CN114306369B

CN114306369B - 一种硫代寡核苷酸注射液及其制备方法

Info

Publication number: CN114306369B
Application number: CN202111593815.1A
Authority: CN
Inventors: 宋更申; 王环宇; 张宏雷; 陈玺朝
Original assignee: Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Youcare Kechuang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114306369A

Abstract

本申请提供一种包含硫代寡核苷酸和用于递送所述硫代寡核苷酸的载体的组合物及其制备方法。本申请的组合物中，通过将载体和硫代寡核苷酸组合使用，增加了硫代寡核苷酸的血清稳定性，同时又可将寡核苷酸有效的递送至肝脏部位，有效地抑制目的基因的表达，抑制了肿瘤的生长。

Description

一种硫代寡核苷酸注射液及其制备方法

技术领域

本申请涉及核酸药物制剂领域，尤其涉及包含硫代寡核苷酸和用于递送所述硫代寡核苷酸的载体的组合物及其制备方法。

背景技术

寡核苷酸，是一类30个以下碱基的短链核苷酸(包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的总称。反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASO)用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在治疗癌症等疾病过程中具有一定积极的作用。

反义寡核苷酸是靶向调节IGF1R信号通路的方法之一，其可与靶mRNA的特定序列碱基配对形成双链，从而激活RNase H降解 mRNA或防止RNA翻译蛋白，从而抑制目标基因表达。迄今为止，国际上已有9个反义核酸类药物批准上市：casimersen、 golodirsen、inotersen、viltolarsen、volanesorsen、fomivirsen福米韦生、mipomersen米泊美生、nusinersen诺西那生、eteplirsen依特立生。

由于反义寡核苷酸的稳定性较差，且没有特定组织靶向性，导致在体内容易被核酸酶降解，不能很好地发挥治疗作用。因此，本领域急需反义寡核苷酸制剂，其能提高反义寡核苷酸的稳定性并增加其治疗效果。

发明内容

针对上述问题，本申请提供了一种硫代寡核苷酸制剂，其包含特定的硫代寡核苷酸和用于递送所述硫代寡核苷酸的载体。所述载体包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和抑制颗粒聚集的缀合脂质。这种反义寡核苷酸制剂，既能提高反义寡核苷酸的血清稳定性，又可以有效地递送至肝脏部位，从而高效地抑制目的基因的表达，有效地治疗肝癌。

并且，本申请研究了载体对于硫代寡核苷酸的治疗肝癌的效果的提高，载体中的四种成分的作用。

具体来说，对于阳离子脂质，在SM-102、ALC-0315和 DOTAP中，SM-102的效果为最好。

对于中性脂质，相比于DOPE，DSPC的效果更好。

对于缀合脂质，相比于ALC-0519，以DMG-PEG2000的效果更好。

具体来说，本申请合成了一种硫代寡核苷酸YK102，核苷酸序列为：5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3’(SEQ ID NO:1)，这是经硫代修饰的寡核苷酸。用美国GE公司OligoPilot 400合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠(cross-linked polystyrenebead)，交联聚苯乙烯珠连接有碱基为修饰核苷单体A，且C5’-羟基被DMT保护的初始核苷酸；经纯化后，得到此反义寡核苷酸，分子式为 C₁₉₂H₂₄₅O₉₉N₇₂S₁₉P₁₉，化学名为：胸腺嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧腺嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧腺嘌呤核苷基-(3'→5'O,O- 硫代磷酸基)-2'-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧腺嘌呤核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基- (3'→5'O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧胞嘧啶核苷基- (3'→5'O,O-硫代磷酸基)-2'-脱氧腺嘌呤核苷(简称为：YK102)。结构式为：

由于硫代寡核苷酸的稳定性较差，且没有组织靶向性，因此在体内容易被核酸酶降解。我们发现YK102能治疗肝癌却不能有效的递送到肝脏部位，因此我们制备了包含载体和硫代寡核苷酸YK102的组合物。其中载体包含包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和抑制颗粒聚集的缀合脂质。我们将载体制备成脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)，既可以增加硫代寡核苷酸的血清稳定性，又可以有效的递送至肝脏部位，从而有效地抑制目的基因的表达，更有效地治疗肝癌。

