JP5336500B2 - 核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子、その製造方法、及びこれを用いた核酸の伝達方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子、その製造方法、及びこれを用いた核酸の伝達方法に関し、より詳細には、天然低密度リポタンパク質の構成成分を模倣して表面改質及び／または再構成することにより、トランスフェクション効率及び安定性が向上した核酸伝達用低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子、その製造方法、及びこれを用いて核酸を伝達する方法に関する。

ＲＮＡ干渉現象の調節因子である、長さ２１−２５ｂｐの二本鎖合成小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖が哺乳動物の細胞に含まれているターゲットメッセンジャーＲＮＡの分割を触発して特異遺伝子の発現を抑制することができるという事実が立証されて以来（Ａ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｉｎ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（１９９９）９５０−２．；Ｓ．Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｊ．Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｗ．Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ａ．Ｙａｌｃｉｎ，Ｋ．Ｗｅｂｅｒ，Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ．Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ Ｎａｔｕｒｅ ４１１（２００１）４９４−８．）、ｍＲＮＡレベルで対象遺伝子を選択的に機能抑制（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）するｓｉＲＮＡの機能により、遺伝子治療法による先天的あるいは後天的疾患の治療に関連して前記ｓｉＲＮＡに対する関心が高まっている。

ｓｉＲＮＡは遺伝子治療法において有望な薬品候補ではあるが、細胞内及び細胞外の障壁が実際の治療に制約となる。陰電荷を持つｓｉＲＮＡは低トランスフェクション効能により細胞面または細胞膜の断面に結合することができないため、細胞吸収率の低下を招く。また、主な細胞外的障害は血清核酸分解酵素による化学分解性であるため、ｓｉＲＮＡの血液内不安定性は特に静脈内投与において問題となる。

このような障害を克服するために、陽イオン性脂質系トランスフェクション剤（Ｄｅ Ｐａｕｌａ Ｄ，Ｂｅｎｔｌｅｙ ＭＶ，Ｍａｈａｔｏ ＲＩ．Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＲＮＡ．１３（２００７）４３１−５６．）及び／またはポリ陽イオン系担体（ＤＪ．Ｇａｒｙ，Ｎ．Ｐｕｒｉ，ＹＹ．Ｗｏｎ，Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７ Ｍａｙ ２６，［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］）が電荷相補性による錯体形成によるｓｉＲＮＡ伝達に用いられた。

特に、ポリ陽イオン性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、血清核酸分解酵素を防ぐためのポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）形成に広く用いられるものであって、血漿膜に結合して細胞異物吸収（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅ）の対象となることができる。

しかしながら、ＰＥＩは、細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）または細胞自殺死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によって多数の細胞株で細胞死滅を触発し、この細胞毒性は分子量が大きくなるほど及び／または分岐度（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｄｅｇｒｅｅ）が大きくなるほど増加することが明らかになった。

低分子量のＰＥＩまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−グラフトＰＥＩ共重合体は細胞毒性が低いと示されたが、陽イオン高分子のアミン密度が低く錯体凝縮が少ないことにより、これらの細胞内のトランスフェクションは活発でなく、したがって培地内の酵素（加水分解）反応及びｓｉＲＮＡの不安定性が増加した。

ＰＥＧ共役化されたｓｉＲＮＡ及びＰＥＩ（分子量２５Ｋ）ポリ電解質錯体（ＰＥＣ）ミセルは、ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ錯体よりも酵素攻撃に対する安定性が大きいだけでなく、遺伝子サイレンシング効果もはるかに優れていることが立証されたという事実に注目すべきである。

天然資源に由来する非合成担体は、その細胞毒性を弱めることができると同時に、生体適合性及び生分解性を改善することができるため、ｓｉＲＮＡの伝達に好ましい。天然系担体の実現例のうちの１つは、免疫反応を触発せずかつ細網内皮体系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）により認識されない低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の脂質部分を用いることである。前記ＬＤＬは通常、脂質及びタンパク質の移動、具体的にはその系統的循環を通じての肝外部組織へのコレステロール伝達に関与する。

実際に、シクロスポリンＡ及びアンフォテリシンＢ脂質錯体（ＡＢＬＣ）のような非親水性薬品は、前臨床（ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）または臨床（ｃｌｉｎｉｃａｌ）治療時にＬＤＬ粒子と結合することによって効果的に伝達された。また、ＬＤＬは、ステアリル−ポリ（Ｌ−リシン）（ステアリル−ＰＬＬ）、いわゆるＴｅｒｐｌｅｘＤＮＡ体系と結合することによって遺伝子伝達に用いられた（ＤＧ．Ａｆｆｌｅｃｋ，Ｌ．Ｙｕ，ＤＡ．Ｂｕｌｌ，ＳＨ．Ｂａｉｌｅｙ，ＳＷ．Ｋｉｍ，Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ Ｔｅｒｐｌｅｘ ＤＮＡ：ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（５）（２００１）３４９−５３．）。前記形成において、陰電荷ＤＮＡと相互反応したＰＬＬ成分及びステアリル基は、ＬＤＬと疎水性相互反応を起こす。

