JP2006238839A - 核酸の細胞内送達効率又は細胞内発現効率を向上させた組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターと、非対象核酸を含む第2の非ウイルス性ベクターとを配合した、対象核酸を細胞内に送達するための組成物であって、対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターが、対象核酸とカチオン性脂質との複合体、又は対象核酸が封入されたリポソームであり、非対象核酸を含む第2の非ウイルス性ベクターが、非対象核酸とカチオン性脂質との複合体、又は非対象核酸が封入されたリポソームである組成物を提供する。
【選択図】 なし
Description
[リン脂質]
ホスファチジルコリン(例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等)、ホスファチジルグリセロール(例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等)、ホスファチジルエタノールアミン(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等)、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。
グリセロ糖脂質(例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド)等。
動物由来のステロール(例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール)、植物由来のステロール(フィトステロール)(例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール)、微生物由来のステロール(例えば、チモステロール、エルゴステロール)等。
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸等。
脂質等を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類;塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類;ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、エタノール等の低級アルコール類;酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類;アセトン等のケトン類等のうち、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、リポソームを調製する。脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に核酸を添加することにより、核酸が内部に封入されたリポソームを調製することができる。
(1)プラスミドDNAとカチオン性脂質との複合体の調製
市販のカチオン性脂質(リポフェクトアミン,Invitrogene社製)溶液1μL(カチオン性脂質濃度:2.4nモル/μL)とプラスミドDNA0.4μgとを無血清培地(ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM))250μL又は50μLに添加して混合することにより(カチオン性脂質の最終濃度:0.01nモル/μL又は0.05nモル/μL,プラスミドDNAの最終濃度:1.6ng/μL又は8ng/μL)、DNAとカチオン性脂質との複合体を調製した。なお、プラスミドDNAとしては、ルシフェラーゼ遺伝子及びその上流にCMVプロモーターを有する全長8454bpのプラスミド(CMVプロモーターを有するpQBIプラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだもの)を使用した。
NIH3T3細胞(4×104個)に、0.02μgDNA量相当の複合体1又は2を添加し、無血清培地(DMEM)0.25mL中、37℃で3時間培養した後、血清含有培地1mLを添加し、37℃で21時間培養した。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現活性(RLU/mgタンパク質)を測定した。ルシフェラーゼ発現活性は、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬(luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルミノメーターにより化学発光量を計測することにより測定した。
図1に示すように、複合体2を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、複合体1を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約40倍であった。
(1)プラスミドDNA封入リポソームの調製
ポリ−L−リジン溶液0.125mL(ポリ−L−リジン濃度:0.1mg/mL,溶媒:HEPES緩衝液)とプラスミドDNA溶液0.125mL(プラスミドDNA濃度:0.1mg/mL,溶媒:HEPES緩衝液)とを混合することにより(ポリ−L−リジンの最終濃度:50ng/μL,プラスミドDNAの最終濃度:50ng/μL)、ポリ−L−リジンとプラスミドDNAとを静電的に相互作用させ、凝集化プラスミドDNAを調製した(粒径:91.6nm,ゼータ電位:44.2mV)。こうして調製された凝集化プラスミドDNAを以下「凝集化プラスミドDNA1」という。
NIH3T3細胞(4×104個)に、0.04μgDNA量相当のリポソーム1又は2を添加し、無血清培地(DMEM)0.25mL中、37℃で3時間培養した後、血清含有培地1mLを添加し、37℃で21時間培養した。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現活性(RLU/mgタンパク質)を測定した。ルシフェラーゼ発現活性は、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬(luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルミノメーターにより化学発光量を計測することにより測定した。
図2に示すように、リポソーム2を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、リポソーム1を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約2.5倍であった。
(1)リポソームの調製
プラスミドDNAとして、GFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子及びその上流にCMVプロモーターを有するプラスミド(CMVプロモーターを有するプラスミドpIRES2−EGFP(Clontech社製)を使用した点を除き、実施例2のリポソーム1と同様にして、プラスミドDNA封入リポソームを調製した。こうして調製されたプラスミドDNA封入リポソームを以下「リポソーム3」という。
NIH3T3細胞(4×104個)に、0.04μgDNA量相当のリポソーム1を添加するとともに、リポソーム1の9倍量(DNA量換算)のリポソーム3又はリポソーム1の9倍量(脂質量換算)のリポソーム4を添加し、無血清培地(DMEM)0.25mL中、37℃で3時間培養した後、血清含有培地1mLを添加し、37℃で21時間培養した。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現活性(RLU/mgタンパク質)を測定した。ルシフェラーゼ発現活性は、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬(luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルミノメーターにより化学発光量を計測することにより測定した。
図3に示すように、リポソーム1とともにリポソーム1の9倍量(DNA換算)のリポソーム3を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、リポソーム1を単独で添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約40倍であった。また、リポソーム1とともにリポソーム1の9倍量(脂質換算)のリポソーム4を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、リポソーム1を単独で添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約6倍であった。
(1)リポソームの調製
脂質混合物として、カチオン性脂質(DOTAP)及び膜融合性中性脂質(DOPE)を含む脂質混合物(DOTAP:DOPE=1:1(モル比))を使用した点、及びプラスミドDNAとして、GFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子及びその上流にCMVプロモーターを有するプラスミド(CMVプロモーターを有するプラスミドpIRES2−EGFP(Clontech社製)を使用した点を除き、実施例2のリポソーム1と同様にしてプラスミドDNA封入リポソームを調製した。こうして調製されたプラスミドDNA封入リポソームを以下「リポソーム5」という。
NIH3T3細胞(4×104個)に、0.04μgDNA量相当のリポソーム1を添加するとともに、リポソーム1の4倍量(DNA量換算)のリポソーム5又はリポソーム1の4倍量(脂質量換算)のリポソーム6を添加し、無血清培地(DMEM)0.25mL中、37℃で3時間培養した後、血清含有培地1mLを添加し、37℃で21時間培養した。その後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現活性(RLU/mgタンパク質)を測定した。ルシフェラーゼ発現活性は、細胞溶解液にルシフェラーゼ活性測定試薬(luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルミノメーターにより化学発光量を計測することにより測定した。
図4に示すように、リポソーム1とともにリポソーム1の4倍量(DNA量換算)のリポソーム5を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、リポソーム1を単独で添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約117倍であった。また、リポソーム1とともにリポソーム1の4倍量(脂質量換算)のリポソーム6を添加した場合のルシフェラーゼ発現活性は、リポソーム1を単独で添加した場合のルシフェラーゼ発現活性の約1.2倍であった。
Claims (6)
- 対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターと、非対象核酸を含む第2の非ウイルス性ベクターとを配合した、対象核酸を細胞内に送達するための組成物であって、
対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターが、対象核酸とカチオン性脂質との複合体、又は対象核酸が封入されたリポソームであり、
非対象核酸を含む第2の非ウイルス性ベクターが、非対象核酸とカチオン性脂質との複合体、又は非対象核酸が封入されたリポソームである組成物。 - 第2の非ウイルス性ベクターの配合量が、第1の非ウイルス性ベクターの配合量の2倍以上(核酸量換算)である請求項1記載の組成物。
- 対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターと、対象核酸及び非対象核酸のいずれも含まない第3の非ウイルス性ベクターとを配合した、対象核酸を細胞内に送達するための組成物であって、
対象核酸を含む第1の非ウイルス性ベクターが、対象核酸とカチオン性脂質との複合体、又は対象核酸が封入されたリポソームであり、
対象核酸及び非対象核酸のいずれも含まない第3の非ウイルス性ベクターが、対象核酸及び非対象核酸のいずれとも複合体形成していないカチオン性脂質、又は対象核酸及び非対象核酸のいずれも封入されていないリポソームである組成物。 - 第3の非ウイルス性ベクターの配合量が、第1の非ウイルス性ベクターの配合量の2倍以上(脂質量換算)である請求項3記載の組成物。
- 対象核酸を含む非ウイルス性ベクターを配合した、対象核酸を細胞内に送達するための組成物であって、
対象核酸を含む非ウイルス性ベクターが、対象核酸とカチオン性脂質との複合体であり、
対象核酸とカチオン性脂質との複合体が、対象核酸及びカチオン性脂質を最終濃度がそれぞれ3.2ng/μL以上及び0.02nモル/μL以上となるように混合することにより得られたものである組成物。 - 対象核酸を含む非ウイルス性ベクターを配合した、対象核酸を細胞内に送達するための組成物であって、
対象核酸を含む非ウイルス性ベクターが、対象核酸の凝集体が封入されたリポソームであり、
対象核酸の凝集体が、対象核酸及びカチオン性物質を最終濃度がそれぞれ100ng/μL以上及び100ng/μL以上となるように混合することにより得られたものである組成物。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008087803A1 (ja) * | 2007-01-16 | 2008-07-24 | Hokkaido University | 抗酸化成分を封入したイオントフォレーシス用リポソーム製剤 |
WO2008153035A1 (ja) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Hokkaido University | インスリンを封入したイオントフォレーシス用リポソーム製剤 |
US7848801B2 (en) | 2005-12-30 | 2010-12-07 | Tti Ellebeau, Inc. | Iontophoretic systems, devices, and methods of delivery of active agents to biological interface |
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2005
- 2005-03-04 JP JP2005061677A patent/JP2006238839A/ja active Pending
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JPN6010048973, J. Control. Release, 2004, vol.98, no.2, pp.317−323 * |
JPN6010048975, Mol. Ther., 2004, vol.9, no.3, pp.443−451 * |
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