CN102925487B - 一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用。本发明所提供的新型阳离子脂质载体化合物具有通式VI的结构，其中，³A及A⁴为亲水性头部，³A或A⁴为由一个或是多个相同或不同的氨基酸组成的亲水性分子，³A与A⁴相同或不同；R为头部与尾部的链接臂，为链状或支链结构；³B及B⁴为疏水性尾部，³B或B⁴为链状疏水性分子，³B与B⁴相同或不同。本发明的新型阳离子脂质载体化合物，具有结构简单、合成方便等特点。此外该化合物具有毒性低、转染效率高的特点，并且避免了合成中的繁琐，转染过程中也无需使用其他类型的辅助脂质体，易于操作和使用，因此，本发明的新型阳离子脂质载体具有潜在的商用转染试剂开发前景。

Description

一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型的非病毒基因给药载体，具体涉及到一种新型阳离子脂质载体及其制备方法。本发明属于生物医药技术领域， 

背景技术

上个世纪90年代，人类开展了规模宏大而意义非凡的人类基因组计划，随着整个计划的完成，人类开始了自己的基因时代。人类对基因的进一步认识也开启了医药研究的生物时代，而基因治疗自然就成为了国内外生物医药要研究的热点领域之一。基因治疗与传统的疗法相对有着独特的优势，尤其是对一些传统医药无法治愈的遗传性或是后天疾病，如：一些恶性肿瘤或是先天性免疫性疾病。在基因治疗的发展中有一个关键问题就是需要一种安全，高效的基因给药载体。目前应用于基因输送的运载系统有很多，主要分为病毒和非病毒转运体系。病毒性载体具有转染效率高的特点，但是病毒性载体具有很强的免疫原性反应，缺乏靶向性，具有与宿主细胞潜在的整合的危险。在病毒性载体的发展中分别有三次医疗事故对病毒性载体的发展起到了很大的影响：1999年在美国宾夕法尼亚大学医学院发生的重组腺病毒“Jesse Gelsinger”事件；2000年在法国发生的逆转录病毒诱导的白血病事件；2003年发生了第二例白血病诱发事件。这些事件严重打击了基因治疗的研究，同时也促使了研究人员对如何研发出安全有效的基因载体提出了更高的要求。在这样的背景下，非病毒基因载体的研究逐渐成为研究的热点。 

目前非病毒转运系统主要包括阳离子脂质体、聚合物、纳米粒、树突结构和透膜性肽等。其中阳离子载体中的阳离子脂质载体因其独特的结构特点一直成为科学界的研究热点。阳离子类物质的报道最早见于上世纪70年代，该类物质能表现出很好的油水两性。在上个世纪90年代阳离子脂质载体的发展就取得了很好的发展，通过对多种哺乳类生物细胞的研究发现阳离子载体能够有效的转入多种基因，而使细胞成功的表达相对应的蛋白。阳离子类载体是由阳离子头部，脂肪族尾部及连接臂组成的两性物质。头部通常以多肽、糖脂等阳离子为主，尾部通常为脂肪族长链， 连接臂主要以在体内能降解的二硫键或酰胺键为主。该类化合物主要是通过静电与DNA/RNA相互作用，将DNA/RNA压缩聚合。以内吞的形式进入细胞，形成的核内体，由于环境pH的变化而使核内体的结构由膜状结构变为六面体结构，而释放DNA/RNA产生作用。阳离子脂质载体具有较高的转染效率，其原因在于：首先，阳离子脂质载体作为一种pH敏感型载体，具有质子海绵作用与亲水-疏水型构型变化作用，载体可以通过这两种方式有效的释放包载物。阳离子脂质载体的头部由于自身的结构特点多具有两个不同的pKa值，一个高于平均生理pH值，另外一个低于平均生理pH值。因此，阳离子脂质体从胞外进入到胞内形成核内体的过程，就是经历生理pH值从高到低的过程(细胞中内吞体与溶酶体及细胞核周围的pH值约为4.5左右)，而这种pH的变化势必会引起如：赖氨酸或是组氨酸等易于质子化的基团质子化，从而带来核内体膜的不稳定，使核内体膜的形态从在近中性的pH环境下的亲水结构层状结构变为在酸性环境下的疏水六面体结构，从而释放出包载物。对于核内体膜会在不同pH条件下发生形态变化的直接证据，则是来源于流感病毒中的一种蛋白。该种蛋白被称之为融合蛋白(fusogenic protein)，其基本结构融合肽(fusogenic peptide)，来源于流感病毒血凝素蛋白。融合蛋白序列是一种短的、两亲性序列，在酸性pH环境中，该序列会发生构型变化，从而使病毒逃逸出核内体，这也是流感病毒能够进入人体细胞并能成功自我复制，感染细胞的原因所在。 

