CN110257374A - 核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents
核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110257374A CN110257374A CN201910269905.1A CN201910269905A CN110257374A CN 110257374 A CN110257374 A CN 110257374A CN 201910269905 A CN201910269905 A CN 201910269905A CN 110257374 A CN110257374 A CN 110257374A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- biconial
- dota
- nano
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 179
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 29
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 27
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 23
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 22
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N Tetraxetan Chemical compound OC(=O)CN1CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC1 WDLRUFUQRNWCPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000010792 warming Methods 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910003317 GdCl3 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 4
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 47
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 abstract description 25
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 abstract description 25
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 abstract description 18
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 8
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- RJOJUSXNYCILHH-UHFFFAOYSA-N gadolinium(3+) Chemical compound [Gd+3] RJOJUSXNYCILHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- QBPPRVHXOZRESW-UHFFFAOYSA-N 1,4,7,10-tetraazacyclododecane Chemical compound C1CNCCNCCNCCN1 QBPPRVHXOZRESW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052775 Thulium Inorganic materials 0.000 description 1
- QOBLJVUECBDJGF-UHFFFAOYSA-N [Mg].CC(O)=O Chemical compound [Mg].CC(O)=O QOBLJVUECBDJGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004774 atomic orbital Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- UYFPKVFXUSSLHS-UHFFFAOYSA-N ethene gadolinium Chemical group [Gd].C=C.C=C UYFPKVFXUSSLHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- GFSTXYOTEVLASN-UHFFFAOYSA-K gadoteric acid Chemical compound [Gd+3].OC(=O)CN1CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC1 GFSTXYOTEVLASN-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000005408 paramagnetism Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0052—Small organic molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
- A61K49/103—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being acyclic, e.g. DTPA
- A61K49/105—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being acyclic, e.g. DTPA the metal complex being Gd-DTPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/101—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals
- A61K49/106—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA
- A61K49/108—Organic compounds the carrier being a complex-forming compound able to form MRI-active complexes with paramagnetic metals the complex-forming compound being cyclic, e.g. DOTA the metal complex being Gd-DOTA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/12—Macromolecular compounds
- A61K49/126—Linear polymers, e.g. dextran, inulin, PEG
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Abstract
本发明提供一种核磁‑光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及其制备方法与应用。所述双模态成像DNA探针由DNA纳米结构、核酸适配体、化学荧光分子和核磁共振成像造影剂制备得到。本发明提供的DNA探针提高了核磁共振成像造影剂和化学荧光分子在体循环中的稳定性,减少了钆离子可能产生的生物毒性,并且利用核酸适配体提高了对肿瘤的靶向性,在钆含量仅为临床剂量1/20的情况下保持了与临床核磁造影剂相当的T1弛豫效能,具有核磁共振成像和荧光成像的协同效果,达到了更高的肿瘤成像分辨率和灵敏度,为肿瘤早期诊断提供有力技术手段。
