KR20150032945A - 지질-코팅된 알부민 나노입자 조성물 및 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법 - Google Patents

지질-코팅된 알부민 나노입자 조성물 및 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법 Download PDF

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KR20150032945A
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lipid
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nanoparticle
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로버트 제이. 리
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더 오하이오 스테이트 유니버시티
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    • C12Y304/21064—Peptidase K (3.4.21.64)

Abstract

지질 나노입자 포뮬레이션, 이를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

지질-코팅된 알부민 나노입자 조성물 및 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법{LIPID-COATED ALBUMIN NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND METHOD OF USING THE SAME}
관련 출원
본 출원은 2012년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 61/650,729 및 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 61/784,892의 우선권을 주장하며, 이 두 명세서는 그 전문들이 본원에 참고 인용된다.
연방정부의 지원을 받은 연구에 대한 진술
본 발명은 미국립보건소가 부여한 승인번호 R01 CA135243, DK088076 및 CA152969 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 따라서, 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖고 있다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출되고 전체적으로 본원에 참고인용된 서열목록을 함유한다. 2013년 5월 22일에 작성된 ASCII 사본의 명칭은 604_55043_SEQ_LIST_OSU-2013-246(2).txt이고, 크기는 1,476 바이트이다.
기술분야
본 발명은 핵산(NAs)을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 치료 조성물을 전달하는데 사용할 수 있는 지질 나노입자(LNs)에 관한 것이다.
리포좀(liposome)은 수성 코어 내에 친수성 분자 또는 지질 이중층(들) 내에 소수성 분자를 운반할 수 있는 하나 이상의 지질 이중층으로 구성된 소포이다. 본원에 사용된 바와 같이, "지질 나노입자"(LN)는 미크론이하 범위의 지질계 입자를 기술하는 일반적 용어이다. LN은 리포좀의 구조적 특징 및/또는 다른 대안적 비-이중층형의 구조를 가질 수 있다. 전신 경로를 통한 LN에 의한 약물 전달은 여러 생리적 장벽의 극복을 필요로 한다. 세망내피계(RES)는 혈행으로부터 LN을 제거하는데 역할을 한다. LN은 혈관구조에서 이탈하여 표적세포에 도달하는 즉시, 보통 세포내이입에 의해 흡수되고 산성 엔도솜(endosome) 조건 내에서 분해하기 전에 세포질 내로 약물을 방출해야 한다.
특히, 이러한 핵산(NA), 예컨대 siRNA 및 여타 치료적 올리고뉴클레오타이드의 전달은 임상 해독(clinical translation)의 가능성을 제한하는 주요 기술적 문제이다.
효과적인 전달 매개제(vehicle)의 개발은 올리고뉴클레오타이드(ON) 치료법의 임상 해독에 대한 관건이다. LN 포뮬레이션은 (1) 약물을 효소 분해로부터 보호할 수 있어야 하고; (2) 모세혈관의 내피를 가로지를 수 있어야 하며; (3) 과도한 면역활성화 또는 비-표적(off-target) 세포독성을 유발함이 없이 표적 세포 종류에 특이적으로 도달할 수 있어야 하고; (4) 세포내이입 및 엔도솜 방출을 촉진할 수 있어야 하며; (5) 콜로이드 안정성이 있고 저장수명이 긴 안정한 포뮬레이션을 형성할 수 있는 것이 필요하다.
본 발명은 치료적 올리고뉴클레오타이드를 고 효율로 캡슐화화하고 효능적 전달을 위한 물리적 및 생물학적 기준을 충족시키는 LN을 제공한다. 특정 양태에 따르면, LN은 초(hyper)-양이온화 및/또는 pH-반응성 HSA-중합체 접합체(conjugates)를 함유한다. 특정 양태에 따르면, HSA-중합체 접합체는 HSA-PEI 또는 HSA-PEHA를 함유한다. 초-양이온화된 알부민-중합체 접합체(APC)의 혼입은 LN 포뮬레이션의 형질감염 효율을 증가시킨다. 이 LN 입자는 본원에서 지질-코팅된 알부민 나노입자(LCAN)라고 기술되기도 한다.
제1 관점으로서, 본 발명은 적어도 하나의 지질 및 양전하를 띤 중합체에 접합된 알부민을 함유하는 지질 나노입자(LN)를 제공한다.
특정 양태에 따르면, LN은 초-양이온화된 알부민-다가양이온(polycation) 접합체(APC)를 함유한다. 특정 양태에 따르면, 다가양이온은 스퍼민(spermine), 디스퍼민(dispermine), 트리스퍼민(trispermine), 테트라스퍼민(tetraspermine), 올리고스퍼민(oligospermine), 터민(thermine), 스퍼미딘(spermidine), 디스퍼미딘(dispermidine), 트리스퍼미딘(trispermidine), 올리고스퍼미딘(oligospermidine), 푸트레신(putrescine), 폴리리신, 폴리아르기닌, 분지형 또는 선형의 폴리에틸렌이민 및 폴리알릴아민으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리아민을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 양전하를 띤 중합체는 본질적으로 폴리에틸렌이민으로 이루어진다.
특정 양태에 따르면, 폴리에틸렌이민은 분자량이 50kDa 이하 또는 약 200 Da 내지 약 2000 Da 범위이다. 특정 양태에 따르면, 양전하를 띤 중합체는 펜타에틸렌헥사민(PEHA) 또는 테트라에틸렌펜타민(TEPA)을 함유한다.
특정 양태에 따르면, LN은 사람 혈청 알부민에 접합된 폴리에틸렌이민을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 접합은 하나 이상의 가교제를 통해 이루어진다. 특정 양태에 따르면, LN은 HSA에 접합된 PEHA를 함유한다.
특정 양태에 따르면, 다수의 PEHA 분자는 각 HSA 분자에 결합된다. 예를 들어, 특정 양태에 따르면, 약 2 내지 약 20개의 PEHA 분자는 각 HSA 분자에 결합될 수 있다. 특정 양태에 따르면, 11개의 PEHA 분자는 각 HSA 분자에 결합된다.
특정 양태에 따르면, LN은 2개 이상의 저분자량 중합체의 혼합물을 함유한다.
특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 지질은 양이온성 지질, 중성 지질 및 PEG화된 지질을 콜레스테롤과 함께 또는 콜레스테롤 없이 함유한다.
특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), L-α-포스파티딜콜린(SPC) 및 d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트(TPGS)를 함유한다. 특정 양태에 따르면, 지질은 25:70:5 몰비의 DOTAP:SPC:TPGS이다.
특정 양태에 따르면, LN은 핵산, 화학치료제 또는 이의 배합물 중에서 선택되는 분자를 캡슐화한다. 특정 양태에 따르면, 캡슐화된 분자는 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miR, 항-miR, shRNA, siRNA 또는 이의 배합물 중에서 선택되는 핵산을 함유한다. 특정 양태에 따르면, 치료제 또는 뉴클레오타이드의 캡슐화율은 40% 이상이다.
특정 양태에 따르면, LN은 직경이 300nm 이하, 200nm 이하 또는 약 98nm 이하이다.
특정 양태에 따르면, 중합체는 오로지 나노입자의 외부 표면에만 직접 연결을 통해 또는 가교제를 통해 결합된다.
특정 양태에 따르면, LN은 추가로 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질을 함유한다. 특정 양태에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질은 폴리소르베이트 80, TPGS 및 mPEG-DSPE로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 특정 양태에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜-접합 지질은 약 15.0 몰% 미만의 농도로 존재한다.
특정 양태에 따르면, LN은 추가로 표적 세포 또는 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 함유한다. 특정 양태에 따르면, 리간드는 항체 또는 항체 단편이다. 특정 양태에 따르면, 리간드는 cRGD, 갈락토오스-함유 모이어티, 트란스페린, 엽산염, 저밀도 지단백질 또는 표피성장인자 중에서 선택된다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 지질 및 양하전을 띤 중합체에 접합된 알부민을 보유하는 지질 나노입자 및 약학적 허용성 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
특정 양태에 따르면, 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 피하 또는 경피적으로 투여된다. 특정 양태에 따르면, 약학적 조성물은 경구 투여용 정제, 멸균 용액, 멸균 현탁액, 동결건조 분말 또는 좌약으로 제조된다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 지질-코팅된 알부민 나노입자(LCAN)를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 사람 혈청 알부민-펜타에틸렌헥사민(HSA-PEHA) 접합체를 합성하는 단계; 이 HSA-PEHA 접합체에 적어도 하나의 지질을 첨가하는 단계; 지질과 HSA-PEHA 접합체의 혼합물에 핵산을 첨가하여 LCAN 전구체를 수득하는 단계; 및 이 LCAN 전구체를 투석 또는 정용여과(diafiltration) 단계로 처리하여 지질-코팅된 알부민 나노입자를 제조하는 단계를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 적어도 하나의 지질은 DOTAP, SPC 및 TPGS를 25:70:5의 비율로 함유한다. 특정 양태에 따르면, 핵산은 pDNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miR, 항-miR, shRNA, siRNA 또는 이의 배합물 중에서 선택된다. 또한, 본 발명은 전술한 방법으로부터 제조된 산물을 제공한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 암 또는 감염 질환을 진단 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 적어도 하나의 지질, 양하전을 띤 중합체에 접합된 알부민 및 약학적 허용성 부형제를 함유하는 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 지질 및 중합체에 접합된 거대분자를 함유하고, 이 거대분자가 핵산과 정전기적 복합체를 형성하는 전달 시스템을 제공한다.
