CN117257965B - 一种核酸递送载体组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸递送载体组合物及其应用。所述组合物包括摩尔比为（30~50）：（4~16）：（31.5~63.5）：（0.5~2.5）的阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质；所述辅助磷脂为DOPE和DSPC中的一种或两种的组合；所述阳离子脂质选自如下结构中的一种或多种的组合，本发明所述的组合物为能够包裹用于蛋白表达的mRNA治疗相关缺陷疾病，高效且无毒副作用。 。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的说，本发明涉及一种核酸递送载体组合物及其应用。
背景技术
近年来，LNP（lipid nanoparticles，脂质纳米粒）作为mRNA有效的递送手段在病毒性传染病、恶性实体肿瘤、蛋白替代治疗、细胞过继性治疗领域展示了巨大的潜力。在蛋白替代或蛋白补充领域药物的发展中，通常以蛋白质多肽或DNA质粒作为功能成分用作研发，而mRNA治疗相比上述的治疗方式具有更高的安全性与高效性，体现在mRNA可直接在胞质中进行蛋白质翻译，无需进入到细胞核，不会引起染色体的插入的风险，同时mRNA利用自身的活细胞进行翻译表达目标蛋白，经过翻译后修饰更加接近目标蛋白的天然构象和特性。另外有些疾病在体外无法形成有效的蛋白药物以及广谱需求的多聚体蛋白，通过mRNA可以表达特定的序列以及多种亚基在体内形成有效的功能成分。
目前很多基础研究以及临床试验证明通过mRNA细胞内递送能够完成相关目标蛋白质合成与加工，产生相应的功能。过去几年时间体外转录的mRNA已经成为了热点药物，Moderna治疗丙酸血症（PA）的编码丙酰辅酶A羧化酶（PCC）α或β亚基（PCCA和PCCB）的基因的mRNA-3927已完成临床I/II期的中期数据，其通过LNP包裹编码PCCA和PCCB亚基蛋白以恢复肝脏中功能性PCC酶活性。LNP通过可电离的阳离子脂质与辅助磷脂、PEG脂质和胆固醇形成纳米颗粒的构建，其通过在pH=4.0的酸性条件下与带负电的mRNA结合来实现mRNA的包裹，经透析后在接近生理环境下呈电中性维持LNP结构，当内吞到溶酶体后，在酸性的条件下，阳离子脂质转变成正电性通过质子海绵效应快速释放mRNA到细胞质中，从而翻译产生蛋白发挥作用。
目前临床应用的可电离脂质有DLin-MC3-DMA（Onpattro®使用）、SM102（Spikevax使用）和ALC-0315（Comirnaty），常用的辅助磷脂包括饱和脂质DSPC和不饱和的脂质DOPE，胆固醇主要通过填充脂质之间降低纳米颗粒的刚性，维持流动性从而增加稳定性，常用的为羊毛脂提取的胆固醇，目前也对固醇类做了相关研究来代替胆固醇，如β-谷甾醇；PEG缀合脂质主要是维持纳米颗粒的亲水性，掩盖其表面的正电性，降低被体内吸附，增加循环时间，延长纳米颗粒的体内半衰期。目前在已上市产品的LNP中选取的辅助脂质为DSPC，其很难保障长链的mRNA递送到蛋白替代疗法所需的靶向部位，当前的LNP递送效率有待提高。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种核酸递送载体组合物。
本发明的另一目的在于提供所述的核酸递送载体组合物的应用。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸递送载体组合物，其中，所述组合物包括摩尔比为（30~50）：（4~16）：（31.5~63.5）：（0.5~2.5）的阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质；所述阳离子脂质选自如下结构中的一种或多种的组合：
。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质选自如下结构：
。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为（40~50）：（10~16）：（32~50）：（0.5~2）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为（45~50）:（10~16）：（33.5 ~44.5）: (0.5~1.5)。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为（48~50）:（10~16）：（33.5 ~41.5）:（0.5~1.5）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为50:16:33.5:0.5。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为48:10:40.5:1.5。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述辅助磷脂为DOPE和DSPC中的一种或两种的组合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述辅助磷脂为DOPE。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述PEG缀合脂质为PEG2k-DMG。