Description
技术领域
本发明属于纳米医学领域,具体地说,涉及一种核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
核磁共振成像(MRI)由于具有高成像分辨率、低干扰、可在任意方向及平面成像的优点,被广泛应用于肿瘤诊断中。核磁共振成像造影剂是指缩短人体组织的Tl和T2等弛豫时间来增加影像的对比的制剂,利用顺磁性或超顺磁性物质的制剂成为主流。利用造影剂来扩增所需组织的全部或部分信号,或者弱化周边组织的信号,从而能将明暗对比放大。钆(Gd)是一种稀土金属元素,其原子轨道含有七个未成对电子,是未成对电子数最多的金属元素。利用这个不成对电子的磁力矩可有效检测钆周围的环境,是常见的核磁造影剂组成元素。为了降低钆离子产生的生物毒性,临床使用的造影剂多为钆络合物,钆-二乙烯二胺五醋酸(DTPA)的络合物最为常见。钆络合物在T1加权成像中可以达到很高的分辨率。然而,由于钆造影剂具有非特异性,核磁成像灵敏度较低,因此肿瘤的早期诊断较为困难。而提高造影剂的用量也会增加钆在体内产生毒害作用的风险。
纳米材料的诞生为钆造影剂提供了有力的辅助。使用纳米材料作为载体,不仅保持了钆造影剂原有的成像效率,还可以一定程度上增加造影剂在肿瘤部位的富集,降低造影剂的非特异性导致的全身毒性。在纳米材料上修饰靶向官能团可以有效提高造影剂对肿瘤的靶向性。DNA纳米材料具备形貌可控性、可寻址性、可修饰性等优势,另外,作为生物大分子,DNA具有其他材料不可比拟的生物安全性,这为DNA纳米材料作为药物载体提供了强有力的支持。目前,研究成果显示DNA纳米结构作为金属纳米粒子、药物分子及其他生物大分子的载体,可被应用于肿瘤的成像与治疗。基于沃森-克里克的碱基互补配对原则,若干条寡核苷酸序列可以配对杂交形成预先设计好的结构。通过这项技术,可以简单方便地制备结构复杂的二维或三维自组装DNA纳米材料。通过单链DNA修饰的钆络合物也可以通过杂交的方式连接到DNA纳米结构上。
近红外荧光成像具有高灵敏度以及高组织穿透率的特点,可以弥补核磁共振成像的低灵敏度问题。将合适的荧光分子修饰在单链DNA末端,再杂交到DNA纳米结构的特定位点,即可实现核磁-光学的双模态成像。
发明内容
本发明的目的是提供一种核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的,本发明提供一种核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,所述双模态成像DNA探针由DNA纳米结构、核酸适配体、化学荧光分子和核磁共振成像造影剂制备得到。
第一方面,本发明提供一种核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
A、将单链DNA的5’端修饰氨基,3’端修饰荧光分子(如Cy3);
B、修饰后的单链DNA与DOTA-NCS反应生成DNA-DOTA;
C、DNA-DOTA与可溶性Gd盐发生络合反应,得到螯合Gd的DNA-DOTA[产物DNA-DOTA(Gd)];
D、将15条短序列单链DNA与1-9条(优选9条)所述螯合Gd的DNA-DOTA杂交得到双锥形纳米DNA;
E、将双锥形纳米DNA与聚乙二醇-聚赖氨酸孵育,得到表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA;
F、将表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA与核酸适配体混合,组装得到核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针;
其中,步骤A中所述单链DNA的核苷酸序列为:5′-TTTTCGCATGTGCTT-3′。(SEQ IDNO:1)
优选地,修饰后的单链DNA为:5′-NH2-TTTTCGCATGTGCTT-Cy3-3′。
步骤D中所述15条短序列单链DNA的核苷酸序列分别为:(SEQ ID NO:2-16)
1)5′-CCGCCGGCAGCCGGCAAGTAAGAGTTTGCCTGGAGCCTGCTAAGCACATGCGA-3′
2)5′-CGTGCATTTCGTCTACACAATCCTAGTCTGCAAGCACATGCGA-3′
3)5′-CTGCCACACACTGGATTTACACAAAGTATGTGGG-3′
4)5′-TTGTGTAGACGAAATGCACGAGCAGGCTCCTGGACTGTTGTTTCTGAAGCACATGCGA-3′
5)5′-AGCCTAGTCCGGACCTTGTAAGACATTCCGCCGGTAAGGCTCACGGACAAAGTATGTGGG-3′
6)5′-GGTCCGGACTAGGCTCAGAAACAACAGTCCTGCCATTGACCAAGCACATGCGA-3′
7)5′-fluorophore-TTCACTGGCGGCGGTCGCCATGGATCCAGCGAAGCACATGCGA-3′
8)5′-CACTTCACCAGGAGGCCTGGACAAAGTATGTGGG-3′
9)5′-GGCAAACTCTTACTTGCCGGAAGCACATGCGA-3′
10)5′-CTGCCGGCGGTTGAAACCGACGGTACGCTTTAAGCACATGCGA-3′
11)5′-GAATATGAATTTGGCGACCGCCGCCAGTGAAGGTCAATGGCACAAAGTATGTGGG-3′
12)5′-GGCAGAGCGTTTGTGGAAACCATTAGGTTTTCCGTGAGCCTTACCGAAGCACATGCGA-3′
13)5′-GCGGAATGTCTTACATCCAGGCCTCCTGGTGAAGTGCGCTGGATCCACAAAGTATGTGGG-3′
14)5′-GTAAATCCAGTGTGTGGCAGGCAGACTAGGTAAACCTAATGGTTTCAAGCACATGCGA-3′
15)5′-CACAAACGCTCTGCCTATTCATATTCAAAGCGTACCGTCGGTTTCA-3′
步骤F中所述核酸适配体的核苷酸序列为:(SEQ ID NO:17)
5′-GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU-3′。所述核酸适配体可以识别表皮生长因子受体(EGFR)。
其中步骤D所述序列为组装双锥形DNA纳米结构骨架所需序列,步骤A中用于螯合Gd的序列与步骤D中序列1)、2)、4)、6)、7)、9)、10)、12)、14)互补配对,步骤F中所述核酸适配体序列与步骤D中序列3)、5)、8)、11)、13)互补配对。
步骤A中所述荧光分子可选自Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5,优选Cy3。
步骤D中15条短序列单链DNA中的序列7)修饰有荧光分子Dylight 800或Cy5.5。
本发明中,所述DOTA可替换为DTPA。
步骤F中所述聚乙二醇-聚赖氨酸优选为PEG5K-K10。
所述核酸适配体的核苷酸2’位为氟代。所述核酸适配体可以识别EGFR,其核苷酸序列为:5′-GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU-3′。
步骤B中所述DOTA-NCS的摩尔用量是单链DNA的100倍过量。
步骤C中所述可溶性Gd盐的摩尔用量是所述DNA-DOTA的100倍过量。
步骤E中所述聚乙二醇-聚赖氨酸中氮元素与所述双锥形纳米DNA中磷元素的摩尔比为0.5:1、1:1或2:1,优选1:1。
在本发明的一个具体实施方式中,制备所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的方法包括以下步骤:
1)将单链DNA的5’端修饰氨基,3’端修饰Cy3,修饰后的单链DNA溶解于80%DMSO中,得到浓度为200mM的单链DNA溶液。
2)将单链DNA溶液与DOTA-NCS混合于HEPES缓冲液I(0.1M pH=9,含300mM MgCl2)中,加入磁子搅拌,37℃水浴中反应18-24h(优选24h),得到DNA-DOTA。
