KR20070106703A

KR20070106703A - 입자를 지질막으로 피복하는 방법

Info

Publication number: KR20070106703A
Application number: KR1020077017660A
Authority: KR
Inventors: 켄타로 코구레; 아리사 미노우라; 히데요시 하라시마
Original assignee: 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠; 시오노기세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2005-01-18
Filing date: 2006-01-18
Publication date: 2007-11-05
Also published as: CN101107069A; CN100566810C; EP1847315A1; US8097276B2; AU2006209335A1; CA2595084A1; JPWO2006077857A1; WO2006077857A1; EP1847315A4; US20090136563A1

Abstract

피복대상인 입자를, 그 사이에 공간이 형성된 2장의 지질막으로 피복할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 이 목적을 달성하기 위해서, 양대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복하는 방법으로서, 상기 양대전성 입자에 복수의 음대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키고, 상기 양대전성 입자와 상기 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 상기 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체를 형성시키고, 상기 음대전성 복합체를 양이온으로 처리한다.

양대전성 입자, 음대전성 입자, 양대전성 SUV형 리포솜, 음대전성 SUV형 리포솜

Description

입자를 지질막으로 피복하는 방법 {Method for coating particle with lipid film}

본 발명은 입자를 지질막으로 피복하는 방법에 관한 것이다.

최근, 약물, 핵산, 펩티드, 단백질, 당 등을 표적 부위에 확실하게 전달하기 위한 벡터의 개발이 왕성하게 행해 지고 있다. 예를 들면, 유전자 치료에 있어서는, 목적 유전자를 표적 세포에 도입하기 위한 벡터로서, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스 등의 바이러스 벡터가 개발되어 있다. 그렇지만, 바이러스 벡터는 대량 생산의 곤란성, 항원성, 독성 등의 문제가 있기 때문에, 이러한 문제점이 적은 리포솜(liposome) 벡터가 주목을 모으고 있다. 리포솜 벡터는 그 표면에 항체, 단백질, 당 사슬 등의 기능성 분자를 도입함으로써, 표적 부위에 대한 지향성을 향상시킬 수 있다는 이점도 가지고 있다.

리포솜의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 지질막의 단순 수화법이 알려져 있다. 지질막의 단순 수화법에 의하면, 유전자 등의 목적 물질의 존재 하, 지질막을 수화시킴으로써, 목적 물질이 봉입된 다중막 리포솜을 조제할 수 있다 (비특허문헌 1). 이렇게 하여 제조된 다중막 리포솜에 대하여 지질막의 단순 수화법을 재차 적 용함으로써, 다중막 리포솜의 외측에 추가로 새로운 지질막을 중층(重層)할 수 있다. 이와 같이 지질막의 단순 수화법을 반복하여 수행함으로써, 다중막 리포솜에 포함되는 지질막의 수를 증가시킬 수 있다.

비특허문헌 1: Kogure 등, 「Journal of Controlled Release」, 2004년, 98권, 317 - 323 페이지

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

그렇지만, 지질막의 단순 수화법 등의 종래의 방법에서는, 지질막이 불균일하게 중층(重層)되기 때문에, 다중막 리포솜에 포함되는 지질막의 수를 제어하는 것은 곤란하였다. 또한, 지질막의 단순 수화법 등의 종래의 방법에서는, 지질막이 바탕층(地層)과 같은 어떠한 층에 겹쳐질 뿐이고, 지질막의 사이에 공간을 형성시키는 것은 곤란하였다.