有研究表明，与常用转染试剂Lipofectamine 2000相比，在同样的实验条件下，融合蛋白/融合肽能够使mRAN的沉默效率提高约3.5倍(Oliveira,S et al.Int J Phar,2007,331(2),211-214)。其次，载体中若是存在氧化还原势的结构(如：二硫键)，同样能够有效的促使siRNA从核内体中释放。之所以含有氧化还原势的载体结构能够有效的释放包载物，是因为在包载物进入细胞后形成的核内体中存在着谷胱甘肽(glutathione,GSH)与硫氧还原蛋白(thioredoxin)等物质[D.Jere,et al.Biomed Mater,2009,4(2),025020.]。这些酶能够在酸性环境中有效的与载体中的相关基团发生作用，造成lipoplex结构的崩解，从而引起核内体膜的不稳定而释放出包载物。有研究表明含有二硫键结构的DOGSDSO及CHDTAEA，在实验条件一致的情况下，与不含类似结构的转染试剂相比，其转染效率能够提高50倍[F.Tang,et al.Bioconjugate Chem,1999,10(5),791-796]。再次，载体结构中其它一些体内已知可降解键，如：酯键，同样可以起到崩解lipoplex结构的作用，从而促进包载物的释放[R.H.Kallet,et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med,2000,161(4 pt 1),1149-1153]。 

此外，阳离子脂质载体与被包载物所形成的复合物的大小，对包载物的转染效 率有着很大影响，尤其是在体内转运时。然而，对于到底多大的复合物对于转染是适合的，却没有明确的定义。早期的研究表明，大小为200-2000nm复合物都能够有效的转染[P.C.Ross,et al,Gene Ther,1999,6,651-659]。但是随后的研究表明，小颗粒复合物(<200nm)表现出更好的转染效率[N.Yagi,et al,Cancer Res,2009,69(16),6531-6538]。对于这个问题目前较为一致的看法就是：复合物易于聚集，使其直径往往>200nm；复合物进入细胞的异质内吞作用是与其大小相关的；直径<100nm的颗粒利于在毛细血管中转运。所以，复合物的大小较为一致的看法是：处于100–300nm之间具有较好的转染效率。 

阳离子脂质载体之所以能够包载核酸类物质，就是因为两者之间的静电作用。但是，正是因为阳离子脂质载体带有正电荷，同样使其在体内转运中具有不稳定性，从而限制了阳离子脂质载体的应用。具体包括以下几点：1.由于阳离子脂质载体形成的阳离子脂质载体表面都带有正电荷，而在体循环中这些表面的正电荷的阳离子脂质载体势必会与血液中的蛋白质或是内皮组织相互作用，从而造成其在体循环中的快速移动产生脱靶效应。2.正电荷复合物通过与血液中的蛋白作用，引起血管栓塞。3.阳离子脂质载体往往会出现对siRNA包载不完全的现象，从而致使siRNA被血清蛋白降解。正是由于上述原因，在使用阳离子脂质载体时，尤其是在体循环中，往往与多种其它脂质体(被称为辅助脂质体)按照一定摩尔比混合使用，使其成为中性脂质体，而这种中性脂质体往往具有很好的转染效果。目前，常用的辅助脂质体有：N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride(DOTMA)；1,2-dioleyloxy-3-trimethylammonium propane(DOTAP)；cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)；dioctadecylamidoglycylapermin(DOGS)；3β-[N-(N′,N′-dimethyl aminoethane)-carbamoyl]cholesterol(DC-Chol)；1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho ethanolamine(DOPE)；cholesterol(Chol)等等。 

之所以加入这些脂质体，除了改善复合物表面的电荷特性外，还有其它作用,诸如：DOPE及类似磷脂类物质可以稳定复合物、增加复合物与细胞膜的相互作用、促进包载物的释放；胆固醇类物质具有稳定体循环时复合物的作用，有研究表明胆固醇可能是通过某种方式减少血清中蛋白与复合物的作用[R.Banerjee,et al,J.Med.Chem,1999,42(21),4292-4299]。这也是众多文献及专利中，多应用辅助脂质体的原因所在。 