3)将DNA-DOTA置换到HEPES缓冲液II(0.1M pH=5)中,用3KDa滤柱以8000-10000rpm离心3-4次,每次离心10-15min(优选10000rpm离心3次,每次离心15min),得到DNA-DOTA溶液;将DNA-DOTA溶液(100μM)与GdCl3溶液(2mM)在37℃水浴中搅拌18-24h(优选24h),发生络合反应,得到螯合Gd的DNA-DOTA溶液[产物DNA-DOTA(Gd)];将所得DNA-DOTA(Gd)产物在16%丙烯酰胺分离胶中进行纯化,用荧光光谱通过Cy3进行定量。
4)将10μM 15条短序列单链DNA溶液(每条序列各10μM)与10μM 9条螯合Gd的DNA-DOTA溶液混合于pH8.3的1×TA/Mg2+缓冲液(4×10-2M Tris,2×10-2M乙酸,1.25×10-2M醋酸镁)中,升温至90-95℃,保持5-8min后迅速降温至2-8℃(优选升温至95℃,保持5min后迅速降温至4℃),得到双锥形纳米DNA。
5)将双锥形纳米DNA与聚乙二醇-聚赖氨酸PEG5K-K10在室温下混合孵育30-60min,得到表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA;其中赖氨酸中的氮元素与DNA中磷元素的摩尔比为1:1;
6)将表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA与50μM EGFR核酸适配体溶液混合,升温至40-50℃保持2-10分钟,然后降温至20-25℃保持2-10分钟,重复5-7个循环(优选地,升温至45℃保持5分钟,然后降温至25℃保持5分钟,重复7个循环),完成组装得到核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
其中,步骤6)中所述EGFR核酸适配体的核苷酸序列为:5′-GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU-3′。所述核酸适配体的核苷酸2’位为氟代。
第二方面,本发明提供按照上述方法制备的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
第三方面,本发明提供所述DNA纳米探针的以下任一应用:
i.用于核磁共振成像;
ii.用于荧光成像;
iii.用于肿瘤核磁共振成像和/或荧光成像造影剂的制备;
iv.用于肿瘤早期诊断;
v.用于肿瘤成像。
第四方面,本发明提供用于肿瘤核磁共振成像和/或荧光成像的造影剂,包含所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
本发明提供的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,所述DNA探针是由DNA自组装技术制备的双锥形三维DNA纳米结构。
优选地,所述DNA探针是由多条短序列DNA单链通过碱基互补配对自组装形成的双锥形三维DNA纳米结构。
本发明提供的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,所述核酸适配体是可以识别表皮生长因子受体的EGFR核酸适配体。
本发明提供的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,所述核磁成像造影剂为单链DNA5’修饰的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(钆),另外单链DNA3’修饰Cy3分子用于定量。
本发明提供的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,所述化学荧光分子为Dylight 800、Cy5.5,在进行小动物活体荧光成像时,为避免修饰钆的DNA单链上荧光分子的影响,优选为Dylight 800。
本发明提供所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)用单链DNA修饰1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)并螯合钆;
(2)制备双锥形DNA纳米结构并与DNA修饰的DNA-DOTA(Gd)进行组装;
(3)在步骤(2)得到的DNA纳米结构表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG5K-K10);
(4)将步骤(3)得到的已修饰的DNA纳米结构与核酸适配体进行组装,得到所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
前述的方法,步骤(1)所述核磁成像造影剂由两步有机化学反应制备得到。第一步,5’端氨基修饰的单链DNA,在HEPES(pH=9)缓冲溶液中与DOTA-NCS反应并相连;第二步,将DNA-DOTA置换到HEPES(pH=5)缓冲溶液中,与GdCl3发生络合反应,得到DNA-DOTA(Gd)。将所得产物在16%丙烯酰胺分离胶中进行纯化。所述DOTA相对于单链DNA约100倍过量,Gd离子相对于DNA-DOTA约100倍过量。
前述的方法,步骤(2)所述组装步骤为:将15条短序列单链DNA(其中一条修饰有Dylight 800)与DNA-DOTA(Gd)在1×TA/Mg2+缓冲溶液中混合,升温至90-95℃,保持5-8min后迅速降温至2-8℃,完成组装。
前述的方法,步骤(3)所述修饰方法为,将制备并提纯好的双锥形DNA纳米结构与聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG5K-K10)在室温下混合孵育30-60min,在浓度方面,优选地,使赖氨酸中氮与DNA中磷的摩尔比为1:1,此时双锥形DNA纳米结构表面呈电中性。这一步骤修饰的目的是提高DNA纳米结构在溶液中的稳定性和分散性。
前述的方法,步骤(4)所述组装步骤为:将步骤(3)得到的已修饰的双锥形DNA纳米结构与核酸适配体混合,升温至40-50℃,然后降温至20-25℃,每个温度下保持2-10分钟,重复5-7个循环,完成组装。例如可将温度升高至40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃;然后降温至20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃;每个温度下保持2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟;
优选地,步骤(4)所述组装步骤为:将步骤(3)得到的已修饰的双锥形DNA纳米结构与核酸适配体混合,升温至45℃,然后降温至25℃,每个温度下保持5分钟,重复7个循环,完成组装。
所述核酸适配体的核苷酸2’位为氟代。
作为优选的技术方案,本发明提供的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)用单链DNA修饰1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)并螯合钆;
(2)制备双锥形DNA纳米结构并与DNA修饰的DNA-DOTA(Gd)进行组装;
(3)在步骤(2)得到的DNA纳米结构表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG5K-K10);
(4)将步骤(3)得到的已修饰的DNA纳米结构与EGFR核酸适配体进行组装,得到所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针(图1)。
本发明还提供所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针在肿瘤成像诊断中的应用。本发明DNA探针中的DNA纳米结构载有核磁共振成像造影剂和荧光分子,可以达到核磁和光学的双模态成像效果。
