CN101107069A - 用脂质膜被覆粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种能够用两张其间形成空间的脂质膜来被覆对象粒子的方法。为达到此目的，采用两张脂质膜被覆带正电粒子的方法，其中使所述带正电粒子与多个带负电SUV型脂质体接触，形成含有由所述带正电粒子和与所述带正电粒子静电结合的所述带负电SUV型脂质体的带负电复合物，用阳离子处理所述带负电复合物。

Description

用脂质膜被覆粒子的方法
技术领域
本发明涉及用脂质膜被覆粒子的方法。
背景技术
近年来，为了将药物、核酸、肽、蛋白质、糖等准确递送到靶向部位的载体的开发很盛行。例如，在基因治疗过程中，开发了将目的基因导入靶细胞的载体-逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等的病毒载体。但是，病毒载体存在大量生产的困难性、抗原性、毒性等问题，因此，少有这样的问题出现的脂质体载体正在引起人们的关注。脂质体载体具有通过向其表面导入抗体、蛋白质、糖链等的功能性分子，能够提高对靶向部位的靶向性这一优点。
公知的脂质体的制备方法，例如有脂质膜的单纯水合法。根据脂质膜的单纯水合法，在基因等目的物质的存在下，能够通过将脂质膜水合制备将目的物质封入其中的多层膜脂质体(非专利文献1)。通过对这样制备得到的多层膜脂质体再次进行脂质膜的单纯水合法，能够在多层膜脂质体外侧得到多层新的脂质膜。就这样通过反复进行脂质膜的单纯水合法，能够增加多层膜脂质体中含有的脂质膜的数量。
非专利文献1：Kogure等，“Journal of Controlled Release”，2004年，98卷，317-323页。
但是，采用脂质膜的单纯水合法等以往的方法，脂质膜被不均匀的多层化，很难控制多层膜脂质体含有的脂质膜的数量。另外，采用脂质膜的单纯水合法等以往的方法，脂质膜只能像地层一样层层重叠在一块，脂质膜之间很难形成空间。
发明内容
因此本发明的目的在于提供一种能够用两张其间形成空间的脂质膜来被覆对象粒子的方法，以及提供通过该方法用两张脂质膜将对象粒子被覆而得到的脂质体。
本发明的第一种方法为，用两张脂质膜将带正电粒子被覆的方法，其特征在于，使所述带正电粒子与多个带负电SUV型脂质体接触，形成含有所述带正电粒子和已与所述带正电粒子静电结合的所述带负电SUV型脂质体的带负电复合物，用阳离子处理所述带负电复合物。
根据本发明的第一种方法，能够用其间形成空间的两张脂质膜被覆带正电粒子。通过本发明的第一种方法被覆带正电粒子得到脂质体，在被覆带正电粒子的两张脂质膜(形成于带正电粒子外例的第一脂质膜以及形成于第一脂质膜外侧的第二脂质膜)之间形成空间，所要求的物质能够保留在该空间。
本发明的第一种方法中，所述带正电粒子优选为目的物质的聚集物。此时，通过本发明的第一种方法能够制作封入目的物质的聚集物，且被覆目的物质的聚集物的两张脂质膜之间形成有空间的两张膜脂质体。
本发明的第一种方法中，所述带正电粒子优选为带正电的n张膜脂质体(n是大于1的整数)。此时，通过本发明的第一种方法能够制作被覆带正电的n张膜脂质体的两张脂质膜之间形成有空间的(n+2)张膜脂质体。
本发明的第一种方法中，所述带正电粒子的ξ电位优选为20～30mV，所述带负电SUV型脂质体的ξ电位优选为-20～-30mV。此时，能够很有效地形成含有带正电粒子和已与该带正电粒子静电结合的多个带负电SUV型脂质体的带负电复合物。
本发明的第一种方法中，所述带正电粒子的粒径优选在50nm以上。此时，能够很有效地形成含有带正电粒子和已与该带正电粒子静电结合的多个带负电SUV型脂质体的带负电复合物。
本发明的第二种方法为，用两张脂质膜将带负电粒子被覆的方法，其特征在于，使所述带负电粒子与多个带正电SUV型脂质体接触，形成含有所述带负电粒子和与所述带负电粒子静电结合的所述带正电SUV型脂质体的带正电复合物，用阴离子处理所述带正电复合物。
根据本发明的第二种方法，能够用在其间形成空间的两张脂质膜被覆带负电粒子。通过本发明的第二种方法被覆带负电粒子得到脂质体，在被覆有带负电粒子的两张脂质膜(形成于带负电粒子外侧的第一脂质膜以及形成于第一脂质膜外侧的第二脂质膜)之间形成空间，所要求的物质能够保留在该空间。
本发明的第二种方法中，所述带负电粒子优选为目的物质的聚集物。此时，通过本发明的第二种方法能够制作封入目的物质的聚集物，且被覆目的物质的聚集物的两张脂质膜之间形成有空间的两张膜脂质体。
本发明的第二种方法中，所述带负电粒子优选为带负电的n张膜脂质体(n是大于1的整数)。此时，通过本发明的第二种方法能够制作被覆带负电的n张膜脂质体的两张脂质膜之间形成有空间的(n+2)张膜脂质体。
本发明的第二种方法中，所述的带负电粒子的ξ电位优选为-20～-30mV，所述带正电SUV型脂质体的ξ电位优选为20～30mV。此时，能够很有效地形成含有带负电粒子和已与该带负电粒子静电结合的多个带负电SUV型脂质体的带正电复合物。
本发明的第二种方法中，所述带负电粒子的粒径优选在50nm以上。此时，能够很有效地形成含有带负电粒子和已与该带负电粒子静电结合的多个带负电SUV型脂质体的带正电复合物。
根据本发明的方法，能够用两张其间形成空间的脂质膜来被覆对象粒子。因此，如果使用目的物质的聚集物作被覆的对象粒子，能够制作封入目的物质的聚集物，且被覆目的物质的聚集物的两张脂质膜之间形成有空间的两张膜脂质体；如果使用n张膜脂质体(n是大于1的整数)作被覆的对象粒子，能够制作被覆n张膜脂质体的两张脂质膜之间形成有空间的(n+2)张膜脂质体。通过本发明的方法被覆带正电粒子或带负电粒子得到的脂质体，在被覆带正电粒子或带负电粒子的两张脂质膜之间形成空间，要求的物质能够保留在该空间。
附图说明
图1(a)为表示通过DNA琼脂糖凝胶电泳测定各分离物的DNA含量的结果的图，(b)为表示通过荧光强度测定各分离物的罗丹明含量以及NBD含量的结果的图。
图2(a)为表示通过DNA琼脂糖凝胶电泳测定各分离物的DNA含量的结果的图，(b)为表示通过荧光强度测定各分离物的罗丹明含量以及NBD含量的结果的图。
图3为表示通过各种多层脂质体被导入细胞内的荧光素酶基因的表现活性的图。
具体实施方式
在本发明的第一种方法中，首先，使带正电粒子与多个带负电SUV型脂质体接触，形成含有带正电粒子和已与带正电粒子静电结合的带负电SUV型脂质体的带负电复合物。
在本发明的第二种方法中，首先，使带负电粒子与多个带正电SUV型脂质体接触，形成含有带负电粒子和已与带负电粒子静电结合的带正电SUV型脂质体的带正电复合物。
带正电粒子的ξ电位没有特别限制，只要它的ξ电位是正值即可，通常为10～60mV，优选为20～50mV，更优选为20～30mV。带负电粒子的ξ电位没有特别限制，只要它的ξ电位是负值，通常为-10～-60mV，优选为-20～-50mV，更优选为-20～-30mV。ξ电位的测定条件无特别限定，温度条件通常为25℃。
带正电粒子以及带负电粒子的粒径没有特别限制，粒径的下限值优选为50nm，更优选为70nm，粒径的上限值优选为500nm，更优选为200nm。如果带正电粒子的粒径在上述范围内，在用阳离子处理已与带正电粒子静电结合的带负电SUV型脂质体的时候，能够用两张脂质膜很有效地被覆带正电粒子。另外，如果带负电粒子的粒径在上述范围内，在用阴离子处理已与带负电粒子静电结合的带正电SUV型脂质体的时候，能够用两张脂质膜很有效地被覆带负电粒子。
带正电粒子在整体为正值时，加入到阳离子物质，即使含有中性物质和/或阴离子物质也可以。带负电粒子在整体为负值时，加入到阴离子物质，即使含有中性物质以及/或者阳离子物质也可以。
带正电粒子或者带负电粒子，能够使用例如，目的物质(例如应递送到细胞内或核内的物质)的聚集物。带正电粒子或者带负电粒子在使用目的物质的聚集物时候，通过用两张脂质膜被覆带正电粒子或者带负电粒子，能够制作封入有目的物质的两张膜脂质体。目的物质的聚集物可以只由目的物质构成，也可以含有目的物质以外的物质(例如：保留目的物质的载体)。
目的物质带正电的时候，例如，可以通过使目的物质和阴离子物质静电结合，使其复合物化的方法来制备目的物质的聚集物。目的物质带负电的时候，例如，可以通过使目的物质和阳离子物质静电结合，使其复合物化的方法来制备目的物质的聚集物。目的物质既不带正电也不带负电的时候，通过目的物质和阳离子物质以适当方式(例如：物理性吸附、疏水性结合、化学结合等)，使其复合物化，制备目的物质的聚集物。复合物化时，通过调整目的物质和阳离子物质或者和阴离子物质的混合比，能够制备整体带正或负电的目的物质的聚集物。
目的物质没有特别的限定，例如，可以是核酸、肽、蛋白质、药物、糖以及它们的复合物等。并且，向核酸中加入DNA或者RNA，就会含有它们的类似物或者衍生物(例如肽核酸(PNA))、硫代磷酸酯DNA等。此外，核酸可以是一条链或两条链，可以是线状也可以是环状。
目的物质为核酸的时候，通过核酸和阳离子物质静电结合复合物化，制备核酸的聚集物。复合物化的时候，通过调整核酸和阳离子物质的混合比，能够制备整体带正或负电的核酸聚集物。
制备目的物质的聚集物的时候使用的阳离子物质没有特别限制，只要分子中具有阳离子基团的物质即可。阳离子物质能够使用的有，例如，阳离子脂质(例如：Lipofectamine(Invitrogen公司制))；具有阳离子基团的高分子；聚赖氨酸、聚精氨酸、赖氨酸和精氨酸的共聚物等的碱性氨基酸的单聚物或者共聚物或者这些的衍生物(例如硬脂酰衍生物)；聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵、氨基葡萄糖等的多阳离子聚合物；硫酸精蛋白等。阳离子物质具有的阳离子基团的数目没有特别的限定，优选2个以上。阳离子基团带有正电荷即可，没有特别的限定，例如，可为氨基；甲胺基、乙胺基等单烷胺基；二甲胺基、二乙胺基等二烷胺基；亚氨基；胍基等。
制备目的物质的聚集物的时候使用的阴离子物质没有特别的限制，只要分子中具有阴离子基团的物质即可。阴离子物质能够使用的有，例如，阴离子脂质；具有阴离子基团的高分子；聚天门冬酰胺等酸性氨基酸的单聚合物或者共聚合物或者这些的衍生物；黄原胶、聚羧乙烯、羧甲基纤维素聚苯乙烯砜酸盐、多糖类、鹿角菜胶、等的多阴离子聚合物。阴离子物质具有的阴离子基团的数目没有特别的限定，优选2个以上。阴离子基团带有负电荷即可，没有特别的限定，例如，可为具有末端羧基的官能团(例如：琥珀酸残基、丙二酸残基等)、磷酸根、硫酸根等。
例如，带正电或者带负电的n张膜脂质体(n为大于1的整数)，可以当作带正电或带负电的粒子使用。在使用n张膜脂质体为带正电或者带负电的粒子的时候，通过用两张脂质膜被覆带正电或者带负电的粒子，能够制作(n+2)张膜脂质体。可以将目的物质封入带正电或者带负电的n张膜脂质体内部，也可以不封入。带正电的n张膜脂质体仅在整体带正电荷的时候，加入到阳离子物质，即使含有中性物质以及/或者阴离子物质也可以。带负电的n张膜脂质体仅在整体带负电荷的时候，加入到阴离子物质，即使含有中性物质以及/或者阳离子物质也可以。
n张膜脂质体能够使用，例如，水合法、超声波处理法、注入乙醇法、注入乙醚法、反相蒸发法、表面活性剂法、冻结溶解法等公知方法制作。另外，使用本发明的方法，通过用两张脂质膜被覆带正电或者带负电的粒子，也能够制得n张膜脂质体。
通过调节构成n张膜脂质体的物质(例如：脂质膜构成成分、被封入脂质体内部的物质等)的种类以及含量，能够制作带正电或者带负电的n张膜脂质体。另外，通过用阳离子物质修饰带负电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体，能够制作带正电的n张膜脂质体；通过用阴离子物质修饰带正电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体，能够制作带负电的n张膜脂质体。
n张膜脂质体能够通过例如水合法，按如下所述制得。将脂质膜的构成成分溶解于有机溶剂后，通过蒸发除去有机溶剂得到脂质膜。此时，有机溶剂，例如，可以是戊烷、己烷、庚烷、环己烷等的碳水化合物；二氯甲烷、氯仿等卤代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；甲醇、乙醇等低级醇类；醋酸甲酯等酯类；丙酮等酮类；可将这些有机溶剂单独或者两种以上相互组合使用。然后，通过水合该脂质膜、搅拌或者超声波处理，可转化为多层膜脂质体。按照公知的方法能够进行由多层膜脂质体向一张膜脂质体或者由一张膜脂质体向多层膜脂质体的转化。通过将n张膜脂质体通过预定的孔径大小的过滤器，能够得到有一定粒度分布的n张膜脂质体。
目的物质为水溶性的时候，通过向制造n张膜脂质体过程中水合脂质膜时使用的水性介质中添加目的物质或者其聚集物，能够将目的物质封入脂质体内部的水相中。此外，目的物质为脂溶性的时候，通过向制造n张膜脂质体过程中使用的有机溶剂中添加目的物质或者其聚集物，能够将目的物质封入脂质体的脂质膜中。
在用阳离子物质修饰带负电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的表面的时候，例如，向带负电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的外液中添加具有疏水性基团的阳离子物质。由此，为使阳离子物质从脂质膜露出，将疏水性基团插入脂质膜，使阳离子物质能够导入带负电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的表面。
在用阴离子物质修饰带正电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的表面的时候，例如，向带正电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的外液中添加具有疏水性基团的阴离子物质。由此，为使阴离子物质从脂质膜露出，将疏水性基团插入脂质膜，使阴离子物质能够导入带正电的n张膜脂质体或者中性的n张膜脂质体的表面。
疏水性基团插入脂质膜即可，并没有特别的限定。疏水性基团可以是，例如硬脂酰基等的饱和或者不饱和脂肪酸基团、胆固醇残基等的固醇残基、磷脂质残基、糖脂残基、长链脂肪族羟基残基(例如：磷脂乙胺残基等)、羟基丙烯烷基、甘油脂肪酸酯残基等，其中特别优选碳原子数为10～20的脂肪酸基团(例如：棕榈酰基、油醇基、硬脂酰基、花生四烯酰基等)。
n张膜脂质体中脂质膜构成成分，只要不阻碍二层脂质的形成即可，并无特殊限定。脂质膜构成成分，例如是脂质、膜稳定剂、抗氧化剂、荷电物质、膜蛋白质等。
调节带正电n张膜脂质体中脂质膜构成成分的种类以及含量，以使n张膜脂质体整体带正电；调节带负电n张膜脂质体中脂质膜构成成分的种类以及含量，以使n张膜脂质体整体带负电。赋予正电荷的脂质膜构成成分，例如，可以是阳离子脂质、阳离子膜稳定剂等，赋予负电荷的脂质膜构成成分，例如，可以是阴离子脂质、阴离子膜稳定剂等。并且，向n张膜脂质体内部封入预定物质(例如目的物质的聚集物)的时候，按照封入n张膜脂质体内部的物质整体所带的电荷，来调节n张膜脂质体中脂质膜构成成分的种类以及含量。
SUV(small unilamellar vesicle)型脂质体为粒径(直径)在100nm以下的一张膜脂质体。SUV型脂质体的粒径(直径)只要在100nm以下即可，无特别限定，通常为30～100nm，优选30～70nm，更优选30～50nm。
多层膜脂质体(MLV)、除SUV之外的一张膜脂质体(例如：LUV(largeunilamellar vesicle)、GUV(giant unlamellar vesicle)等)粒子直径在100nm以上(一般认为有100nm以上粒子直径的脂质膜为平面膜)，膜的曲度以及膜表面能小，脂质体之间难以产生聚集。相反，SUV型脂质体粒子直径没到100nm，膜的曲度以及膜表面能大，脂质体之间易于产生聚集。因此，如果用阳离子处理与带正电粒子静电结合的带负电SUV型脂质体，带负电SUV型脂质体之间就能够有效膜融合。另外，如果用阴离子处理与带负电粒子静电结合的带正电SUV型脂质体，带正电SUV型脂质体之间就能够有效膜融合。
SUV型脂质体能够用如超声波法，依如下所述制作。将脂质膜的构成成分溶解于有机溶剂后，通过蒸发除去有机溶剂得到脂质膜。此时，有机溶剂可以是，例如戊烷、己烷、庚烷、环己烷等的碳水化合物；二氯甲烷、氯仿等卤代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；甲醇、乙醇等低级醇类；醋酸甲酯等酯类；丙酮等酮类；可将这些有机溶剂单独或者两种以上相互组合使用。然后，通过水合该脂质膜、搅拌或者超声波处理可转化为多层膜脂质体。将得到的多层脂质体再由探针型超声波装置进行处理，可制得一张小的膜脂质体SUV型脂质体。
SUV型脂质体中的脂质膜构成成分没有特别限制，只要不阻碍形成二层脂质即可，脂质膜的构成成分，例如，可以是脂质、膜稳定化剂、抗氧化剂、荷电物质、膜蛋白质等。
调节带正电SUV型脂质体中脂质膜构成成分的种类以及含量，以使SUV型脂质体整体带正电；调节带负电SUV型脂质体中脂质膜构成成分的种类以及含量，以使SUV型脂质体整体带负电。赋予正电荷的脂质膜构成成分，例如，可以是阳离子物质、阳离子膜稳定化剂等；赋予负电荷的脂质膜构成成分，可以是阴离子物质、阴离子膜稳定化剂等。带正电SUV型脂质体只要整体带正电，加入到赋予正电荷的脂质膜构成成分，可以含有赋予负电荷的脂质膜构成成分和/或中性的脂质膜构成成分；带负电SUV型脂质体只要整体带负电，加入到赋予负电荷的脂质膜构成成分，可以含有赋予正电荷的脂质膜构成成分和/或中性的脂质膜构成成分。
带正电SUV型脂质体含有的赋予正电荷的脂质膜构成成分为阳离子脂质的时候，阳离子脂质的配量通常为脂质的总配量的5～30％(摩尔比)，优选10～20％(摩尔比)，更优选10～15％(摩尔比)。
带负电SUV型脂质体含有赋予负电荷的脂质膜构成成分为阴离子脂质的时候，阴离子脂质的配量通常为脂质的总配量的5～30％(摩尔比)，优选10～20％(摩尔比)，更优选10～15％(摩尔比)。
带正电SUV型脂质体的ξ电位没有特别限制，只要它的ξ电位是正值即可，通常为10～60mV，优选为20～50mV，更优选为20～30mV。带负电SUV型脂质体的ξ电位没有特别限制，只要它的ξ电位是负值，通常为-10～-60mV，优选为-20～-50mV，更优选为-20～-30mV。ξ电位的测定条件无特别限定，温度条件通常为25℃。
在n张膜脂质体或SUV型脂质体中，脂质是脂质膜的必要成分，其配量通常为脂质膜构成成分的总配量的30～100％(摩尔比)，优选50～100％(摩尔比)，更优选70～100％(摩尔比)。
脂质，可以为例如，磷脂、糖脂、固醇、饱和或者不饱和的脂肪酸等。磷脂，例如，可以是磷脂酰胆碱(例如：二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酸酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱等)、磷脂酰甘油(例如：二油酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油等)、磷脂酰乙醇胺(例如：二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心肌磷脂、神经鞘髓磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、它们的氢化物等。糖脂质，例如，可以是甘油糖脂(例如：次硫酸核糖基甘油酯、二糖基二甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯)、鞘糖脂(例如：半乳糖基糖脂、神经节苷脂)等。固醇，例如，可以是来源于动物的固醇(例如：胆固醇、胆固醇琥珀酸、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、链甾醇、二氢胆固醇)、来源于植物的固醇(植物甾醇)(例如：豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇、菜油甾醇)、来源于微生物的固醇(例如：酵母甾醇、麦角甾醇)等。饱和或者不饱和的脂肪酸，例如，可以是棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等的碳原子数12～20的饱和或者不饱和的脂肪酸。
脂质分中性脂质、阳离子脂质以及阴离子脂质，中性脂质，例如，可以是二酰磷脂酰胆碱、二酰磷脂酰乙胺、胆固醇、神经酰胺、神经鞘磷脂、脑磷脂、脑苷脂等；阳离子脂质，例如，可以是DODAC(dioctadecyldimethylammonium chloride)、DOTMA(N-(2，3-dioleyloxy)propyl-N，N，N-trimethylammonium)、DDAB(didodecylammonium bromide )、DOTAP(1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane)、DC-Chol(3β-N-(N′，N′-dimethyl-aminoethane)-carbamolcholesterol)、DMRIE(1，2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、DOSPA(2，3-dioleoyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N，N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate)等；阴离子脂质，例如，心肌磷脂、二酰磷脂酰丝氨酸、二酰磷脂酸、N-琥珀酰磷脂酰乙胺(N-琥珀酰PE)、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、胆固醇琥珀酸等。
n张膜脂质体或者SUV型脂质体中，膜稳定剂是为了使脂质膜物理性或者化学性稳定、调节脂质膜的流动性而添加任意成分，其配量通常是脂质膜构成成分的总配量的10～50％(摩尔比)，优选20～50％(摩尔比)、更优选30～50％(摩尔比)。
膜稳定剂，例如，可以是固醇、甘油或者其脂肪酸酯等。固醇，可以是与上述同样的具体例，甘油的脂肪酸酯，例如，可以是甘油三酸酯、三辛酸。
n张膜脂质体或者SUV型脂质体中，抗氧化剂是为了防止脂质膜氧化而添加的任意成分，其配量通常是脂质膜构成成分的总配量的5～30％(摩尔比)，优选10～30％(摩尔比)、更优选20～30％(摩尔比)。
抗氧化剂，例如，可以是生育酚、丙烷基没食子酸、抗坏血酸棕榈酸脂、丁基羟基甲苯等。
n张膜脂质体或者SUV型脂质体中，荷电物质是为了赋予正电荷或者负电荷而添加的任意成分，其配量通常是脂质膜构成成分的总配量的5～30％(摩尔比)，优选10～20％(摩尔比)、更优选10～15％(摩尔比)。
赋予正电荷的荷电物质，例如，硬脂酰胺、油醇氨等的饱和或者不饱和脂肪族胺；二油酰基三甲基氨基丙烷等的饱和或者不饱和阳离子合成脂质等，赋予负电荷的荷电物质，例如，可以是二(十六烷基)磷酸酯、胆固醇琥珀酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
n张膜脂质体或者SUV型脂质体中，膜蛋白质是为了维持脂质膜的构造和赋予脂质膜功能性而添加的任意成分，其配量通常是脂质膜构成成分的总配量的0.1～2％(摩尔比)，优选0.5～2％(摩尔比)、更优选1～2％(摩尔比)。
膜蛋白质，例如，可以是膜表面蛋白质、膜内蛋白质等。
使带正电或者带负电粒子分别与带负电或者带正电SUV型脂质体接触的条件没有特别的限定，温度通常为10～40℃、优选20～30℃，pH通常为6.5～8.0、优选为7.0～7.5，时间通常为1～20分钟、优选为5～10分钟。接触时使用的溶媒没有特别的限定，例如，可以使用HEPES缓冲液、生理盐水、蔗糖溶液等。分散于溶媒中的带负电或者带正电SUV型脂质体的量通常相对于带正电或者带负电粒子过剩，例如，为理论上封入带正电或者带负电粒子的最低限量所必需的带负电或者带正电SUV型脂质体的量的2～4倍量。
带负电SUV型脂质体如果和带正电粒子接触，带正电粒子和带负电SUV型脂质体通过静电相互作用而结合，由多个带负电SUV型脂质体被覆带正电粒子。由此，形成含有带正电粒子和与带正电粒子静电结合的多个带负电SUV型脂质体的带负电复合物。此时，优选形成ξ电位为-20～-50mV的带负电复合物，更优选形成ξ电位为-20～-30mV的带负电复合物。由此，能够用阳离子有效处理与带正电粒子静电结合的带负电SUV型脂质体。带负电复合物的ξ电位能够通过调节带正电粒子以及带负电SUV型脂质体的ξ电位、粒径等来调节。
带正电SUV型脂质体如果和带负电粒子接触，带负电粒子和带正电SUV型脂质体通过静电相互作用而结合，由多个带正电SUV型脂质体被覆带负电粒子。由此，形成含有带负电粒子和与带负电粒子静电结合的多个带正电SUV型脂质体的带正电复合物。此时，优选形成ξ电位为20～50mV的带正电复合物，更优选形成ξ电位为20～30mV的带正电复合物。由此，能够用阴离子有效处理与带负电粒子静电结合的带正电SUV型脂质体。带正电复合物的ξ电位能够通过调节带负电粒子以及带正电SUV型脂质体的ξ电位、粒径等来调节。
按照本发明的第一种方法，接着用阳离子处理形成的带负电复合物。
按照本发明的第一种方法，接着用阴离子处理形成的带正电复合物。
阳离子没有特别的限定，例如，可以是H+等的1价阳离子；Ca2+、Mg2+等的2价阳离子；Al3+等的3价阳离子等。产生H+的物质，例如，可以使用盐酸、醋酸等，产生Ca2+的物质，例如，可以使用氯化钙等，产生Mg2+的物质，例如，可以使用氯化镁等，产生Al3+的物质，例如，可以使用氯化铝等。
阴离子没有特别的限定，例如，可以是OH-、SO4 2-、PO4 3-、离解型短链脂肪酸等。产生H-的物质，例如，可以使用氢氧化钠等，产生SO4 2-的物质，例如，可以使用硫酸钠等，产生PO4 3-的物质，例如，可以使用磷酸钠等，产生离解型短链脂肪酸的物质，例如，可以使用辛酸(CH3(CH2)6COOH)等。
用阳离子处理带负电复合物的条件没有特别的限定，温度通常为10～40℃、优选20～30℃，pH通常为6.5～8.0、优选为7.0～7.5，时间通常为1～20分钟、优选为5～10分钟。阳离子处理时使用的溶媒没有特别限定于水溶液，例如，可以使用HEPES缓冲液。溶媒中添加的阳离子的量可以按照阳离子的性质等进行适当调节，通常为脂质的50倍量(阳离子摩尔/脂质摩尔)以上。
用阴离子处理带正电复合物的条件没有特别的限定，温度通常为10～40℃、优选20～30℃，pH通常为6.5～8.0、优选为7.0～7.5，时间通常为1～20分钟、优选为5～10分钟。阴离子处理时使用的溶媒没有特别限定于水溶液，例如，可以使用HEPES缓冲液。溶媒中添加的阴离子的量可以按照阴离子的性质等进行适当调节，通常为脂质的50倍量(阴离子摩尔/脂质摩尔)以上。
如果用阳离子处理带负电复合物，与带正电粒子静电结合的带负电SUV型脂质体的表面的负电荷消失，带负电SUV型脂质体的表面的疏水性增强，引起挨着的带负电SUV型脂质体之间的膜融合，带正电粒子被两张脂质膜被覆。此外，如果用阴离子处理带正电复合物，与带负电粒子静电结合的带正电SUV型脂质体的表面的正电荷消失，带正电SUV型脂质体的表面的疏水性增强，引起挨着的带正电SUV型脂质体之间的膜融合，带负电粒子被两张脂质膜被覆。这样，在带正电或者带负电粒子的外侧，重新形成了被覆带正电或者带负电粒子的两张脂质膜，此时，两张脂质膜之间形成空间。
使用目的物质的聚集物为带正电或者带负电粒子的时候，封入目的物质的聚集物，制作在被覆目的物质的聚集物的两张脂质膜之间形成空间的两张膜脂质体；使用n张膜脂质体(n为大于1的整数)为带正电或者带负电粒子的时候，制作在被覆n张膜脂质体的两张脂质膜之间形成空间的(n+2)张膜脂质体。
使用本发明的第一种方法通过用两张脂质膜被覆带正电粒子得到的脂质体，通常带负电。但是，根据带负电复合物的ξ电位的大小、阳离子的种类等，也有带正电的情况。使用本发明的第二种方法通过用两张脂质膜被覆带负电粒子得到的脂质体，通常带正电。但是，根据带正电复合物的ξ电位的大小、阴离子的种类等，也有带负电的情况。
使用本发明的第一种方法或者第二种方法通过用两张脂质膜被覆带正电或者带负电粒子得到带正电脂质体的时候，得到的带正电脂质体能够当作本发明的第一种方法中的带正电粒子；当得到带负电脂质体或者中性电脂质体的时候，用阳离子物质修饰该带负电脂质体或者中性电脂质体，制备带正电脂质体，制备的该带正电脂质体能够能够当作本发明的第一种方法中的带正电粒子。这样通过反复操作本发明的第一和/或第二种方法，能够控制脂质膜的数量，制作多层膜脂质体。
使用本发明的第一种方法或者第二种方法通过用两张脂质膜被覆带正电或者带负电粒子得到带负电脂质体的时候，得到的带负电脂质体能够当作本发明的第二种方法中的带负电粒子；当得到的是带正电脂质体或者中性电脂质体的时候，用阴离子物质修饰该带正电脂质体或者中性电脂质体制备带负电脂质体，该带负电脂质体能够当作本发明的第二种方法中的带负电粒子。这样通过反复操作本发明的第一和/或第二种方法，能够在已经形成的两张脂质膜的外侧形成新的两张脂质膜，能够控制脂质膜的数量，制作多层膜脂质体。而且，在已经形成的两张脂质膜的外侧形成新的脂质膜的时候，还保留着已经形成的两张脂质膜以及该两张脂质膜之间形成的空间。
根据本发明的第一或者第二种方法，向通过用两张脂质膜被覆带正电或者带负电粒子得到的脂质体中，优选封入目的物质。目的物质为需要递送到细胞内或者核内的物质(例如：核酸、肽、蛋白质、药物、糖、它们的复合物等)的时候，封入目的物质的脂质体能够可作为目的物质的细胞内或者核内递送用载体。封入目的物质的脂质体，可通过使用目的物质的聚集物作为带正电或者带负电粒子，或，通过使用封入目的物质的n张膜脂质体作为带正电或者带负电粒子得到。此外，能够通过在带正电或者带负电粒子的外侧新形成的两张脂质膜之间保留目的物质(例如：通过保留含有目的物质的液体)得到。
递送目的物质的细胞不局限于原来的生物种类，动物、植物、微生物等任意一个都可以，优选动物，更优选哺乳动物。哺乳动物，例如，可以是人类、猿猴、牛、羊、山羊、马、猪、兔、狗、猫、白鼠、老鼠、土拨鼠等。此外，递送目的物质的细胞的种类没有特别的限定，例如，可以是体细胞、生殖细胞、干细胞或者它们的培养细胞等。
封入目的物质的脂质体，例如，可以在分散液状态下使用。分散溶媒，例如，可以使用生理盐水、磷酸缓冲溶液、枸橼酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液等的缓冲溶液。向分散液中，例如，可以添加糖类、多元醇、水溶性高分子、非离子表面活性剂、抗氧化剂、pH调节剂、水合促进剂等的添加剂来使用。
封入目的物质的脂质体，可以通过in vivo以及in vitro的任意一个来使用。在通过in vivo使用的时候，给药途径，例如，可以是静脉、腹腔内、皮下、经鼻等的非口服给药，给药量以及给药次数按照封入脂质体的目的物质的种类或者数量等能够进行适当调节。
实施例
实施例1
(1)DNA/多聚赖氨酸复合物的形成
DNA以及多聚赖氨酸分别溶解于5mM HEPES缓冲剂(pH7.4)中。而且，使用质体DNA(含有在CMV促进剂以及其下游连接有荧光素酶基因全长约7kbp的质体DNA)。然后，混合DNA溶液(0.1mg/mL)以及多聚赖氨酸溶液(0.1mg/mL)，室温下，用涡流搅拌，制备含有DNA/多聚赖氨酸复合物的溶液。这样制备得到的DNA/多聚赖氨酸复合物的粒径约70～100nm，ξ电位约30～40mV。而且，根据准弹性光散乱方法测定流体力学的直径，根据电泳的光散乱分光测光器(ELS-8000)分析ξ电位(以下相同)。
(2)SUV型脂质体的制备
将蛋黄磷脂酰胆碱/胆固醇琥珀酸(9∶2(摩尔比))溶解于0.5mL氯仿中，放置溶液于玻璃试管中。通过吹入氮气除去溶媒后，放置干燥器中干燥1小时。将得到的脂质膜(0.55微摩尔)用预先加热到25℃的1mL HEPES缓冲溶液水合，在超声波槽内用超声波处理剥离脂质膜。最后用探针型超声波装置进行10分钟的超声波处理，制备SUV型脂质体。这样制备的SUV型脂质体的粒径约为50～100nm，ξ电位约30mV。
SUV型脂质体的荧光标识通过导入罗丹明(红色)或者NBD(4-nitrobenzo-2-oxa-1，3-diazole)标识化二油酰磷脂酰乙胺(蓝色)来实现。此时，溶解水相标识物罗丹明于水合脂质膜的溶媒中(10mM)、溶解脂质标识物NBD标识化二油酰磷脂酰乙胺于氯仿溶液中(相当于总脂质的0.1摩尔％)。
(3)由DNA/多聚赖氨酸复合物的脂质膜被覆
将500μL的SUV型脂质体添加到250μL的DNA/多聚赖氨酸复合物溶液中，令两者接触。据此，形成含有DNA/多聚赖氨酸复合物和与DNA/多聚赖氨酸复合物静电结合的多个SUV型脂质体的复合物。此复合物的粒径约为500～3000nm，ξ电位约为-30mV。并且，在室温(25℃)下接触5分钟。
接触后，添加0.1N盐酸55μL，用H+处理所述复合物。由此，与DNA/多聚赖氨酸复合物静电结合的SUV型脂质体的表面的负电荷消失，SUV型脂质体的表面的疏水性增强，紧邻的SUV型脂质体之间发生膜融合。H+处理后的粒径约85～130nm，ξ电位约-20～-40mV。通过H+处理粒径变小，DNA/多聚赖氨酸复合物静电结合的SUV型脂质体之间发生膜融合，表明形成了封入有DNA/多聚赖氨酸复合物的脂质体。
H+处理后的悬浊液在不连续蔗糖密度梯度(0，30，60％)上分层，在20℃、160000g的条件下进行2小时的离心分离。从上部开始每1mL回收一个分离物，测定荧光强度。通过不连续蔗糖密度梯度离心分离回收得到的分离物里面，DNA含量高的分离物作为含有脂质体的分离物。含有脂质体的分离物，能够从蔗糖30～60％部分(境界)回收得到。
实施例2
与实施例1同样，用脂质膜将DNA/多聚赖氨酸复合物被覆，制备封入有DNA/多聚赖氨酸复合物的脂质体(以下称作第一脂质体)。并且，此时，使用NBD标识脂质(蓝色)标识后的物质作为SUV型脂质体。
向第一脂质体的外液添加1mg/mL硬脂酰化辛精氨酸溶液12μL，通过在室温下放置30分钟，将辛精氨酸(总脂质的5摩尔％)导入至第一脂质体(以下称为第二脂质体)。并且，第一脂质体的ξ电位为负(约-30mV)，在第一脂质体表面上导入辛精氨酸得到的第二脂质体的ξ电位为正(约30～50mV)。
与实施例1同样，将SUV型脂质体(粒径：约50～100nm，ξ电位：约-30mV，脂质浓度：0.55mM，添加量：1.5mL)添加到第二脂质体溶液(0.37mM，750μL)中，令两者接触。据此，形成含有第二脂质体和与第二脂质体静电结合的多个SUV型脂质体的复合物。并且，此时，使用罗丹明荧光标识内水相后的物质作为SUV型脂质体。形成的复合物的粒径约为340～1500nm，ξ电位约为-30mV。
接触后，添加0.1N盐酸165μL，用H+处理所述复合物。由此，与第二脂质体静电结合的SUV型脂质体的表面的负电荷消失，SUV型脂质体的表面的疏水性增强，紧邻的SUV型脂质体之间发生膜融合。H+处理后的粒径约170～240nm，ξ电位约-60mV。通过H+处理粒径变小，第二脂质体静电结合的SUV型脂质体之间发生膜融合，表明第二脂质体被脂质膜被覆。
H+处理后的悬浊液在不连续蔗糖密度梯度(0，5，30％)上分层，在20℃、160000g的条件下进行2小时的离心分离。从上部开始每1mL回收一个分离物。通过琼脂糖凝胶电泳测定各分离部分的DNA的含量(参照图1(a))，同时测定罗丹明以及NBD的荧光强度，计算出罗丹明含量以及NBD含量(参照图1(b))。
通过不连续蔗糖密度梯度离心分离回收得到的分离物里面，DNA含量高的分离物(分离物11)作为含有脂质体的分离物。含有脂质体的分离物，能够从蔗糖5～30％部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂质体的分离物中，NBD、罗丹明以及DNA共存，SUV型脂质体保留着含有罗丹明的内水相进行融合，在融合后的脂质体中形成了保留着含有罗丹明的内水相的空间。
并且，含有脂质体的分离物中，NBD和罗丹明之间的荧光能量没有观察到移动。第二脂质体的脂质膜和含有NBD标识化脂质(蓝色)，第二脂质体的脂质膜和含有罗丹明的内水相没有接触。即，通过与第二脂质体静电结合的SUV型脂质体之间的膜融合，第二脂质体被两张脂质膜被覆，含有罗丹明的内水相保留在第二脂质体外侧新形成的两张脂质膜之间的空间里。假如，如果通过与第二脂质体静电结合的SUV型脂质体之间的膜融合，第二脂质体被一张脂质膜被覆，含有罗丹明的内水相保留在第二脂质体的脂质膜和第二脂质体外侧形成的脂质膜之间，这样，就能够观察NBD和罗丹明之间的荧光能量移动。另外，假如，通过与第二脂质体静电结合的SUV型脂质体之间的膜融合，如果第二脂质体的脂质膜和SUV型脂质体的脂质膜发生融合，(脂质膜的数量无变化)、含有罗丹明的内水相保留在第二脂质体内部，这样，就能够观察NBD和罗丹明之间的荧光能量移动。
实施例3
DNA/多聚赖氨酸复合物被脂质膜被覆，除了制备封入DNA/多聚赖氨酸复合物的脂质体(第一脂质体)时、使用内水相被罗丹明荧光标识后的物质作为SUV型脂质体这一点，以及，除了形成含有第二脂质体和与第二脂质体静电结合的多个SUV型脂质体的复合物时，使用用NBD标识化脂质荧光标识的物质这一点，与实施例2进行同样的实验。
并且，根据实施例2的结果，第一脂质体以及第二脂质体中，DNA/多聚赖氨酸复合物被两张脂质膜被覆，这两张脂质膜之间保留着含有罗丹明的内水相。
H+处理后的悬浊液在不连续蔗糖密度梯度(0，5，30％)上分层，在20℃、160000g的条件下进行2小时的离心分离。从上部开始每1mL回收一个分离物。通过琼脂糖凝胶电泳测定各分离部分的DNA的含量(参照图2(a))，同时测定罗丹明以及NBD的荧光强度，计算出罗丹明含量以及NBD含量(参照图2(b))。
通过不连续蔗糖密度梯度离心分离回收得到的分离物里面，DNA含量高的分离物(分离物11)作为含有脂质体的分离物。含有脂质体的分离物，能够从蔗糖5～30％部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂质体的分离物中，NBD、罗丹明以及DNA共存，NBD和罗丹明之间未观察到荧光能移动，与第二脂质体静电结合的SUV型脂质体发生膜融合时，第二脂质体中存在着两张脂质膜之间形成的空间(存在着含有罗丹明的内水相的空间)。
实施例4
按照实施例1(1)，形成DNA/多聚赖氨酸复合物。并且，与实施例1同样使用质体DNA(含有在CMV促进剂以及其下游连接有荧光素酶基因全长约7037kbp的质体DNA(含有在CMV促进剂的pcDNA 3.1质体中导入荧光素酶基因的物质))作为DNA。
按照实施例1(2)，制备含有由蛋黄磷脂酰胆碱/胆固醇琥珀酸(9∶2(摩尔比))构成的脂质膜的SUV型脂质体(以下称作第一SUV型脂质体)、含有由二油酰磷脂酰乙胺/胆固醇琥珀酸(9∶2(摩尔比))构成的脂质膜的SUV型脂质体(以下称作第二SUV型脂质体)。
按照实施例1(3)，使用第一SUV型脂质体将DNA/多聚赖氨酸复合物用脂质膜被覆，制备脂质体A(两张膜)。此外，使用第二SUV型脂质体将DNA/多聚赖氨酸复合物用脂质膜被覆，制备脂质体B(两张膜)。另外，使用第二SUV型脂质体将脂质体A用脂质膜被覆，制备脂质体C(四张膜)。另外，使用第一SUV型脂质体将脂质体B用脂质膜被覆，制备脂质体D(四张膜)。
脂质体A～D的外液中添加1mg/mL的硬脂酰化辛精氨酸溶液12μL，通过在室温下放置30分钟，将辛精氨酸(总脂质的5摩尔％)导入至各脂质体表面。并且，通过向各脂质体表面导入辛精氨酸，统一了全体脂质体向细胞内移动路径(微胞饮作用)。
将混悬有各脂质体(相当于DNA 0.4μg)的0.25mL的不含血清的DMEM培养基添加到在24孔板上培养的NIH3T3细胞(4×104细胞/孔)，在37℃孵化3小时。3小时后，加入10％小牛血清培养基1mL，再孵化45小时。然后，溶解细胞，将荧光素酶活性测定试剂加入到细胞溶解液中，用亮度计(LuminescencerPSN、ATTO)测定荧光素酶的活性。使用BCA蛋白质定量仪(PIERCE、罗克福德(IL))测定细胞溶解液中的蛋白质含量。
其结果用图3表示。如图3所示，随着构成脂质体的脂质膜的组成、数量等的变化，脂质体的功能(导入基因的能力)发生变化。

Claims (12)

1.一种用两张脂质膜被覆带正电粒子的方法，其特征在于，
使所述带正电粒子与多个带负电SUV型脂质体接触，形成含有所述带正电粒子和已与所述带正电粒子静电结合的所述带负电SUV型脂质体的带负电复合物，用阳离子处理所述带负电复合物。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带正电粒子为目的物质的聚集物。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带正电粒子为带正电n张膜脂质体(n是大于1的整数)。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带正电粒子的ξ电位为20～30mV，所述带负电SUV型脂质体的ξ电位为-20～-30mV。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带正电粒子的粒径在50nm以上。
6.一种用两张脂质膜被覆带负电粒子的方法，特征在于，
使所述带负电粒子与多个带正电SUV型脂质体接触，形成含有所述带负电粒子和已与所述带负电粒子静电结合的所述带正电SUV型脂质体的带正电复合物，用阴离子处理所述带正电复合物。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述带负电粒子为目的物质的聚集物。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述带负电粒子为带负电n张膜脂质体(n是大于1的整数)。
9.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述带负电粒子的ξ电位为-20～-30mV，所述带正电SUV型脂质体的ξ电位为20～30mV。
10.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述带负电粒子的粒径在50nm以上。
11.根据权利要求1至5任一项所述的方法用两张脂质膜被覆带正电粒子得到的脂质体。
12.根据权利要求6至10任一项所述的方法用两张脂质膜被覆带负电粒子得到的脂质体。
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