本发明的意义在于提供了一种新型阳离子脂质载体的制备，该载体具有制备简单，易于修饰，细胞毒性低，转染效率优于商用转染试剂的优点。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种非病毒基因给药载体； 

本发明的目的之二是提供所述的载体的制备方法； 

本发明的目的之三是提供所述的载体在制备细胞转染试剂中的应用。 

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段： 

本发明设计了一种以氨基酸为骨架的两亲性阳离子脂质体，本发明的一种阳离子脂质载体，其特征在于所述阳离子脂质载体具有通式VI的结构： 

其中，³A及A⁴为亲水性头部，³A或A⁴为由一个或是多个相同或不同的氨基酸组成的亲水性分子，³A与A⁴相同或不同； 

其中，R为头部与尾部的链接臂，为链状或支链结构； 

其中，³B及B⁴为疏水性尾部，³B或B⁴为链状疏水性分子，³B与B⁴相同或不同。 

在本发明中，优选的，R包括但不限于二硫键、硫原子、氧原子或是碳原子。 

在本发明中，优选的，所述的³A或A⁴可以是同一种氨基酸组成或是同一种氨基酸的不同连接方式组成，如式XIV，XV，n=0～25，m=0～25；或是不同氨基酸组成；或是其它类型的胺；或是荧光分子。同时又不局限于此类结构。 

在本发明中，优选的，所述的链状疏水性分子为饱和或是不饱和性脂肪族烷烃、 胆固醇或如式XI所示的疏水性分子： 

其中，更优选的，所述的饱和脂肪族烷烃如式VII所示，其中n=5～25； 

所述的不饱和脂肪族烷烃如式VIII所示，其中n=5～25,m=5～25；或所述的不饱和脂肪族烷烃如式IX所示,其中n=5～25,m=5～25；或所述的不饱和脂肪族烷烃如式X所示，其中n=5～25； 

在式VII，VIII，IX，X中x为-OH、-NH₂、-Cl或-Br； 

进一步的，本发明还公开了一种制备以上所述的阳离子脂质载体的方法，其特征在于包括以下步骤： 

A.使用式I的结构与Boc₂O反应，得到式II: 

其中，R为头部与尾部的链接臂，为链状或支链结构； 

B.式II在DCC，DMAP的条件下，反应得到带有疏水性尾部的式III: 

其中³B及B⁴为疏水性尾部，³B或B⁴为链状疏水性分子，³B与B⁴相同或不同； 

C.式III在TFA的条件下，脱去Boc保护基，而得式IV。 

D.式IV在一定条件下，反应得到带有亲水性头部的式V。 

¹A及A²为亲水性头部，¹A或A²为由一个或是多个相同或不同的氨基酸组成的亲水性分子，¹A与A²相同或不同； 

E.式V在TFA的条件下，脱去Boc保护基，即得式VI。 

其中，³A及A⁴为亲水性头部，³A或A⁴为由一个或是多个相同或不同的氨基酸组成的亲水性分子，³A与A⁴相同或不同。 

在本发明所述的方法中，优选的，¹A或A²可以是同一种氨基酸组成或是同一种氨基酸的不同连接方式组成，如式XII，XIII，n=0～25，m=0～25；或是不同氨基酸组成；或是其它类型的胺；或是荧光分子。同时又不局限于此类结构。 

在本发明所述的方法中，优选的，R为二硫键、硫原子、氧原子或是碳原子。 

在本发明所述的方法中，优选的，所述的³A或A⁴的结构如式XIV或XV，其中n=0～25，m=0～25； 

在本发明所述的方法中，优选的，链状疏水性分子为饱和或是不饱和性脂肪族烷烃、胆固醇或如式XI所示的疏水性分子： 

其中，更优选的，所述的饱和脂肪族烷烃如式VII所示，其中n=5～25； 

所述的不饱和脂肪族烷烃如式VIII所示，其中n=5～25,m=5～25；或所述的不饱和脂肪族烷烃如式IX所示,其中n=5～25,m=5～25；或所述的不饱和脂肪族烷烃如式X所示，其中n=5～25； 