脂质纳米颗粒是使用脂质形成的一种纳米微粒。在药学领域中，通常使用脂质纳米颗粒直接包裹化学药物，在基因治疗领域，可以使用脂质纳米颗粒包裹反义寡核苷酸。

反义寡核苷酸与普通化学药物的一个明显区别是核酸带有数量庞大的磷酸根，因而呈负电。为了使其能够被脂质纳米颗粒更好地包裹，需要使用一类特殊的脂质——阳离子脂质。阳离子脂质往往具有一个带铵根的亲水端，在酸性环境下能够与氢离子结合呈正电。借助两者的静电吸附，就能够将核酸包裹在脂质纳米颗粒中。包裹后的结构外部因阳离子脂质的疏水端向外而呈疏水性，此时可以加入传统脂质体合成中常用的一端修饰有聚乙二醇(PEG)的脂质——PEG-脂质，使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合，而PEG-脂质的亲水端(连有PEG)则向外形成核酸脂质纳米颗粒的外壳。为了增加核酸脂质纳米颗粒的稳定性，还可以添加适量的胆固醇等成分，使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合更为紧密，最终得到核酸脂质纳米颗粒的成品。

因此，本申请提供了一种组合物，其中通过脂质纳米颗粒递送硫代寡核苷酸YK102，可增加硫代寡核苷酸最的血清稳定性，有效地递送至肝脏，并增加其对肝癌的治疗效果，符合临床应用要求。

本申请在具体的实施方案中所用到的重要物料的名称及简写：

1)、本专利中的简称：SM-102

CAS号：2089251-47-6

结构式：

化学名：8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷9-基酯

英文名：heptadecan-9-yl 8-[2-hydroxyethyl-(6-oxo-6- undecoxyhexyl)amino]octanoate

用途：具有一个带胺基的亲水端，可同时提供正电荷，借助静电吸附，与带负电荷的mRNA复合，就能够将核酸包裹在纳米脂质体中，当纳米脂质体被细胞内吞后，可离子化脂质具有pH敏感性，可离子化阳离子脂质会在酸性环境下离子化，破坏内涵体膜，从而实现脂质纳米颗粒(LNP)的内涵体逃逸，mRNA体内转染。可稳定核酸并增加其对核酸酶降解的抵抗力，使其能够被递送到所需的靶细胞。

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

2)、本专利中的简称：ALC-0315

CAS号：2036272-55-4

结构式：

英文名：6-[6-(2-hexyldecanoyloxy)hexyl-(4- hydroxybutyl)amino]hexyl 2-hexyldecanoate

中文名：((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基) 双(2-己基癸酸酯)

用途：具有一个带胺基的亲水端，可同时提供正电荷，借助静电吸附，与带负电荷的mRNA复合，就能够将核酸包裹在纳米脂质体中，当纳米脂质体被细胞内吞后，可离子化脂质具有pH敏感性，可离子化阳离子脂质会在酸性环境下离子化，破坏内涵体膜，从而实现脂质纳米颗粒(LNP)的内涵体逃逸有助于内涵体逃逸， mRNA体内转染。可稳定核酸并增加其对核酸酶降解的抵抗力，使其能够被递送到所需的靶细胞。。

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

3)、本专利中的简称：DOTAP

CAS号：132172-61-3

结构式：

英文名：2,3-bis[[(Z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl- trimethylazanium；chloride

中文名：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵

来源：西安瑞禧生物科技有限公司

4)、本专利中的简称：DOTMA

CAS号：104872-42-6

结构式：

英文名：1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (chloridesalt)

中文名：二油酰丙基氯化三甲铵

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

5)、本专利中的简称：DODMA

CAS号：104162-47-2

结构式：

英文名：1,2-dioleyloxy-3-dimethylaminopropane

中文名：1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

6)、本专利中的简称：DSPC

CAS号：816-94-4

结构式：

英文名：[(2R)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl]2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate

中文名：二硬脂酰磷脂酰胆碱

用途：构成脂质体的基本结构。

来源：江苏东南纳米材料有限公司

7)、本专利中的简称：DOPE

CAS号：4004-05-1

结构式：

英文名：[(2R)-3-[2-aminoethoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(Z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl](Z)-octadec-9-enoate

中文名：二油酰磷脂酰乙醇胺

用途：构成脂质体的基本结构。

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

8)、本专利中的简称：DMG-PEG 2000

CAS号：1397695-86-1

结构式：

英文名：1,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000。

中文名：二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000

用途：缀合PEG的脂质，使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合，而PEG-脂质的亲水端(连有PEG)则向外形成核酸脂质纳米颗粒的外壳。

来源：艾伟拓(上海)医药科技有限公司

9)、本专利中的简称：ALC-0159

CAS号：1849616-42-7

结构式：

英文名：2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide

中文名：甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺

来源：厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司

本申请涉及的具体方案如下：

一方面，本申请涉及一种组合物，其包含硫代寡核苷酸和用于递送所述硫代寡核苷酸的载体，所述硫代寡核苷酸的核苷酸序列为：5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3’，其中所述载体包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和抑制颗粒聚集的缀合脂质。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体与所述硫代寡核苷酸的质量比为(10-30)：1。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述阳离子脂质，中性脂质，辅助脂质和缀合脂质的摩尔比为(30-50)：(10-20)： (25-55):(0.5-5)。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述阳离子脂质选自以下中的一种或者多种：

4-(二甲氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(DLin-MC3- DMA)，8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷9-基酯(简称为SM-102)，

((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(简称为ALC-0315)，

(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(简称为DOTAP)，(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵及其盐，

1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(简称为DOTMA)，

1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(简称为DODMA)。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述中性脂质选自以下中的一种或者多种：二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其混合物磷脂。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述辅助脂质选自以下中的一种或者多种：胆固醇、维生素E、DC-胆固醇或其衍生物。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述抑制颗粒聚集的缀合脂质选自以下中的一种或者多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)，甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺 (ALC-0159)。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体包括SM- 102、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000，四者摩尔比为：40：15： 43：2。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体包括SM- 102、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2000，四者摩尔比为：40：15： 43：2。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体包括ALC- 0315、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000，四者摩尔比为：40：15： 43：2。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体包括SM- 102、DSPC、胆固醇、ALC-0519，四者摩尔比为：35：20：43： 2。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，所述载体包括 DOTAP、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000，四者摩尔比为：40： 15：43：2。

在一个实施方案中，在本申请的组合物中，还包括药物可用的赋形剂或稀释剂中的一种或多种。

在一个实施方案中，本申请的组合物是注射液。

在一个实施方案中，本申请的组合物是纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均尺寸为50nm-150nm；并且所述纳米颗粒制剂的多分散指数≤0.3。

另一方面，本申请还涉及制备所涉及的组合物的方法，其包括以下步骤：

1)采用有机溶剂进行脂质溶解，

2)采用微流控技术制备LNP中间体溶液。

在一个实施方案中，本申请的制备方法中，所述制备纳米脂质体的溶剂选自以下中的任一种：乙醇、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)。

在又一个方面，本申请还涉及所制备的组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，所述癌症为肝癌。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1.YK102的制备

YK102，核苷酸序列为：5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA- 3’，化学名称及结构式参见以上发明内容。。

制备方法如下：

用到的仪器和试剂有：美国GE公司OligoPilot 400合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠(cross-linked polystyrene bead)，交联聚苯乙烯珠连接有碱基为修饰核苷单体A，且C5′-羟基被DMT保护的初始核苷酸；

用乙腈分别配制四种核苷酸溶液：

1)DMT-dA(bz)亚磷酰胺单体

2)DMT-dC(bz)亚磷酰胺单体

3)DMT-dG(ibu)亚磷酰胺单体

4)DMT-dT亚磷酰胺单体

采用如下步骤制备：

(1)脱保护

使用二氯乙酸的甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。

(2)偶联

使用5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。

(3)氧化

使用氢化黄元素作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。

(4)羟基保护

使用乙酸酐为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。

重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。

(5)使用脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。

(6)氨解及纯化

将固相载体转移至反应器中，加入浓氨水(25-28％)，在60℃保持氨解13h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，用反相柱层析，冷冻干燥制得产品，含量：94.5％。