根据本发明一些具体实施方案，其中，以所述组合物总质量为100%计，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的总质量比例为94.6%~97.0%。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述核酸选自mRNA、siRNA、miRNA、shRNA和质粒中的一种或多种的组合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为9.1~16.4。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为13.5~16.4。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为13.8。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为16.4。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为50:16:33.5:0.5；并且所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为16.4。
根据本发明一些具体实施方案，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为48:10:40.5:1.5；并且所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为16.4。
另一方面，本发明还提供了本发明所述的核酸递送载体组合物在制备蛋白替代治疗药物中的应用。
综上所述，本发明提供了一种核酸递送载体组合物及其应用。本发明的组合物具有如下优点：
本发明所述的组合物为能够包裹用于蛋白表达的mRNA治疗相关缺陷疾病，高效且无毒副作用。
附图说明
图1为化合物L1的氢谱图；
图2为化合物L1-1的氢谱图；
图3为化合物L5的氢谱图；
图4为不同组合经尾静脉注射后荧光水平示意图，其中(a)为24h后活体荧光水平示意图，（b）为24h后肝脏荧光水平示意图；
图5为不同组合经肌肉注射后荧光水平示意图，其中(a) 为24h后活体荧光水平示意图，（b）为24h后肝脏荧光水平示意图，（c）为24h后淋巴结荧光水平示意图；
图6为不同N/P比LNP的粒径及EE%示意图；
图7为不同摩尔比LNP的粒径及EE%示意图；
图8为序号为1至13组合的6hEPO表达水平示意图；
图9为序号为14至18及8、13组合的6hEPO表达水平示意图；
图10为初步安全性评价示意图，其中(a) 为ALT水平示意图；（b）为AST水平示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
合成实施例1
阳离子脂质化合物L1的制备如下：
步骤1：
将化合物1（1.5 g）溶于DCM（50 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI，3.70 g），4-二甲氨基吡啶（DMAP，79 mg），三乙胺（1.95 g）和十五烷-8-醇（2.94 g）分批加入反应体系，室温搅拌16h。取少量反应液稀释与1标样对照点板（PE/EA=10/1，磷钼酸和溴甲酚绿），观察到极性变小的新点。反应液加水淬灭，分液，有机相减压蒸发，加适量硅胶拌样、纯化（25 g正相柱，PE/EA，0-0 % 5min，0-10% 20min，10-10% 10min，流速30ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物2（2.5 g，59.4%收率）。
步骤2：