다른 광범위한 관점에 따르면, 본 발명은 지질 나노입자를 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법은 지질 나노입자에 핵산을 캡슐화하되, 이 지질 나노입자가 중합체에 접합된 알부민을 함유하는 단계, 이 지질 나노입자를 약학적 조성물에 혼입시키는 단계 및 이 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1: 다양한 ODN 대 HSA-PEI(600) w/w 비의 HSA-PEI(600)(APC)-올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN) 복합체의 겔 이동성 전이 분석. 리보뉴클레아제 환원효소 R1(RNR R1) 서브유닛(Alpha DNA에서 구입)에 대한 ASO인 LOR-2501을 사용했다.
도 2: LN (LN)-HSA-PEI(600)-LOR-2501(APC-ODN) 복합체의 제타 전위.
도 3a 및 3b: LCAN에서 LOR-2501에 의한 RNR R1 mRNA 발현의 억제조절(downregulation). LCAN은 다른 배지 조건 하에 다양한 APC 농도에서 제조했다. 도 3a는 무혈청 배지를 나타내고; 도 3b는 10% FBS를 함유하는 배지를 나타낸다. 액틴 대비 RNR R1 mRNA 발현은 mRNA 발현의 기준으로서 미처리된 KB 세포가 제공된 RT-PCR로 측정했다.
도 4: LCAN-HSA-PEI(600)-LOR-2501(APC) 복합체로 처리된 KB 세포의 세포 생육성 연구. 형질감염은 무혈청 배지에서 수행했다. 세포 생육성은 미처리된 KB 세포의 평균 생육성 대비 퍼센트로서 나타냈다.
도 5: 다양한 ODN 대 APC w/w 비에서 HSA-PEHA-LOR-2501(APC-ODN) 복합체의 겔 이동성 전이 분석. LOR-2501은 본 연구의 ODN으로서 사용했다.
도 6: LCAN에서 LOR-2501에 의한 RNR R1 mRNA 발현의 억제조절. LCAN은 무혈청 조건 하에 다양한 APC 농도에서 제조했다. 액틴 대비 RNR R1 mRNA 발현은 미처리된 KB 세포가 mRNA 발현의 기준선으로서 제공된 RT-PCR로 측정했다.
도 7: LN-G3139 대비 지질-코팅된 알부민 나노입자(LCAN)-G3139에 의한 KB 세포에서의 Bcl-2 억제조절.
도 8: APC를 합성하기 위한 모식도 예.
도 9: 초-양이온화된 pH 반응성 APC의 작용 기전.
도 10: CAL-51 유방암 세포에서 항-miR-211이 부하된 LCAN에 의한 p27/kip1 mRNA의 상승조절.
도 11: CAL-51 세포에서 항-miR-221이 부하된 LCAN에 의한 에스트로겐 mRNA의 상승조절. 에스트로겐 수용체는 miR-221의 표적이다.
당업자는 이하 양태들의 상세한 설명이 오로지 예시적이며, 어떠한 방식으로든지 제한하려는 것이 아니라는 것을 알 것이다. 기타 양태들도 본 발명의 혜택을 보는 숙련된 자에게는 자명할 것이다. 본원에서, "양태", "관점" 또는 "실시예"란 표현은 이와 같이 기술된 본 발명의 양태들이 특별한 특징, 구조 또는 특성을 포함할 수 있되, 모든 양태가 반드시 특정 특징, 구조 또는 특성을 포함할 필요는 없다는 것을 시사한다. 또한, "한 양태에 따르면"이란 어구의 반복 사용은 동일한 양태를 의미할 수도 있으나, 반드시 동일한 양태를 의미하는 것은 아니다.
본원에 기술된 실시 또는 방법의 통상적인 특징은 전부 제시되고 설명된 것은 아니다. 물론, 이러한 임의의 실제 실시 개발에 있어서, 개발자는 특정 목표, 예컨대 애플리케이션-관련 및 비지니스-관련 제약의 준수 등을 달성하기 위해 다수의 실시-특이적 결정이 이루어질 것이고, 이러한 특정 목표가 실시할 때마다, 그리고 개발자마다도 달라질 것이라는 것을 잘 알고 있을 것이다. 게다가, 이러한 개발 노력은 복잡하고 시간 소모적일 것이나, 그럼에도 불구하고 본 발명의 혜택을 보는 당업자에게는 통상적인 일일 것이다.
일반적 설명
핵산(NA)계 치료법은 유전자 발현을 촉진 또는 억제하기 위해 개발되고 있다. 유전자 돌연변이 및 miRNA 프로필의 변화가 암 및 여타 질환의 기본 원인인 것으로 생각되고 있으므로, NA계 물질(agent)은 기본 병인에 직접 작용하여 치료 가능성을 최대화할 수 있다. NA계 치료법의 비제한적 예로는 플라스미드 DNA(pDNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miR), 모방체(mimic)(mimetic), 항(anti)-miR/길항(antiago)miR/miR 억제제, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 포함한다. 본원에 기술된 나노입자 조성물의 개발에 이르기까지, NA계 치료법의 임상 해독은 NA를 세포내 표적으로 수송하는 것이 특히 어렵고, NA가 비교적 불안정하여 혈청 뉴클레아제 및 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽기 때문에 NA의 실시에 있어서 여러 가지 장애에 부딪혔다. 또한, NA의 높은 음전하는 세포막을 따라 수송을 불가능하게 했고, 이 역시 유용성을 제한했다.
본원에 기술된 LN은 통상의 치료 화합물 및 NA계 치료제 모두의 전달에 유용한 플랫폼(platform)을 제공한다. LN을 사용하여 조제된 약물은 증가된 혈액 순환 시간 및 향상된 투과성 및 체류(EPR) 효과로 인한 고형암 부위에의 증가된 축적과 같은 바람직한 생체내 약동학(PK) 성질을 제공한다. 또한, 특정 양태에 따르면, LN은 폴리에틸렌 글리콜로 표면 코팅되어, 혈청 단백질에 의한 LN의 옵소닌화 및 그 결과 RES-매개 흡수를 저하시킬 수 있고, 및/또는 세포-특이적 리간드로 코팅되어 표적화된 약물 전달을 제공할 수 있다.
LN의 제타 전위는 전신 전달을 위해 과도하게 양성 또는 음성이지 않아야 하는 것이 바람직하다. 높은 양전하를 가진 LN은 비-표적 세포, 조직 및 혈행 혈장 단백질과 비특이적으로 상호작용하는 경향이 있고, 세포독성을 유발할 수 있다. 대안적으로, 높은 음전하를 띤 LN은 역시 음전하인 NA를 효과적으로 혼입할 수 없고, 빠른 RES-매개 제거(clearance)를 야기할 수 있어 치료 효능을 감소시킨다. 중성 내지 중간 전하를 띤 LN은 생체내 약물 및 유전자 전달에 가장 적합하다.
특정 양태에 따르면, 본원에 기술된 LN은 초-양이온화된 알부민-중합체 접합체(APC)를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, "초-양이온화된"이란 용어는 각 다가양이온이 다수의 양전하를 운반한다는 것을 의미한다. 특별한 양태에 따르면, 20개 이하의 다가양이온이 각 알부민 분자에 결합할 수 있다. 이러한 인자들은 보통 카르복시 기들이 단일 양전하 아민 작용기들로 교체된 알부민 접합체를 함유하는 종래의 양이온화된 알부민에 비해 APC에 훨씬 높은 총 전하 함량을 제공한다. 이러한 높은 전하 밀도로 인해, APC는 다수의 양이온 또는 양전하를 보유하는 올리고뉴클레오타이드 입자, 분자, 화합물 또는 포뮬레이션과 같은 다가음이온(polyanion)과 매우 효과적으로 상호작용할 수 있다.
본원에 사용된 "지질 나노입자"(LP)란 용어는 1 이상의 지질 성분에 의해 형성된 소포(vesicle)를 의미한다. 본원에 기술된 지질 성분은 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 임의의 생리학적 pH에서 총 양전하(net positive charge)를 운반하는 지질이다. 특정 양태에 따르면, 양전하는 ASO와 같은 음전하를 띤 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 결합에 사용된다.
적당한 양이온성 지질로는 다음과 같은 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 염산염(DC-Chol); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP); 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 염(DDAB); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 클로라이드(DL-EPC); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N-N-N-트리메틸 암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N-N-N-디메틸 암모늄 클로라이드(DODMA); N,N-디옥타데실-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트(DOSPA); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE); 디옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS); 양이온 변형 기에 접합된 중성 지질; 및 이의 배합물. 또한, 입수용이한 제제 중의 다수의 양이온성 지질이 사용될 수 있으며, 그 예로는 LIPOFECTIN?(GIBCO/BRL 제품), LIPOFECTAMINE?(GIBCO/BRL 제품), siPORT NEOFX?(어플라이드 바이오시스템스 제품), TRANSFECTAM?(Promega 제품) 및 TRANSFECTIN?(Bio-Rad Laboratories, Inc. 제품)이 있다. 당업자는 많은 더욱 양이온성 지질이 LN 포뮬레이션에 혼입시키기에 적합하다는 것을 알고 있을 것이다. 특정 양태에 따르면, 양이온성 지질은 포뮬레이션에 존재하는 총 지질의 약 80.0 몰% 이하, 또는 포뮬레이션의 약 5.0 내지 약 50.0 몰% 범위의 농도로 존재할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 현재 개시된 LN 포뮬레이션은 또한 음이온성 지질을 포함할 수도 있다. 음이온성 지질은 생리학적 pH에서 총 음전하를 운반하는 지질이다. 이러한 음이온성 지질은 양이온성 지질과 배합 시, LN의 총 표면 전하를 감소시키고 LN 이중층 구조의 pH-의존적 붕괴를 도입시켜, 산성 pH에서 비라멜라 상을 유도하여 뉴클레오타이드 방출을 촉진하거나 세포막과의 융합을 유도하는데 유용하다.