本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明通过DNA自组装构建一个DNA纳米小结构,并通过分子杂交技术连接核磁造影剂、荧光分子和表皮生长因子核酸适配体,可以起到靶向肿瘤部位进行成像的效果。核磁成像具有高分辨率的特点,而荧光成像的灵敏度较高,两者可以互补,协同作用,使成像更为高效。
(二)本发明制备的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针由聚乙二醇-聚赖氨酸修饰,可以增加在体内的稳定性,同时降低了钆元素对组织器官可能产生的毒副作用。高稳定性也使得该DNA探针在体内的滞留时间长,在2h后仍有较强的成像信号。而作为对照组的DTPA(Gd)更容易被代谢,T1加权成像效果低于本发明所述DNA探针。
(三)由于本发明所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针具有EGFR核酸适配体介导的靶向作用,与DTPA(Gd)相比,不仅成像效果好,而且也降低了非特异性导致的全身毒性。同时,高靶向性也降低了该探针的注射剂量,约为临床剂量(0.001mol/kg)的1/20。
(四)本发明提供的DNA探针提高了核磁共振成像造影剂和化学荧光分子在体循环中的稳定性,减少了钆离子可能产生的生物毒性,并且利用核酸适配体提高了对肿瘤的靶向性,具有核磁共振成像和荧光成像的协同效果,达到了更高的肿瘤成像分辨率和灵敏度。
(五)本发明提供的DNA探针提高了核磁共振成像造影剂和化学荧光分子在体循环中的稳定性,减少了钆离子可能产生的生物毒性,并且利用核酸适配体提高了对肿瘤的靶向性,在钆含量仅为临床剂量1/20的情况下保持了与临床核磁造影剂相当的T1弛豫效能,具有核磁共振成像和荧光成像的协同效果,达到了更高的肿瘤成像分辨率和灵敏度,为肿瘤早期诊断提供有力技术手段。
附图说明
图1为本发明核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的结构示意图,修饰有核酸适配体、荧光分子以及核磁成像造影剂。
图2为本发明实施例1中制备的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的凝胶分析和表征。其中,a是用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对该DNA纳米探针进行的结构分析。其中泳道1、2、3、4分别代表未组装DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构、组装DNA-DOTA(Gd)后的双锥形DNA纳米结构、在BiN基础上修饰了EGFR核酸适配体的双锥形DNA纳米结构、修饰过PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构在硫酸软骨素中孵育除去PEG5K-K10后的结构。b、c是对组装的DNA探针和修饰PEG5K-K10后的DNA探针进行的原子力显微镜表征,图中标尺为50nm。
图3为本发明实施例3中利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)测试的MDA-MB-231细胞对核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及各对照组结构的摄入结果。
图4为本发明实施例4中利用小动物活体荧光成像系统对核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及各对照组结构在荷瘤小鼠体内分布进行的成像结果。
图5为本发明实施例5中利用小动物核磁成像系统和小动物活体荧光成像系统对注射核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的荷瘤小鼠进行的活体双模态成像结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例中所用仪器和材料如下:
仪器:Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf,德国),荧光分光光度计(Perkinelmer,美国),原子力显微镜(Bruker,德国),电感耦合等离子质谱仪(Perkinelmer,美国),激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss,德国),流式细胞仪(Bioscience),小动物荧光活体成像系统(Perkinelmer,美国),小动物核磁共振成像系统(Bruker,德国)。
原料:短序列核苷酸链(PAGE纯化)、EGFR核酸适配体(HPLC纯化)购自北京擎科生物技术有限公司,带Dylight800修饰单链DNA购自日本Takara公司,DOTA-NCS购自美国Alamada公司,PEG5K-polylysine10(PEG5K-K10)购自美国Microcyclics公司,细胞培养基购自维森特生物技术有限公司,其他试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。
试剂:实验中所用的缓冲溶液有TA/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)、PBS缓冲溶液(pH 7.4)和HEPES缓冲溶液(pH 5.0,pH 9.0)。其中,1×TA/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为:4×10- 2mol·L-1Tris,2×10-2mol·L-1乙酸和1.25×10-2mol·L-1醋酸镁;1×PBS缓冲溶液(pH7.4)的组成为:136.9×10-3mol·L-1(8.00g·L-1)NaCl,2.68×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KCl,9.75×10-3mol·L-1(1.56g L-1)Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol·L-1(0.20g L-1)KH2PO4;HEPES缓冲溶液的组成为:HEPES酸和HEPES碱。这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯,购自Sigma-Aldrich公司。
细胞:MDA-MB-231三阴性人乳腺癌细胞系,购自中国协和医科大学基础医学研究所。
培养基:DMEM高糖培养基,添加10%胎牛血清,细胞接种于100mm2培养皿中,置于5%CO2培养箱,37℃培养,当细胞生长至融合度80%左右时传代;所用培养基和胎牛血清购自Life Technology公司。
实验动物:裸鼠(雌性,5-6周龄,16-17g)及饲料购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物实验均依照中国科学院国家纳米科学中心动物管理与使用规章进行。
实施例1 核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备
本实施例采用以下方法制备核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针,包括以下步骤:
1、DNA-DOTA(Gd)核磁共振成像造影剂的制备
该核磁共振成像造影剂由两步有机化学反应制备得到。具体步骤如下:第一步,5’端氨基修饰,3’端Cy3修饰的单链DNA溶解于去离子水中,浓度调整至200μM;DOTA-NCS溶解于80%DMSO中,浓度调整至200mM;单链DNA和DOTA-NCS混合于0.1M HEPES(pH=9,含300mMMgCl2)缓冲溶液中,加入磁子搅拌,在37℃水浴中反应24h。此步反应为氨基和异硫氰根的偶联反应。第二步,将得到的DNA-DOTA置换到0.1M HEPES(pH=5)缓冲溶液中,用3KDa滤柱离心3次(10000rpm,15min)。将置换好的DNA-DOTA溶液(100μM)与2mM GdCl3发生络合反应,同样在37℃水浴中搅拌反应24h。将所得DNA-DOTA(Gd)产物在16%丙烯酰胺分离胶中进行纯化,用荧光光谱通过Cy3进行定量。
2、双锥形DNA纳米探针的制备
