CN106362163A - 一类具有双靶向功能的核酸输送纳米体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类具有双靶向功能的核酸输送纳米体系。该载体通过对药物多肽的修饰形成不规则磷脂层包裹多肽/核酸复合物的内核，在此基础上，外层包裹特定靶向肿瘤的透明质酸，由于多肽中不带电荷或带弱正电荷的氨基酸序列可以部分暴露在磷脂层外面，与透明质酸形成紧密的外壳。该载体可以根据不同的治疗靶点变换多肽中的氨基酸序列，也可以利用其他聚合物代替透明质酸。

Description

一类具有双靶向功能的核酸输送纳米体系
技术领域
本发明涉及的是一种药物技术领域的药物输送技术，特别是一种可用于核酸(DNA、siRNA、microRNA以及shRNA等)和多肽体内系统输送的非病毒载体体系的构建及制备技术，具体涉及一类具有双靶向功能的核酸输送纳米体系。
背景技术
在针对特定疾病治疗中，生物大分子药物(包括核酸、蛋白质和多肽)的治疗靶点明确，并且自身易被体内对应的酶降解为对人体无害的内源性分子片段，因此受到相关研究者的重视与深入探究，人们希望能够开发出安全高效的生物大分子药物制剂，从而克服生物大分子药物在体内易于降解难以到达治疗位点，以及生物利用度低的弊端。到目前为止，采用生物材料包裹核酸的纳米颗粒的报道非常多，但大多数的载体材料只能用于实验试剂，难以成为药物制剂。[Yin，H等，用于基因治疗的非病毒载体，自然评论.基因，2014，15(8)，541-55.]其中以聚阳离子和阳离子脂质体作为核酸载体的输送系统已经研究了三十多年，它们相比病毒载体而言除了载体本身没有生物安全隐患之外，还具有成本低，基因担载密度和担载分子量大、制备简单，便于化学修饰等优势，也存在着化学毒性大、体内循环周期短(不利于靶向)的缺点。多肽作为载体的组成部分，报道的主要有细胞穿透肽和细胞靶向肽等，其中利用靶向肿瘤的表皮生长因子受体(EGFR)的特定靶向肽构建载体是较广泛的方法，但大多数报道是通过共价结合的方式将靶向肽连接在载体材料的末端，然后通过自组装构建靶向肿瘤表皮生长因子受体(EGFR)的输送体系。[Yin，Z等，基因纳米复合物与单克隆抗体结合的肝癌靶向治疗，国际纳米医学，2012，7，4625-4635.]当然也有通过将靶向基团修饰在脂质上，然后通过脂质体来包裹核算药物的报道也不少。[Liang，X等，用双层脂质膜自组装多肽从而增强表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物和基因传递纳米囊泡的发展，生物材料，2016，82，194-207.]。而这些纳米载体的弊端在于所用的载体在体内的降解与代谢机理没有经过深入研究，是否能够成药还不得而知。另外其体内的输送效率也较低，难以实现临床应用。为了提高输送效率，因此双靶向的载体也应用而生。但目前应用最多的双靶向载体主要是在载体的表面连接靶向目标细胞的不同受体的构建方式，这种方式的特点是增强载体的靶向能力以期提高输送效率。[Kos，P等，基于特定多肽序列-PEG-寡聚氨基酰胺的双靶向复合物，生物制药，2015，104(2)，464-475.]在本发明中，我们同样构建能够实现双靶向核酸输送体系，但与现有的双靶向纳米体系不同的是，我们的双靶向是先后生物响应的动态靶向，首先利用最外层的透明质酸靶向过表达CD44的肿瘤组织与细胞，实现纳米体系穿过肿瘤血管壁与主动靶向相结合的特定输送，然后外层的透明质酸发生解组装和降解，这时穿插在透明质酸层中的多肽序列IVNQPTYGYWHY(GE11)可以特定靶向到肿瘤细胞过表达的表皮生长因子受体(EGFR)，进而被靶细胞内吞，接着借助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)完成内吞逃逸，实现核酸药物的有效释放。
发明内容