적당한 음이온성 지질의 예로는 다음과 같은 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다: 지방산, 예컨대 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산; 콜레스테릴 헤미석시네이트; 1,2-디-O-테트라데실-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(diether PG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨 염); 1,2-디미리스틸-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(나트륨염); 1-헥사데카노일,2-(9Z,12Z)-옥타데카디에노일-sn-글리세로-3-포스페이트; 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)](DOPG); 디올레오일포스파타이드 산(DOPA); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 중성 지질에 접합된 음이온성 변형 기; 및 이의 배합물. 본 발명의 음이온성 지질은 포뮬레이션의 약 60.0몰% 이하 또는 포뮬레이션의 약 5.0 내지 약 25.0몰%의 농도로 존재한다.
특정 양태에 따르면, 전하를 띤 LN은 형질감염에 유익하나, 세포독성 및 RES-매개의 흡수와 같은 비-표적(off-target) 효과가 일어날 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 분자는 지질 앵커(anchor)에 접합되고 본원에 기술된 LN에 포함되어 LN 응집 또는 막과의 상호작용을 방해할 수 있다. 친수성 중합체는 지질 성분들에 공유 결합하거나 또는 가교제를 사용하여 아민과 같은 작용기에 접합될 수 있다.
친수성 중합체의 적당한 접합체로는 비제한적으로, 폴리비닐 알코올(PVA); 폴리소르베이트 80; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-PEG2000(DSPE-PEG2000); D-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트(TPGS); 디미리스토일포스파티딜에탄올아민-PEG2000(DMPE-PEG2000); 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민-PEG2000(DPPE-PEG2000)을 포함한다. 특정 양태에 따르면, 친수성 중합체는 포뮬레이션의 약 0 내지 약 15.0 몰% 범위의 농도, 또는 포뮬레이션의 약 5.0 내지 약 10.0 몰% 범위의 농도로 존재할 수 있다. 또한, 특정 양태에 따르면 사용된 PEG의 분자량은 약 100 내지 약 10,000 Da 또는 약 100 내지 약 2,000 Da 사이이다.
본원에 기술된 LN은 추가로 중성 및/또는 콜레스테롤 지질을 헬퍼 지질로서 함유할 수 있다. 이 지질은 포뮬레이션을 안정화하고, 생체내 제거를 감소시키고, 또는 형질감염 효율을 증가시키는데 유용하다. LN은 용해안정성(lyostability) 및 동결안정성(cryostability)을 촉진시키기 위해, 당류 용액, 예컨대 비제한적으로 글루코오스, 소르비톨, 수크로오스, 말토오스, 트레할로스, 락토오스, 셀루비오스, 라피노스, 말토트리오스, 덱스트란 또는 이의 배합물에 조제될 수 있다.
중성 지질은 생리학적 pH에서 총전하(net charge)가 0이다. 본원에 개시된 LN 포뮬레이션에는 하나의 중성 지질 또는 여러 중성 지질의 배합물이 포함될 수 있다.
적당한 중성 지질로는, 비제한적으로 포스파티딜콜린(PC, 예, DSPC, DPPC, DOPC, DMPC, soyPC, eggPC, HSPC), 포스파티딜에탄올아민(PE, 예, DOPE, DSPE, DPPE, DSPE, DMPE), 세라미드, 세레브로사이드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 디아실글리세롤, 글리코실화된 디아실글리세롤, 프레놀, 리소좀성 PLA2 기질, N-아실글리신, 및 이의 배합물을 포함한다.
다른 적당한 지질로는 비제한적으로 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤(PG, 예, DSPG, DMPG, DPPG), 및 리소포스파티딜에탄올아민; 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 데모스테롤, 시토스테롤, 지모스테롤, 디오스제닌, 라노스테놀, 스티그마스테롤, 라쏘스테롤 및 데하이드로에피안드로스테론; 및 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 세라마이드, 스핑고미엘린, 강글리오사이드, 글리코스핑고지질, 포스포스핑고지질, 피토싱고신; 및 이의 배합물을 포함한다.
본원에 기술된 LN 포뮬레이션은 추가로 융합원성 지질 또는 융합원성 코팅을 포함하여 막 융합을 촉진시킬 수 있다. 적당한 융합원성 지질의 예로는 비제한적으로 글리세릴 모노-올리에이트, 올레산, 팔미토올레산, 포스파티드산, 포스포이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2) 및 이의 배합물을 포함한다.
여기에 기술된 LN 포뮬레이션은 추가로 양이온성 중합체 또는 양이온성 중합체의 접합체를 함유할 수 있다. 양이온성 중합체 또는 이의 접합체는 단독으로 사용될 수도 있고, 또는 지질 나노캐리어(nanocarrier)와 함께 사용될 수 있다. 적당한 양이온성 중합체로는 폴리에틸렌이민(PEI); 펜타에틸렌헥사민(PEHA); 스퍼민; 스퍼미딘; 폴리(L-리신); 폴리(아미도 아민) (PAMAM) 덴드리머(dendrimer); 폴리프로필렌이민 덴드리머; 폴리(2-디메틸아미노 에틸)-메타크릴레이트(pDMAEMA); 키토산; 트리스(2-아미노에틸)아민 및 이의 메틸화된 유도체; 및 이의 배합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 양태에 따르면, 사슬 길이 및 분지화는 중합체 전달 시스템의 실시에 중요한 고려 인자이다. 고분자량 중합체, PEI(MW 25,000)는 형질감염제로 사용되나, 세포독성을 나타낸다. 저분자량 PEI(MW600)는 세포독성을 유발하지 않으나, 핵산과의 안정한 축합을 촉진하지 못함으로 인해 사용이 제한된다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 알부민과 같은 큰 분자에 저분자량 중합체의 접합은 LN 포뮬레이션의 세포독성을 저하시키면서 NA 축합에 의한 정전기적 복합체화의 활성을 증가시키는 유용한 방법이다.
또한, 현재 개시된 LN 포뮬레이션에는 음이온성 중합체도 혼입될 수 있다. 적당한 음이온성 중합체로는 폴리(프로필아크릴산)(PPAA); 폴리(글루탐산)(PGA); 알긴산염; 덱스트란 유도체; 잔탄; 유도체화된 중합체; 및 이의 배합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
특정 양태에 따르면, LN 포뮬레이션은 중합체의 접합체를 포함한다. 이 접합체는 표적화제, 친지성 모이어티, 단백질 또는 전체적인 치료 효능을 증가시키는 여타 분자들에 가교결합될 수 있다. 적당한 가교제로는 비제한적으로 N-석신이미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피오네이트(SPDP); 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP); 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC); 디이소프로필 카르보디이미드(DIC); 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(EDC); N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS); N',N'-카르보닐디이미다졸(CDI); N-에틸-5-페닐이속사졸륨-3'-설포네이트(Woodward's reagent K); 및 이의 배합물을 포함한다.
LN에 표적화제의 첨가는 수동 표적화 시도보다 증가된 효능을 제공한다. 표적화는 특정 표적화 모이어티, 예컨대 비제한적으로 세포 표면 수용체에 대한 항체 또는 리간드, 펩타이드, 지단백질, 당단백질, 호르몬, 비타민, 항체, 항체 단편, 및 이 모이어티들의 접합체 또는 배합물의 혼입을 수반한다.
특정 양태에 따르면, 표적화 효율의 최대화는 표적화제를 부분 캡슐화하여 세포 표적에 접근할 수 없게 해주는 다른 성분들과 표적화 리간드의 예비혼합보다는 적당한 표적화 모이어티에 의한 LN의 표면 코팅을 포함한다. 이 방법은 세포 표면 수용체와의 상호작용을 최적화한다.
표적화제는 합성 동안 LN에 직접 혼입되거나, 또는 후속 단계에서 첨가될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 표적화 모이어티 상의 작용기 뿐만 아니라 치료 적용분야의 세부사항(예, 분해성 결합)은 LN으로의 적당한 혼입 방법을 좌우한다. 예를 들어, 친지성 영역을 보유하지 않는 표적화 모이어티는 LN의 지질 이중층에 직접 삽입할 수 없고, 삽입하기 전에 지질 앵커(anchor)에 사전 접합을 필요로 하거나 LN과의 정전기적 복합체를 형성해야만 한다.
또한, 특정 상황 하에서, 표적화 리간드는 친지성 앵커(anchor)에 직접 결합할 수 없다. 이러한 상황에서, 가교제(crosslinking agent) 형태의 분자 가교(bridge)는 상호작용을 용이하게 하는데 활용될 수 있다. 특정 양태에 따르면, 고착된(anchored) 표적화 모이어티의 입체적 제한이 의도한 생리학적 표적과의 충분한 상호작용을 방해한다면 가교제를 사용하는 것이 유익하다. 또한, 표적화 모이어티가 특정 배향하에서만 기능성이라면(예, 모노클로널 항체), 가교제를 통한 지질 앵커와의 결합이 유익하다. 특정 양태에 따르면, 다른 생물접합 방법이 표적화제를 LN에 결합시키는데 사용될 수 있다. 생체내 포뮬레이션의 축적 및 관련 세포독성을 방지하기 위해서는 환원성 또는 가수분해성 결합이 적용될 수 있다.