相同浓度(10μM)已纯化好的15条短序列单链DNA和9条DNA-DOTA(Gd)(5′-Gd-DOTA-TTTTCGCATGTGCTT-Cy3-3′)混合于1×TA/Mg2+缓冲溶液(pH=8.3)中,升温至95℃,保持5min后迅速降温至4℃,得到杂交有DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构;将双锥形DNA纳米结构与聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG5K-K10)在室温下混合孵育30min,调整使赖氨酸中氮与DNA中磷的摩尔比为1:1。将得到的已修饰的双锥形DNA纳米结构与EGFR核酸适配体(5′-GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU-3′)(50μM)混合,升温至45℃,而后降温至25℃,每摄氏度保持5分钟,重复7个循环,完成组装(图1)。
所述15条短序列单链DNA的核苷酸序列分别为:
1)5′-CCGCCGGCAGCCGGCAAGTAAGAGTTTGCCTGGAGCCTGCTAAGCACATGCGA-3′
2)5′-CGTGCATTTCGTCTACACAATCCTAGTCTGCAAGCACATGCGA-3′
3)5′-CTGCCACACACTGGATTTACACAAAGTATGTGGG-3′
4)5′-TTGTGTAGACGAAATGCACGAGCAGGCTCCTGGACTGTTGTTTCTGAAGCACATGCGA-3′
5)5′-AGCCTAGTCCGGACCTTGTAAGACATTCCGCCGGTAAGGCTCACGGACAAAGTATGTGGG-3′
6)5′-GGTCCGGACTAGGCTCAGAAACAACAGTCCTGCCATTGACCAAGCACATGCGA-3′
7)5′-fluorophore-TTCACTGGCGGCGGTCGCCATGGATCCAGCGAAGCACATGCGA-3′
8)5′-CACTTCACCAGGAGGCCTGGACAAAGTATGTGGG-3′
9)5′-GGCAAACTCTTACTTGCCGGAAGCACATGCGA-3′
10)5′-CTGCCGGCGGTTGAAACCGACGGTACGCTTTAAGCACATGCGA-3′
11)5′-GAATATGAATTTGGCGACCGCCGCCAGTGAAGGTCAATGGCACAAAGTATGTGGG-3′
12)5′-GGCAGAGCGTTTGTGGAAACCATTAGGTTTTCCGTGAGCCTTACCGAAGCACATGCGA-3′
13)5′-GCGGAATGTCTTACATCCAGGCCTCCTGGTGAAGTGCGCTGGATCCACAAAGTATGTGGG-3′
14)5′-GTAAATCCAGTGTGTGGCAGGCAGACTAGGTAAACCTAATGGTTTCAAGCACATGCGA-3′
15)5′-CACAAACGCTCTGCCTATTCATATTCAAAGCGTACCGTCGGTTTCA-3′
其中,序列7)中fluorophore为Dylight 800。
图2是对实施例1得到的产物核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针进行的凝胶分析和表征。a是用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对该DNA纳米探针进行的结构分析。其中BiN-NG代表未组装DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构,BiN代表组装DNA-DOTA(Gd)后的双锥形DNA纳米结构,EBiN代表在BiN基础上修饰了EGFR核酸适配体,EPBiN-NP代表修饰过PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构在硫酸软骨素中孵育除去PEG5K-K10后的结构。由电泳图可知,与未组装的双锥形DNA纳米结构相比,随着DNA-DOTA(Gd)和EGFR核酸适配体的逐步组装,该结构分子量增大,在泳道中移动速度变慢,证明了核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的成功组装。
b和c是使用原子力显微镜对未修饰PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构(EBiN)和修饰过PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构(EPBiN)进行的表征,可以看出两种结构都具有类似双锥的形态,证明PEG5K-K10的修饰不影响双锥形DNA纳米结构本身的形貌,图中标尺为50nm。
实施例2 核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备
本实施例与实施例1不同之处在于,在合成核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针过程中选用的核磁共振成像造影剂为DNA-DTPA(Gd),即选用DTPA与钆螯合。除此之外,其余原料选择以及制备方法和反应条件同实施例1,从而制备得到核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
实施例3 核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的活细胞摄入
本实施例采用以下方法考察核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的活细胞摄入情况,具体如下:
由于激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)的激发波长限制,将DNA探针上修饰的Dylight800荧光分子替换为Cy5.5。MDA-MB-231细胞培养在含有10%胎牛血清和1%双抗(双抗为一种含有青霉素(10,000IU)和链霉素(10,000μg/mL)的100倍工作浓度的混合液)的高糖DMEM完全培养基中,培养环境为37℃和5%CO2。当细胞生长至融合度为80%左右,将细胞消化,重新接种于35mm2共聚焦小皿中,过夜培养12h。将培养基分别替换为含有DNA-DOTA(Gd)、只杂交DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构(BiN)、杂交EGFR核酸适配体和DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构(EBiN)、表面修饰PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构(PBiN)、完全组装的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针(EPBiN),以及无任何添加的培养基,使DNA纳米结构的终浓度为0.1μM,孵育12h。将孵育好的细胞依次用1×PBS清洗3次,在CLSM下观察。DNA-DOTA(Gd)所连的Cy3荧光在543nm波长处激发,而Cy5.5在633nm处激发,用于观察双锥形DNA纳米结构。结果如图3所示,只有很少的游离DNA-DOTA(Gd)被细胞摄取,这是由细胞的非特异性摄取造成的;与游离的DNA-DOTA(Gd)相比,BiN可以有效提高细胞对其的摄入率,证明DNA纳米结构有协助药物内化的作用;修饰PEG5K-K10后,PBiN呈电中性,更容易被细胞摄入;在杂交EGFR核酸适配体后,细胞摄入量显著增加,表明EGFR核酸适配体有良好的靶向作用,使DNA探针更容易被细胞识别。
实施例4 裸鼠成瘤模型的构建及核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针活体分布
裸鼠(雌性,5-6周龄,16-17g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。每只小鼠在左侧腋下接种约1×106个MDA-MB-231细胞。