一方、血液から天然ＬＤＬを分離する方法は極めて複雑かつ多くの時間を必要とするため、ＬＤＬ模倣モデルである再構成ＬＤＬ−類似マイクロエマルション（ＬＤＥ）が、アポリポタンパク質が含まれていないコレステロールエステル及びリン脂質から開発された。動物研究及び臨床治療において、ＬＤＥは血流中に注入されたとき天然ＬＤＬのように作用することが確認された（ＲＣ．Ｍａｒａｎｈａｏ，Ｂ．Ｇａｒｉｃｏｃｈｅａ，ＥＬ．Ｓｉｌｖａ，Ｐ．Ｄｏｒｌｈｉａｃ−Ｌｌａｃｅｒ，ＳＭ．Ｃａｄｅｎａ，ＩＪ．Ｃｏｅｌｈｏ，ＪＣ．Ｍｅｎｅｇｈｅｔｔｉ，ＦＪ．Ｐｉｌｅｇｇｉ，ＤＡ．Ｃｈａｍｏｎｅ．Ｐｌａｓｍａ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４（１７）（１９９４）４６６０−６．）。

しかしながら、ｓｉＲＮＡｓなどのような核酸に基づいた方法を実用化するためには、トランスフェクション効率及び／または安定性が低いという従来の問題点を解決するための新しい技術及び／または戦略が切に求められている。

本発明は、このような従来技術の問題点を解決するためのものであって、天然低密度リポタンパク質の構成成分を模倣して表面改質及び／または再構成することにより、トランスフェクション効率及び安定性が向上した核酸伝達用低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記トランスフェクション効率及び安定性が向上した核酸伝達用低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子の製造方法を提供することを他の目的とする。

さらに、本発明は、前記トランスフェクション効率及び安定性が向上した核酸伝達用低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子を用いて核酸を伝達する方法を提供することをさらに他の目的とする。

本発明は、このような目的を達成するための手段であって、本発明の第１の態様は、コレステリルエステル及びトリグリセリドを含有するコア脂質部と、前記コア脂質部の上層面に疎水性相互反応によって結合されており、コレステロール、リン脂質、及び陽イオン性脂質を含有する陽イオン性の表面脂質部とを含む核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子を提供する。

また、本発明は、核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子を製造する方法を提供する。

さらに、本発明は、前記低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子を用いて標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）に核酸を伝達する方法を提供する。

本発明に係る核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子は、天然低密度リポタンパク質の構成成分を模倣して表面改質及び再構成した陽イオン性ナノ粒子であって、トランスフェクション効率及び安定性が高く、核酸、特にｓｉＲＮＡを標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）に効率的に伝達することができる。

陽イオン性脂質マイクロエマルション（ＣＬＭ）の製造のための低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌの脂質部分の配列に関する概略図であって、陽電荷ＣＬＭ表面及び陰電荷ｓｉＲＮＡの間の静電気相互作用によるｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の形成化過程も示した。 透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観測したＣＬＭの映像を示すものであって、スケールバーは５００ｎｍである。 透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観測したＣＬＭの映像を示すものであって、スケールバーは２００ｎｍである。 １０％血清の存在下でＭＤＡＭＢ４３５細胞における遺伝子担体の細胞毒性分析の結果を示すものであって、黒い四角形及び白い三角形はそれぞれＰＥＩ２５Ｋ及びＣＬＭを示す。 ｓｉＲＮＡ／ＣＬＭ錯体の特性を示すものであって、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の大きさ及びゼータ電位値の測定結果はＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの重量比と関数的関係にある。 ｓｉＲＮＡ／ＣＬＭ錯体の特性を示すものであって、ゲル遅延分析の結果はＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの重量比と関数的関係にある。Ｂパネルにおいて、重量比Ｍ及び０はマーカー及び対照群ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧそれぞれに対応し、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの錯体化完了時の重量比は矢印で示す。 １０％血清含有のＲＰＭ−１培地１６４０内のｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の大きさの測定値を示す。 ２時間培養後のＰＣ−３細胞内のｃｙ３ラベル化されたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の流速細胞分析の結果を示す。 遺伝子発現抑制とｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のトランスフェクションによるＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの重量比が関数関係にあることを示す。 遺伝子発現抑制とｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のトランスフェクションによるＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの重量比が関数関係にあることを示す。

本発明の第１の態様は、コレステリルエステル及びトリグリセリドを含有するコア脂質部と、前記コア脂質部の上層面に疎水性相互反応によって結合されており、コレステロール、リン脂質、及び陽イオン性脂質を含有する陽イオン性の表面脂質部とを含む核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子に関する。

本発明のコレステリルエステルは、コレステロールに炭素数１０〜２４の飽和または不飽和脂肪酸がエステル結合されたものを意味する。好ましくは、オレイン酸のような炭素数１６〜１８の不飽和脂肪酸のエステルである。本発明のナノ粒子は、単一または複数の種類のコレステリルエステルを含むことができる。

本発明のトリグリセリドは、多様な脂肪酸の組成を有する精製トリグリセリド、または複数の脂肪酸で構成されたトリグリセリドを主成分とする植物油であってもよい。好ましくは、上記トリグリセリドは動物性または植物性油（ｏｉｌ）であってもよく、植物性油は大豆油、オリーブ油、綿実油、ゴマ油、肝油などを含む。前記油は単独または２種類以上を混合して用いることができる。

本発明のコレステリルエステル及びトリグリセリドは、疎水性結合によって本発明の低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子のコア脂質部を形成する。

本発明のリン脂質は、本発明がナノ粒子を形成することができるいかなる種類の中性、陽イオン性、陰イオン性であることができ、単一または複数の種類のリン脂質の混合物であることができる。前記リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、これらのｌｙｓｏ形態、炭素数６〜２４の脂肪族鎖を有する完全に飽和されたまたは部分硬化された形態であることができる。本発明のリン脂質は特に限定されるわけではないが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、エッグホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）からなる群から１つ以上選択される。