다양한 LN 제조 방법은 본 발명의 LN을 합성하는데 적합하다. 예를 들면, 에탄올 희석, 동결-해동, 박막 수화, 초음파처리, 압출, 고압 균질화, 계면활성제 투석, 마이크로유동화, 접선 유동 정용여과, 멸균여과, 및/또는 동결건조가 사용될 수 있다. 또한, LN의 크기를 줄이기 위해 여러 가지 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 균질화는 Avestin Emulsiflex C5?와 같은 지질 균질화에 적합한 임의의 장치들에서 수행할 수 있다. 압출은 적당한 소공 크기(0.05 내지 0.2㎛)의 폴리카보네이트 막을 사용하여 Lipex Biomembrane 압출기에서 수행할 수 있다. 샘플 내의 크기 변동을 최소화하기 위해 입자 크기 축소 사이클을 다수 수행할 수 있다. 최종 LN은 그 다음 Sepharose CL4B와 같은 크기배제컬럼을 통해 통과시키거나 또는 접선 유동 정용여과(tangential flow diafiltration)로 처리하여 LN을 정제할 수 있다.
본원에 기술된 LN의 임의의 양태는 제조방법에 에탄올을 추가로 포함할 수 있다. LN 포뮬레이션에 약 30 내지 50% 에탄올의 혼입은 지질 이중층을 불안정화시키고, 음이온성 ASO 및 siRNA와 양이온성 지질 같은 전하를 띤 모이어티 중에서 정전기적 상호작용을 촉진한다. 고 에탄올 용액에서 제조된 LN은 투여하기 전에 희석한다. 대안적으로, 에탄올은 투석, 또는 정용여과로 제거할 수 있고, 이 역시 비-캡슐화된 NA를 제거한다.
특정 양태에 따르면, LN은 멸균되어야 하는 것이 바람직하다. 멸균은 사전여과 하에 또는 사전 여과 없이 0.2 또는 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 LN을 통과시켜 달성할 수 있다.
LN의 물리적 특성규명은 많은 방법을 통해 수행할 수 있다. 동적 광산란(DLS) 또는 원자간력 검경법(AFM)은 평균 직경 및 이의 표준편차를 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에 따르면, LN은 직경이 약 200nm 또는 그 미만인 것이 특히 바람직하다. 제타 전위차계를 통한 제타 전위 측정은 입자의 상대적 안정성을 결정하는데 유용하다. 동적 광산란 분석 및 제타 전위 분석은 모두 탈이온수 또는 적당한 완충액 중의 희석된 샘플로 수행할 수 있다. 저온 투과전자검경법(Cryo-TEM) 및 주사전자검경법(SEM)은 LN의 상세한 모폴러지를 결정하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 LN은 수 개월 동안 동결 시 안정하다. 합성과 투여 사이에 장시간을 필요로 하는 LN은 표준 절차를 사용하여 동결건조할 수 있다. 동결에 앞서 10% 수크로오스와 같은 동결보호제가 LN 현탁액에 첨가되어 동결건조 동안 포뮬레이션의 완전성을 유지할 수 있다. LN 포뮬레이션의 동결건조는 장기간 안정성에 권장된다.
특정 양태에 따르면, 본원에 기술된 LCAN은 직경이 300nm 미만이고, 특별한 양태에 따르면, 평균 직경이 약 50 내지 약 200nm 사이이다. 이러한 LN은 특히 전신 투여 동안 발견되는 고 혈청 조건 하에서, 높은 형질감염 및 낮은 세포독성을 나타낸다. LN은 광범위한 현행 치료제 및 시스템에 유용하고, 혈청 안정성이 높으며, 높은 형질감염 효율로 표적화된 전달을 수행하도록 설계할 수 있다.
알부민-중합체 접합체(APC)
LN에 형질감염제로서 양이온성 중합체 단독 사용 및 지질과의 병용 사용은 종종 형질감염 효율을 이롭게 한다. 한가지 중합체성 형질감염제는 고분자량의 폴리에틸렌이민(PEI)이고, 이는 분자량이 약 25kDa인 큰 중합체이다. PEI25K는 pDNA를 세포로 전달하는데 사용되고 있지만, 세포독성으로 인해 생체내 사용이 제한되었다. 덜 독성인 저분자량 PEI(MW 약 600kDa)도 연구되었지만, 이는 NA와 상호작용하여 NA를 전달하는 능력이 떨어졌다.
본 발명은 전술한 중합체의 모든 결함이 없는 초-양이온화된 알부민-중합체 접합체(APC)를 제공한다. APC는 pDNA와 같은 제제를 전달하기 위해 단독 사용될 수 있고, 또는 ASO 및 siRNA와 같은 제제를 전달하기 위해 지질계 포뮬레이션과 배합될 수 있다. 또한, 알부민은 이의 소수성 코어(core)로 인해 엔도솜 용해 활성을 보유하며, 이 코어는 형태 변화 시 노출될 수 있고 이중층 붕괴 또는 막 융합을 유도할 수 있다. 일부 양태, 예컨대 HSA-PEI600 접합체의 경우, APC는 pH 변화에 반응성인 이온화 프로필을 나타낸다. 전하 밀도는 산성인 엔도솜 pH에서 증가한다.
한 양태에 따르면, APC는 양이온성 지질 배합물과 배합되어 때로 LCAN이라 지칭되는 양이온성 지질-APC-NA 나노입자로 어셈블리한다. 다른 양태에 따르면, APC는 음이온성 지질 배합물과 배합되어 지질-APC-NA 나노입자로 어셈블리된다. 특정 양태에 따르면, LN은 초-양이온화된 APC를 함유한다. 이러한 LN는 추가 세포독성없이 높은 형질감염 효율을 보유한다. APC 합성 모식도는 도 8에 제시했다. 초-양이온화된 pH 반응성 APC의 작용 기전은 도 9에 제시했다.
또한, 본 발명은 중합체, 예컨대 양전하를 띤 중합체에 접합된 거대분자(macromolecules)를 제공한다. 한 양태에 따르면, 저분자량 pH 민감성 중합체(폴리에틸렌이민 MW600, PEI600)는 가교제를 통해 사람 혈청 알부민(HSA)에 접합되어 초-양이온화된 pH 반응성 APC를 산출한다. LN에 HSA-PEI600 접합체의 첨가는 KB 세포(HeLa의 서브라인)에서 실질적인 세포독성 없이 혈청의 존재 하에 ASO LOR-2501(Alpha DNA에서 구입)에 의한 RRM1(별칭, RNR R1)의 억제조절을 유의적으로 증가시킨다.
다른 양태에 따르면, 저분자량의 펜타에틸렌헥사민(PEHA)은 가교제를 통해 HSA에 접합되어 초-양이온화된 pH-반응성 APC를 제공한다. 지질-코팅된 알부민 나노입자(LCNA)로 지칭되는 이 특정 포뮬레이션은 특히 안티센스 ODN, pDNA, siRNA, shRNA, miR 및 항-miR과 같은 올리고뉴클레오타이드를 전달하는데 유용하다. 이론적 구속을 원하지 않지만, HSA-PEHA는 나노입자의 안정성 및 생물학적 활성을 개선시키는 것으로 생각된다. 특정 양태에 따르면, 이 포뮬레이션 중의 지질은 25:70:5(mol/mol) 비의 DOTAP, SPC 및 TPGS이다.
이용분야
이용분야에 따라, 본원에 개시된 LN은 NA의 부하량(loading) 증가, 혈청 안정성 증가, 저하된 RES-매개의 흡수, 표적화된 전달 또는 엔도솜 내에서의 pH 민감성 방출과 같은 특성에 유리하도록 설계할 수 있다. LN 포뮬레이션들은 다양한 성질로 인해, 특별한 치료 목적을 달성하기 위해서는 본원에 제공된 여러 방법들 중 하나를 사용할 수 있다. 특정 목적을 충족시키기 위해, 양이온성 지질, 음이온성 지질, 폴리알켄, 중성 지질, 융합원성(fusogenic) 지질, 양이온성 중합체, 음이온성 중합체, 중합체 접합체, 펩타이드, 표적화 모이어티 및 이의 배합물을 적용할 수 있다.
본원에 기술된 LN은 올리고뉴클레오타이드(ON) 치료제, 예컨대 cDNA, siRNA, shRNA, miRNA, 항-miR 및 안티센스 ODN의 치료적 전달을 위한 플랫폼(platform)으로서 사용될 수 있다. 이러한 치료제들은 다양한 종류의 암, 백혈병, 바이러스 감염 및 여타 질환과 같은 매우 다양한 질환을 관리하는데 유용하다. 예를 들어, 환형 RGD, 엽산염, 트란스페린 또는 항체와 같은 표적화 모이어티들은 표적화된 약물 전달을 가능하게 하여 활성을 크게 증대시킨다. 많은 종양들은 자신의 세포 표면에서 수용체들을 과잉발현한다. 적당한 표적화 모이어티들의 비제한적 예로는 트란스페린(Tf), 엽산염, 저밀도 지단백질(LDL), 및 표피 성장인자를 포함한다. 또한, 종양 혈관 내피 마커, 예컨대 알파-v-베타-3 인테그린 및 전립선-특이적 막 항원(PSMA)은 LN의 표적으로서 가치가 있다. 특정 양태에 따르면, 제타 전위가 50mV 미만인 직경이 약 300nm 이하로 측정되는 입자를 보유하고 캡슐화 효율이 20.0% 초과인 LN 포뮬레이션은 NA 전달에 유용하다.
본원에 기술된 LN 포뮬레이션의 양태들은 단독으로 또는 서로 다른 양태와 함께 실시 시, 현행 LN 디자인의 패러다임과 상승작용을 한다.
본원에 기술된 LN은 광대한 스펙트럼의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 치료제의 비제한적 예로는 항신생물제, 항감염제, 국소 마취제, 항알러지제, 항빈혈제, 혈관형성 억제제, 베타-아드레날린 차단제, 칼슘 채널 길항물질, 항-고혈압제, 항우울제, 항경련제, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 항류마티스제, 구충제, 항기생충제, 코르티코스테로이드, 호르몬, 호르몬 길항물질, 면역조절제, 신경전달물질 길항물질, 항당뇨병제, 항-간질약, 지혈제, 항-고혈압제, 항녹내장제, 면역조절성 사이토킨, 진정제, 케모킨, 비타민, 독소, 마약, 조영제 및 이의 배합물을 포함한다.