在式VII，VIII，IX，X中x为-OH、-NH₂、-Cl或-Br； 

更进一步的，本发明还提供了以上任一项所述的阳离子脂质载体在制备细胞转染制剂中的应用。 

本发明还提供了一种利用本发明的阳离子脂质体制备细胞转染制剂的方法，包括以下步骤： 

称取化合物VI适量，置于已硅烷化的锥形瓶中，溶于一定量有机溶剂中(乙醇或是氯仿或是两者一定比例的混合溶液)，震荡溶解后，以适当流速的氮气或是氩气吹干溶剂，使溶解物成贴壁薄膜状，残留的溶剂减压慢慢蒸去，取出，放于真空干燥器中干燥一晚。于第二天取出，加入DEPC水，加塞封口。于一定温度下超声后，过滤膜，即制得脂质体细胞转染制剂。 

相较于现有技术，本发明的一种阳离子脂质载体具有以下优点： 

1.本发明的一种阳离子脂质载体毒性低。 

与商用转染试剂LipofectamineRNAiMAX相比，对Hela细胞的细胞活力的影响没有显著性的差异，即对Hela细胞没有明显的细胞毒性。 

2.本发明的一种阳离子脂质载体转染效率高。 

实验证明化合物VI能够有效的将siRNA转染入细胞。siRNA-阳离子脂质体复合物与细胞孵育5h后，N/P=2时，已经能够在细胞内见到荧光；N/P=6时，从高内涵图片上来看，已经能够明显看到细胞内有siRNA转入；N/P=12时，从荧光强度上看，其转染效果与市售转染试剂LipofectamineRNAiMAX的转染效果相当；在高N/P组别中，转染效果好于LipofectamineRNAiMAX。此外，从图片上看siRNA-阳离子脂质体复合物不仅能过进入细胞质中，而且可能具有一定的进入细胞核的能力。 

3.本发明的一种阳离子脂质载体能够有效的抑制靶基因的表达。 

通过对Hela细胞中siMek1 mRNA表达的考察，可以得出以下结果：24h时，N/P=24的siRNA-阳离子脂质体复合物能够抑制约73%的表达；48h时，N/P=20的siRNA-阳离子脂质体复合物能够抑制约69.5%的表达,N/P=24，28的siRNA-阳离子脂质体复合物能够抑制约79.5%及84.8%。从结果看：本发明的阳离子脂质载体不经能够有效的进行转染，并且能够在进入细胞后有效的释放包载物，而对靶基因进行沉默。此外,从结果上看阳离子脂质体似乎对包载物的释放具有缓释的效果。 