本発明のリン脂質及びコレステロールは遺伝子トランスフェクション効率を向上させ、組み合わせられた陽イオン性脂質の細胞毒性を減少させるヘルパー脂質の役割を果たす。リン脂質は、前記ナノ粒子の陽イオン性脂質とエンドソーム膜の融合を促進し、エンドソーム小胞膜を不安定化する。また、コレステロールは、脂質充填に形態的側面において堅固性を付与することにより、ヘルパーの活性と共に本発明のナノ粒子の安定性も向上させる。

本発明の陽イオン性脂質は、生理学的ｐＨのように特定のｐＨで実質的に陽電荷を帯びる陽イオン性脂質を含む。本発明の一実施形態において、前記陽イオン性脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ′−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、Ｎ−（Ｎ′−アミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）、Ｎ−（Ｎ′−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキシアミド）エチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム−リフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オク−タデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５′−（コレスタ−５−エン−３．ベータ．−オキシ）−３′−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９′、１２′−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ′−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、及び１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）からなる群から１つ以上選択される。

特に、ＤＣ−Ｃｈｏｌは、その他の陽イオン性脂質よりもその毒性が弱く、ＤＣ−Ｃｈｏｌ系列の遺伝子担体が黒色腫、嚢胞性繊維腫、子宮頸部癌、乳癌、及び卵巣癌などの多様な疾患の臨床治療に使用承認を受けた。したがって、本発明にＤＣ−Ｃｈｏｌが用いられることが好ましい。

本発明の一好ましい実施形態は、コレステリルエステル、及びトリグリセリドを含有するコア脂質部と、前記コア脂質部の上層面に疎水性相互反応によって結合されており、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］−コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）を含有する陽イオン性の表面脂質部とを含む核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子に関する。

前記陽イオン性脂質は、本発明の核酸と静電気相互作用によって結合することにより、核酸／脂質錯体を形成することができる。

本発明のナノ粒子は、低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子である。天然ＬＤＬは２つの脂質相、すなわち極性構成分（リン脂質及びアポリポタンパク質）及びコレステロールエステルとトリグリセリドで予め構成された非極性中性脂質からなり、組成及び物理化学的特性は表１のとおりである。リン脂質及びアポリポタンパク質は非極性脂質を乳化させて表面の安定性を提供することにより、安定した生物学的マイクロエマルションを形成することができる。

本発明に係る前記核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子は、コレステリルエステル３０〜６０重量％、トリグリセリド０．１〜１０重量％、コレステロール５〜２０重量％、リン脂質５〜３０重量％、及び陽イオン性脂質１０〜５０重量％を含むことを特徴とする。好ましくは、コレステリルエステル４０〜５０重量％、トリグリセリド１〜５重量％、コレステロール８〜１２重量％、リン脂質１２〜１６重量％、及び陽イオン性脂質２５〜３０重量％を含有することを特徴とする。

また、本発明のコア脂質部と表面脂質部の重量比は、ナノ粒子キャリアの重量を基準として３０：７０〜７０：３０、好ましくは４０：６０〜６０：４０、より好ましくは４５：５５〜５５：４５である。

本発明の一実施形態において、ＣＬＭでリン脂質：コレステロール：陽イオン性脂質の間のモル比は９．４：１３：２６であり、陽イオン性脂質／ヘルパー脂質のモル比は実質的に等モル比を提供する値である１．１６であることができる。

本発明の低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子は、核酸運搬用として用いることができる。

本発明の核酸は、小干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ジオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、相補性ジオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、アプタマー、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、運搬リボ核酸（ｔＲＮＡ）、及びアンチセンスオリゴジオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）からなる群から選択されるが、これに限定されるわけではない。

例えば、本明細中でｓｉＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、あるいは単一鎖ＲＮＡ内部で二重鎖の形態を帯びる単一鎖ＲＮＡを意味する。二重鎖の間の結合はヌクレオチド間の水素結合によってなされ、二重鎖内部のすべてのヌクレオチドが相補的に完全に結合しなければならないものではない。ｓｉＲＮＡの長さは１５〜６０、１５〜５０、または１５〜４０（二重鎖ＲＮＡの一側のヌクレオチドの個数、すなわち塩基対の個数を意味し、単一鎖ＲＮＡである場合には単一鎖ＲＮＡ内部の二重鎖の長さを意味する）ヌクレオチドであり、通常１５〜３０、１５〜２５または１６〜２５のヌクレオチド、好ましくは１９〜２５、２１〜２５、または２１〜２３のヌクレオチドのｓｉＲＮＡを含む。また、ｓｉＲＮＡは、血中安定性を向上させたり免疫反応を弱化させるなどの目的のために、様々な官能基を導入したヌクレオチドを含むことができる。

したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、典型的なｓｉＲＮＡを修飾した形態または非修飾の形態であることができる。例えば、ｓｉＲＮＡの一側末端がポリエチレングリコールによって修飾されることができる。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は親水性、柔軟性、及び非イオン性高分子であるために単核食細胞系（ＭＰＳ）が認識しないように粒子の表面を改質させ、担体に対して長期循環性を付与する最も一般的な材料の１つである。（Ｘｉｎｇ Ｘ，Ｙｕｊｉａｏ Ｃｈａｎｇ Ｊ，Ｈｕｎｇ Ｍ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．３０（１−３）（１９９８）２１９−２２７．；Ｓ．Ｍａｏ，Ｍ．Ｎｅｕ，Ｏ．Ｇｅｒｍｅｒｓｈａｕｓ，Ｏ．Ｍｅｒｋｅｌ，Ｊ．Ｓｉｔｔｅｒｂｅｒｇ，Ｕ．Ｂａｋｏｗｓｋｙ，Ｔ．Ｋｉｓｓｅｌ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）−ｇｒａｆｔ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ／ｓｉＲＮＡ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．１７（５）（２００６）１２０９−１８．）。