NA계 치료제는 본 발명의 LN 포뮬레이션에 잘 적용할 수 있다. 이러한 NA계 치료제의 예로는 비제한적으로 pDNA, siRNA, miRNA, 항-miRNA, ASO 및 이의 배합물을 포함한다. 혈청 뉴클레아제로부터 보호하고 치료제를 안정화시키기 위해, 치환 NA 염기 단위 및/또는 포스포로디에스테르 링커에 대한 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 변형으로는, 주쇄 변형(예, 포스포티오에이트 결합); 2' 변형(예, 2'-O-메틸 치환된 염기); 양쪽이온성 변형(6'-아미노헥시 변형된 ODN); 말단 친지성 모이어티(예, 지방산, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체)의 첨가; 및 이의 배합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 변형된 서열은 본원에 개시된 LN 포뮬레이션과 상승작용한다. 예를 들어, ODN에 3'-콜레스테롤의 첨가는 주로 합성 동안 정전기적 상호작용에 의해 함께 유지되던 시스템에 친지성 상호작용을 부가하여 LN 복합체에 안정성을 공급한다. 또한, 이러한 친지성 부착은 세포막의 외측 소엽(leaflet)에 ODN을 국재화시켜 세포 투과를 촉진한다.
치료 이용분야에 따라, 본원에 기술된 LN은 다음과 같은 방법들로 투여할 수 있다: 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 경피, 종양내, 동맥내, 전신 또는 대류-증강 전달. 특별한 양태에 따르면, LN은 정맥내, 근육내, 피하 또는 종양내로 전달된다. 다른 또는 유사 LN에 의한 후속 용량투여는 대안적인 투여 경로를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본원에 개시된 유효량의 LN 포뮬레이션, 및/또는 추가 제제를 약학적 허용성 담체에 용해 또는 분산된 상태로 함유한다. "약학적" 또는 "약리학적 허용성"이란 어구는 동물, 예컨대 사람에게 투여했을 때, 어떠한 부작용, 알러지 또는 다른 유해 반응도 나타내지 않는 분자 엔타이티(entities) 및 조성물을 의미한다. 적어도 하나의 화합물 또는 추가 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제법은 본 발명의 분야에 숙련된 자에게 잘 알려져 있을 것이다(예컨대, 본원에 참고 인용된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 2003 참조). 게다가, 동물(예, 사람) 투여 시, LN 제제는 FDA 사무국의 생물학적 기준이 요구하는 멸균성, 발열원성, 일반적 안정성 및 순도 기준을 충족시켜야 한다는 것을 잘 알고 있을 것이다.
본원에 개시된 조성물은 이의 투여 형태가 고체, 액체 또는 에어로졸인지에 따라, 그리고 주사와 같은 투여 경로 시 멸균될 필요가 있는지에 따라 다른 종류의 담체(carrier)를 함유할 수 있다. 본원에 개시된 조성물은 정맥내, 피내, 경피, 경막내, 동맥내, 복강내, 비내, 질내, 직장내, 국소적, 근육내, 피하, 점막, 자궁내, 경구, 국소(topically), 국부(locally), 흡입(예, 에어로졸 흡입)을 통해, 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접 침지시키는 국부적 관류, 카테터를 통해, 세척(lavage)을 통해, 크림으로, 지질 조성물(예, 리포좀)로, 또는 다른 방법에 의해 또는 당업계의 숙련된 자에게 알려져 있는 전술한 경로의 임의의 조합을 통해 투여될 수 있다(예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 2003, 본원에 참고 인용됨).
동물 또는 사람 환자에게 투여된 본원에 개시된 조성물의 실제 투약량은 체중 또는 표면적, 상태의 정도, 치료할 질환의 종류, 이전 또는 진행중인 치료적 시술, 환자의 특발증 및 투여 경로와 같은 물리적 인자 및 생리학적 인자에 따라 결정될 수 있다. 투약량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투약량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 피검자(subject)의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여할 책임이 있는 담당자는 아무튼 개개인에 적당한 용량(들)과 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도를 결정할 것이다.
특정 양태에 따르면, 약학적 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 물론, 각 치료적으로 유용한 조성물에 활성 화합물(들)의 양은 이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에 적당한 투약량이 수득될 수 있는 방식으로 제조될 수 있다. 용해성, 생체이용성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 저장기간, 뿐만 아니라 다른 약리학적 사항과 같은 요인을 고려하여 당업자는 이러한 약학적 포뮬레이션을 제조할 것이고, 이런 경우, 다양한 투약량과 치료 섭생이 필요할 수 있다.
다른 비제한적 예로서, 용량은 또한 투여당 약 1 ㎍/kg/체중, 약 5 ㎍/kg/체중, 약 10 ㎍/kg/체중, 약 50 ㎍/kg/체중, 약 100 ㎍/kg/체중, 약 200 ㎍/kg/체중, 약 350 ㎍/kg/체중, 약 500 ㎍/kg/체중, 약 1 mg/kg/체중, 약 5 mg/kg/체중, 약 10 mg/kg/체중, 약 50 mg/kg/체중, 약 100 mg/kg/체중, 약 200 mg/kg/체중, 약 350 mg/kg/체중, 약 500 mg/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상 및 여기에서 파생될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 여기에 나열된 숫자로부터 파생될 수 있는 범위의 비제한적 예로서, 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중 범위, 약 5 ㎍/kg/체중 내지 약 500 mg/kg/체중 범위의 활성 약학적 성분(API) 등이 전술한 숫자들에 기초하여 투여될 수 있다.
특정 양태에 따르면, 본원의 조성물 및/또는 추가 제제는 소화 경로를 통해 투여되도록 조제한다. 소화 경로로는 조성물이 직접 소화관과 접촉하는 모든 가능한 투여 경로를 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 약학적 조성물은 경구, 협측, 직장 또는 설하로 투여될 수 있다. 이러한 것일 때, 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체에 의해 조제될 수 있다.
추가 양태에 따르면, 본원에 기술된 조성물은 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "비경구"란 용어는 소화관을 우회하는 경로를 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 약학적 조성물은 예컨대 비제한적으로 정맥내, 피내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다(미국 특허 6,753,514, 6,613,308, 5,466,468, 5,543,158, 5,641,515 및 5,399,363은 각각의 전문이 본원에 참고 인용된다).
유리 염기 또는 약리학적 허용성 염으로서 본원에 개시된 조성물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적당히 혼합된 물에 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에 제조될 수도 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에서, 이 제제들은 미생물의 성장을 억제하기 위해 보존제를 함유한다. 주사용으로 적당한 약학적 형태로는 멸균 수성 용액 또는 분산액과 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(본원에 전문이 참고 인용된 미국 특허 5,466,468 참조). 모든 경우, 제형은 멸균되어야 하고, 용이한 주사성이 존재할 정도로 유체여야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해서 보존적이어야 한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예컨대 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에는 등장성을 달성하기 위한 제제, 예컨대 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 지속적인 흡수는 흡수지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 발휘될 수 있다.
수용액을 비경구 투여하는 경우, 예컨대 용액은 필요한 경우 적당히 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스에 의해 등장성이 되어야 한다. 이러한 특별한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명에 비추어서 당업자라면 잘 알 것이다. 예를 들어, 1회 투약량은 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해되고, 피하주입 유체 1000ml에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다(예컨대, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투약량의 약간의 변형은 치료받는 피검자의 상태에 따라 필연적으로 일어날 것이다. 투여 담당자는 아무튼 피검자 개개인에 적당한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 사람에게 투여 시, 제제는 FDA 사무국의 생물학적 기준에 필요한 멸균성, 발열원성, 일반 안정성 및 순도 기준에 부합해야 한다.
멸균 주사 용액은 필요한 경우 앞서 열거한 다양한 다른 성분과 함께 적당한 용매에 조성물을 필요한 양만큼 혼입시켜 제조하고, 그 다음 멸균한다. 일반적으로, 분산액은 앞서 열거한 것 중에서 필요한 여타 성분과 기본 분산 매질을 함유하는 멸균 매개제에 다양한 멸균 조성물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사 용액을 제조하기 위한 멸균 분말인 경우에, 일부 제조 방법은 사전 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가 필요 성분의 분말을 산출하는, 진공건조 및 동결건조 기술이다. 분말화된 조성물은 물 또는 식염수 용액과 같은 액체 담체와 안정화제의 존재 또는 부재 하에 배합된다.
다른 양태에 따르면, 조성물은 다양한 여러 경로, 예컨대 국소(즉, 경피) 투여, 점막 투여(비내, 질 등) 및/또는 흡입을 통해 투여하도록 조제될 수 있다.
특정 양태에 따르면, 조성물은 점안제, 비내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 매개제로 전달할 수 있다. 조성물을 비측 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 전달하는 방법은 미국 특허 5,756,353 및 5,804,212(각각 본원에 전문이 참고 인용됨)에 기술되어 있다. 이와 마찬가지로, 비내 마이크로입자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 5,725,871, 전문이 참고 인용됨)을 이용한 약물의 전달도 역시 약제 분야에 잘 알려져 있고 본원에 기술된 조성물을 전달하는데 이용될 수 있다. 이와 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달은 미국 특허 5,780,045(전문이 본원에 참고 인용됨)에 기술되어 있고, 본원에 기술된 조성물을 전달하는데 이용될 수 있다.