그래서, 본 발명은 피복대상인 입자를, 그 사이에 공간이 형성된 2장(2 sheet)의 지질막으로 피복할 수 있는 방법, 및 상기 방법에 의해서 피복대상인 입자를 2장의 지질막으로 피복하여 얻어지는 리포솜을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명의 제 1 방법은, 양대전성 입자(particle having a positive electrostatic-charging property)를 2장(2 sheet)의 지질막으로 피복하는 방법으로서, 상기 양대전성 입자에 복수의 음대전성 SUV형 리포솜(SUV type liposome having a negative electrostatic-charging property)을 접촉시키고, 상기 양대전성 입자와 상기 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 상기 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체(complex having a negative electrostatic-charging property)를 형성시키고, 상기 음대전성 복합체를 양이온(cation)으로 처리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제 1 방법에 의하면, 양대전성 입자를, 그 사이에 공간이 형성된 2장의 지질막으로 피복할 수 있다. 양대전성 입자를 본 발명의 제 1 방법에 의해 피복하여 얻어지는 리포솜에 있어서, 양대전성 입자를 피복하는 2장의 지질막(양대전성 입자의 외측에 형성되 제 1 지질막 및 제 1 지질막 외측에 형성된 제 2 지질막)의 사이에는 공간이 형성되어 있고, 이 공간에는 소정의 물질을 유지시킬 수 있다.

본 발명의 제 1 방법에 있어서, 상기 양대전성 입자가 목적물질의 응집체인 것이 바람직하다. 이 경우, 목적물질의 응집체가 봉입되어 있고, 목적물질의 응집체를 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 2층막 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명의 제 1 방법에 있어서, 상기 양대전성 입자가 양대전성 n층막 리포솜(n은 1 이상의 정수이다)인 것이 바람직하다. 이 경우 양대전성 n층막 리포솜을 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 (n+2)층막 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명의 제 1 방법에 있어서, 상기 양대전성 입자의 제타전위(zeta potential)가 20 내지 30 mV이고, 상기 음대전성 SUV형 리포솜의 제타전위가 -20 내지 -30 mV인 것이 바람직하다. 이 경우, 양대전성 입자와 그 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 복수의 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체를 효율적으로 형성시킬 수 있다.

본 발명의 제 1 방법에 있어서, 상기 양대전성 입자의 입경이 50 nm 이상인 것이 바람직하다. 이 경우, 양대전성 입자와 그 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 복수의 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체를 효율적으로 형성시킬 수 있다.

본 발명의 제 2 방법은 음대전성 입자(particle having a negative electrostatic-charging property)를 2장의 지질막으로 피복하는 방법으로서, 상기 음대전성 입자에 복수의 양대전성 SUV형 리포솜(SUV type liposome having a positive electrostatic-charging property)을 접촉시키고, 상기 음대전성 입자와 상기 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 상기 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체(complex having a positive electrostatic-charging property)를 형성시키고, 상기 양대전성 복합체를 음이온(anion)으로 처리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제 2 방법에 의하면, 음대전성 입자를, 그 사이에 공간이 형성된 2장의 지질막으로 피복할 수 있다. 음대전성 입자를 본 발명의 제 2 방법에 의해 피복하여 얻어지는 리포솜에 있어서, 음대전성 입자를 피복하는 2장의 지질막의 사이(음대전성 입자의 외측에 형성된 제 1 지질막 및 제 1 지질막의 외측에 형성된 제 2 지질막)에는 공간이 형성되어 있고, 이 공간에는 소정의 물질을 유지시킬 수 있다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서, 상기 음대전성 입자가 목적물질의 응집체인 것이 바람직하다. 이 경우 목적물질의 응집체가 봉입되어 있고, 목적물질의 응집체를 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 2층막 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서, 상기 음대전성 입자가 음대전성 n층막 리포솜(n은 1 이상의 정수이다.)인 것이 바람직하다. 이 경우, 음대전성 n층막 리포솜을 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 (n+2)층막 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서, 상기 음대전성 입자의 제타전위가 -20 내지 -30 mV이고, 상기 양대전성 SUV형 리포솜의 제타전위가 20 내지 30 mV인 것이 바람직하다. 이 경우, 음대전성 입자와 그 음대전성 입자에 정전기적으로 결합된 복수의 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체를 효율적으로 형성시킬 수 있다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서, 상기 음대전성 입자의 입경이 50 nm 이상인 것이 바람직하다. 이 경우 음대전성 입자와 그 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 복수의 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체를 효율적으로 형성시킬 수 있다.