向化合物2（2.5 g）的二氯甲烷溶液（20 ml）溶液中加入三氟乙酸（10 ml）。将混合物在室温下搅拌16小时。TLC显示化合物2完全消失，有一个极性变大的点生成。将反应液旋干，加入饱和碳酸氢钠水溶液（50ml）淬灭多余的三氟乙酸，乙酸乙酯（50 ml×2）萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后的粗产品，加适量硅胶和DCM拌样、纯化（25 g正相柱，PE/EA，0-0 % 5min，0-50% 20min，50-50% 5min，流速30ml/min）得到无色油状液体化合物3（1.8 g，85%收率）。
步骤3：
将化合物3（200 mg）溶于超干二氯甲烷（5 ml），在冰浴下搅拌，依次加入超干吡啶（58 mg）和三光气（43 mg），冰浴下搅拌0.5h。取少量反应液与3标样对照点板（PE/EA=1/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，将所得固体用超干二氯甲烷（5 ml）溶解后，滴加入化合物1-(3-羟丙基)-4-甲基哌嗪（500 mg）和吡啶（10 ml）的混合溶液中，滴加完成后，反应液在70oC下搅拌三小时，溶液为橙黄色，TLC(DCM/MeOH/NH4OH=10/1/0.1, 磷钼酸)显示，在吡啶下方有一个新点生成，加适量硅胶和二氯甲烷拌样、纯化（10 g正相柱，DCM:DCM/MeOH/NH4OH，0-0 % 5min，0-70% 20min，70-70% 10min，流速20ml/min）得到淡黄色油状液体化合物L1（130 mg，51%收率）。化合物L1的氢谱图见图1。
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.95 – 4.86 (m, 2H), 4.14 (t,J= 8.0Hz 2H), 4.11 – 4.03 (m, 4H), 2.72 – 2.31 (m, 10H), 2.30 (s, 3H), 1.84 – 1.77(m, 2H), 1.56 – 1.48 (m, 8H), 1.30 – 1.21 (m, 40H), 0.90 – 0.85 (t,J= 6.8 Hz,12H) 。
合成实施例2
阳离子脂质化合物L1-1的制备如下：
步骤1：
将化合物3（200 mg）溶于超干二氯甲烷（5 ml），在冰浴下搅拌，依次加入超干吡啶（58 mg）和三光气（43 mg），冰浴下搅拌0.5h。取少量反应液与3标样对照点板（PE/EA=1/1，磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，将所得固体用超干二氯甲烷（5 ml）溶解后，滴加入化合物1-(2-羟乙基)-4-甲基哌嗪（500 mg）和吡啶（10 mL）的混合溶液中，滴加完成后，反应液在70oC下搅拌三小时，溶液为橙黄色，TLC(DCM/MeOH/NH4OH=10/1/0.1，磷钼酸)显示，在吡啶下方有一个新点生成，加适量硅胶和二氯甲烷拌样、纯化（10 g正相柱，DCM:DCM/MeOH/NH4OH，0-0 % 5min，0-70% 20min，70-70% 10min， 流速20ml/min）得到淡黄色油状液体化合物L1-1（130 mg，50%收率）。化合物L1-1的氢谱图见图2。
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.79 (s, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.87 (s,4H), 2.79 (s, 2H), 2.54 (s, 4H), 2.49 (s, 2H), 2.44 (s, 2H), 2.27 (s, 3H),1.68 (d, J = 12.4 Hz, 4H), 1.56 (d, J = 12.4 Hz, 4H), 1.37 (d, J = 0.6 Hz,8H), 1.34 (d, J = 1.2 Hz, 8H), 1.31 - 1.29 (m, 24H), 0.90 (s, 12H) 。
合成实施例3
阳离子脂质化合物L5的制备如下：
步骤1：
将化合物1-1（5.0 g）溶于DCM（200 ml），室温搅拌，依次称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDCI，12.3 g），4-二甲氨基吡啶（DMAP，262 mg）, 三乙胺（6.51g）和6-十一烷醇（7.39 g）分批加入反应体系，室温搅拌16h。取少量反应液稀释与1-1标样对照点板（PE/EA=10/1，磷钼酸和溴甲酚绿），观察到极性变小的新点。反应液加水淬灭，分液，有机相减压蒸发，加适量硅胶拌样、纯化（80 g正相柱， PE/EA，0-0 % 5min，0-10%20min，10-10% 10min，流速40ml/min），点板监测，将纯产物部分馏分蒸发，得到无色油状液体化合物1-2（8.0 g，68.9％收率）。
步骤2：
向化合物1-2（8.0 g）的二氯甲烷溶液（50 ml）溶液中加入三氟乙酸（15 ml）。将混合物在室温下搅拌16小时。TLC显示化合物1-2完全消失，有一个极性变大的点生成。将反应液旋干，加入饱和碳酸氢钠水溶液（100ml）淬灭多余的三氟乙酸，乙酸乙酯（100 ml*2）萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后，加适量硅胶和DCM拌样、纯化（80 g正相柱，PE/EA，0-0 % 5min，0-40% 20min，40-40% min，流速50ml/min）得到无色油状液体化合物1-3（5.8 g，89%收率）。
步骤3：
将化合物1-3（300 mg）溶于超干二氯甲烷（5 ml），在冰浴下搅拌，依次加入超干吡啶（115 mg）和三光气（86 mg），冰浴下搅拌0.5h。取少量反应液与1-3标样对照点板（PE/EA=1/1， 磷钼酸），观察到极性变小的新点。反应液减压蒸发，所得固体加超干二氯甲烷（5 ml）溶解后，滴加入化合物N-(2-羟乙基)六亚甲二胺（500 mg）和吡啶（10 mL）的混合溶液中，滴加完成后，反应液在70oC下搅拌三小时，溶液为橙黄色，TLC(DCM/MeOH/NH4OH=10/1/0.1, 磷钼酸)显示，在吡啶下方有一个新点生成，加适量硅胶和二氯甲烷拌样、纯化（10 g正相柱，DCM:DCM/MeOH/NH4OH， 0-0 % 5min， 0-70% 20min， 70-70% 10min， 流速20ml/min）得到淡黄色油状液体化合物L5（170 mg，41％收率）。化合物L5的氢谱图见图3。
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.95 – 4.86 (m, 2H), 4.27 – 4.22 (m,2H), 4.09 (d,J= 12.0 Hz, 4H), 2.78 – 2.70 (m, 2H), 2.65 – 2.50 (m, 4H), 1.80– 1.30 (m, 16), 1.28 – 1.10(m, 24H), 0.87 (t,J= 4.0 Hz, 12H) 。
组合物实施例1：阳离子脂质与两种辅助磷脂组合LNP载体制备
配制水相：将mRNA（Luc-mRNA，Luc-mRNA对应的核苷酸序列见专利申请CN202210286081.0的SEQ ID NO:1）按照0.144mg/mL的终浓度稀释于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。
配制有机相：将阳离子脂质L1/L1-1/L5:DSPC/DOPE:胆固醇:PEG2k-DMG=50:10:38.5:1.5按照总浓度10mg/mL溶于乙醇。
将3ml水相缓冲液和1ml脂质有机相加入到15ml离心管中，分别连接于微流控的A、B两端，将芯片安装到微流控设备中，设置一定的流速比例，先用纯水和纯乙醇进行预实验，待压力与流速均处于平稳时，加入料液，料液流经芯片同时观察芯片出口的样品颜色，弃去前、后3~5滴乳白色液滴（约100μL），将中端样品收集到EP管中，随后将样品快速转移到透析袋中，在20mM Tris-HCl缓冲液中透析12-24h，透析结束后转移至4℃冰箱保存。
使用Ribogreen试剂盒，按照操作说明测定样品的包封率，使用酶标仪在激发光485nm，发射光535nm处测定样品荧光，通过样品荧光值计算样品包封率。使用马尔文公司的Zetasizer nano仪器，使用标准检测方法进行粒径与PDI检测、Zeta电位分析。本实施例制备得到的负载mRNA的LNP的粒径、PDI和包封率的检测结果如表1所示。
表1.各组合的理化表征
以0.5mg/kg对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠通过尾静脉注射Luc-mRNA-脂质纳米颗粒，每组配方使用5只平行鼠，L5+DSPC组合因包封率太低放弃，24h通过尾静脉注射荧光底物，然后将小鼠麻醉进行活体成像以及解剖进行离体器官成像，结果如图4所示。结果显示，L1-1+DOPE组合在整体以及肝脏离体中表现最高的荧光强度，与商业化的SM102+DSPC组合呈现显著性差异。
以0.5mg/kg对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠通过肌肉注射Luc-mRNA-脂质纳米颗粒，每组配方使用5只平行鼠，L5+DSPC组合因包封率太低放弃，24h通过尾静脉注射荧光底物，然后将小鼠麻醉进行活体成像以及解剖进行离体器官成像，结果如图5所示。结果显示，在活体成像中整体荧光强度以及肝脏离体成像荧光中，L1-1+DOPE组合表现最高的荧光强度，相对于商业化SM102+DSPC组合呈现显著性差异，且在淋巴结中该组合与SM102+DSPC组合等效非劣。
组合物实施例2：L1-1与DOPE组合LNP载体制备
（1）不同N/P的L1-1-LNP实施效果例
将L1-1、DOPE、胆固醇与PEG-DMG按照设定的N/P比进行配置，参照阳离子脂质与辅助磷脂组合LNP载体制备实施例中LNP的合成步骤和配比进行，最终对LNP进行理化参数检测，包括粒径、电位、包封率。结果见表2和图6。结果显示脂质/mRNA在9.1~16.4之间呈现良好的趋势。
（2）不同L1-1摩尔百分数的L1-1-LNP实施效果例
按照L1-1的摩尔比从30%~70%区间采用L1-1、DOPE、胆固醇和PEG-DMG形成LNP，参照阳离子脂质与辅助磷脂组合LNP载体制备实施例中LNP的合成步骤进行，最终对LNP进行理化参数检测，包括粒径、电位、包封率。结果见表3和图7。结果显示在脂质四组份中L1-1摩尔百分数为30%~50%之间呈现良好的趋势。
（3）L1-1-LNP组分比例实施效果例
具体的组成配方及理化表征见表4，小鼠通过尾静脉注射EPO-mRNA-脂质纳米颗粒（EPO-mRNA对应的核苷酸序列见专利申请CN202210286081.0的SEQ ID NO:2），每组配方使用5只平行鼠，在特定时间点(6h和12h)分别采集小鼠血液。将所得的血液在4℃下5000g离心10min分离出血清，根据市售试剂盒进行ELISA分析，各项检测结果详见图8。
基于图8显示的数据，我们采用设计的配方包载EPO mRNA进行试验，按照上述的小鼠实验进行操作，具体的理化性质及EPO表达水平见表5和图9，结果显示LNP的比例为 L1-1：胆固醇：DOPE：PEG-DMG为50:16:33.5:0.5，N/P比为16.4时EPO表达量高；当L1-1：胆固醇：DOPE：PEG-DMG为48:10:40.5:1.5，N/P比为16.4时EPO表达量同样较高，两组配方均与对照组SM102的EPO表达量有显著性差异。
表2. 不同N/P比LNP的理化参数
表3.不同L1-1摩尔百分数的LNP理化参数
表4.不同L1-1-LNP组合组成及理化参数
表5. 不同L1-1-LNP组合组成及理化参数
试验例L1-1-LNP的初步安全性
按照上述表5的组合进行合成LNP，小鼠通过尾静脉注射，每组配方使用5只平行鼠，在24h分别采集小鼠血液。将所得的血液在4℃下5000g离心10min分离出血清，根据市售试剂盒进行ELISA分析AST和ALT水平，具体结果见图10。
Claims (7)
1.一种核酸递送载体组合物，其中，所述组合物包括摩尔比为（30~50）：（4~16）：（31.5~63.5）：（0.5~2.5）的阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质，所述辅助磷脂为DOPE；所述PEG缀合脂质为PEG2k-DMG；所述核酸选自mRNA、siRNA、miRNA和shRNA中的一种或多种的组合；所述阳离子脂质选自如下结构中的一种或多种的组合：
。
2.根据权利要求1所述的核酸递送载体组合物，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为（40~50）：（10~16）：（32~50）：（0.5~2）。
3. 根据权利要求1所述的核酸递送载体组合物，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为（45~50）: （10~16）：（33.5 ~44.5）: (0.5~1.5)。
4.根据权利要求1所述的核酸递送载体组合物，其中，以所述组合物总质量为100%计，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的总质量比例为94.6%~97.0%。
5. 根据权利要求1~4任意一项所述的核酸递送载体组合物，其中，所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为9.1-16.4。
6.根据权利要求1~4任意一项所述的核酸递送载体组合物，其中，阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为50:16:33.5:0.5；并且所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为16.4；或者
阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG缀合脂质的摩尔比为48:10:40.5:1.5；并且所述阳离子脂质和核酸的N/P比值为16.4。
7.权利要求1~6任意一项所述的核酸递送载体组合物在制备蛋白替代治疗药物中的应用。
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