本发明的目的在于克服现有核酸体内输送技术中的不足，利用食品药品监督管理局(FDA)允许的生物材料通过合理组装提供一种可以紧密包裹核酸、表面带负电荷以便体内长效循环、双靶向特定细胞并有效进入细胞内的核酸载体；更具体来说，是一种双靶向特定细胞表面的高效安全的具有双靶向功能的核酸输送纳米体系(双靶向纳米颗粒)。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，所述双靶向核酸载体是表面带负电荷的具有双靶向基团的纳米级核酸载体；所述载体的内核是由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物，所述外壳是聚阴离子，所述聚阴离子通过静电和氢键作用包裹在所述复合物的表面；所述多肽是由阳离子多肽序列与靶向肽序列连接而成的具有靶向和包裹功能的多肽。
优选的，所述聚阴离子选自透明质酸、透明质酸钠、羧甲基壳聚糖中的一种或几种。
优选的，所述多肽是包含阳离子多肽-b-细胞靶向肽的两嵌段序列多肽。更优选所述多肽通过聚精氨酸和特定靶向表皮生长因子受体((＊)5)的多肽IVNQPTYGYWHY的序列组合而成。
优选的，所述多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
优选的，所述由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物是先将多肽与核酸形成纳米复合物，然后通过静电作用使阳离子脂质体或阳离子胶束与该复合物自组装形成表面为不规则磷脂层或胶束的纳米颗粒。
优选的，所述阳离子脂质体是由阳离子脂质与中性脂质、阳离子脂质与胆固醇或阳离子脂质与两亲性分子形成的脂质体；所述阳离子胶束是由阳离子脂质与中性脂质、阳离子脂质与胆固醇或阳离子脂质与两亲性分子形成的胶束。
优选的，所述阳离子脂质体具有阳离子双层磷脂膜；所述阳离子胶束是具有表面带正电荷的胶束。
优选的，所述核酸选自DNA、siRNA、microRNA或shRNA。
第二方面，本发明还涉及一种前述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体或胶束：阳离子脂质与中性脂质、胆固醇，或两亲性分子制得阳离子脂质体，或是阳离子脂质与中性脂质、胆固醇或两亲性分子形成的制得阳离子胶束。
％、纳米载体的制备：将20～40μg/mL的多肽溶液，与5～10μg/mL核酸混合，然后加入到稀释至5～10μg/mL的阳离子脂质体或胶束中，常温孵育，制得由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物；
C、将所述复合物与聚阴离子溶液混合均匀，即得所述具有双靶向功能的核酸输送纳米载体。
优选的，所述阳离子脂质体或阳离子胶束、多肽、核酸的质量比为(1～4)∶(4～8)∶1；所述聚阴离子、核酸的质量比为13∶1～40∶1。在本发明的制备体系中，阳离子脂质体或胶束、多肽的质量比低于1∶1(如0.5∶1)；或多肽与核酸的质量比为低于4∶1(如2∶1)都将得不到由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物。
第三方面，本发明还涉及一种前述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体在作为体内系统输送核酸体系中的用途。
本发明通过核酸、包含阳离子多肽-b-细胞靶向肽的两嵌段序列多肽(如图1)、阳离子脂质体，以及透明质酸通过协同效应自组装构建的纳米载体的组成与功能如下：
(1)利用多肽中的带正电荷多肽序列包裹核酸同时通过细胞靶向肽肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)；
(2)利用脂质体融膜作用使载体突破细胞膜与内涵体膜；
(3)利用透明质酸屏蔽载体内部的正电荷并靶向肿瘤细胞表面受体CD44。
因此，本发明与现有的lipopolyplexes相比，不仅避免了聚阳离子的毒性(多肽是人体内源性分子)，而且有效突破了通过PEG化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为双靶向纳米颗粒的构建示意图；其中，A为双靶向纳米颗粒制备示意图；B为双靶向纳米颗粒被靶细胞内吞和胞内输送路径；
图2为双靶向纳米颗粒包裹DNA的Zeta电位图；其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，D代表DM；
图3为双靶向纳米颗粒包裹DNA的粒径图；其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，D代表DNA；
图4为双靶向纳米颗粒包裹siRNA的Zeta电位图；其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，R代表siRNA；
图5为双靶向纳米颗粒包裹siRNA的粒径图；其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，R代表siRNA；
图6为双靶向纳米颗粒包裹DM和siRNA的凝胶电泳图；H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，R代表siRNA；其中，A为包裹DNA；B为包裹siRNA；
图7为双靶向纳米颗粒包裹siRNA的HCCLM3细胞内吞实验；
图8为双靶向纳米颗粒包裹萤光素酶质粒的HCCLM3细胞转染活性图，其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，D代表DM；
图9为双靶向纳米颗粒包裹萤光素酶质粒和siRNA的HCCLM3细胞毒性图，H代表透明质酸、L代表阳离子脂质体、D代表DNA；其中，A为包裹萤光素酶质粒；B为包裹siRNA；
图10为双靶向纳米颗粒包裹survivin siRNA的survivin基因沉默图，其中，H代表透明质酸，L代表阳离子脂质体，P代表多肽，R代表siRNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明涉及一种药物技术领域的可用于核酸输送的双靶向纳米载体；是一种通过聚阴离子、阳离子脂质体或胶束、多肽和核酸合理组装的核酸输送体系，如其示意图1；具体由四个组份组成，分别是：
a、聚阴离子，包括透明质酸、透明质酸钠、羧甲基壳聚糖等多糖类聚合物。
b、阳离子脂质体，包括可以形成阳离子双层磷脂膜的由阳离子脂质与中性脂质、胆固醇或两亲性分子形成的脂质体；阳离子胶束，由阳离子脂质与中性脂质、胆固醇或两亲性分子形成的胶束。
c、多肽，包括由阳离子多肽序列和具有靶向细胞的多肽序列组成的多肽，以及由阳离子多肽序列和穿透细胞的多肽序列组成的多肽。
d、核酸，包括DNA，siRNA，microRNA以及shRNA。
其中，多肽组分进行核酸的包裹和跨越磷脂膜的作用；进一步的，多肽组分进行核酸的包裹和并靶向细胞表面受体的作用。
阳离子脂质体组分主要进行融合细胞膜和内涵体膜作用。
聚阴离子组分进行屏蔽电荷的作用。进一步的，聚阴离子组分进行屏蔽电荷与靶向细胞表面受体的作用。
多肽是由阳离子多肽序列与靶向肽序列直接连接或通过适当的氨基酸片段连接而成。
本发明涉及的用阳离子多肽-b-细胞靶向肽的两嵌段序列多肽。是一类集包裹与靶向为一身的阳离子多肽，以下多肽序列为含有靶向序列的多肽(但不含有间隔序列(spacer))，其序列结构为：
表1.多肽的组成与名称。
多肽 氨基酸序列 简称
P1 RRRRRRRRRRRRRRRRIVNQPTYGYWHY R16D，(SEQ ID NO.1)
本发明中涉及的用作靶向肿瘤细胞的细胞靶向肽通过聚精氨酸和特定靶向表皮生长因子受体(EGFR)的多肽IVNQPTYGYWHY的序列组合而成，以及优选出最佳的载体。
本发明涉及一种上述的核酸载体的制备方法，包括如下步骤：
a、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体：采用阳离子脂质((2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP))与中性脂质(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE))的质量比为0.5～1∶1的氯仿溶液旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30～60分钟。
b、纳米载体的制备：利用上述制备好的多肽稀释到一定浓度(20～40μg/mL)，与一定浓度(5～10μg/mL)的核酸按质量比为(4～8)∶1的比例进行混合，再加到阳离子脂质体或胶束(稀释至5～10μg/mL)中制备由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物，其中，复合物的脂质体、多肽和核酸的质量比为(1～4)∶(4～8)∶1，在常温下孵育25～35分钟。然后对应加入不同比例(聚阴离子、核酸的质量比为13∶1～40∶1)的透明质酸钠水溶液，并混合均匀，放置5～25分钟。
本发明对多肽/脂质体/透明质酸协同组装的靶向特定细胞表面的高效安全的双靶向核酸载体(也叫双靶向纳米颗粒)的物化性质表征方法包括：凝胶电泳、动态光散射和Zeta电位；双靶向纳米颗粒的转染活性与毒性实验的DNA质粒是荧光素酶质粒；双靶向纳米颗粒的细胞内吞实验的siRNA是cy3标记的无序siRNA；双靶向纳米颗粒的转染活性与毒性实验的细胞是HCCLM3细胞；双靶向纳米颗粒的细胞内吞实验的细胞为HCCLM3细胞；双靶向纳米颗粒的siRNA输送的siRNA是survivin siRNA。
实施例1、双靶向纳米颗粒的制备方法
如图1所示，双靶向纳米颗粒的用于测物化性质的体系在水溶液中进行。将上述不同质量比例的多肽与核酸溶液混合后加入到阳离子脂质体中继续混合均匀。在室温下孵育30分钟，然后将不同比例的聚阴离子加入该混合物中并充分混合均匀，静置15分钟。用于细胞实验的载体体系用无血清培养基代替超纯水即可。
实施例2、双靶向纳米颗粒的Zeta电位
采用zetasizer 2000测定双靶向纳米颗粒的表面电荷，样品测定时间设置为自动，每个样品测定3次，取平均值作图。复合物的ζ电位测定结果如图2和图4所示。由图可知：随着透明质酸与DNA的质量比值增加，双靶向纳米颗粒的Zeta电位从正电荷减少到负电荷，当透明质酸：DNA的值为14∶1时，双靶向纳米颗粒的Zeta电位达到负的平衡值最大值-34mV，随着透明质酸：DNA的值增加双靶向纳米颗粒的Zeta基本保持不变。所以只选用透明质酸与DNA的质量比值为14∶1的纳米载体进行研究。在此基础上，我们选用了透明质酸与siRNA的质量比值为14∶1的纳米载体进行研究，发现当加入透明质酸后其Zeta电位同样从正电荷54mV降低到负电荷-34mV。
实施例3、双靶向纳米颗粒的粒径
室温条件下，用Malvern Nano ZS激光粒度仪测定双靶向纳米颗粒的水化半径，折射介质设置为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，每个样品测定3次，取平均值作图。复合物的粒径测定结果，如图3和图5所示，在不同透明质酸与核酸的质量比下，双靶向纳米颗粒的粒径在100-200nm之间，但同时发现，当透明质酸与核酸的质量比为14∶1时，粒径最小，结合其表面电势为-35mV的结果(图2)可知双靶向纳米颗粒在这个质量比时组装的最好。
实施例2、双靶向纳米颗粒的凝胶电泳
配置质量比1.0％琼脂糖溶液用于DNA检测(质量比3.0％琼脂糖溶液用于DNA检测)，在微波炉中加热溶解，取40mL溶液，倒入专用的EB污染的烧杯中，加入约4μL的EB溶液，搅匀后倒入模具中，插上梳子，约30min之后，胶就凝固了，电泳槽中加入适量TAE缓冲液，将琼脂糖凝胶放入电泳槽等待上样。然后配置不同质量比的双靶向纳米颗粒溶液，室温孵育30min。上样的Marker选用1000-10000kb的质粒maker，上样时先取1μL的上样缓冲液，加入5μL的样品样品，混合均匀后，加入到凝胶孔中。加上电压120伏的电压，蓝色的溴酚蓝会快速的移动到胶的底端之后，约20min，用紫外凝胶成像系统拍照。复合物的凝胶电泳结果，如图6所示；图6a和6b中各个样品的具体命名见表1、2。如图6所示，结果显示所有的载体将DNA或siRNA完全包裹住，故DNA或siRNA在电泳时无迁移，泳道中没有条带。
表2.双靶向纳米颗粒的组成与名称
实施例5、细胞内吞效率
首先，在96孔细胞培养板中，加入2.5×104个细胞/0.175mL的细胞悬液，培养过夜将50μL的多肽Opti-MEM(无血清培养基)溶液与50μL的荧光素酶质粒Opti-MEM溶液充分混合(2μg荧光素酶质粒)，然后将该混合物加入到阳离子脂质体溶液中继续混合，在室温静置30分钟，然后分别加入不同比例的透明质酸Opti-MEM溶液，充分混合后孵育15分钟。然后每个样品的溶液稀释至800μL，然后除去细胞培养基，用PBS洗涤一次，然后将稀释的样品液以200μL/孔(每孔加入质粒的量是250ng的质粒)的量与细胞共孵育4小时。每个质量比做四个复孔。然后将相应各孔中的细胞消化，轻轻吹打收集离心(4℃，1000rpm，5min)，离心后弃去上清，加入1mL的1×PBS，轻轻吹打均匀后离心，重复洗2遍后，每个样品中加入300μL的1×PBS，并将细胞溶液转移到流式管中，流式细胞仪检测(BD)。结果如图7所示，样品LPD和HLPD均可以被细胞有效内吞。
实施例6、双靶向纳米颗粒的细胞转染实验
首先，在96孔细胞培养板中，加入2.5×104个细胞/0.175mL的细胞悬液，培养过夜。将50μL的多肽Opti-MEM(无血清培养基)溶液与50μL的荧光素酶质粒Opti-MEM溶液充分混合(2μg荧光素酶质粒)，然后将该混合物加入到阳离子脂质体溶液中继续混合，在室温静置30分钟，然后分别加入不同比例的透明质酸Opti-MEM溶液，充分混合后孵育15分钟。然后每个样品的溶液稀释至800μL，然后除去细胞培养基，用PBS洗涤一次，然后将稀释的样品液以200μL/孔(每孔加入质粒的量是250ng的质粒)的量与细胞共孵育4小时。每个质量比做四个复孔。阳性对照组Lipofectamine2000(L2K)，以其最佳质量比3(w/w＝3∶1)除去无血清的培养基，每孔加入含10％胎牛血清的1640培养基，再培养24小时，检测转染结果。
以报告基因荧光素酶考察了一系列双靶向纳米颗粒的转染活性，结果如图8所示。设置阳性对照组是质量比为3的Lipfectamine2000(L2K)，可以看出，本发明构建的双靶向纳米颗粒的转染效率与对照组相比大大提高。进一步揭示了该组装体系的优越性。
实施例7、双靶向纳米颗粒细胞毒性实验
采用CCK8法测定双靶向纳米颗粒的毒性，结果如图9所示。以Lipofectamine2000作为阳性对照组，不做任何处理的细胞为阴性对照组。在96孔细胞培养板中，加入2.5×104个细胞/0.175mL的细胞悬液，培养过夜。将50μL的多肽Opti-MEM(无血清培养基)溶液与50μL的荧光素酶质粒Opti-MEM溶液充分混合(2μg荧光素酶质粒)，然后将该混合物加入到阳离子脂质体溶液中继续混合，在室温静置30分钟，然后分别加入不同比例的透明质酸Opti-MEM溶液，充分混合后孵育15分钟。然后每个样品的溶液分别用无血清培养基稀释至800μL，然后除去细胞培养基，用PBS洗涤一次，然后将稀释的样品液以200μL/孔(每孔加入质粒的量是250ng的质粒)的量与细胞共孵育4小时。每个质量比做四个复孔。阳性对照组PEI25kDa和双靶向纳米颗粒，以其最佳质量比3(w/w＝3∶1)包裹荧光素酶质粒，避光条件下再加入10μL的CCK8溶液，置于细胞培养箱中培养上2小时。酶标仪570nm处测定结果，630nm处做对照。结果如图9所示，在HCCLM3细胞当中，双靶向纳米颗粒基本没有细胞毒性。但值得注意的是，双靶向纳米颗粒是表面带负电荷的具有双靶向基团的可用于体内系统输送的纳米级核酸载体，而LPD或者LPR表面带正电荷，仅是一种转染试剂。
实施例8、双靶向纳米颗粒输送surviving siRNA的基因沉默实验
将HCCLM3细胞以2×105个/孔在玻璃底的培养皿中培养过夜。利用等同量的无序siRNA和surviving siRNA共混制备样品。去掉培养基，每孔加入2μg siRNA/500μl的药品溶液。在细胞培养箱中与细胞共孵育4小时，然后用PBS洗涤。换上完全培养基，继续孵育44小时然后将细胞收集，进行实时-PCR检测，在MX3000P实时-PCR仪器(美国，Stratagene公司)上操作。如图10所示，发现与包裹等同量的无序siRNA相比，HLPR可以沉默90％的靶基因。具有优良的输送siRNA效率。
综上所述，本发明用有靶向功能的靶向肽序列和聚阳离子多肽序列组成的多肽包裹核酸并靶向肿瘤细胞。利用阳离子脂质体突破细胞膜与内涵体膜从而进入细胞浆中，利用药用级透明质酸屏蔽载体内部的正电荷并靶向肿瘤细胞的表面受体。该载体的优势是利用人体安全的生物材料构建出紧密包裹核酸、体内长效循环与高效靶向肿瘤细胞，并顺利进入细胞浆通过解组装和自身降解释放出核酸或通过改变多肽的序列以纳米颗粒的形式进入细胞核的新型非病毒载体。该载体的具体构建方法：首先将多肽与核酸形成纳米复合物，然后通过静电作用使脂质体与该复合物自组装形成表面为不规则脂质膜的纳米颗粒，因为多肽序列中有一段用于靶向的氨基酸序列为电中性的，其中部分序列可以在脂质膜表面突伸出来，然后再加入透明质酸，从而通过透明质酸与纳米颗粒的表面正电荷的静电作用，以及与突出的多肽的氢键作用，从而组装成可以在体内长效循环，靶向特定肿瘤细胞表面受体，并通过脂质体融膜作用顺利突破细胞膜与内涵体膜进入细胞质，在微酸性的细胞质内降解释放核酸，同时自身被及时代谢。由于所用的多肽、脂质体和多糖类聚阴离子都是人体可接受的药用材料，所以该载体具有药用的潜质。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述载体是表面带负电荷的具有双靶向基团的纳米级核酸载体；所述载体的内核是由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物；所述双靶向核酸载体的外壳是聚阴离子，所述聚阴离子通过静电作用包裹在所述复合物的表面；所述多肽是由阳离子多肽序列与靶向肽序列连接而成的具有靶向和包裹功能的多肽。
2.根据权利要求1所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述聚阴离子选自透明质酸、透明质酸衍生物、羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖衍生物中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物是先将多肽与核酸形成纳米复合物，然后通过静电作用使阳离子脂质体或阳离子胶束与该复合物自组装形成表面为不规则磷脂层或胶束的纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述阳离子脂质体是由阳离子脂质与中性脂质、阳离子脂质与胆固醇或阳离子脂质与两亲性分子形成的脂质体；所述阳离子胶束是由阳离子脂质与中性脂质、阳离子脂质与胆固醇或阳离子脂质与两亲性分子形成的胶束。
5.根据权利要求3或4所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述阳离子脂质体具有阳离子双层磷脂膜；所述阳离子胶束是具有表面带正电荷的胶束。
6.根据权利要求1所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体，其特征在于，所述核酸选自DNA、siRNA、microRNA或shRNA。
8.一种根据权利要求1～7中任一项所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体或胶束：阳离子脂质与中性脂质、胆固醇，或两亲性分子制得阳离子脂质体，或是阳离子脂质与中性脂质、胆固醇或两亲性分子形成的制得阳离子胶束。
％、纳米载体的制备：将20～40μg/mL的多肽溶液，与5～10μg/mL核酸混合，然后加入到稀释至5～10μg/mL的阳离子脂质体或胶束中，常温孵育，制得由不规则磷脂层或胶束包裹多肽/核酸的复合物；
C、将所述复合物与聚阴离子溶液混合均匀，即得所述具有双靶向功能的核酸输送纳米载体。
9.根据权利要求8所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体或阳离子胶束、多肽、核酸的质量比为(1～4)∶(4～8)∶1；所述聚阴离子、核酸的质量比为13∶1～40∶1。
10.一种根据权利要求1～7中任一项所述的具有双靶向功能的核酸输送纳米载体在作为体内系统输送核酸体系中的用途。
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