成瘤后(瘤体尺寸约100mm3)的小鼠随机分为六组,每组三只。将相同剂量(150μL,55μM)的游离荧光染料(DNA-Dylight800)、杂交DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构(BiN)、杂交EGFR核酸适配体和DNA-DOTA(Gd)的双锥形DNA纳米结构(EBiN)、表面修饰PEG5K-K10的双锥形DNA纳米结构(PBiN)、完全组装的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针(EPBiN)经尾静脉注射入小鼠体内。选取3h、6h、8h、12h、24h五个时间点,在小动物活体荧光成像系统中进行成像分析。24h后,处死小鼠并解剖,取肿瘤及主要器官进行荧光成像。
结果如图4所示,与组装的DNA纳米结构相比,游离染料在体内的代谢速度很快,并且没有在肿瘤部位累积;由于靶向作用,EBiN和EPBiN更容易在肿瘤部位聚集;由于PEG5K-K10的表面修饰,PBiN和EPBiN在体内的代谢时间有所延长。通过时间点分析可以得出,在6h以内,EBiN、PBiN和EPBiN的荧光信号强度相当,且比其他对照组强;8h后,EPBiN组在肿瘤部位的荧光信号强度逐渐强于其他组,而24h后,只有EPBiN组在肿瘤部位还存在荧光信号。对肿瘤和主要器官的荧光成像也显示,EPBiN组肿瘤组织的荧光强度最高,表明该DNA探针可以特异性识别MDA-MB-231肿瘤细胞,并且具有长效成像的效果。
实施例5 裸鼠成瘤模型的构建及活体双模态成像
与实施例4相同,每只小鼠在右侧腋下接种约1×106个MDA-MB-231细胞。10天后,在左侧腋下接种相同数目的细胞。构建好成瘤模型后,将小鼠随机分为三组,每组三只。
首先进行核磁共振成像在体外的预实验。将制备好的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针(EPBiN)溶于1×TA/Mg2+缓冲溶液中分别制成2.2μM、4.4μM、6.6μM、8.8μM和11.1μM的储液,则对应钆浓度为20μM、40μM、60μM、80μM和100μM。以商业化临床造影剂DOTA(Gd)作为对照,制成相同浓度梯度的溶液。根据小动物核磁成像系统中测得的T1结果计算,两种材料的T1弛豫率相同。
体内实验:将核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针、DOTA(Gd)和游离染料(DNA-Dylight800)通过尾静脉注射入不同组小鼠体内,保证DNA探针和DOTA(Gd)剂量相同(0.005mmol/kg),DNA探针和游离染料的荧光分子含量相同。将DNA探针组和DOTA(Gd)组进行核磁成像,DNA探针组和游离染料组进行荧光成像。图5结果表明,受本发明所述DNA探针的代谢时间限制,核磁共振成像的持续时间大约为2h,而荧光成像具有高灵敏度,因此在24h后在肿瘤部位仍有荧光信号。核磁成像的优点在于高分辨率和对比度,与DOTA(Gd)相比,本发明所述DNA探针在1h-2h范围内的T1加权成像在两侧腋下肿瘤部位有高信号强度。因此,结合核磁共振成像的高对比度和荧光成像的高灵敏度,以及DNA探针的靶向性和稳定性,本发明所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针可以对肿瘤实现高效双模态成像。
实施例6 核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的生物安全性
细胞实验:将MDA-MB-231细胞培养在96孔板中过夜,再将细胞孵育在不同浓度(0.05μM,0.1μM,0.25μM,0.5μM和1μM)的DNA探针溶液中,培养24h。通过MTT比色实验(0.5mg/mL)测定细胞的生存率。结果显示,在所有浓度下,细胞的存活率均在90%以上,表明本发明所述DNA探针不会造成明显的细胞损伤。
组织学实验:将110μM的DNA探针通过尾静脉给荷瘤小鼠注射,并设置空白对照组。24h后,解剖取小鼠的心肝脾肺肾,用苏木素伊红进行染色,证明本发明所述核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针不会造成明显的组织损伤和病变,具有良好的生物安全性。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针及其制备方法与应用
<130> KHP191111501.0
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttcgcatg tgctt 15
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgccggcag ccggcaagta agagtttgcc tggagcctgc taagcacatg cga 53
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtgcatttc gtctacacaa tcctagtctg caagcacatg cga 43
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgccacaca ctggatttac acaaagtatg tggg 34
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgtgtagac gaaatgcacg agcaggctcc tggactgttg tttctgaagc acatgcga 58
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcctagtcc ggaccttgta agacattccg ccggtaaggc tcacggacaa agtatgtggg 60
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtccggact aggctcagaa acaacagtcc tgccattgac caagcacatg cga 53
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttcactggcg gcggtcgcca tggatccagc gaagcacatg cga 43
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacttcacca ggaggcctgg acaaagtatg tggg 34
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcaaactct tacttgccgg aagcacatgc ga 32
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgccggcgg ttgaaaccga cggtacgctt taagcacatg cga 43
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaatatgaat ttggcgaccg ccgccagtga aggtcaatgg cacaaagtat gtggg 55
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcagagcgt ttgtggaaac cattaggttt tccgtgagcc ttaccgaagc acatgcga 58
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcggaatgtc ttacatccag gcctcctggt gaagtgcgct ggatccacaa agtatgtggg 60
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtaaatccag tgtgtggcag gcagactagg taaacctaat ggtttcaagc acatgcga 58