발명의 효과

본 발명의 방법에 의하면, 피복대상인 입자를 그 사이에 공간이 형성된 2장(2 sheet)의 지질막으로 피복할 수 있다. 따라서, 피복대상인 입자로서 목적물질의 응집체를 사용하면, 목적물질의 응집체가 봉입되어 있고, 목적물질의 응집체를 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 2층막 리포솜을 제조할 수 있고, 피복대상인 입자로서 n층막 리포솜 (n은 1 이상의 정수이다)를 사용하면, n층막 리포솜을 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 (n+2)층막 리포솜을 제조할 수 있다. 양대전성 입자 또는 음대전성 입자를 본 발명의 방법에 의해 피복하여 얻어지는 리포솜에 있어서, 양대전성 입자 또는 음대전성 입자를 피복하는 2장의 지질막의 사이에는 공간이 형성되어 있고, 이 공간에는 소정의 물질을 유지시킬 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 제 1 방법에 있어서는, 우선, 양대전성 입자(particle having a positive electrostatic-charging property)에 복수의 음대전성 SUV형 리포솜(SUV type liposome having a negative electrostatic-charging property)을 접촉시키고, 양대전성 입자와 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체를 형성시킨다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서는, 우선, 음대전성 입자(particle having a negative electrostatic-charging property)에 복수의 양대전성 SUV형 리포솜(SUV type liposome having a positive electrostatic-charging property)을 접촉시키고, 음대전성 입자와 음대전성 입자에 정전기적으로 결합된 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체를 형성시킨다.

양대전성 입자의 제타전위(zeta potential)는 양수인 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 10 내지 60 mV, 바람직하게는 20 내지 50 mV, 보다 바람직하게는 20 내지 30 mV이다. 음대전성 입자의 제타전위는 음수인 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 -10 내지 -60 mV, 바람직하게는 -20 내지 -50 mV, 보다 바람직하게는 -20 내지 -30 mV이다. 제타전위의 측정 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 온도 조건은 통상 25℃이다.

양대전성 입자 및 음대전성 입자의 입경은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 입경의 하한치는 바람직하게는 50 nm, 보다 바람직하게는 70 nm이고, 입경의 상한치는 바람직하게는 500 nm, 보다 바람직하게는 200 nm이다. 양대전성 입자의 입경이 상기 범위에 있으면, 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 음대전성 SUV형 리포솜을 양이온(cation)으로 처리할 때에, 양대전성 입자를 2장(2 sheet)의 지질막으로 효율 좋게 피복할 수 있다. 또한, 음대전성 입자의 입경이 상기 범위에 있으면, 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 양대전성 SUV형 리포솜을 음이온(anion)으로 처리할 때에, 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 효율 좋게 피복할 수 있다.

양대전성 입자는 전체로서 양(positive)으로 대전되는 한, 양이온성 물질에 추가로, 중성 물질 및/또는 음이온성 물질을 포함하고 있어도 된다. 음대전성 입자는, 전체로서 음(negative)으로 대전되는 한, 양이온성 물질에 추가로, 중성 물질 및/또는 양이온성 물질으로 포함하고 있어도 된다.

양대전성 또는 음대전성 입자로서는, 예를 들면, 목적물질(예를 들면 세포 내 또는 핵 내에 전달할 물질)의 응집체를 사용할 수 있다. 양대전성 또는 음대전성 입자로서 목적물질의 응집체를 사용하는 경우, 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써, 목적물질이 봉입된 2층막 리포솜을 제작할 수 있다. 목적물질의 응집체는 목적물질만으로 구성되어도 되고, 목적물질 이외의 물질(예를 들면, 목적물질을 유지하는 담체)를 포함하고 있어도 된다.