4.本发明的一种阳离子脂质载体具有粒径分布均匀，血清稳定性高的特点。 

综上，本发明的一种新型阳离子脂质载体，具有结构简单、合成方便、毒性低、转染效率高、通过转染能够有效的抑制靶基因的表达的特点，具有潜在的商用转染试剂开发的前景。 

附图说明

图1为本发明阳离子脂质载体粒径分布图； 

图2为本发明阳离子脂质载体琼脂糖凝胶阻滞电泳检测结合稳定性图； 

图3为本发明阳离子脂质载体肝素对siRNA释放的影响图； 

图4为本发明阳离子脂质载体对Hela细胞细胞毒实验图； 

图5为本发明阳离子脂质载体对Hela细胞转染的高内涵实验图； 

图6为本发明阳离子脂质载体在Hela细胞中转染siRNA48h后，抑制Mek1 mRNA表达的PCR结果； 

注：其中CLD为化合物VI的代号；RNAiMAX为商用转染试剂；N/P为阳离子脂质载体中N原子与核酸中P原子的摩尔数之比。 

图7为本发明阳离子脂质载体在Hela细胞中转染siRNA48h后，抑制Mek1mRNA表达的real-time PCR结果； 

注：其中CLD为化合物VI的代号；RNAiMAX为商用转染试剂；N/P为阳离子脂质载体中N原子与核酸中P原子的摩尔数之比。缩略语表 

本文公开的本发明使用下列化学命名： 

DCC     二环己基碳二亚胺 

DMAP    二甲基氨基吡啶 

Boc     叔丁氧羰基 

Boc₂O   二碳酸二叔丁酯 

TFA     三氟乙酸 

DEPC水  去RNA酶水 

LRM     Lipofectamine RNAi 

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。 

实施例1化合物VI的合成 

所有溶剂、原料和试剂如不特别指名，均为分析纯或化学纯。溶剂的无水处理按照常规方法进行。 

A.使用式I的结构与Boc₂O反应，得到式II。 

B.式II在DCC，DMAP的条件下，反应得到带有疏水性尾部的式III。 

C.式III在TFA的条件下，脱去Boc保护基，而得式IV。 

D.式IV在一定条件下，反应得到带有亲水性头部的式V。 

E.式V在TFA的条件下，脱去Boc保护基，即得式VI。 

F.合成的路线及试剂与条件如下： 

试剂与条件:a.Boc₂O,NaOH,H₂O,dioxane,12h,25°C;b.DCC,DMAP，CH₂Cl₂,25°C;c.TFA,CH₂Cl₂,30min;d.DCC,DMAP，CH₂Cl₂,25°C;e.TFA,CH₂Cl₂,30min. 

实施例2用于核酸转染的脂质体的制备 

称取化合物VI 4.2mg于已硅烷化的锥形瓶中，溶于1mL有机溶剂中(氯仿/甲醇=1:1,v/v)，震荡溶解后，以流速为5kg/cm²的氮气或是氩气吹干溶剂，使溶解物成贴壁薄膜状，残留的溶剂减压慢慢蒸去，取出，放于真空干燥器中干燥一晚。于第二天取出，加入1mL DEPC水，加塞封口。于50°C的水浴中超声30min，过0.25 μm无菌滤膜，即制得阳离子脂质体（CLD）。 

接着将浓度为20μM的核酸类溶液与阳离子脂质体按照N/P=20混合，室温下孵育30min，即完成包载核酸的阳离子脂质体的制备。 

实施例3粒径及表面电势(Zeta potential)的测定 

本发明以Zetaszier Nano-ZS测量测定载体的粒径及其表面电位。结果平均粒径为119.4583nm，粒径分布系数PDI=0.224。表面电势为1.72e4mv。本发明阳离子脂质载体粒径分布图如图1所示。 

实施例4与siRNA结合稳定性考察 

阳离子脂质载体之所以能够有效的将siRNA转入细胞，原因在于其能够有效的包载siRNA。本发明以结合稳定性试验，来考察本发明制备得到的阳离子脂质载体与siRNA结合能力，选用的方法是凝胶阻滞实验。 

结果表明：随着N/P的升高，本发明制备得到的阳离子脂质体（CLD）与siRNA能够有效的结合。当N/P=6时，CLD已经能够有效的将siRNA包载，游离的siRNA斑点亮度相对于N/P=1，2，4三组中的游离siRNA亮度已经开始变弱。随着N/P的升高，游离siRNA斑点亮度进一步逐渐变弱。当N/P=12时，游离siRAN斑点亮度相当于对照组siMek1亮度已经变的非常暗了，这就说明随着N/P的升高，CLD与siRNA能够有效的结合。本发明阳离子脂质载体琼脂糖凝胶阻滞电泳检测结合稳定性图如图2所示。 

实施例5肝素对siRNA的释放性影响 

酸性蛋白(如：肝素)能与阳离子样品结合而置换出siRNA，这样势必会影响CLD/siMek1复合物的稳定性，而这对进入细胞后的CLD/siMek1复合物有着重要的意义。 

试验结果表明：随着肝素钠溶液中肝素钠含量的增加，游离siMek1斑点的亮度逐渐增加，说明肝素对CLD/siMek1复合物的稳定性是有影响的，能够有效的将CLD/siMek1复合物中的siRNA置换出来。当肝素钠的量为1.25μg时，就能够将siRNA从CLD-siMek1复合物中置换出来，开始出现游离siRNA亮斑。随着肝素钠的量逐渐增加，siRNA被置换出来的就越多，表现为游离siRNA亮斑的亮度逐渐变大。当肝素钠的量为25μg时，从CLD/siMek1复合物中置换出的siRNA亮斑亮度 已经接近与对照组siMek1斑点的亮度。而这对于进入细胞质的CLD/siMek1复合物有着重要的意义。当细胞质中带负电荷的蛋白能够有效的将siRNA置换出来时，将有利于siRNA能够发挥其敲除作用，结果如图3所示。 