实施例2

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。 SM-102占总脂质的摩尔比为40％；DSPC占总脂质的摩尔比为 15％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

本实施例还提供上述硫代寡核苷酸注射液的制备方法，包括以下步骤：

分别准确称量20mg的SM-102、DSPC、胆固醇、DMG- PEG2000，加无水乙醇溶解，配制成浓度为10mg/ml的溶液，按照摩尔比为40：15：43：2的摩尔比配制载体混合溶液，作为有机相备用。

用50mM的pH4.0的柠檬酸缓冲液溶解硫代寡核苷酸YK102，并稀释配制成0.153mg/ml的溶液，作为水相备用。

用BD(为品牌名，中文为碧迪，下同)3ml注射器分别抽取2ml有机相，BD 10ml注射器抽取7ml水相，左边泵放置有机相和右边泵放置水相，在微流控设备中制备LNP中间体溶液。

微流控参数：

制备体积为：9.0ml；有机相流速为5.0ml/min；水相流速为 15ml/min；收集LNP中间体溶液。

上述LNP中间体溶液加入其体积9倍的PBS溶液稀释，在小试超滤设备上超滤浓缩，超滤膜孔径为50KD，浓缩至10ml左右时，再加入4倍的PBS溶液稀释，并在超滤设备上浓缩，最终浓缩体积小于 5ml时停止超滤。

收集超滤液，并用PBS定容至5mL，过0.2um微孔滤膜，收集液体测粒径。

表1实施例2～6处方中的辅料配比

实施例3

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。SM-102占总脂质的摩尔比为40％；DOPE占总脂质的摩尔比为 15％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

其余步骤同实施例2。

实施例4

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。 ALC-0315占总脂质的摩尔比为40％；DSPC占总脂质的摩尔比为 15％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

其余步骤同实施例2。

实施例5

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。 SM-102占总脂质的摩尔比为35％；DSPC占总脂质的摩尔比为20％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；ALC-0159占总脂质的摩尔比为2.0％。

其余步骤同实施例2。

实施例6

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。DOTAP占总脂质的摩尔比为40％；DSPC占总脂质的摩尔比为 15％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

其余步骤同实施例2。

实施例7

本实施例提供一种硫代寡核苷酸注射液，由以下重量百分比计的组分组成：YK10240mg/ml，YK102与总脂质的质量比为1：20。 SM-102占总脂质的摩尔比为35％；DSPC占总脂质的摩尔比为 20％；胆固醇占总脂质的摩尔比为43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

其余步骤同实施例2。

对比例1

据YK102原料药的理化性质，本品水溶性极佳，溶化性最快，澄清度好，符合冻干制剂，不添加辅料，加注射用水溶解，溶液经以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，放冻干机冻干,在对比研究中，再用生理盐水配制成的药物浓度为YK102 40mg/ml。

关键质量指标的检测：

使用Litesizer 500纳米粒度及Zeta电位分析仪(安东帕Anton Paar)，通过动态光散射测定脂质纳米颗粒的大小及多分散指数 PDI；根据制造商的说明，使用Quant-itRibogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)确定脂质纳米颗粒的包封效率；使用梅特勒-托利多台式实验室pH计FE28检测溶液/水溶液pH，测试结果见表2。

表2实施例和对比例粒径、PDI、包封率和pH对比结果

样品名称	粒径nm	PDI	包封率	溶液的pH
					实施例2	73.98	13.5	94.3	7.41
实施例3	65.41	21.7	89.7	7.40
					实施例4	87.98	24.9	86.4	7.43
实施例5	117.07	16.9	85.5	7.42
					实施例6	119.06	19.4	79.9	7.43
实施例7	85.98	22.9	83.4	7.42
					对比例1	-	-	-	7.13