목적물질이 양으로 대전되어 있는 경우, 예를 들면, 목적물질과 음이온성 물질을 정전기적으로 결합시켜서 복합체화함으로써, 목적물질의 응집체를 제조할 수 있다. 목적물질이 음으로 대전되어 있는 경우, 예를 들면, 목적물질과 양이온성 물질을 정전기적으로 결합시켜서 복합체화함으로써, 목적물질의 응집체를 제조할 수 있다. 목적물질이 음 및 양의 어느 경우로도 대전되어 있지 않은 경우, 목적물질과 양이온성 물질을 적절한 방식(예를 들면, 물리적 흡착, 소수(疎水) 결합, 화학결합 등)으로 결합시켜서 복합화함으로써, 목적물질의 응집체를 제조할 수 있다. 복합체화 시, 목적물질과 양이온성 물질 또는 음이온성 물질과의 혼합 비율을 조정함으로써, 전체로서 양 또는 음으로 대전하는 목적물질의 응집체를 제조할 수 있다.

목적물질은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 핵산, 펩티드, 단백질, 약물, 당, 이들의 복합체 등을 들 수 있다. 또한, 「핵산」에는 DNA 또는 RNA에 추가로, 이들의 유사체 또는 유도체 (예를 들면, 펩티드 핵산(PNA), 포스포티오에이트(phosphorothioate) DNA 등)이 포함된다. 또한, 핵산은 단일 사슬 또는 이중 사슬의 어느 것이어도 되고, 선상 또는 고리상의 어느 것이어도 된다.

목적물질이 핵산인 경우, 핵산과 양이온성 물질과 정전기적으로 결합시켜서 복합체화함으로써, 핵산의 응집체를 제조할 수 있다. 복합체화 시, 핵산과 양이온성 물질과의 혼합 비율을 조정함으로써, 전체로서 양 또는 음으로 대전되는 핵산의 응집체를 제조할 수 있다.

목적물질의 응집체를 제조하는 때에 사용하는 양이온성 물질은, 분자 중에 양이온성기를 갖는 물질이라면, 특별히 제한되는 것은 아니다. 양이온성 물질로서는, 예를 들면 양이온성 지질(예를 들면, lipofectamine (Invitrogen사제)); 양이온성기를 갖는 고분자; 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 리신(lysine)과 아르기닌(arginine)의 공중합체 등의 염기성 아미노산의 단독 중합체 또는 공중합체 또는 이들의 유도체 (예를 들면, 스테아릴(stearyl)화 유도체); 폴리에틸렌이민, 폴리(알릴아민)(poly(allylamine)), 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), 글루코사민(glucosamine) 등의 폴리양이온(polycation)성 폴리머; 황산 프로타민 (protamine sulfate) 등을 사용할 수 있다. 양이온성 물질이 갖는 양이온성기의 수는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 2개 이상이다. 양이온성기는 양으로 하전될 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 아미노기; 메틸아미노기, 에틸아미노기 등의 모노알킬아미노기; 디메틸아미노기, 디에틸아미노기 등의 디알킬아미노기; 이미노기; 구아니디노(guanidino)기 등을 들 수 있다.

목적물질의 응집체를 제조하는 때에 사용하는 음이온성 물질은 분자 중에 음이온성기를 갖는 물질인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 음이온성 물질로서는, 예를 들면, 음이온성 지질; 음이온성기를 갖는 고분자; 폴라아스파라긴산(polyasparaginic acid) 등의 산성 아미노산의 단독중합체 또는 공중합체 또는 이들의 유도체; 산탄 검(xanthan gum), 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스 폴리스티렌술폰산염, 다당류(polysaccharide), 카라기난(carrageenan) 등의 폴리음이온(polyanion)성 폴리머 등을 사용할 수 있다. 음이온성 물질이 갖는 음이온성기의 수는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 2개 이상이다. 음이온성기는 음으로 하전할 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면, 말단 카르복실기를 갖는 관능기 (예를 들면, 숙신산(succinic acid) 잔기, 마론산(malonic acid) 잔기 등), 인산기, 황산기 등을 들 수 있다.