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cacaaacgct ctgcctattc atattcaaag cgtaccgtcg gtttca 46
<210> 17
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccuuaguaa cgugcuuuga ugucgauucg acaggaggcc ccacauacuu ugu 53
Claims (10)
1.核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、将单链DNA的5’端修饰氨基,3’端修饰荧光分子;
B、修饰后的单链DNA与DOTA-NCS反应生成DNA-DOTA;
C、DNA-DOTA与可溶性Gd盐发生络合反应,得到螯合Gd的DNA-DOTA;
D、将15条短序列单链DNA与1-9条所述螯合Gd的DNA-DOTA杂交得到双锥形纳米DNA;
E、将双锥形纳米DNA与聚乙二醇-聚赖氨酸孵育,得到表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA;
F、将表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA与核酸适配体混合,组装得到核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针;
其中,步骤A中所述单链DNA的核苷酸序列为:5′-TTTTCGCATGTGCTT-3′;
步骤D中所述15条短序列单链DNA的核苷酸序列分别为:
1)5′-CCGCCGGCAGCCGGCAAGTAAGAGTTTGCCTGGAGCCTGCTAAGCACATGCGA-3′
2)5′-CGTGCATTTCGTCTACACAATCCTAGTCTGCAAGCACATGCGA-3′
3)5′-CTGCCACACACTGGATTTACACAAAGTATGTGGG-3′
4)5′-TTGTGTAGACGAAATGCACGAGCAGGCTCCTGGACTGTTGTTTCTGAAGCACATGCGA-3′
5)5′-AGCCTAGTCCGGACCTTGTAAGACATTCCGCCGGTAAGGCTCACGGACAAAGTATGTGGG-3′
6)5′-GGTCCGGACTAGGCTCAGAAACAACAGTCCTGCCATTGACCAAGCACATGCGA-3′
7)5′-TTCACTGGCGGCGGTCGCCATGGATCCAGCGAAGCACATGCGA-3′
8)5′-CACTTCACCAGGAGGCCTGGACAAAGTATGTGGG-3′
9)5′-GGCAAACTCTTACTTGCCGGAAGCACATGCGA-3′
10)5′-CTGCCGGCGGTTGAAACCGACGGTACGCTTTAAGCACATGCGA-3′
11)5′-GAATATGAATTTGGCGACCGCCGCCAGTGAAGGTCAATGGCACAAAGTATGTGGG-3′
12)5′-GGCAGAGCGTTTGTGGAAACCATTAGGTTTTCCGTGAGCCTTACCGAAGCACATGCGA-3′
13)5′-GCGGAATGTCTTACATCCAGGCCTCCTGGTGAAGTGCGCTGGATCCACAAAGTATGTGGG-3′
14)5′-GTAAATCCAGTGTGTGGCAGGCAGACTAGGTAAACCTAATGGTTTCAAGCACATGCGA-3′
15)5′-CACAAACGCTCTGCCTATTCATATTCAAAGCGTACCGTCGGTTTCA-3′步骤F中所述核酸适配体的核苷酸序列为:5′-GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU-3′。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤A中所述荧光分子选自Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5,优选Cy3。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤D中15条短序列单链DNA中的序列7)修饰有荧光分子Dylight800或Cy5.5。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述DOTA可替换为DTPA。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤F中所述聚乙二醇-聚赖氨酸为PEG5K-K10;和/或
所述核酸适配体的核苷酸2’位为氟代。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤B中所述DOTA-NCS的摩尔用量是单链DNA的100倍过量;和/或
步骤C中所述可溶性Gd盐的摩尔用量是所述DNA-DOTA的100倍过量;和/或
步骤E中所述聚乙二醇-聚赖氨酸中氮元素与所述双锥形纳米DNA中磷元素的摩尔比为0.5:1、1:1或2:1,优选1:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将单链DNA的5’端修饰氨基,3’端修饰Cy3,修饰后的单链DNA溶解于80%DMSO中,得到浓度为200mM的单链DNA溶液;
2)将单链DNA溶液与DOTA-NCS混合于HEPES缓冲液I中,加入磁子搅拌,37℃水浴中反应18-24h,得到DNA-DOTA;
3)将DNA-DOTA置换到HEPES缓冲液II中,用3KDa滤柱以8000-10000rpm离心3-4次,每次离心10-15min,得到DNA-DOTA溶液;将DNA-DOTA溶液与GdCl3在37℃水浴中搅拌18-24h,发生络合反应,得到螯合Gd的DNA-DOTA溶液;
4)将10μM15条短序列单链DNA溶液与10μM9条螯合Gd的DNA-DOTA溶液混合于pH8.3的1×TA/Mg2+缓冲液中,升温至90-95℃,保持5-8min后迅速降温至2-8℃,得到双锥形纳米DNA;
5)将双锥形纳米DNA与聚乙二醇-聚赖氨酸PEG5K-K10在室温下混合孵育30-60min,得到表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA;其中赖氨酸中的氮元素与DNA中磷元素的摩尔比为1:1;
6)将表面修饰聚乙二醇-聚赖氨酸的双锥形纳米DNA与50μM EGFR核酸适配体溶液混合,升温至40-50℃保持2-10分钟,然后降温至20-25℃保持2-10分钟,重复5-7个循环,完成组装得到核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针;
其中,步骤2)中所述HEPES缓冲液I为含300mM MgCl2的0.1 M HEPES缓冲液,pH9;
步骤2)中所述HEPES缓冲液II为pH5的0.1 M HEPES缓冲液;
步骤6)中所述EGFR核酸适配体的核苷酸序列为(5’-3’):
GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGCCCCACAUACUUUGU。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备的核磁-光学双模态成像双锥形DNA纳米探针。
9.权利要求8所述DNA纳米探针的以下任一应用:
i.用于核磁共振成像;
ii.用于荧光成像;
iii.用于肿瘤核磁共振成像和/或荧光成像造影剂的制备。
10.用于肿瘤核磁共振成像和/或荧光成像的造影剂,其特征在于,包含权利要求8所述DNA纳米探针。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910269905.1A CN110257374B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910269905.1A CN110257374B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110257374A true CN110257374A (zh) | 2019-09-20 |