药理学实验：

实施例2-7和对比例1对人肝癌HepG2细胞原位裸鼠肿瘤模型生长抑制实验与空白模型对照组比较，将传代培养的肿瘤细胞，在无菌条件下将肿瘤细胞消化后，制成混悬液，以氯化钠注射液冲洗后再稀释成混悬液,给予裸鼠右前肢腋部皮下接种保种。裸鼠为 4～6周Nu/Nu的雌性裸鼠，体重20.0～22.0g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

待保种裸鼠皮下肿瘤生长至直径约1-2cm时(体积＞ 1000mm³)，无菌条件下取出瘤块，将瘤块切成约1.0×1.0mm大小的瘤块备用。将要手术接种的裸鼠以0.5％戊巴比妥10ml/kg麻醉后，将裸鼠固定在手术台上，消毒腹部皮肤，在右上腹部剪开约 1cm切口，暴露肝脏，手术洞巾覆盖。将准备好的瘤块放入专用接种套管针内，用套管针将瘤块植入肝脏内，创口出血部位用消毒纱布进行止血处理。然后将手术后的肝脏放回小鼠腹腔内，用4/0号手术缝合针依次缝合腹肌和皮肤。

实验设空白模型对照组、对照例1组、实施例1-6组。待术后3 周用小动物B超检测模型肿瘤生长情况，选取已生长原位肿瘤，且肿瘤大小相似的动物按动物体重随机分组。

按照5mg/kg给药，给药时间为受试间隔48小时静脉注射给药一次，在给药期间各给药组均未出现动物死亡，受试药连续给药10 次。与空白模型对照组比较结果见下表，各给药组对肿瘤生长均有抑制作用。

表3肿瘤抑制结果

组别	给药方式	瘤重(g)	抑瘤率(％)
				空白模型对照组	—	1.228	—
对比例1	iv.	0.545	55.6
				实施例2	iv.	0.164	86.6
实施例3	iv.	0.328	73.3
				实施例4	iv.	0.348	71.7
实施例5	iv.	0.371	69.8
				实施例6	iv.	0.473	61.5
实施例7	iv.	0.351	80.4

从实施例2-7对肿瘤生长的抑制实验中，可以看出，各脂质成分的变化对肿瘤生长的抑制的影响：

对于中性脂质，相比于DOPE，DSPC的效果更好。

对于缀合脂质，相比于ALC-0519，以DMG-PEG2000的效果更好。

在实施例2-7和对比例1相比，对肿瘤生长均有更好的抑制作用。其中以实施例2效果为最好，其对肿瘤生长抑制作用为对比例 1的125％。其采用的脂质体的技术方案为SM-102、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000，其中：SM-102占总脂质的摩尔比为40％； DSPC占总脂质的摩尔比为15％；胆固醇占总脂质的摩尔比为 43％；DMG-PEG2000占总脂质的摩尔比为2.0％。

实施例2-7，采用微流控方法制备硫代寡核苷酸注射液，无需冻干既可以实现反义寡核苷酸的高稳定性，且在体内不容易被核酸酶降解，与对比例相比增加了反义寡核苷酸的血清稳定性，又可以有效的递送至肝脏部位，效果显著，从而有效地抑制目的基因的表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州天龙药业有限公司

<120> 一种硫代寡核苷酸注射液及其制备方法

<130> PA211-243

<140> 2021115938151

<141> 2021-12-23

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（(Artificial Sequence)）

<400> 1

tcctccggag ccagacttca 20

Claims

1.一种组合物在制备治疗肝癌的药物中的用途，其特征在于，所述组合物包含硫代寡核苷酸和用于递送所述硫代寡核苷酸的载体，所述载体与所述硫代寡核苷酸的质量比为20﹕1，所述硫代寡核苷酸的核苷酸序列为：5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3’，所述载体为摩尔比为35﹕20﹕43﹕2或40﹕15﹕43﹕2的8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷9-基酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的赋形剂的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用途，所述组合物是注射剂。

4.根据权利要求3所述的用途，所述注射剂是注射液。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的用途，所述组合物是纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的粒径为50-150nm；并且所述纳米颗粒制剂的多分散指数≤0.3。