또한, 본원에 개시된 조성물은 에어로졸을 통해 전달될 수 있을 것으로 생각된다. 에어로졸 이란 용어는 미분 고체 또는 액체 입자가 액화 또는 압축 기체 추진제에 분산된 콜로이드계를 의미한다. 흡입에 전형적인 에어로졸은 액체 추진제 또는 액체 추진제와 적당한 용매의 혼합물에 현탁된 활성 성분의 현탁액으로 이루어진다. 적당한 추진제로는 탄화수소 및 탄화수소 에테르를 포함한다. 적당한 용기는 추진제의 압력 요건에 따라 달라질 것이다. 에어로졸의 투여는 피검자의 연령, 체중 및 증상의 정도 및 반응에 따라 달라질 것이다.
실시예
본 발명의 특정 양태들은 이하 실시예에서 상세히 설명된다. 이 실시예들은 본 발명의 바람직한 양태들을 나타내지만, 단지 예시적으로 제공된 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의와 이하 실시예로부터 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있고, 이의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 용법 및 조건에 부합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행할 수 있다.
실시예 1
HSA(25%)는 Octapharma에서 구입했다. PEHA는 Sigma-Aldrich에서 구입했다. pH가 M HCl로 8.0으로 조정된 PEHA 스톡 용액을 제조했다. HSA는 500x PEHA와 배합했다. 그 다음, 이 용액에 80x의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC)(Fisher Scientific 제품)을 교반 하에 첨가했다. 반응은 실온에서 4시간 넘게 진행했다. 산물 HSA-PEHA는 PD-10 탈염 컬럼에서 겔 여과 크로마토그래피로 정제하거나, MWCO 10,000 막을 이용해 투석하여 미반응 PEHA와 부산물을 제거했다. 산물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석으로 측정했다. HSA-PEHA 접합체의 분자량은 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 비행시간 질량 분광분석법(MADLI TOF MS)으로 측정했다. 66405.756의 m/z를 나타내는 결과에 근거할 때, 평균 11개의 PEHA가 각 HSA에 결합되어 있었다. 산물은 4℃에서 보관하거나, 동결하거나 또는 동결건조할 수 있다.
실시예 2
지질 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)(Avanti Polar Lipids), 대두 유래의 L-α-포스파티딜콜린(SPC)(Avanti Polar Lipids), 및 d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트(TPGS)(Eastman Chemical)를 에탄올에 용해시켰다. 지질은 25:70:5(mol/mol)로 배합했다. 간략히 설명하면, DOTAP, SPC 및 TPGS를 각각 3.15, 8.83 및 0.63μmol씩 에탄올 4ml에 배합했다. 그 다음, 이것을 20mM HEPES 완충액(pH 7.4) 4ml에 용해된 HSA-PEHA 3mg에 첨가하고, 그 다음 bcl-2에 대한 ASO인, 20mM HEPES 완충액 2ml 중의 G3139(Alpha DNA에서 구입) 1mg에 첨가하여 40% 에탄올을 함유하는 혼합물을 형성시켰다. 그 다음, 이것을 MWCO 10K Slide-A-Lyzer 카세트를 사용하여 HEPES 완충액에 대하여 투석하여 에탄올 및 유리 G3139를 제거했다. 산물인 지질-코팅된 알부민 나노입자(LCAN)-G3139는 정용여과에 의해 2mg/ml ODN 농도로 농축했고, 이 산물에 10% 수크로오스를 첨가하고, 산물은 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과했다. LCAN-G3139는 4℃에서 안정했고, 장기간 보관하기 위해 동결 또는 동결건조했다. LCAN의 입자 크기는 NICOMP 370 입자 크기 분석기로 측정했다. 제타 전위는 zetaPALS 기구에서 측정했다. 약물 부하 효율은 Oligreen ssDNA 정량 시약을 사용하여 측정했다. LCAN 입자는 직경이 <200nm 이고, 제타 전위가 +20 내지 +40mV이며, G3139 캡슐화 효율이 60% 초과인 것으로 확인되었다. 동일한 방법을 사용하여 나노입자 합성 동안 지질 성분에 지질-유도체화된 리간드를 혼입시켜 리간드-접합된 LCAN을 합성했다. 가능한 리간드로는 트란스페린, 엽산염, cRGD 또는 항체를 포함한다.
실시예 3
HSA-PEHA 접합체는 다음과 같이 합성했다. HSA(25%)는 Octapharma에서 구입했다. PEHA는 물에 용해시키고, pH는 HCl로 8.0으로 조정했다. 이 HSA 용액에 500배 과량의 PEHA를 첨가하고, 그 다음 80배 과량의 EDC를 교반 하에 첨가했다. 반응은 실온에서 4hr 동안 진행시켰다. 산물은 물에 대해 MW가 10,000인 MicroKros 카트리지에서 접선 유동 정용여과로 정제 및 농축했다. 산물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석으로 측정하고, 산물 중의 PEHA 함량은 PEHA 기반 표준 곡선을 사용하여 TNBS 아민 함량 분석으로 측정했다. PEHA-HSA 비는 미변형 HSA 대비 아민 함량의 과잉량을 기반으로 하여 계산했고, 10.5:1인 것으로 확인되었다. SDS-PAGE 분석 결과, 접합체는 단일 밴드로서 이동한 것으로 나타났고, 이는 HSA-PEHA 산물에 분자간 가교결합의 부족을 시사한다.
G3139는 bcl-2에 대한 18mer 포스포로티오에이트 ASO 이다. AlphaDNA에서 구입한 G3139는 mM HEPES, pH 7.4에 용해시켰다. DOTAP/SPC/TPGS 25:70:5(m/m)를 에탄올에 용해시키고 20mM HEPES에 희석된 HSA-PEHA에, 그 다음 G3139 용액에 첨가하여, 40%의 최종 에탄올 농도 및 1:3:10(wt/wt) 비의 ODN:HSA-PEHA:총 지질을 수득했다. 그 결과, 콜로이드성 복합체가 형성되었고, 이는 LCAN의 전구체였다. 그 다음, 이것을 물로 4x 희석하고, MWCO가 30,000인 MicroKros 카트리지에서 5mM HEPES 완충액(pH 7.4)에 대해 접선 유동 정용여과로 처리했다. 그 다음, 산물에 수크로오스를 첨가했다(10% 최종 농도). LCAN-G3139는 0.2㎛ 필터를 사용하여 멸균 여과하고 -20℃에서 동결 보관했다. 산물은 OliGreen 분석으로 측정 시, G3139 농도가 2mg/ml였다. 산물에서 G3139의 회수율은 67%였다. LCAN의 입자 크기는 NICOMP Particle Sizer Model 370(Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA)에서 분석했다. 부피-가중 가우스 분포 분석은 평균 입자 직경 및 크기 분포를 측정하기 위해 사용했다. 제타 전위(ξ)는 ZetaPALS(Brookhaven Instruments Corp., Worcestershire, NY)에서 측정했다. 모든 측정은 3반복으로 수행했다. 입자 크기는 98±40nm였고, 제타 전위는 +23mV였다.
산물 LCAN-G3139는 KB(사람 암종) 세포에서 bcl-2 억제조절에 대해 분석했다. KB 세포는 형질감염 24h 전에 10% FBS 및 1% 항생제를 함유하는 RPMI 1640(Life Technologies) 배지에서 2x104 세포/㎠의 밀도로 6웰 평판에서 평판배양했다. 배지는 제거하고 RPMI 1640 배양 배지에 G3139 농도가 1μM인 다양한 G3139 ODN 포뮬레이션으로 교체했다. 대조용 LN-G3139는 HSA-PEHA는 첨가하지 않고 LCAN과 같은 방법으로 제조한 DOTAP/SPC/TPGS 25:70:5(m/m)의 조성을 가진 LN 포뮬레이션이었다. 37℃에서 4h 후 형질감염 배지를 제거하고 세포는 PBS로 3회 세척했다. 그 다음, 세포에 갓 제조한 배지를 첨가했다. 형질감염 48h 후 세포를 수거했다. 간략히 설명하면, 총 RNA는 Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출했고, cDNA는 RNA를 랜덤 헥사머 프라이머(Perkin Elmer, Boston, MA)와 항온처리하고, 그 다음 역전사효소(Invitrogen), 반응 완충액, 디티오스레이톨, dNTP 및 RNAsin과 항온처리한 뒤, 써멀 사이클러(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 42℃에서 60분, 94℃에서 5분간 항온처리하여 합성했다. 그 결과 수득되는 cDNA는 다음과 같은 bcl-2 프라이머와 프로브를 사용하여 실시간 PCR(ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems)로 증폭시켰다:
순방향 프라이머 CCCTGTGGATGACTGAGTACCTG[서열번호 1];
역방향 프라이머 CCAGCCTCCGTTATCCTGG[서열번호 2]; 및
프로브 CCGGCACCTGCACACCTGGA[서열번호 3].
또한, 하우스키핑 유전자 ABL mRNA도 동시에 증폭시켰고, Bcl-2 mRNA는 ABL mRNA 수준으로 표준화했다.
결과는 도 7에 제시했다. 이 결과는 LCAN-G3139가 HSA-PEHA를 함유하지 않는 G3139의 일반적인 LN 포뮬레이션인 LN-G3139보다 Bcl-2 억제조절에 훨씬 더 효과적이라는 것을 보여주었다. 이 데이터는 LCAN-G3139가 대부분의 LN보다 우수한 조성물이며, 안티센스 ASO 및 다른 올리고뉴클레오타이드 약물, 예컨대 siRNA, miR 모방체 및 항-miR 올리고를 전달하는데 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 4
본 실시예에는 저분자량 PEI(600)를 사용했다. 대체 저분자량 중합체, 예컨대 펜타에틸렌헥사민(PEHA)도 유사한 기술을 사용하여 접합시킬 수 있다.
