，
N-(l-(2,3-디올레오일옥시) 프로필 -Ν,Ν,Ν-트리메틸암모늄클로라이드 (D0TAP), Ν,Ν-디메틸 -(2，3-디올레오일옥시)프로필아민 (D0DMA), 및 Ν,Ν,Ν-트리메틸 -(2，3-디올레오일옥시)프로필아민 (D0TMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
또한， 상기 양이온성 지질은 분자 당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 여러 개인 지질 종류일 수 있다. 구체적으로， Ν， Ν-디을레일 -Ν , Ν-디메틸암모늄클로라이드 (D0DAC)， Ν,Ν-디스테아릴 -Ν,Ν-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB) ,
1,2-디아실 -3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실 -3-디메틸암모늄-프로판 (DAP) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.
또한， 상기 양이온성 지질은 1 내지 12 개의 올리고알킬렌아민 (oligoalkyleneamine)의 아민 작용기에 탄소수 11 내지 25 개의 포화 또는 불포화 탄화수소를 결합시킨 양이온성 지질일 수도 있으며， 상기 양이온성 지질은 다음의 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
Figure imgf000011_0001
R2 상기 식에서,
n과 m및 1은 각각 0내지 12이되， 1 ≤ n + m + 1 < 12이며， a와 b및 c는 각각 1 내지 6이며， Rl, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로서 , Rl, R2및 R3중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소이다.
바람직하게는， n과 m및 1은 독립적으로 0내지 7이며， 1 ≤ n+m+1 < 7일 수 있다.
바람직하게는 a와 b 및 c는 2 내지 4일 수 있다.
바람직하게는， Rl, R2 및 R3는 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (Hgnoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl )， 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl) , 에이코入 ]· 타에닐 (eicosapentaenyl ) , 에루실 (erucyl) , 도코사핵사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 양이온성 지질의 구체적인 예는 모노올레오일트리에틸렌테트라마이드， 디올레오일트리에틸렌테트라마이드， 트리올레오일트리에틸렌테트라마이드，
테트라올레오일트리에틸렌테트라마이드 모노리놀레오일테트라에틸렌 펜타마이드， 디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 트리리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드， 테트라리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드， 펜타 리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드， 모노미리스를레오일디에틸렌트리 아마이드, 디미리스를레오일디에틸렌트리아마이드， 모노올레오일펜타에틸렌 핵사마이드， 디을레오일펜타에틸렌핵사마이드， 트리올레오일펜타에틸렌 핵사마이드， 테트라올레오일펜타에틸렌핵사마이드， 펜타올레오일펜타에틸렌 핵사마이드 및 핵사올레오일펜타에틸렌핵사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한편, 양이온성 고분자는 키토산 (chi tosan) , 글라이콜 키토산 (glycol chi tosan) , 프로타민 (protamine)， 폴리라이신 (polylysine)， 폴리아르기닌 (polyarginine) , 폴리아미도아민 (PAMAM) , 폴리에틸렌이민 (polyethyl enimine) , 덱스트란 (dextran)， 히알루론산 (hyaluroni c aci d) , 알부민 (albumin) , 고분자폴리에틸렌이민 (PEI )， 폴리아민 및 폴리비닐아민 (PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며， 바람직하게는 고분자폴리에틸렌이민 (PEI ) , 폴리아민 및 폴리비닐아민 (PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은， 최종적으로 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로， 0.01 내지 50 중량 %， 구체적으로는 0. 1 내지 10 중량 %사용될 수 있다. 상기 양이온성 화합물의 함량이 0.01중량 %미만이면 플라스미드 DNA-펩티드와 복합체를 형성할 수 있는 층분한 양이 되지 못하고， 50 중량 ¾>을 초과하면， 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물과 플라스미드 DNA—펩티드는， 수상에서 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다.
구체적인 일 양태로서， 상기 양이온성 화합물 (N)과 플라스미드 DNA(P)의 전하량의 비율 (N/P ; 플라스미드 DNA의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이은 전하 비율)은， 0. 1 내지 128이며， 구체적으로는 0.5 내지 64， 더 구체적으로는 1 내지 32이고， 보다 더 구체적으로는 1 내지 24， 가장 구체적으로는 6 내지 24인 것이 좋다. 상기 비율 (N/P)이 0. 1 미만인 경우에는 양이온성 화합물이 플라스미드 DNA와 충분히 결합하지 못하기 때문에， 상기 비율이 0. 1 이상이어야 양이온성 화합물과 플라스미드 DNA가 정전기적 결합에 의해 충분한 양의 플라스미드 DNA를 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율 (N/P)이 128 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로， 128 이하로 하는 것이 좋다.
한편， 본 발명에 따른 제조방법에서 단계 (b)는 단계 (a)에서 얻어진 용액과 유기용매에 용해시킨 양친성 블록 공중합체 용액과 흔합하여 나노입자 형태의 플라스미드 DNA-양이온성 화합물과의 복합체를 양친성 블록 공중합체가 형성하는 나노입자 구조체 내부에 봉입시키는 단계이다. 상기 단계 (b)에서는 양친성 블록 공중합체를 유기용매상에 녹이는데， 이때 사용되는 유기용매는 아세톤， 에탄올， 메탄올， 메틸렌클로라이드， 클로로포름， 다이옥산， 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴， 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 에탄올, 다이메틸설폭사이드， 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 특별한 한정은 없으며， 양친성 블록 공중합체의 용해를 위해 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
또한， 상기 양친성 블록 공중합체는， 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는， 수상에서， 소수성 B 블록이 코어 (내벽 )를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘 (외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 전달체가 세포 내로 전달되는 효을을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류， 다당류， 비타민， 펩티드， 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드 (ani samide) , 비타민 B9(엽산) , 비타민 B12 , 비타민 A, 갈락토오스， 락토오스， 만노오스， 히알루론산， RGD펩티드, NGR펩티드, 트랜스페린， 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은， 생체적합성 생분해성 고분자로서， 일실시예에서， 폴리에스테르， 폴리언하이드라이드， 폴리아미노산， 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로， 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드， 폴리글리콜라이드， 폴리카프로락톤， 폴리디옥산 -,2-온， 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체， 폴리락타이드와 폴리디옥산 -2-온의 공중합체， 폴리락타이드와 폴리카프로 톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서， 상기 소수성 B블록은 수평균분자량이 50 내지 50 , 000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20， 000달톤， 보다 더 구체적으로는 1 , 000 내지 5， 000달톤인 것일 수 있다. 또한， 소수성 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤， 콜레스테를， 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 친수성 블록 (A)과 소수성 블록 (B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은， 조성물 전체 건조중량을 기준으로， 40 내지 99.98 중량 %이며， 구체적으로는 85 내지 99.8중량 %， 더 구체적으로는 90 내지 99.8 중량 %인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량 % 미만이면 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고， 함량이 99.98 중량 ¾>를 초과하면 함입할 수 있는 플라스미드 DNA의 함량이 너무 적어지게 된다.
나아가， 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서， 친수성 블록 (A)과 소수성 블록 (B)의 조성비는， 공중합체 중량을 기준으로， 친수성 블록 (A)이 40 내지 70 중량 ¾>， 구체적으로는 50 내지 60 중량 % 범위일 수 있다. 친수성 블록 (A)의 비율이 40 중량 % 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에， 공증합체가 나노입자를 형성하기에 층분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록 (A)의 비율이 40 중량 % 이상인 것이 좋은 한편， 70중량 %를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 플라스미드 DNA/양이온성 화합물 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로， 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록 (A)의 비율이 70 중량 % 이하인 것이 좋다. 또한， 상기 단계 (b)에서는 추가적으로 융합성 지질을 유기용매에 용해시켜 흔합하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 융합성 지질은 플라스미드 DNA와 양이은성 지질의 복합체에 흔합시， 소수성 상호작용으로 결합하여 플라스미드 DNA, 양이은성 지질 및 융합성 지질의 복합체를 형성하고， 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 일실시예에서, 상기 융합성 지질은 인지질， 콜레스테를， 및 토코페를로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
구체적으로， 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산 (phosphat idic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테를 및 토코페를에는 콜레스테를 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체， 및 대사체가 포함된다.
구체적으로는 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민 (dilauroyl phosphat idylethanolamine) , 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민 (dimyristoyl phosphat idylethanolamine) , 디팔미토일 포스파티딜에탄을아민 (dipalmitoyl phosphat idylethanolamine)， 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (distearoyl phosphat idylethanolamine) , 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (dioleoyl phosphat idylethanolamine) , 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민 (dil inoleoyl phosphat idylethanolamine) 1-팔미토일 -2-올레오일 포스파티딜에탄올아민 (l-palmitoyl-2-oleoyl phosphat idylethanolamine)，
1， 2-디피타노일 -3-sn-포스파티딜에탄올아민 ( 1， 2-di hyt anoyl-3-sn-phosphat idylethanolamine) 디라우로일 포스파티딜콜린 (dilauroyl phosphat dylchol ine) 디미리스토일 포스파티딜콜린 (dimyristoyl phosphat dylchol ine) 디팔미토일 포스파티딜콜린 (dipalmitoyl phosphat dylchol ine) 디스테아로일 포스파티딜콜린 (distearoyl phosphat dylchol ine) 디올레오일 포스파티딜콜린 (dioleoyl phosphat dylchol ine) 디리놀레오일 포스파티딜콜린 (di 1 inoleoyl phosphatidylcholine) 1-팔미토일 -2-을레오일 포스파티딜콜린 (1— palmitoyl— 2— oleoyl phosphat idylchol ine) ,
1， 2-디피타노일 -3-sn-포스파티딜콜린 ( 1， 2-di phy t anoy 1 -3-sn-phosphat i dy 1 ch oline), 디라우로일 포스파티딘산 (di lauroyl phosphat i die acid), 디미리스토일 포스파티딘산 (dimyristoyl phosphat i die acid), 디팔미토일 포스파티딘산 (dipalmitoyl phosphat i die acid), 디스테아로일 포스파티딘산 (distearoyl phosphat i die acid), 디올레오일 포스파티딘산 (dioleoyl phosphat i die acid), 디리놀레오일 포스파티딘산 (dilinoleoyl phosphat i die acid), 1-팔미토일 -2-올레오일 포스파티딘산 (l-palmitoyl-2_oleoyl phosphat i die acid) , 1， 2-디피타노일 -3-sn-포스파티딘산 ( 1， 2-d i phy t anoy 1 -3-sn-phosphat i d i c acid), 콜레스테를 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
바람직한 구체예에서， 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (dioleoyl phosphat idyl ethanol amine, DOPE) , 디팔미토올레오일포스포콜린 (l,2-dipa nitoleoyl-sn-glycero-3-phosphochol ine, DPPC) , 디올레오일포스포콜린
( 1 , 2-d i o 1 eoy 1 -sn-g 1 ycer ο-3-phosphocho 1 i ne , DOPC)， 디팔미토올레오일포스포에탄올아민
( 1， 2-d ipalmitol eoy 1ᅳ sn— g 1 ycero-3-phosphoethano 1 amine, DPPE ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 한편，또 다른 하나의 추가적인 양태로서，본 발명에 따른 플라스미드 DNA 전달용 조성물의 제조방법은 이하의 단계를 더 포함할 수 있다.
(c) 단계 (b)에서 얻어진 흔합물로부터 유기용매를 제거하는 단계. 바람직하게， .상기 단계 (c)에서는 단계 (b)에서 제조된 안정화된 나노입자를 포함하는 흔합물로부터 다양한 제거방법， 예를 들어 유기용매의 증발 등에 의해 유기용매를 제거하여 고분자 나노입자 수용액을 수득하게 된다. 나아가， 바람직한 하나의 양태로서 , 본 발명의 제조방법은 상기 단계 (c) 이후에， 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 추가적인 양태로서，본 발명의 제조방법은，상기 단계
(d) 의 동결건조 전에， 단계 (c)에서 얻은 고분자 나노입자 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나， 양친성 블록 공중합체 조성물을 동결건조 후， 재건 (reconst i tut ion)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로， 구체적으로， 락토스， 만니를， 솔비를 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은， 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로， 1 내지 90 중량 %, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량 % 이다.
이상과 같은 본 발명의 제조방법에. 의하면， 플라스미드 DNA와 펩티드를 수상에서 결합시키고, 양이온성 화합물을 단일상인 수상에서 복합체를 형성시켜 정전기적 결합에 의해 나노입자 형태의 복합체가 효과적으로 형성되고， 동결건조를 통해 수용액을 제거하는 과정에서 결합력이 증가하여, 최종적으로 제조되는 고분자 나노입자의 수득률이 매우 향상되게 된다. 나아가， 이러한 제조방법은 유기용매를 상대적으로 적게 사용하므로 환경친화적일뿐 아니라， 양이온성 화합물이 복합체 형성 이후의 단계에서 제조기구， 용기 등에 달라붙어 조성물 비율이 변경되는 것을 방지하여 재현성이 유지되고, 제조가 매우 편이하며， 플라스미드 DNA를 복합체 형성을 통해 소수성 약물 입자로 바꾸어 대량 생산이 용이하다는 특징을 갖는다.
또한， 본 발명에 따라 제조된 조성물에서는 플라스미드 DNA와 양이은성 화합물 복합체는 상기 양친성 블록 공중합체에 의해 형성되는 나노입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하기 때문에， 혈증 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다. 한편， 또 다른 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 고분자 나노입자를 포함하는 플라스미드 DNA 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면， 상기 플라스미드 DNA-펩티드와 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여， (플라스미드 DNA-펩티드)—양이온성 화합물 복합체를 형성하고， 이 복합체가 양친성 블록 고분자에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입된 고분자 나노입자 구조체가 제조되게 된다. 이와 같이 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 상기 조성물의 구성성분인 플라스미드 DNA, 펩티드， 양이온성 화합물， 양친성 블록 고분자 등에 관한 사항은 상기 본 발명에 따른 제조방법에서 기재된 바와 동일하다. 또한， 본 발명에 따른 조성물은 융합성 지질을 더 포함할 수 있으며， 이 또한 상기 본 발명에 따른 제조방법에서 기재된 바와 동일하다. 바람직한 일 양태에서， 상기 조성물 중 나노입자의 입자 크기는， 10 내지 300 nm이며， 더욱 구체적으로는 10 내지 100 nm인 것이 좋다. 또한， 상기 나노입자 입자의 표준 전하는 -20 내지 20 mV 이며， 더욱 구체적으로 -10 내지 10 mV인 것이 좋다. 상기 입자 크기 및 표준 전하는， 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 플라스미드 DNA의 흡수도 및 안정성 면에서 가장 바람직하다. 본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체 나노입자 구조체에 봉입된 음이온 플라스미드 DNA-양이온성 화합물 복합체 함유 조성물은， 혈관， 근육， 피하， 경구， 뼈， 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고， 이러한 투여 경로에 적합하게， 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제， 캡슐， 분체 제제， 액제 등， 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데， 바람직한 일 양태로서， 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어， 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우， 이를 주사용 증류수, 0, 9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다. 【발명의 실시를 위한 형태】 이하， 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나， 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다. [비교예 1] 플라스미드 DNA I 1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드
(dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) I디을레일포스파티딜 -에탄을아민 (DOPE) 함유조성물 제조
GFP( Green Fluorescence Protein)를 발현하는 35, 000 염기 쌍을 갖는 플라스미드 DNA (이하 'GFP pDNA' 라 함) 2 / 을 증류수 4.35 에 dioTETA 21 을 증류수 흑은 산성 용매인 100 mM 소듐아세테이트 완층용액 (pH 4.2) 21 ^에 녹인 용액을 증류수 100 ^에 녹이고， DOPE 11.57 / g을 에틸아세테이트 11.57 ^에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 40 //g을 에틸아세테이트 0.8 ^에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태 (bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 등근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 pDNA/ dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k—1.7k)/ DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 0.45 urn hydrophi l ic f i lter로 여과시킨 후 4°C에 보관하였고 추후 세포 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 IX가 되게 섞어 주었다. 비교예 1에서 얻어진 조성물은 아래의 표 2와 같다 (비교예 1) .
【표 2】
Figure imgf000019_0001
[실시예 1-2] 플라스미드 DNA I 펩티드 I 1，6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (di o-TETA) I mPEG-PLA 토코페를 (2k-l .7k) / 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유조성물 제조
GFP pDNA 2 / g을 증류수 4.35 ^에 녹인 용액 및 펩티드 1
(스퍼민— SMBP-서열번호 3의 펩티드 사용)， dioTETA 21 / g을 증류수 흑은 산성 용매인 lOO mM소듐아세테이트 완층용액 (pH 4.2) 21 / 에 녹인 용액을 증류수 100 ^에 녹이고， DOPE 11.57 을 에틸아세테이트 11.57 에 녹인 용액， mPEG-PLA-토코페를 40 / g을 에틸아세테이트 0.8 에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태 (bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 pDNAp/ dioTETA/ mPEG-PLA-토코페를 (2k— 1.7k)/ DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 0.45 urn hydrophi l ic f i lter로 여과시킨 후 4°C에 보관하였고 추후 세포 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 IX가 되게 섞어 주었다.
또한， 실시예 1과 동일한 방법으로 dioTETA대 mPEG-PLA 토코페를 비율을 달리 하여 pDNAp I dioTETA/ mPEG-PLA-토코페를 (2k-1.7k)/ DOPE함유 조성물을 제조하였다. 실시예 1 및 2에서 얻어진 조성물은 아래의 표 3과 같다.
【표 3】
Figure imgf000020_0001
(pDNAp : pDNA와 펩티드의 결합체)
[실시예 3-8] pDNA I 펩티드 I 1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) /디을레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유조성물 제조
상기 실시예 1， 2와 동일한 방법으로 dioTETA/pDNA 의 비율 (N/P 비율)과 DOPE 양만을 달리하여 조성물을 제조하였다. 실시예 3 내지 8에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4와 같다.
【표 4】 Cat ionic Helper 조성물 pDNA 펩티드 고분자
1 ipid 1 ipid pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA-토코페를 2 /zg 1 β 1.05 /zg 40 g 0.58 μ&
3
(2k-1.7k)/ DOPE
pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA—토코페를 2 tig l i 1.05 iig 200 g 0.58 4
(2k-1.7k)/ DOPE
pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA-토코페를 2 1 β§ 4.2 ig 40 ig 2.3 iig 5
(2k-1.7k)/ DOPE
pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA-토코페를 2 /ig 1 4.2 iig 200 zg 2.3 6
(2k-1.7k)/ DOPE
pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA-토코페를 2 i g 1 β& 10.5 //g 40 /g 5.8 g 7
(2k-1.7k)/ DOPE
pDNAp/ dioTETA/
실시예
mPEG-PLA-토코페롤 2 / g l 10.5 200 5.8 /g 8
(2k-1.7k)/ DOPE
[실시예 9—12] pDNA I펩티드 I 1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) /디올레일포스파티딜 -에탄을아민 (DOPE) 함유조성물 제조
실시예 1 , 2와 동일 방법으로 dioTETA의 희석 용매만을 달리하여 조성물을 제조하였다. 실시예 9 내지 12에서 얻어진 조성물은 아래의 표 5와 같다.
【표 5]
Figure imgf000021_0001
s
10 dioTETA/
mPEG-PLA-토코 丁
페를
(2k-1.7k)/
DOPE
pDNAp/ 100
dioTETA/ mM
실시예 mPEG-PLA-토코 aceta
2 iig 1 β 4.2 iig 40 iig 2.3 /ig
11 페를 te
(2kᅳ 1.7k)/ buffe
DOPE r
pDNAp/ 100
dioTETA/ mM
실시예 mPEG-PLA—토코 aceta
2 ug 1 4.2 iig 200 iig 2.3 m
12 페를 te
(2k-1.7k)/ buffe
DOPE r
[실시예 13-15] pDNA/펩티드 I 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) / mPEXr-PLA토코페를 (2k-1.7k) I디올레일포스파티딜 -에탄을아민 (DOPE) 함유조성물 제조
GFPpDNA2/ig을 증류수 4.35 에 녹인 용액 및 펩티드 1 zg을 증류수
1 에 녹인 용액， dioTETA 10.5 //g을 증류수 흑은 산성 용매인 100 mM 소듐아세테이트 완충용액 (pH 4.2) 10.5 ^에 녹인 용액을 증류수 100 에 녹이고， DOPE 5.8 을 에틸아세테이트 0.58 ^에 녹인 용액， mPEG-PLA-토코페롤 100 /g을 에틸아세테이트 2 에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후 초음파 분쇄 상태 (bath type)에서 10분간 더 섞어주었다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 pDNAp/ dioTETA/ mPEG-PLA-토코페를 (2k- 1.7k)/ DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 0.45 urn hydrophilic filter로 여과시킨 후 4°C에 보관하였고 추후 세포 실험 진행 시 10X PBS를 최종 부피에 IX가 되게 섞어 주었다.
또한， 실시예 13과 동일한 방법으로 Spermine에 SMCC를 링커로 사용한 NLS 서열을 달리 하여 pDNAp I dioTETA/ mPEG-PLA-토코페를 (2k-1.7k)/ DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 실시예 13 내지 15에서 얻어진 조성물은 아래의 표 6과 같다.
【표 6】
Figure imgf000023_0001
(pDNAp : pDNA와 펩티드의 결합체)
[실험예 1] pDNA I 펩티드 / 1，6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) I디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유조성물의 크기 및 표면 전하비교
dioTETA/pDNA의 비율 (N/P비율)， mPEG— PLA-토코페를 (2k-1.7k) 양 및 DOPE양에 따른 나노입자 형성 여부를 확인하기 위하여 크기， 표면 전하를 확인하였다.
동적 광산란 (I)LS ; dynami c l ight scatter ing)방법을 이용하여 입자의 크기와 표면 전하를 측정하였다. 구체적으로， He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, MALVERN사의 Zetasi zer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다.
펩티드 유무， dioTETA대 mPEG-PLA 토코페롤 비율에 따른 비교예 1， 실시예 1 내지 2 나노입자의 크기 및 표면 전하는 아래의 표 7에 나타내었다. 【표 7】
Figure imgf000024_0001
[실험예 2] pDNA I 펩티드 I 1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) I디을레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유조성물의 단백질 활성 평가
GFP pDNA를 비교예 1 및 실시예 1~8의 제조법으로 pDNA / 1 , 6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA 토코페를 (2k-1.7k) I 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) , pDNA I 펩티드 I 1，6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA 토코페를 (2k-1.7k) I 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE)를 제조하고 293 세포에 고분자 나노입자를 처리하였다. 그런 다음， GFP 단백질의 발현으로 나타나는 형광을 측정함으로써 고분자 나노입자의 세포내 전달 능력을 측정하였다.
24 wel l 세포 배양판에 6 x l04개의 세포를 분주하고 24시간 후에 , 5% 혈청의 존재 하에서 500 ng의 pDNA가 되게 24 시간 동안 처리하였다. 다시 24시간 후에， GFP 형광을 형광 현미경으로 관찰하였다. 측정결과는 하기 도 2에 나타내었다. 대조군은 인산완층액 (Phosphate buf fered sal ine)만을 처리한 것이다.
[실험예 3] pDNA I 펩티드 I 1，6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA토코페를 (2k-1.7k) /디을레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE) 함유조성물과 pDNA I 리포펙타민 3000의 유전자전달비교 평가
Luci ferase pDNA를 실시예 8의 제조법으로 pDNA / 1， 6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA 토코페를 (2k-1.7k) / 디올레일포스파티딜—에탄을아민 (DOPE), pDNA I 펩티드 I 1,6-디을레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA) I mPEG-PLA 토코페를 (2k_1.7k) I 디올레일포스파티딜 -에탄올아민 (DOPE)를 제조하였다. 또한 Lucif erase pDNA를 리포펙타민 3000과 l(ug):3(ul) 비율로 결합 시켜 제조 하였다.
96 well 세포 배양판에 lxlO4 개의 여러 종류의 암세포 (SK-Mel, HT1080, A549, Hctll6, Miapaca2, HepG2)를 분주하고 24시간 후에， 5%혈청의 존재 하에서 50， 100 ng의 pDNA가 되게 24 시간 동안 처리하였다. 다시 24 시간 후에, Luciferase 발광을 Luciferase 분석기를 통해 관찰하였다. 측정결과는 하기 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다. 대조군은 인산완층액 (Phosphate buffered saline)만을 처리한 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
유효성분으로서 플라스미드 DNA ;
핵 배치 신호 (NLS) 서열 또는 RGD 펩티드 서열을 포함하는 펩티드;
양이온성 화합물 ; 및
양친성 블록 공중합체 ;
를 포함하며，
상기 플라스미드 DNA는 펩티드와 결합하여， 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고， 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
[청구항 2】
거 U항에 있어서， 플라스미드 DNA는 30 , 000 염기쌍 이상으로 이루어지는 것인 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 플라스미드 DNA는 최종 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.001내지 10증량 %포함되는 것인, 플라스미드 DNA전달용 조성물. -
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 펩티드는 DNA 결합 그룹에 링커를 통해 공유결합된 것인, 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 5]
제 4항에 있어서, 상기 DNA 결합 그룹은 폴리아민인 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서, 상기 폴리아민은 스퍼민인 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 7】
제 1항 내지 게 4항 증 어느 한 항에 있어세 상기 양이온성 화합물은 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 양이온성 지질은 하기 화학식 1의 양이온성 플라스미드 DNA 전달용 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000027_0001
상기 식에서，
n과 m 및 1은 각각 0 내지 12이되, 1 ≤ n + m + 1 < 12이며， a와 b 및 c는 각각 1 내지 6이며， Rl , R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로서， Rl , R2 및 R3 중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 블포화 탄화수소이다.
【청구항 9】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 화합물은 최종 조성물의 총 중량에 대해 0.01 내지 50 중량 %사용되는 것을 특징으로 하는， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 10]
거 U항 내지 게 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 플라스미드 DNA의 음이온 전하 (P)에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 (N) 비율 (N/P)이 0.1 내지 128인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 11】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 양친성 블록 공증합체는 친수성 블록 (A) 및 소수성 블록 (B)를 포함하는 A-B형 블록 공중합체이며， 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜， 폴리비닐알콜， 폴리비닐피를리돈， 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며， 상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르， 폴리언하이드라이드， 폴리아미노산， 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 12]
제 1항 내지 게 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 양친성 블록 공중합체의 중량 (b)대비 플라스미드 DNA및 양이온성 화합물 복합체의 중량 (a)비율 [a/b X 100； (플라스미드 DNA 중량+양이온성 화합물 중량) /양친성 블록 공중합체 중량 X 10이은 0 . 001 내지 100중량 %인 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 13]
제 11항에 있어서， 상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 콜레스테를, 토코페를， 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 14]
거 U항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 양친성 블록 공중합체의 함량은 최종 조성물의 총 건조중량에 대해 40 내지 99 . 98 중량 %인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 15】
제 11항에 있어서， 상기 친수성 블록 (A) 및 소수성 블록 (B)의 조성비가， 양친성 블록 공중합체의 총 중량에 대해 각각 40 내지 70중량 ¾>인 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 16】
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서， 융합성 지질을 추가로 포함하는, 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
【청구항 17]
게 4항에 있어서,
상기 링커는 SMCC (석시닐 4-(N-말레이미도메틸)사이클로핵산—1—일-카르복실레이트)， SMPB (석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트) 및 GMBS(N- Y -말레이미도부티릴-옥시석신이미드 에스테르)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인， 플라스미드 DNA 전달용 조성물.
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