实施例6阳离子脂质体对细胞的毒性的考察 

本发明以细胞毒实验，来考察本发明阳离子脂质载体对细胞的生长的影响。所用细胞为Hela细胞，选用的方法是CCK-8试剂盒测定细胞活力法。 

Hela按6000个/孔，每孔体积100μl的比例接种在96孔板中，于37°C、5%CO₂的条件下孵育24小时。细胞孵育24小时后，加入已配制好的siRNA-阳离子脂质体复合物，于37°C、5%CO₂的条件下孵育24小时。在避光条件下，取出96孔板，吸去培养液，以每孔120μl的量加入已稀释好的CCK-8溶液。加毕，于37°C、5%CO₂的条件下孵育1-4小时。取出，用酶标仪测定每孔在450nm波长下的吸收值。 

对每种细胞重复三次测试的结果显示：由阳离子脂质载体制备而得的siRNA-阳离子脂质体复合物与商用转染试剂LipofectamineRNAiMAX相比，对Hela细胞没有显著性的差异，即对Hela细胞没有明显的细胞毒性，结果如图4所示。 

实施例7阳离子脂质载体的转染效率的考察 

本发明选用Hela细胞考察本发明的阳离子脂质载体的转染效率，以高内涵对阳离子脂质载体的转染效果进行考察。 

Hela按6000个/孔，每孔体积100μl的比例接种在96孔板中，于37°C、5%CO₂的条件下孵育24小时。细胞孵育24小时后，加入已配制好的siRNA-阳离子脂质体复合物，于37°C、5%CO₂的条件下孵育5小时。5小时后，染色，高内涵测定。 

结果表明，如图5所示，化合物VI能够有效的将siRNA转染入细胞。siRNA-阳离子脂质体复合物与细胞孵育5h后，N/P=2时，已经能够在细胞内见到荧光；N/P=6时，从高内涵图片上来看，已经能够明显看到细胞内有siRNA转入；N/P=12时，从荧光强度上看，其转染效果与市售转染试剂LipofectamineRNAiMAX的转染效果相当；在高N/P组别中，转染效果好于LipofectamineRNAi MAX。此外，从图片上看siRNA-阳离子脂质体复合物不仅能过进入细胞质中，而且可能具有一定的进入细胞核的能力。 

实施例8对阳离子脂质载体转染作用进行PCR及real time PCR考察 

本发明阳离子脂质载体的转染效率，不仅使用高内涵对其转染效果进行考察，此外还使用了PCR及real time PCR技术对转染后靶基因的成膜效率进行了考察。本发明选用Hela细胞考察阳离子脂质载体对转染后靶基因的成膜效率，结果如图6、图7所示。 

通过对Hela细胞中MEK1 mRNA表达的考察，可以得出以下结果：24h时，N/P=24的siRNA-阳离子脂质体复合物能够抑制约73%的表达；48h时，N/P=20的siRNA-阳离子脂质体复合物能够抑制约69.5%的表达,N/P=24，28的siRNA/阳离子脂质体复合物能够抑制约79.5%及84.8%。从结果看：本发明的阳离子脂质载体不经能够有效的进行转染，并且能够在进入细胞后有效的释放包载物，而对靶基因进行沉默。此外，从结果上看阳离子脂质体似乎对包载物的释放具有缓释的效果。 

以上所述仅为本发明较佳实施例，然其并非用以限定本发明的范围，任何熟悉本项技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可在此基础上做进一步的改进和变化，因此本发明的保护范围当以本申请的权利要求书界定的范围为准。 

Claims (3)

1.一种阳离子脂质载体，其特征在于所述阳离子脂质载体的结构如通式（VI）所示：

在所述通式（VI）中，

2.一种制备权利要求1所述的阳离子脂质载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

A.使用式（I）的结构与Boc₂O反应，得到式（II）：

B.式II在DCC，DMAP的条件下，反应得到带有疏水性尾部的式（III）：

在所述式（III）中，

C.式III在TFA的条件下，脱去Boc保护基，而得式（IV）：

在所述式（IV）中，

D.式IV在一定条件下，反应得到带有亲水性头部的式（V）：

在所述式（V）中，

E.式V在TFA的条件下，脱去Boc保护基，即得式（VI）：

在所述式（VI）中，

3.权利要求1所述的阳离子脂质载体在制备细胞转染制剂中的应用。