HSA-PEI 접합체는 EDC를 사용하여 제조했다. 42mg HSA와 188mg PEI(MW=600)(몰비 HSA:PEI 1:500)를 작은 바이엘에서 pH 8.0으로 조정된 HBS에 총 부피 2.0ml로 배합했다. PEI의 높은 알칼리성으로 인해, PEI 스톡 용액은 혼합 전에 pH 8.0으로 적정했다. EDC는 실온으로 평형화시킨 뒤, 9.60mg EDC(HSA 대비 80배 몰 과량)를 HSA와 PEI의 교반 용액에 천천히 첨가했다. 이 혼합물을 교반 하에 실온에서 1h 동안 반응시켰다. pH는 반응 과정 동안 약 9.0으로 유지시켰다. 산물은 PD-10 컬럼을 통해 통과시켜 미반응 시약을 제거했다. HSA-PEI 접합체의 DNA 축합 효율을 측정하기 위해 겔 이동성 전이 분석을 수행했다.
환원성 링커를 도입시키는 대체 접합 방법에서, HSA-PEI 접합체는 Traut 시약을 사용하여 제조했다. 42mg HSA와 188mg PEI(MW=600)(HSA:PEI 몰비 1:500)를 작은 바이엘에서 pH 8.0으로 조정된 HBS에 총 부피 2.0ml로 배합했다. PEI의 높은 알칼리성으로 인해, PEI 스톡 용액은 혼합 전에 pH 8.0으로 적정했다. 3.5mg Traut 시약(HSA 대비 40배 몰 과량)을 10㎕ DMSO에 용해하고 HSA와 PEI의 교반 용액에 천천히 첨가했다. 이 혼합물을 교반 하에 실온에서 2h 동안 반응시켰다. pH는 반응 과정 동안 8.0으로 유지시켰다. 설프하이드릴의 산화를 초래하는 이황화 가교결합으로 HSA-PEI 접합체가 형성되었다. 미반응 시약을 제거하기 위해, 산물은 PD-10 컬럼을 통해 통과시켜 정제했다. 접합체의 DNA 축합 효율을 측정하기 위해 겔 이동성 전이 분석을 수행했다.
또 다른 합성 방법에 따르면, HSA-PEI 접합체는 SPDP를 사용하여 제조했다. Traut 시약에 의해 활성화된 HSA 42mg 및 SPDP로 활성화된 PEI(MW=600) 188mg(HSA:PEI 몰비 1:500)을 작은 바이엘에서 pH 8.0으로 조정된 HBS에 총 부피 2.0ml로 배합했다. 그 결과, 이황화 결합을 통해 알부민-PEI 접합체가 형성되었다. 겔 이동성 전이 분석은 접합체의 축합 효율을 측정하기 위해 수행했다.
알부민-PEI 접합체는 DTBP를 사용하여 제조했다. HSA 42mg과 PEI(MW=600) 188mg(HSA:PEI 몰비 1:500)를 작은 바이엘에서 pH 8.0으로 조정된 HBS에 총 부피 2.0ml로 배합했다. PEI의 높은 알칼리성으로 인해, PEI 스톡 용액은 혼합 전에 pH 8.0으로 적정했다. 3.9mg DTBP(HSA 대비 20배 몰 과량)를 10㎕ DMSO에 용해하고 HSA와 PEI의 교반 용액에 천천히 첨가했다. 이 혼합물을 교반 하에 실온에서 밤새 반응시켰다. pH는 반응 과정 동안 8.0으로 유지시켰고, 미반응 시약을 제거하기 위해, 산물은 PD-10 컬럼을 통해 통과시켰다. 접합체의 축합 효율을 측정하기 위해 겔 이동성 전이 분석을 수행했다.
실시예 5
HSA-PEI 접합체를 함유하는 LN을 제조했다. 다양한 w/w 비의 HSA-PEI(0, 0.5, 1, 3, 6:1, HSA:ODN w/w)를 ODN LOR-2501(0.2μM)(Alpha DNA에서 구입)과 배합하여 겔 이동성 전이 분석을 통해 최적의 지연(retardation) 비율을 찾아냈다. 지연은 3:1(HSA:ODN w/w)에서 나타났다(도 1). 100% 에탄올에 용해된 DDAB, CHOL 및 TPGS 지질 스톡은 60:35:5의 몰비로 배합했다. 에탄올 중의 지질 혼합물 100㎕를 900㎕ 1X PBS 완충액에 첨가하여 10% 에탄올에 빈 LN이 형성되도록 했다. 그 다음, 빈 LN과 HSA-PEI/ODN 복합체를 배합시켜 LCAN을 형성시켰다. 이 포뮬레이션을 순간 볼텍싱하고 KB 세포에 형질감염하기 전에 실온에서 15분 동안 방치했다. 제타 전위 분석은 LN:HSA:ODN = 10:1, 2, 3:1 비로 HSA-PEI 및 ODN LOR-2501(Alpha DNA에서 구입)을 함유하는 LCAN에서 완수했다. 사용된 ODN의 농도는 0.2μM이었다(도 2). HSA-PEI를 함유하는 모든 LCAN은 5 내지 25mV 범위의 양전하를 나타냈다. HSA-PEI가 없는 LCAN은 중성의 전하를 나타냈다. 도 3은 LCAN에서 LOR-2501에 의한 RNR R1 mRNA 발현의 억제조절을 보여준다.
37℃, 5% CO2 대기 하에 RPMI 1640 배지에서 증식시킨 KB 세포는 형질감염 24h 전에 6웰 평판에서 3.0x105 세포/웰의 밀도로 평판배양했다. 세포는 약 80% 융합성으로 증식시켰고, 혈청 함유 배지는 제거했다. 세포는 1000㎕ 형질감염 배지로 형질감염시키고 4h 동안 처리했다. 형질감염은 0% 및 10% 혈청-함유 RPMI 1640 배지의 존재 하에 나타났다. 실험은 3반복으로 수행했다. 처리가 완료된 후, 세포는 1X PBS로 세척하고, 혈청-함유 RPMI 1640을 복원시켰다. 처리가 끝난 지 48시간 후, 세포는 하우스키핑 유전자로서 액틴을 이용한 RT-PCR로 RNR R1 발현 수준에 대해 분석했다. 결과는 도 2에 제시했다. 무혈청 조건 하에, 1:3 ODN:HSA LCAN 포뮬레이션은 최대의 형질감염 효능을 나타냈다. 이와 반대로, 10% 혈청에서는 1:1 ODN:HSA LCAN 포뮬레이션이 가장 효능적이었다. 처리 48h 후 세포 생육성은 MTT 분석으로 평가했다(도 4). PEHA 대 알부민의 접합을 수반하는 유사 실험을 완수했고 형질감염 활성은 유사했다(도 7 및 도 8).
실시예 6
항-miR-221을 CAL-51 유방암 세포로 전달하기 위한 LCAN을 연구했다.
LCAN(HSA-PEI 기반 APC를 사용하여)은 전술한 바와 같이 제조했다. CAL-51(삼중 음성 유방암) 세포는 형질감염 24h 전에 6웰 평판에서 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS가 보충된 DMEM/F12 배지에서 2x104 세포/㎠의 밀도로 평판배양했다. LCAN은 항-miR-221(100nM)과 배합하여 miR-221의 하류 표적들인 p27/Kip1 및 에스트로겐 수용체 알파(ERα)를 상승조절하는 능력을 평가했다. CAL-52 세포는 20% 혈청의 존재 하에 형질감염시켰다. 처리는 4h 동안 진행했고, 그 후 형질감염 배지를 제거하고, 새 배지(10% FBS 보충)로 교체했다. 다시 RT-PCR을 개시하기 전에 추가 44h 동안 세포를 증식시켰다. 세포 유래의 RNA는 TRIzol Reagent(Life Technologies)로 추출했고, cDNA는 SuperScript? III First-Strand Synthesis System(Life Technologies)으로 제조자의 지시에 따라 제조했다. 그 다음, RT-PCR은 SYBR green(Life Technologies) 및 p27/kip1(Alpha DNA) 및 ERα용 프라이머를 사용하여 수행했다:
순방향: 5'-CGGAGCACGGGGACGGGTATC-3'[서열번호 4],
역방향: 5'-AAGACGAAGGGGAAGACGCACATC-3'[서열번호 5].
β-액틴은 대조군으로 사용했다. 도 10 및 도 11에서 입증되듯이, LCAN/항-miR-221은 p27/Kip1 발현을 적당히 증가시켰고, ERα 발현은 약간 증가시켰다.
실시예 7
HSA-PEHA 접합체는 비교적 큰 스케일로 합성했다. 합성 동안 HSA:PEHA:EDC 몰비는 1:1500:200(mol/mol)으로 사용했다. 5g PEHA(MW 232.37, 기술적 등급)를 80ml ddH2O에 용해시키고, 그 다음 1M HCl을 사용하여 pH 8.0으로 조정했다. 1g(4ml)의 HSA(25, Octapharma) 및 그 다음 562.5mg의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(EDC, DMSO에 용해됨]를 교반 하에 PEHA 용액에 첨가했다. 이 반응은 실온에서 3h 동안 지속했다. 그 다음, 혼합물을 MWCO 10,000 Spectrum 막을 사용하여 ddH2O에 대해 4℃에서 투석했다. 완충액은 투석 사이클의 마지막 3h 시점에 외부 완충액 중의 표준 닌하이드린 또는 TNBS 아민 분석에 의해 PEHA 유래의 아민이 검출할 수 없게 될 때까지 3 내지 4h 마다 교체했다. 추가 증량 합성 시, 투석 절차는 예컨대 Millipore Pellicon cassett system 또는 Spectroper hollowfiber system을 사용하여 접선 유동 정용여과로 교체할 수 있다. 이 방법은 또한 원하는 농도로 산물을 농축시키는데 사용할 수도 있다. 산물은 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 통과시켜 멸균 용기에 담아 4℃에서 보관했다. 장기간 보관하기 위해서는, 산물은 -20℃에서 보관할 수 있다. 산물은 또한 동결건조할 수 있다.