本発明の一実施形態において、ＰＥＧの分子量が５０００ダルトンである場合、ＲＮａｓｅ消化に対してｓｉＲＮＡを十分に保護すると同時に、ｓｉＲＮＡの効果的なトランスフェクション性能を維持し続けることができる。

本発明において、陽イオン性脂質と核酸のＮ／Ｐ比率は約０．１〜１２８、好ましくは０．５〜３２、より好ましくは１〜１６である。本発明の一実施形態において、陽イオン性脂質と核酸の重量比は１．４〜３２、好ましくは２．８〜１６．８である。

本発明の低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子は、単一または複数の種類のアポタンパク質を含むことができる。前記アポタンパク質は、天然リポタンパク質から抽出したり、タンパク質の組み替えにより生産することができる。前記アポタンパク質の好ましい例としては、Ｂ−１００、ａｐｏＥなどが挙げられる。前記アポタンパク質は、本発明のナノ粒子の効率的かつ特異な方式での細胞内への導入を可能にする。

本発明の第２の態様は、本発明の核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子を製造する方法を提供する。この製造方法における各成分の種類及び含有量は、上述したものと同じである。

本発明の一実施形態において、
（ａ）コレステリルエステル、トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、及び陽イオン性脂質を有機溶媒に溶解する段階；
（ｂ）前記溶解液から有機溶媒を除去して脂質膜を形成する段階；
（ｃ）前記脂質膜に水溶液を加えて水和させる段階；
とを含む核酸伝達用低密度リポタンパク質類似陽イオン性ナノ粒子を製造する方法を提供する。

前記（ａ）段階の有機溶媒は、クロロホルム、メタノール、及びシクロヘキサンから構成された群から選択された１種以上であること特徴とし、例えば、クロロホルム、メタノール単独、または前記クロロホルムとメタノールを一定の比率で混合した有機溶媒を用いることができるが、これに限定されるわけではない。

前記（ｂ）段階の有機溶媒の除去は、コレステリルエステルの融点以上の温度で実行することを特徴とし、コレステリルオレートを用いる場合、５２〜６０℃の温度が好ましい。

本発明の他の一実施形態において、
（ａ′）コレステリルエステル、トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、及び陽イオン性脂質を溶解する段階；
（ｂ′）前記溶解液に水を添加して混合する段階；
（ｃ′）前記混合液を撹拌し、均一溶液を作成する段階；
とを含む核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子の製造方法を提供する。

前記（ａ′）段階において、脂質成分は、加熱したり前記（ａ）段階で説明した有機溶媒を用いて溶解することができる。有機溶媒を用いて溶解する場合には、（ｄ′）前記均質液内の有機溶媒を除去する段階をさらに含む。有機溶媒の除去は、コレステリルエステルの融点以上の温度で実行することを特徴とし、コレステリルオレートを用いる場合、５２〜６０℃の温度が好ましい。

前記（ｂ′）段階において、水は３〜７倍（ｖ／ｖ）を添加することができる。

前記（ｃ′）段階の均質化は、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、高圧均質化（ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、または膜流動化剤（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）などの公知の方法を用いて粒子を均一化することができる。超音波処理する場合には１〜５分間実行することを特徴とし、１２５Ｗの条件で実行することが好ましいが、これに限定されるわけではない。

本発明の別の実施形態において、前記核酸伝達用低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子は、変形溶媒乳化法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって製造されることができる。

本発明の第３の態様は、前記低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子を用いて標的細胞に核酸を伝達する方法に関する。

本発明の一実施形態において、（１）核酸と前記低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子の錯体を形成する段階と、（２）前記錯体を標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）にトランスフェクションさせる段階とを含むことを特徴とする。

前記（１）段階の錯体は、例えば、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；以下、「ＰＢＳ」とする）または脱塩水内で核酸の存在下に前記低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子を培養して形成されることを特徴とし、前記ＰＢＳはｐＨ７．０〜８．０であり、０．８％のＮａＣｌを含有することが好ましいが、これに限定されるわけではない。

本発明に係る前記方法は、前記（１）段階の後に、前記核酸−ＰＥＧ共役物と前記低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子の錯体のゲル遅延処理をさらに含むことを特徴とするが、前記ゲル遅延処理を行う理由は、陰電荷を帯びる小干渉リボ核酸と陽電荷を帯びるナノ粒子表面の間の静電気反応により、これらが安定した錯体を形成するかを確認するためである。

本発明の一実施形態において、核酸をＰＥＧで修飾する場合には、段階（１）に先立って（１′）核酸−ＰＥＧ共役物を形成する段階をさらに含むことができる。

具体的には、前記（１′）段階の共役物は、核酸とＰＥＧの間の二硫化結合を用いて得ることができ、より好ましくは、核酸は、３′−ヘキシルアミン作用基を有するものが用いられる。ＰＢＳ（ｐＨ７．５）上で過量のＳＰＤＰ（Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）は、３′−ヘキシルアミン小干渉リボ核酸と反応して核酸を活性化させる。反応せずに残った過剰のＳＰＤＰは、脱塩コラム（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて除去される。ＳＰＤＰで活性化された小干渉リボ核酸は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量：５０００）−ＳＨと過剰に反応して二硫化結合を形成してＰＥＧに接合される。反応せずに残った過剰のＰＥＧ−ＳＨは透析（ＭＷＣＯ＝１００００）によって除去し、二硫化結合によってＰＥＧが接合された小干渉リボ核酸を精製することができる。

例えば、ｓｉＲＮＡは、好ましい遺伝子発現機能抑制力によって遺伝子治療に用いることができる強力な手段ではあるが、安定性及びトランスフェクション効果に関連した問題により、実際の応用には制約がある。

本発明に係る陽イオン性ナノ粒子（ＣＬＭ）は、血清含有培地内での静電気相互作用によって核酸と安定した錯体を形成し、核酸と結合した前記ＣＬＭは非常に低い細胞毒性及び効果的な細胞吸収性を有するため、核酸を伝達するのに効果的である。

または、血漿アポリポタンパク質は、血液に対する高親和力のためにＣＬＭの表面に吸着して天然アポリポタンパク質含有脂質タンパク質を模倣することができる。したがって、天然脂質タンパク質の作用によってＣＬＭが生体内で生成されるものと推測される。

以下、本発明の内容を実施例及び実験例によって具体的に説明する。しかしながら、これらは本発明をより詳細に説明するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれらによって限定されるわけではない。

以下の実施例及び実験例で用いられたコレステリルオレート、グリセリルトリオレート（トリグリセリド）、エステル化されていないコレステロールはそれぞれＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社で購入した。

Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］−コレステロールヒドロクロライドはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社の製品である。

また、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ及びＧＦＰ ｓｉＲＮＡはＢｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ．（大田、大韓民国）社で購入した。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡのセンス鎖として５′−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵｄＴｄＴ−３′、アンチセンス鎖として５′−ＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣｄＴｄＴ−３′とし、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡのセンス鎖として５′−ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣｄＴｄＴ−３、ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖として５′−ＧＡＵＣＵＣＡＵＣＡＧＧＧＵＡＣＵＣＣｄＴｄＴ−３′とした。

Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルフヒドリル基によって誘導体化されたメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ−ＳＨ、分子量５０００）はＰｉｅｒｃｅ社（Ｌｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及びＮｅｃｔａｒ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）でそれぞれ購入した。

一方、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１（ＲＰＭ−１）培地１６４０、及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で購入した。その他のすべての化学薬品及び試薬は分析用途として用いた。

実施例１（陽イオン性脂質マイクロエマルションの調製）
陽イオン性脂質マイクロエマルション（ＣＬＭ）を変形溶媒乳化法で調製した。すなわち、２２．５ｍｇ（４５重量％）のコレステリルオレート、１．５ｍｇ（３重量％）のグリセリルトリオレート、７ｍｇ（１４重量％）のＤＯＰＥ、５ｍｇ（１０重量％）のエステル化されていないコレステロール、及び１４ｍｇ（２８重量％）のＤＣ−コレステロールをガラス瓶内の２ｍＬのクロロホルム：メタノール（２：１）溶液に溶解した。ＣＬＭでＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＣ−Ｃｈｏｌの間のモル比は９．４：１３：２６であり、陽イオン性脂質／ヘルパー脂質のモル比は有効組成物に対してほぼ等モル比を提供する値である１．１６であった。

１０ｍＬの蒸溜水を前記瓶に添加して十分にかき混ぜた。前記懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ超音波処理機４５０（２０ｋＨｚ、デューティ周期＝４０、出力制御＝３．５）で３分間超音波処理した。

前記マイクロエマルションを回転式蒸発器に移し、溶媒はコレステリルオレートの融点である５２−６０℃の温度で除去し、前記調製されたマイクロエマルションを４℃で保管した。

実施例２（ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの合成）
前記ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧは二硫化物結合を用いて共役処理した。すなわち、感知ストランド（２０ｎｍｏｌのＶＥＧＦまたはＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）の３′にあるヘキシルアミン基によって改質された３００μｇのｓｉＲＮＡをＰＢＳ（ｐＨ７．５）に溶解した。

続いて、ＤＭＳＯに溶解した２０μＬ（４００ｎｍｏｌ）のＳＰＤＰ原液（２０ｍＭ）を前記ｓｉＲＮＡ溶液に添加した。室温で３時間反応させた後、ゲル透過クロマトグラフィ（Ｄ−ＳａｌｔＴＭデキストラン脱塩コラム，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｌｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって過量のＳＰＤＰを除去し、ｓｉＲＮＡ−ＳＰＤＰを精製した。

ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に溶解した４μｍｏｌのｍＰＥＧ−ＳＨを精製した前記ｓｉＲＮＡ−ＳＰＤＰ溶液に添加し、室温で３日間反応させた。未反応のＰＥＧを脱塩水に対する透析処理（ＭＷＣＯ１０、０００）によって分離し、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ共役物は高速真空濃縮器で濃縮した。

純度と濃度は２６０及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を用いて測定した。精製されたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ共役化物を−８０℃で保管した。

実施例３（錯体の形成）
ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡの重量比がそれぞれ０、１．４、２．８、４．２、５．６、及び８．４となるようにｓｉＲＮＡ−ＰＥＧを取り、室温で１５分間ＰＢＳ（ｐＨ７．４及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）または脱塩水内でＣＬＭを培養した。生成された錯体に対してゲル遅延化、大きさ、及びゼータ電位を測定した。

実施例４（ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／陽イオン性マイクロエマルション錯体に対するゲル遅延処理）
ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体（２０μＬ）を上述したように相違した重量比で形成した後、２μＬの積荷染料（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）と混合した（１０×）。２２μＬの懸濁液全体をトリス−アセテート（ＴＡＥ）展開緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と共に２％のアガロースゲル上の電気泳動分解用ウェルに積荷した後、１００Ｖで１５分間陰極から陽極に移動させた。

得られたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧはエチジウムブロマイド染色で可視化し、ＵＶでゲル映像を得た。

実施例５（ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のトランスフェクション）
細胞培養はＰＣ３（ヒト前立腺癌細胞株）を韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）で求め、加熱非活性化した１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭ−１培地１６４０で成長させた。

ＧＦＰ−過発現及び安定的にトランスフェクションされたＭＤＡＭＢ４３５（ヒト乳癌細胞）は三養社（大田、大韓民国）で求め、１０％の血清及び上述した抗生剤が補充されたＤＭＥＭで成長させた。

培養物は５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気下で３７℃で維持し、融合がなされた後にトリプシン／ＥＤＰＡを用いて正常分裂させた。

ｃｙ３−ラベル化されたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧをＣＬＭと錯化反応させ、１０％血清含有培地内のＰＣ３細胞で２時間培養してトランスフェクションさせた。

実験例１（陽イオン性ナノ粒子の特性化）
実施例３で製造されたＣＬＭの平均直径はレーザ光散乱法で測定した結果１０３．６±４．５ｎｍであり、ＴＥＭ観測の結果、図２に示すように前記ＣＬＭは球状であることが確認された。ＣＬＭのゼータ電位値は＋４１．７６±２．６３ｍＶであった。天然ＬＤＬと比較すると、ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＤＯＰＥの結合によってこの数値が増加し、また表面電荷が陰の値から陽の値に変化した。ＣＬＭは調製後、室温で数週間凝集せずに安定性を維持した。

主なコア組成物であるコレステリルオレートの融点は５２℃であるため、ＣＬＭコアは普通の生理的温度で固体状態を維持した。これはＣＬＭの安定性が長期間維持される理由でもある。高安定性のおかげで、従来のＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポゾーム形成よりも優れた長所を有する。

したがって、ＣＬＭの物理化学的特性は、ＣＬＭがｓｉＲＮＡの伝達のために陽性に改質された脂質マイクロエマルションであると同時に、治療分野において安定したＬＤＬ模倣体系であることが分かる。

前記において、ＣＬＭの形態は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて肉眼で観察した。２０μＬのマイクロエマルション（５ｍｇ／ｍＬ）を３００メッシュのフォルムバー（Ｆｏｒｍｖａｒ）／炭素支持体網に連続して３回浸漬した後に網を２分間乾燥し、８０ｋＶでツァイスオメガ９１２ＴＥＭ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）を操作して前記網を観察した。

また、大きさ及びゼータ電位の測定は、ＣＬＭまたはこれとｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの錯体に関して直径及び表面ゼータ電位値を、波長６３２ｎｍ及び検出角度９０°のＨｅ−Ｎｅレーザが搭載された動的光散乱器（ＤＳＬ）（Ｚｅｔａ−Ｐｌｕｓ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、ＮＹ）で測定した。

大きさの測定において、各試料を脱塩水で適切に希釈して秒あたり１０４〜１０５の（細胞）個数を維持するようにし、血清内の錯体に関する安定性研究のために、１０％のＦＢＳ含有ＲＰＭ−１培地１６４０を錯体に添加して反応速度論的側面で測定した。

実験例２（陽イオン性ナノ粒子の細胞毒性の分析）
陽イオン性ナノ粒子の細胞毒性を測定するために、ＭＤＡＭＢ４３５細胞を分析の２４時間前に９６ウェルプレート（ウェルあたり１０４個の細胞）に播種した。

様々な濃度（３、６、１２、１８、２４、３６、４８、及び７２μｇ／ｍＬ）のＣＬＭ及びＰＥＩを１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭ−１培地１６４０内で製造した。培養培地を除去して、製造された懸濁液１００μＬをプレートウェルに添加した。各ウェル中の細胞をＣＬＭ及びＰＥＩ懸濁液で３７℃で２４時間培養した後、１０μＬのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＭＤ、米国）を各ウェルに加えた。細胞を３７℃でさらに４時間培養した後、マイクロプレート（ＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ５５０）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

体外細胞毒性分析は、ＭＤＡＭＢ４３５細胞の細胞質脱水素酵素を培養培地に放出することによって定量化した。１０％血清培地の存在下にＣＬＭ及び最も一般的な無ウイルス型遺伝子担体の１つであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５Ｋを、追って行うトランスフェクション実験を考慮して３〜７２μｇ／ｍＬの範囲の量で用いて前記分析を行った。ＰＥＩ２５ＫのＩＣ５０値は約９μｇ／ｍＬであり、２４時間の細胞培養後、１８μｇ／ｍＬであるときに６．９±０．４％の細胞生存率を示した反面、ＣＬＭは最高４８μｇ／ｍＬまで何の有害な影響も誘発しなかった。薬量を多く投与した場合、７２μｇ／ｍＬのＣＬＭは７８±１％の細胞生存率を示し、同じ条件で５．２±０．１％の生存率を示したＰＥＩ２５Ｋと比較し著しく高い値を示した（図３)。

ｓｉＲＮＡ−無含有ＰＥＩ２５Ｋ及びＣＬＭの細胞毒性比較の結果、ＣＬＭは細胞に対してＰＥＩ２５Ｋよりも毒性が弱いことが確認され、これはＣＬＭが細胞毒性の面において優れているという長所があり、トランスフェクション効率を維持し続けると共にＰＥＩを代替するのに有利であるということを提示する。

実験例３（ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の特性化）
ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧとＣＬＭの錯化過程を特性化するために、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧを室温の水溶液でＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ重量比との関数的関係で培養した。静電気相互作用による錯体形成度は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によってマイクロエマルションの大きさ及びゼータ電位値を観測して算出した。

図５に示すように、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡの重量比が１から４．６７に増加するのに伴い、ＣＬＭのゼータ電位値は−１３．８±３．９から＋３５．６７±１．２ｍＶに増加しており、その後、重量比４．７を超えた値で一定に維持された。これらのデータは、すべての陰電荷ｓｉＲＮＡホスフェート残留物が重量比４．７でＣＬＭと完全な錯体を形成するようになるという事実を提示する。

さらに、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧで被覆されたＣＬＭの大きさは、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧのいかなる重量比でもほぼ１００ｎｍに近い一定した水準を維持していることから、ＣＬＭはｓｉＲＮＡ−ＰＥＧに培養した後に大きく凝集していないことが分かる（図５）。これらの大きさ及びゼータ電位データは、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の陽電荷表面が錯体間で電荷反発力を起こす可能性があることを提示した。

また、錯体表面上のＰＥＧ鎖は保護雲の役割を果たし、立体反発力によって凝集を防ぐものと判断される。

これと並行して、ゲル遅延化分析も重量比１．４〜８．４の範囲のＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡに対して行った。アガロースゲル電気泳動の結果、ＣＬＭは重量比５．６及び８．４でｓｉＲＮＡ−ＰＥＧによって十分に遅延されることが確認された（図６）。

前記の結果は、重量比が５．６を超えたときに電荷の相互作用によってｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体が十分に形成されたことを示す。ゼータ電位データとゲル遅延分析はすべて、錯化形成が重量比約５で完全に達成されることを示し、錯体形成とｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の重量比の相互連係性を裏付けるものである。

実験例４（１０％血清培地内におけるｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭの安定性）
ＰＥＧ５Ｋが二硫化物結合による共役化によってｓｉＲＮＡ伝達系に導入された。ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体形成後、１０％血清含有培地でＤＬＳを用いてその大きさを測定した。

図７に示すように、血漿タンパク質の高速及び低速吸着という二種類のパターンが反応速度論的に表現された。急速吸着は、大きさを４７．６ｎｍに増大させる２分間の培養時間よりも遅く達成された。血清内で行う２〜２０分の培養時間にｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の大きさがゆっくりしかしながら漸進的に１９．３ｎｍに増加（２分では１５１．２±１３．２ｎｍ、２０分では１７０．３±２９．９ｎｍ）し、変動プロファイルを示す。

血漿タンパク質の吸着及びポリエチレングリコール化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ナノ粒子表面上の再配列は初期に増加しており、２０分の培養時に最大値に到達したことが立証された。このような事実は、培養の最初の２０分間でのｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体上のタンパク質吸着を説明する。一方、２０〜６０分培養時の錯体の大きさはほぼ一定しており、凝集による大きさの増加はなく錯体の安定性を示す。

これらの結果は、ＬＤＬ模倣ナノ粒子におけるＰＥＧ鎖による立体反発力は血漿タンパク質の不連続吸着を減少させ、凝集現象を現わさず血清培地での高安定性に寄与するという事実を提示する。

実験例５（ｓｉＲＮＡ／ＣＬＭ錯体の細胞吸収）
ｓｉＲＮＡ／ＣＬＭ錯体の細胞吸収能力を評価するために、ｃｙ３−ラベル化されたｓｉＲＮＡ−ＰＥＧをＣＬＭと錯化反応させ１０％血清含有培地内のＰＣ３細胞で２時間培養した。Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の細胞吸収相対量を流速細胞分析法で分析した。

すなわち、ＰＣ３細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生剤が補充されたＲＰＭ−１培地１６４０に含まれた６個の細胞プレートに、ウェルあたり細胞数５×１０５個の密度で播種し、３７℃で２４時間成長させて収穫した。培地を除去した後、得られた細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。１μｇのｓｉＲＮＡ−ＰＥＧまたはｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体（重量比８．４のＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ）を３７℃で２時間培養した。培地を除去して細胞吸収を中断させた。細胞を冷たいＰＢＳでゆっくり洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）のパラフォルムアルデヒド溶液で固定させた。流速細胞分析法で細胞吸収を観測し（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェアで分析した（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。

図８は、ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体の蛍光強度プロファイルが右側に移動したことを示す。前記の結果は、細胞吸収が対照群に比べて著しく高いという事実を提示する。

ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧの場合にのみ、対照群に比べて細胞吸収の改善が極めて遅かった。したがって、ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧが自己形成され、ミセルが細胞吸収の小幅増加を誘発したであろうと推測できる。

実験例６（ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のトランスフェクション効果）
ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のｓｉＲＮＡ遺伝子抑制効果を血清含有培地に含まれたＧＦＰ過発現及びトランスフェクションされた安定したＭＤＡＭＢ４３５細胞株を用いて測定した。

すなわち、ＧＦＰ−過発現ＭＤＡＭＢ４３５細胞を１０％ＦＢＳ及び抗生剤が補充されたＤＭＥＭ培地に含まれた１２個の細胞プレートにウェルあたり細胞数２×１０５個の密度で播種した。トランスフェクション実験の２４時間前に細胞を培養した。培地を除去した後、得られた細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。

様々な濃度（０、１．４、２．８、５．６、８．４、及び１６．８）のｓｉＲＮＡ−ＰＥＧまたはｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体（相違した重量比のＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡ）１μｇを３７℃で２時間１０％ＦＢＳ含有培地で培養した。細胞上清液を血清を補充した新たな培地に交換した。

その後、トランスフェクションされた細胞を４２時間成長させて収穫し、細胞はＰＢＳに溶解された０．１％トリトン×１００で処理した。細胞溶解物の蛍光度を５２５ｎｍの波長で測定した（４８８ｎｍで励起する）。

ＰＣ３細胞を用いたＶＥＧＦ放出抑制実験で、上述したように試料をトランスフェクションした後、４時間後に細胞培地を血清を補充した新たな培地に交換した。トランスフェクション後の培養６時間後、前記培地は１０％ＦＢＳ及び２０μｇ／ｍＬのヘパリンを補充した新たなＲＰＭ−１培地に交替した。さらに１６時間培養した後、ＶＥＧＦ含有細胞上清液を回収した。

細胞から放出されたＶＥＧＦの濃度は、製造者の指針に従ってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ免疫分析キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。

ＧＦＰまたはＶＥＧＦｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体は、１０％血清ＲＰＭ−１培地においてＧＦＰ過発現ＭＤＡＭＢ−４３５細胞またはＶＥＧＦ放出ＰＣ−３細胞でそれぞれ処理された。

前記錯体のＧＦＰ遺伝子サイレンシング効果を図９に示した。ＤＣ−Ｃｈｏｌ（ＣＬＭに含まれる）／ｓｉＲＮＡの重量比の増加と共に、前記ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体のＧＦＰ遺伝子発現は重量比１．４〜８．４の範囲で抑制された。

ＧＦＰｓｉＲＮＡ−ＰＥＧを含むＣＬＭ錯体は、重量比が５．６及び８．４のとき、ＧＦＰ発現においてそれぞれ４１．２±３．７％及び５８．９±４．９％の下方調整率を示した。この結果は、重量比５．６超過時にＧＦＰｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体が完全に形成されたという事実と一致する（図９）。

伝達系としての完全錯体がｓｉＲＮＡに対する化学量論的効果を有し、それによってサイレンシング遺伝子の能力を高めることができるという点を説明することができる。トランスフェクション効率もまた、ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ−ＰＥＧがＣＬＭとの錯化反応に用いられたことを除いては、上述したものと同じ方式でＶＥＧＦ放出ＰＣ３細胞で測定された。ＰＣ３細胞におけるＶＥＧＦ抑制プロファイルは、ＭＤＡＭＢ４３５細胞におけるＧＦＰ抑制プロファイルと極めて類似していた（図１０）。

重量比５．６及び８．４のＶＥＧＦｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭにおいて、ＶＥＧＦ発現抑制値はそれぞれ３７．６±１．２％及び５３．８±０．９％であり、ＰＣ３細胞で順に現れた。一方、ＧＦＰ及びＶＥＧＦｓｉＲＮＡ−ＰＥＧのみが細胞吸収量が小さいため、これらの遺伝子サイレンシング効果はそれぞれ６．９±６．５％及び９．５５±７．２％であった（図９及び１０）。

重量比１６．８でターゲットタンパク質発現の抑制率は、ＧＦＰｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ及びＶＥＧＦｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体でそれぞれ３８±０．３％及び２２．８±１３％であったが、この結果は、錯化していないＣＬＭが残留し、これらが細胞吸収に関してｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ／ＣＬＭ錯体と競争する可能性が大きいということを提示する。重量比１６．８で遺伝子サイレンシング効果の小幅減少が観測される理由はこのためであろう。

本発明を添付の図面及び実施形態を参照して説明したが、当業者であれば、下記の特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域を逸脱しない範囲内で本発明の多様な修正及び変更が可能であることを理解するはずである。

本明細書中の記載からも明らかなように、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は骨髄性白血病細胞、腸、腎臓、及び脳腫瘍などの各種腫瘍で過発現するため、本発明に係る陽イオン性ナノ粒子はＬＤＬＲを用いた腫瘍治療法に効果的に適用することができる。

Claims (6)

1. コレステリルエステル及びトリグリセリドを含有するコア脂質部（ｌｉｐｉｄ ｃｏｒｅ ｐａｒｔ）；
   前記コア脂質部の上層面に疎水性相互反応によって結合されており、コレステロール、リン脂質、及び陽イオン性脂質を含有する陽イオン性の表面脂質部；及び
   静電気的相互作用によって前記陽イオン性の表面脂質部に結合された核酸；
   を含む核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。
2. コレステリルエステル３０〜６０重量％、トリグリセリド０．１〜１０重量％、コレステロール５〜２０重量％、リン脂質５〜３０重量％、及び陽イオン性脂質１０〜５０重量％を含有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。
3. コア脂質部と表面脂質部の重量比が３０：７０〜７０：３０であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。
4. 前記リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、エッグホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）からなる群から１つ以上選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。
5. 前記陽イオン性脂質が、３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′，Ｎ′−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ′−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、Ｎ−（Ｎ′−アミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）、Ｎ−（Ｎ′−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキシアミド）エチル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム−リフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オク−タデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５′−（コレスタ−５−エン−３．ベータ．−オキシ）−３′−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス，シス−９′，１２′−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ′−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、及び１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）からなる群から１つ以上選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。
6. 前記核酸が小干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ジオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、相補性ジオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、アプタマー、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、運搬リボ核酸（ｔＲＮＡ）、及びアンチセンスオリゴジオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸伝達用核酸−低密度リポタンパク質類似（ＬＤＬ−ｌｉｋｅ）陽イオン性ナノ粒子複合体。

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