CN110257374B CN110257374B (zh) | 2020-12-01 |
Family
ID=67913506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910269905.1A Active CN110257374B (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110257374B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113899724A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-01-07 | 南京林业大学 | 一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106390143A (zh) * | 2015-07-17 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 肿瘤靶向核磁共振/荧光双模态成像造影剂及其制备和应用 |
-
2019
- 2019-04-04 CN CN201910269905.1A patent/CN110257374B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106390143A (zh) * | 2015-07-17 | 2017-02-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 肿瘤靶向核磁共振/荧光双模态成像造影剂及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CAO LM等: "The interplay of T1- and T2-relaxation on T1-weighted MRI of hMSCs induced by Gd-DOTA-peptides", 《BIOMATERIALS》 * |
LI,JB等: "Radiolabeling of DNA Bipyramid and Preliminary Biological Evaluation in Mice", 《BIOCONJUGATE CHEMISTRY》 * |
NANDHINI PONNUSWAMY等: "Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclesase degradation", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
NAYAN P AGARWAL等: "Block Copolymer Micellization as a Protection Strategy for DNA Origami", 《ANGEW CHEM INT ED》 * |
SONG LL等: "tumor-targeted DNA Bipyramid for in vivo dual-modality imaging", 《ACS APPL.BIO MATER》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113899724A (zh) * | 2021-09-28 | 2022-01-07 | 南京林业大学 | 一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法 |
CN113899724B (zh) * | 2021-09-28 | 2022-03-18 | 南京林业大学 | 一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110257374B (zh) | 2020-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhen et al. | Ferritins as nanoplatforms for imaging and drug delivery | |
CN107469088A (zh) | 一种基于dna折纸术的精确识别靶向纳米载体的构建方法及其应用 | |
CN105705638B (zh) | 改善的具有高效能的纳米颗粒型寡核苷酸结构及其制备方法 | |
CN110478322B (zh) | 一种核酸药物复合物及其制备方法和应用 | |
KR101755617B1 (ko) | 삼차원 자기조립 핵산 나노입자 구조를 갖는 약물전달체 | |
US20220226473A1 (en) | Nucleic acid nanocarrier drug and preparation method thereof, pharmaceutical composition and application thereof | |
CN110003185B (zh) | 基于绿色荧光蛋白生色团bi的大环多胺类两亲化合物及其制备方法和用途 | |
CN101709073B (zh) | 核苷酸磷脂分子及脂质体及其制备方法和应用 | |
CN110257374A (zh) | 核磁-光学双模态成像双锥形dna纳米探针及其制备方法与应用 | |
CN112707943B (zh) | 结合5′-末端缀合物和中性/阳离子混合脂材包载的小干扰rna及其修饰方法 | |
Yan et al. | A pH-responsive activatable aptamer probe for targeted cancer imaging based on i-motif-driven conformation alteration | |
Shen et al. | Antisense peptide nucleic acid-functionalized cationic nanocomplex for in vivo mRNA detection | |
CN111150852B (zh) | 含顺铂的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
Zhang et al. | Surface-adaptive nanoparticles with near-infrared aggregation-induced emission for image-guided tumor resection | |
CN110960530B (zh) | 含他克林的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
CN111053765B (zh) | 含紫杉醇的药物、其制备方法、药物组合物及应用 | |
CN111096965B (zh) | 含双氢青蒿素的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
CN114099695A (zh) | 一种ra16-a与dna四面体载体共聚物及其制备方法和应用 | |
CN107266929B (zh) | 一类以菁染料荧光基团为母体骨架结构的近红外荧光染料及其制备方法与应用 | |
CN114773418B (zh) | 一种核酸适配体簇修饰的纳米结构及其制备方法和应用 | |
CN110960683A (zh) | 含甲氨蝶呤的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
CN111053913A (zh) | 含阿糖胞苷的药物、其制备方法、药物组合物及应用 | |
CN114904010B (zh) | 一种分层自组装负载siRNA纳米粒子的制备方法及其应用 | |
CN110960684B (zh) | 含10-羟基喜树碱的药物、其制备方法、药物组合物及其应用 | |
CN110960536B (zh) | 含阿司匹林的药物、其制备方法、药物组合物及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |