CN101709073B

CN101709073B - 核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101709073B
Application number: CN 200910238737
Authority: CN
Inventors: 杨振军; 唐晨; 潘德林; 张礼和
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-12-01
Also published as: CN101709073A

Abstract

本发明公开了一类核苷酸磷脂化合物及其制备方法，具有通式(VIII)或(IX)的结构，基于“一釜法”策略大量简便制取得到。本发明进一步提供一类新型脂质体以及其制备方法，本发明涉及的磷脂脂质体，具有制备简单、效用良好、应用范围广泛等特点。该种脂质体可以作为研究反义寡核苷酸与小干扰RNA(siRNA)机理的分子生物学工具，也具有潜在的药物开发前景。

Description

核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物转运载体技术领域，涉及一种用于核酸跨膜转运的新型核苷酸磷脂分子及其制备方法，还涉及该核苷酸磷脂分子所形成的脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

基于核酸的一些药物和生物活性分子如异核苷、寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)及各种RNA、DNA单链和双链要想发挥其生物活性，必须能有效的解决其透过细胞膜的能力。很多技术已经被用来提高这些化合物的细胞摄取，例如，高压静脉注射、脂质体和纳米聚合物等，但是这些方法都存在各自的短板而限制其发展。

目前在核酸类分子跨膜方面应用最广泛的是脂质体载体，包括天然磷脂脂质体和阳离子脂质体。天然磷脂含负电荷，对核酸类分子的携带能力差，需要繁琐的处理和制剂设备及工艺方能制成脂质体，虽然有成本优势但是易用性差，且不可能作为转染试剂使用。阳离子脂质体虽然能高效地携带转运核酸类分子，但其对细胞膜也会造成严重损伤，虽然使用简便，但细胞毒性决定了其只能在低浓度下用于转染实验，无法大规模用于药物制剂。而且作为高效转染试剂的阳离子脂质体工艺为外国所把持，价格高昂。这一切，使得寻找高效的电中性的脂质体载体成为极为必要的举措。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一类具有高效转运核酸类化合物透膜能力的磷脂脂质体及其制备方法和应用，包括方便地大量制备核苷酸磷脂化合物并进一步形成脂质体的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的两亲性结构：

即，一个核苷结构的亲水基团和一个脂肪醇或甘油脂的亲脂基团，两种基

团由磷脂连接构成一个核苷酸磷脂分子。

其中，所述核苷酸磷脂分子中所含碱基，即式(VIII)和式(IX)中的Base基团，为各种常见的天然嘌呤和嘧啶碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等。

磷酸部分除结合亲水及亲脂基团的两个羟基之外的第三个羟基，即式(VIII)和式(IX)中的R₁基团，为长度在1nm以内，含12个碳原子以下的非离子型取代基，如甲基、乙基、腈乙基、苄基等，也可以是非取代的氢原子。

所含的脂肪醇或甘油脂的亲脂基团，即式(VIII)和式(IX)中的R₂基团，为长度在10到18个碳原子的脂肪烃或醚类取代基，可以是饱和的或不饱和的，例如十六烷基、十八烯基、聚乙二醇等。

本发明还提供所述核苷酸磷脂分子的制备方法，是亚磷酰化方法，其可以但不必须经由一釜法策略制备。

所述一釜法策略使用能够简单大量获得的试剂，在常温条件下，8小时之内得到目标化合物。该策略包括下列步骤：

(a)在无水无氧条件下的亚磷酰化反应；通过三价亚磷酰试剂构建磷脂分子，尤其是存在含有三价磷的亚磷脂化合物中间体；

(b)反应完成后蒸干溶剂，无需转移的氧化反应；

(c)氧化之后无需转移、条件温和的脱保护基反应。

进一步，所得化合物还可经由正相硅胶色谱方法纯化。

本发明进一步提供所述核苷酸磷脂分子的应用，可将其用于制备脂质体，但不仅仅局限于此一用途。

所述脂质体可以由本发明公开的核苷酸磷脂分子构成，或由本发明公开的核苷酸磷脂分子和其他化合物混合构成。这些化合物可以是胆固醇、含阳离子的磷脂、大豆磷脂等，但不仅仅局限于这一范围。

上述由本发明公开的核苷酸磷脂分子构成，或由本发明公开的核苷酸磷脂分子和其他化合物混合构成的空白脂质体可以携带核苷分子、核苷酸链、siRNA分子透过细胞膜。所述的核苷分子是指天然核苷、经由化学修饰的核苷、异核苷；所述的核苷酸链是指各种天然核苷酸链和经由化学修饰的核苷酸链，包括但不局限于单/双链寡核苷酸、直链/环状核苷酸链、脱氧/非脱氧核苷酸形成的链；所述的siRNA分子是指化学合成的siRNA分子、经由Dicer酶降解生产的siRNA分子和化学修饰的siRNA分子。

本发明进一步提供一种制备上述脂质体的方法，可以是通过制剂手段使核苷分子、核苷酸链或siRNA分子包裹在脂质体内，也可以是将空白脂质体和上述分子简单混合后孵育形成可以透过细胞膜的结合物。

本发明还提供所述脂质体的用途，可以作为转染试剂，携带基因分子透过细胞膜；所述的基因分子指携带遗传性息的DNA单链、RNA单链、DNA双链、RNA双链及其他可以用作质粒转染的DNA分子。

本发明可以实现以下优点：提供了一类核苷和各种核酸的高效透膜载体，低细胞毒性，体内可降解为内源性物质，且使用简便；且该类载体经由一釜法完成的合成路线及简单的纯化方法制备得到，具有相对低廉的制造成本。本发明涉及的磷脂脂质体，具有制备简单、效用良好、应用范围广泛等特点，是一类膜透性好的载体分子，可用于介导核苷酸类化合物如siRNA、质粒的透膜。该种脂质体可以作为研究反义寡核苷酸与小干扰RNA(siRNA)机理的分子生物学工具，或一种通用的转染试剂，同时也具有潜在的药物开发前景。

附图说明

图1为代表性化合物B的合成路线；

图2为代表性化合物B的核磁共振氢谱谱图；

图3为代表性化合物F的合成路线；

图4为毛细管电泳评价脂质体对核酸链的亲和力；

图5为荧光法观测脂质体内包合siRNA的情况及使用其进行细胞转染的结果，其中A表示HEK293细胞系转染实验；B表示BT474细胞系转染实验；C和D表示激光共聚焦显微观测脂质体-核酸复合物颗粒。

具体实施方式

一、核苷酸磷脂化合物的合成

根据本发明，制备核苷酸磷脂化合物的合成方法，主要包括以下步骤：

A.使用式(I)的结构与式(II)或式(III)通过亚磷酰化方法构建式(IV)化合物或式(V)化合物，即在无水无氧条件下进行亚磷酰化反应，亚磷酰试剂式(I)R₁基团为一短的亲脂基团，可以是但不局限于甲基、腈乙氧基、苄基；

B.对式(IV)、式(V)的亚磷酰进行氧化，氧化剂可以是但不局限于双氧水、过氧叔丁醇，得到式(VI)和式(VII)；

C.将式(VI)和式(VII)脱除DMTr保护，从而形成核苷酸磷脂分子式(VIII)和式(IX)。

以上所示Base为各种常见的天然嘌呤和嘧啶碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等；

以上所示R₁为长度在1nm以内，含12个碳原子以下的不含电荷的取代基，如甲基、乙基、腈乙基、苄基等；

以上所示R₂为长度在10到18个碳原子内的脂肪烃取代基，为长度在10到18个碳原子的脂肪烃或醚类取代基，可以是饱和的或不饱和的，例如十六烷基、十八烯基、聚乙二醇等。

(1)一釜法策略

根据本发明，核苷酸磷脂化合物的制备应通过包括下列步骤的方法实现：(a)在无水无氧条件下的亚磷酰化反应；(b)反应完成后蒸干溶剂，无需转移的氧化反应；(c)氧化之后无需转移条件温和的脱保护基反应；

根据本发明，用于亚磷酰化的试剂可以是1H-四氮唑。

根据本发明，用于脱除DMTr保护基的试剂可以是三氟乙酸(TFA)。

根据本发明，用于反应的溶剂包括，但不限于：吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。

(2)纯化方法

一釜法合成核苷酸磷脂之后的产物可进一步经由正相硅胶色谱方法纯化，以二氯甲烷∶甲醇＝50∶1～10∶1(体积比)的洗脱条件可分离纯化上述系列核苷酸磷脂产物。

以下通过具体合成的实施例进一步说明本发明，但不代表对本发明有任何限制。

根据上述的方法，我们得到了一系列核苷酸磷脂化合物，代表性的例举其中六个化合物A-F：

实施例1化合物B的合成

反应路线如图1所示。

取化合物B1(亚磷酰化核苷单体均购自国药集团，为DNA合成常用化合物，市场来源广泛)(740mg)，1H-四唑(70mg)，无水无氧条件下混合，溶于双蒸无水CH₃CN 15ml中，搅拌。取化合物正十六醇(棕榈醇)(360mg)，溶于10ml双蒸无水CH₃CN中，缓缓注入前述搅拌反应中。室温继续搅拌反应2小时，TLC鉴定反应基本完全后冰浴降温。

冰浴搅拌下逐滴滴加过氧叔丁醇(0.3ml，4eq.)，观察无剧烈放热后撤去冰浴，继续反应30分钟。然后向反应体系中加入30ml 5％CHCl₂COOH的CH₂Cl₂溶液，室温搅拌反应15分钟，TLC鉴定反应完全后，硅胶柱层析(环己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)分离，产物为白色小胶珠状固体，完全抽干后为贴壁白色间带红色固体，共计390mg，总收率66％.

产物核磁氢谱检验如图2所示。

¹H NMR(CD₃OD)：δ7.73(s，1H)，6.24(t，1H，J＝6.0Hz，1H)，5.01(m，1H)，4.78-4.08(m，5H)，3.73(d，J＝2.8，2H)，2.83(m，2H)，2.48(m，1H)，2.34(m，1H)，1.81(s，3H)，1.62-1.67(m，2H)，1.33(s，26H)，0.82(t，J＝7.2Hz，3H).

高分辨质谱得MS：m/z 600.3409[M+H]⁺.

实施例2化合物F的合成

反应路线如图3所示。

取化合物F1(购自国药集团)(400mg)，1H-四唑(40mg)，无水无氧条件下混合，溶于双蒸无水CH₃CN 10ml中，搅拌。取化合物正十二醇(180mg)，溶于10ml双蒸无水CH₃CN中，缓缓注入前述搅拌反应中。室温继续搅拌反应2小时，TLC鉴定反应基本完全后冰浴降温。

冰浴搅拌下逐滴滴加过氧叔丁醇(0.2ml)，观察无剧烈放热后撤去冰浴，继续反应30分钟。然后向反应体系中加入25ml 5％CHCl₂COOH的CH₂Cl₂溶液，室温搅拌反应15分钟，TLC鉴定反应完全后，注入饱和浓氨水10ml，搅拌反应30分钟，TLC鉴定反应完全后，以硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1)分离，产物为白色小胶珠状固体，共计183mg，总收率73％.

高分辨质谱得MS：m/z 514.3233[M+H]⁺.

本发明要求权利的系列化合物都可以用和产物相对应的原料，以上述方法合成，故不再一一赘述。

二、核苷酸磷脂脂质体的制备

(1)空白脂质体的制备：

经过纯化后的上述核苷酸磷脂化合物可用于制备空白脂质体，通过以下方法实施：

(a)将核苷酸磷脂的乙醇溶液通过薄膜分散法制为空白脂质体；

(b)透析去小分子杂质；

(c)冻干。

该空白脂质体可按照中华人民共和国药典中关于脂质体药物载体的使用方法，用做各种药物的载体。

(2)脂质体-核酸复合物的制备：

除预制空白脂质体用于包载药物之外，本发明公开的系列核苷酸磷脂化合物还可以通过溶液状态与核酸分子相互作用，形成脂质体-核酸复合物，从而发挥转染试剂的作用。具体通过以下方法实施：

(a)将核苷酸磷脂分散在乙醇∶水＝100∶0～50∶50的溶液中；

(b)将上述溶液同核酸(如siRNA、反义寡核苷酸、质粒)溶液混合；

(c)将上述混合液25摄氏度下振摇孵育30分钟；

(d)上述孵育后混合液即为脂质体-核酸复合物，可以直接用于细胞转染，也可以通过薄膜法、冻融法等方法修饰粒径或进一步提高包封率。

根据本发明，用于制备脂质体和透析的主要溶剂包括，但不限于，去离子水(H₂O)、吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。其中具体操作方法为相关专业人员所熟知，故不再赘述。

三、根据本发明，核苷酸磷脂脂质体可以用于以下用途：

A.siRNA透膜转运：

核苷酸磷脂脂质体可以用于协助siRNA的透膜转运。通过制备脂质体包裹的siRNA或者将siRNA和核苷酸磷脂简单共孵育制得的复合物，可以有效的将siRNA转运进细胞膜。

B.寡核苷酸透膜转运：

寡核苷酸也可以用和A所述同样的方式进行转运。

C.基因转染：

本发明也可以用作基因转染试剂，通过将核苷酸磷脂和质粒进行大约30分钟的简单共孵育，即能形成转染复合物，完成有效转染。

应用实例1：对寡核苷酸双链的结合能力；

使用21个碱基对长度的双链DNA和化合物合成方法举例中的核苷酸磷脂化合物C，对比在有无脂质体参与情况下DNA双链的毛细管电泳行为，说明该类脂质体对寡核苷酸的结合能力，如图4所示。

实验条件：

所用双链DNA序列(购买自北京奥科生物技术有限公司)如下：

5’-TCGGGAAATTTCTCTATTATT-3’

3’-TTAGCCCTTTAAAGAGATAAT-5’

所用核苷酸磷脂化合物C为其乙醇的真溶液。

毛细管电泳实验温度25℃，检测波长254nm，电泳电压25kV，流动相缓冲液为25mM TBE，pH＝8.0。图中所示峰为溶液中游离的双链DNA的检出峰。所用DNA为0.2od/μL的21碱基dsDNA在25mM的TBE中的溶液。

图4中所示三条曲线，自上而下分别为：

(1)DNA：仅以DNA双链溶液单独进行毛细管电泳；

(2)0’：以DNA双链和50倍质量当量的核苷酸磷脂混合振摇后立刻进行毛细管电泳；

(3)30’：以DNA双链和50倍质量当量的核苷酸磷脂混合后振摇30分钟再进行毛细管电泳。

电泳结果显示，加入该种磷脂后，溶液中游离的双链DNA片段大幅减少，说明该磷脂可以迅速捕捉结合双链DNA寡核苷酸片段。

应用实例2：转染和透膜能力，如图5所示。

转染实验：使用化合物合成方法举例中的核苷酸磷脂B和羧基荧光素(FAM)荧光标记的siRNA(序列如下，购买自北京奥科生物技术有限公司)混合孵育，即将核苷酸磷脂B的乙醇真溶液加入到siRNA中孵育，在激光共聚焦显微下能够观察到脂质体-siRNA复合物(图5C、D，脂质体中可见明显绿色荧光聚集)；以粒度仪检测该复合物的平均粒径为350nm。将该复合物和细胞共孵育后，观察到细胞内荧光(图5A、B)，证明siRNA已被转染入细胞内。

实验所用siRNA序列：

5’-UCGGGAAAUUUCUCUAUUAdTdT-3’

3’-dTdTAGCCCUUUAAAGAGAUAAU-5’

本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。

此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。

Claims

1.一种核苷酸磷脂分子，其具有如式(VIII)或式(IX)所示的两亲性结构：

即，一个核苷结构的亲水基团和一个脂肪醇或甘油脂的亲脂基团，两种基团由磷脂连接构成一个核苷酸磷脂分子；

其中所含碱基，即式(VIII)和式(IX)中的Base基团，为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；

其中磷酸部分除结合亲水及亲脂基团的两个羟基之外的第三个羟基，即式(VIII)和式(IX)中的R₁基团，为甲基或腈乙基；

其中所含的脂肪醇或甘油脂的亲脂基团，即式(VIII)和式(IX)中的R₂基团，为长度在10到18个碳原子的饱和脂肪烃取代基。

2.根据权利要求1所述核苷酸磷脂分子，其中的R₂基团为十六烷基。

3.一种制备权利要求1所述核苷酸磷脂分子的方法，包括下列步骤的方法实现：

(a)在无水无氧条件下的亚磷酰化反应；通过三价亚磷酰试剂构建含有三价磷的亚磷脂化合物中间体；

(b)反应完成后蒸干溶剂，无需转移的氧化反应；

(c)氧化之后无需转移、条件温和的脱保护基反应。

4.根据权利要求3所述的制备方法，进一步包括脱除保护基完成后经由正相硅胶色谱方法进行纯化。

5.一种脂质体，其是由权利要求1所述的核苷酸磷脂分子构建；该脂质体单独由权利要求1所述的核苷酸磷脂分子构成，或由权利要求1所述的核苷酸磷脂分子和其他化合物混合构成；

其中，所述其他化合物是胆固醇、含阳离子的磷脂或大豆磷脂。

6.根据权利要求5所述的脂质体，携带核苷分子、核苷酸链或siRNA分子；所述的核苷分子是指天然核苷、经由化学修饰的核苷、异核苷；所述的核苷酸链是指各种天然核苷酸链和经由化学修饰的核苷酸链；所述的siRNA分子是指化学合成的siRNA分子、经由Dicer酶降解生产的siRNA分子和化学修饰的siRNA分子。

7.根据权利要求6所述的脂质体，其中所述的核苷酸链包括单/双链寡核苷酸、直链/环状核苷酸链或脱氧/非脱氧核苷酸形成的链。

8.一种制备权利要求6-7任一项所述脂质体的方法，是通过制剂手段使核苷分子、寡核苷酸链或siRNA分子包裹在脂质体内，或是将空白脂质体和上述分子简单混合后孵育形成可以透过细胞膜的结合物。

9.权利要求6-7任一项所述脂质体用于制备作为携带基因分子透过细胞膜的转染试剂的用途，其中所述的基因分子指携带遗传性息的DNA单链、RNA单链、DNA双链、RNA双链及其他用作质粒转染的DNA分子。