산물 단백질 농도는 BCA 단백질 분석으로 측정했다. HSA-PEHA 접합체의 아민 함량은 HSA 대비 분자량의 변화를 기초로 하여 TNBS 분석 또는 MALDI-TOF MS로 측정했다. 아민 TNBS 분석과 조합된 겔 투과 크로마토그래피는 산물에 유리 PEHA의 부재 및 가교된 HSA의 결여를 입증하는데 사용했다. 사용된 시약의 비용이 그다지 크지 않기 때문에, 반응 수율은 중요하지 않다. 산물의 순도는 매우 높은 것으로 예상된다. 정확한 산물의 세부사항은 최종 산물에 존재하는 가교된 HSA와 유리 PEHA의 최고 한계와 PEHS 대 HSA 비에 기초하여 정의할 수 있다.
본원에 개시된 포뮬레이션 및 방법의 특정 양태들은 상기 실시예들에 명시했다. 이 실시예들은 본 발명의 특별한 양태들을 나타내지만, 단지 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이 실시예들로부터 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 파악할 수 있고, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 변화 및 수정을 통해 본원에 기술된 조성물 및 방법을 다양한 용법 및 조건에 맞출 수 있다. 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 등가물이 본 발명의 필수적인 범위 안에서 구성요소들을 대체할 수 있다. 또한, 본 발명의 필수적인 범위를 벗어남이 없이 특정 상황 또는 물질을 본 발명의 교시에 맞추기 위해 많은 수정이 이루어질 있다.
<110> THE OHIO STATE UNIVERSITY <120> LIPID-COATED ALBUMIN NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND METHOD OF USING THE SAME <130> 1-55043/OSU-2013-246(2) <150> US 61/650,729 <151> 2012-05-23 <150> US 61/784,892 <151> 2013-03-14 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 ccctgtggat gactgagtac ctg 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 ccagcctccg ttatcctgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic probe <400> 3 ccggcacctg cacacctgga 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 cggagcacgg ggacgggtat c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 aagacgaagg ggaagacgca catc 24

Claims (43)

  1. 적어도 하나의 지질 및 적어도 하나의 알부민-중합체 접합체(APC)를 함유하고, 여기서 중합체가 적어도 하나의 양전하를 띤 중합체를 함유하는 지질 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, APC가 초(hyper)-양이온화된 알부민-다가양이온 접합체를 함유하는 지질 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 제타 전위가 약 0 내지 약 +40 mV인, 지질 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, APC가 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드에 결합할 수 있는 지질 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 양전하를 띤 중합체가 스퍼민(spermine), 디스퍼민, 트리스퍼민, 테트라스퍼민, 올리고스퍼민, 터민(thermine), 스퍼미딘(spermidine), 디스퍼미딘, 트리스퍼미딘, 올리고스퍼미딘, 푸트레신(putrescine), 폴리리신, 폴리아르기닌, 분지형 또는 선형의 폴리에틸렌이민 및 폴리알릴아민으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리아민을 함유하는 지질 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 양전하를 띤 중합체가 폴리에틸렌이민을 함유하는 지질 나노입자.
  7. 제6항에 있어서, 폴리에틸렌이민이 분자량이 50kDa 이하이거나, 또는 분자량이 약 200 내지 약 2000 Da인 지질 나노입자.
  8. 제6항에 있어서, 폴리에틸렌이민이 사람혈청알부민에 접합된, 지질 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 양전하를 띤 중합체가 테트라에틸렌펜타민(TEPA)을 함유하는 지질 나노입자.
  10. 제1항에 있어서, 양전하를 띤 중합체가 2종 이상의 저분자량 중합체의 혼합물을 함유하는 지질 나노입자.
  11. 제1항에 있어서, 알부민이 하나 이상의 가교제를 통해 적어도 하나의 양전하를 띤 중합체에 접합되어 있는, 지질 나노입자.
  12. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 사람혈청알부민(HSA)에 접합된 펜타에틸렌헥사민(PEHA)을 함유하는 지질 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 평균 약 11개의 PEHA 분자가 각 HSA 분자에 결합되어 있는 지질 나노입자.
  14. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질이 양이온성 지질, 중성 지질, PEG화된 지질 및 콜레스테롤 중 하나 이상의 함유하는 지질 나노입자.
  15. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 지질이 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), L-α-포스파티딜콜린(SPC) 및 d-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 1000 석시네이트(TPGS)를 함유하는 지질 나노입자.
  16. 제15항에 있어서, 지질이 DOTAP:SPC:TPGS 25:70:5의 몰비인 지질 나노입자.
  17. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 핵산, 화학치료제 및 이의 배합물 중에서 선택되는 적어도 하나의 분자를 캡슐화하는 지질 나노입자.
  18. 제17항에 있어서, 캡슐화된 분자가 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miR, 항-miR, shRNA, siRNA 및 이의 배합물 중에서 선택되는 핵산을 함유하는 지질 나노입자.
  19. 제17항에 있어서, 캡슐화된 분자가 항신생물제, 항감염제, 국소 마취제, 항알러지제, 항빈혈제, 혈관형성 억제제, 베타-아드레날린 차단제, 칼슘 채널 길항물질, 항-고혈압제, 항우울제, 항경련제, 항균제, 항진균제, 항바이러스제, 항류마티스제, 구충제, 항기생충제, 코르티코스테로이드, 호르몬, 호르몬 길항물질, 면역조절제, 신경전달물질 길항물질, 항당뇨병제, 항-간질약, 지혈제, 항-고혈압제, 항녹내장제, 면역조절성 사이토킨, 진정제, 케모킨, 비타민, 독소, 마약, 조영제 및 이의 배합물 중에서 선택되는 치료제를 함유하는 지질 나노입자.
  20. 제17항에 있어서, 캡슐화된 분자가 핵산 치료제를 함유하는 지질 나노입자.
  21. 제20항에 있어서, 핵산 치료제가 pDNA, siRNA, miRNA, 항-miRNA, ASO 및 이의 배합물 중에서 선택되는 지질 나노입자.
  22. 제20항에 있어서, 핵산 치료제가 NA 염기 단위를 치환시키는 변형에 의해, 포스포디에스테르 링커의 포스포로티오에이트 치환에 의해 및/또는 리보오스 단위의 2'-O-메틸화에 의해 안정화되는 지질 나노입자.
  23. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 직경이 약 300nm 이하인 지질 나노입자.
  24. 제1항에 있어서, 지질 나노입자가 직경이 약 200nm 이하인 지질 나노입자.
  25. 제1항에 있어서, 중합체가 직접 연결을 통해 또는 링커를 통해 지질의 외부 표면에 결합되는, 지질 나노입자.
  26. 제16항에 있어서, 지질 나노입자가 분자의 캡슐화 효율이 적어도 약 40% 또는 그 이상인 지질 나노입자.
  27. 제1항에 있어서, 추가로 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질을 함유하는 지질 나노입자.
  28. 제27항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질이 폴리소르베이트 80, TPGS 및 mPEG-DSPE 중 하나 이상을 함유하는 지질 나노입자.
  29. 제27항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜-접합된 지질이 약 15.0 몰% 미만의 농도로 존재하는 지질 나노입자.
  30. 제1항에 있어서, 추가로 표적 세포 또는 세포 표면 상의 표적 분자에 결합할 수 있는 리간드를 함유하는 지질 나노입자.
  31. 제30항에 있어서, 리간드가 항체 또는 항체 단편인 지질 나노입자.
  32. 제30항에 있어서, 리간드가 cRGD, 갈락토오스-함유 모이어티, 트란스페린, 엽산염, 저밀도 지단백질 또는 표피성장인자 중에서 선택되는 지질 나노입자.
  33. 제1항에 기재된 지질 나노입자 및 약학적 허용성 부형제를 함유하는 약학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 약학적 조성물이 경구, 정맥내, 복강내, 피하 또는 경피적으로 투여되는 약학적 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 약학적 조성물이 경구 투여용 정제, 흡입제 또는 좌약으로 제조되는 약학적 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 약학적 조성물이 멸균 용액, 멸균 현탁액 또는 동결건조 분말로서 제조되는 약학적 조성물.
  37. 사람혈청알부민-펜타에틸렌헥사민(HSA-PEHA) 접합체에 적어도 하나의 지질을 첨가하여 혼합물을 형성시키는 단계;
    이 혼합물에 적어도 하나의 치료 분자를 첨가하는 단계; 및
    이 혼합물을 투석 또는 정용여과 단계로 처리하여 지질 나노입자를 제조하는 단계를 포함하여, 지질 나노입자를 제조하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 적어도 하나의 지질이 DOTAP, SPC 및 TPGS를 25:70:5의 비로 함유하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 치료 분자가 pDNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miR, 항-miR, shRNA, siRNA 또는 이의 배합물 중에서 선택되는 방법.
  40. 제39항에 기재된 방법으로 제조된 산물.
  41. 제33항에 기재된 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 것을 포함하여, 질환을 치료하는 방법.
  42. a. 적어도 하나의 지질; 및
    b. 중합체에 접합된 거대분자를 함유하고;
    c. 이때 거대분자가 핵산을 캡슐화하는, 전달 시스템.
  43. a. 중합체에 접합된 알부민을 함유하는 지질 나노입자 내에 핵산을 캡슐화하는 단계;
    b. 지질 나노입자를 핵산 포뮬레이션 내에 혼입시키는 단계; 및
    c. 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 지질 나노입자를 사용하는 방법.
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