양대전성 또는 음대전성 입자로서는, 예를 들면, 양대전성 또는 음대전성 n층막 리포솜(n은 1 이상의 정수이다)를 사용할 수 있다. 양대전성 또는 음대전성 입자로서 n층막 리포솜을 사용하는 경우, 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써, (n+2)층막 리포솜을 제조할 수 있다. 양대전성 또는 음대전성 n층막 리포솜의 내부에는 목적물질 (예를 들면, 세포 내 또는 핵 내로 전달될 물질)이 봉입되어 있어도 되고, 봉입되어 있지 않아도 된다. 양대전성 n층막 리포솜은 전체로서 양으로 대전하는 한, 양이온성 물질에 추가로, 중성물질 및/또는 음이온성 물질을 포함하여도 된다. 음대전성 n층막 리포솜은, 전체로서 음으로 대전되는 한, 음이온성 물질에 추가로, 중성물질 및/또는 양이온성 물질을 포함하여도 된다.

n층막 리포솜은, 예를 들면, 수화법, 초음파처리법, 에탄올 주입법, 에테르 주입법, 역상증발법, 계면활성제법, 동결·융해법 등의 공지의 방법을 사용하여서 제조할 수 있다. 또한, n층막 리포솜은 본 발명의 방법을 사용하여 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 제조할 수 있다.

n층막 리포솜을 구성하는 물질(예를 들면, 지질막 구성 성분, 리포솜 내부에 봉입되는 물질 등)의 종류 및 함유량을 조절함으로써, 양대전성 또는 음대전성 n층막 리포솜을 제조할 수 있다. 또한, 음대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면을 양이온성 물질로 수식(修飾)함으로써, 양대전성 n층막 리포솜을 제조할 수 있고, 양대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면을 음이온성 물질로 수식함으로써, 음대전성 n층막 리포솜을 제조할 수 있다.

n층막 리포솜은, 예를 들면, 수화법에 의해서 다음과 같이 제조할 수 있다. 지질막의 구성성분을 유기용제에 용해한 후, 유기용제를 증발 제거함으로써 지질막을 얻는다. 이 때, 유기용제로서는, 예를 들면, 펜탄, 헥산, 헵탄(heptane), 시클로헥산 등의 탄화수소류; 염화 메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류; 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류; 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올류; 초산메틸, 초산에틸 등의 에스테르류; 아세톤 등의 케톤류 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜 사용할 수 있다. 이어서, 지질막을 수화시키고, 교반 또는 초음파 처리함으로써, 다중막 리포솜으로 전환시킬 수 있다. 다중막 리포솜으로부터 1층막 리포솜으로의 전환 또는 1층막 리포솜으로부터 다중막 리포솜으로의 전환은 공지의 방법에 따라서 수행할 수 있다. n층막 리포솜을 소정의 포어사이즈(pore size)의 필터에 통과시킴으로써, 일정한 입도 분포를 갖는 n층막 리포솜을 얻을 수 있다.

목적물질이 수용성인 경우, n층막 리포솜의 제조 시, 지질막을 수화하는 때에 사용되는 수성 용매에 목적물질 또는 그 응집체를 첨가함으로써, 리포솜 내부의 수상에 목적물질을 봉입할 수 있다. 또한, 목적물질이 지용성인 경우에는 n층막 리포솜의 제조 시, 사용되는 유기용제에 목적물질 또는 그 응집체를 첨가함으로써, 리포솜의 지질막에 목적물질을 봉입할 수 있다.

음대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면을 양이온성 물질로 수식하는 경우, 예를 들면, 음대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 외액(外液)에 소수성기를 갖는 양이온성 물질을 첨가한다. 이것에 의해, 양이온성 물질이 지질막으로부터 노출하도록 소수성기가 지질막에 삽입되고, 음대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면에 양이온성 물질을 도입할 수 있다.

양대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면을 음이온성 물질로 수식하는 경우, 예를 들면, 양대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 외액에 소수성기를 갖는 음이온성 물질을 첨가한다. 이것에 의해, 음이온성 물질이 지질막으로부터 노출하도록 소수성기가 지질막에 삽입되고, 양대전성 n층막 리포솜 또는 중성 n층막 리포솜의 표면에 음이온성 물질을 도입할 수 있다.

소수성기는, 지질막에 삽입될 수 있는 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 소수성기로서는, 예를 들면, 스테아릴기 등의 포화 또는 불포화 지방산기, 콜레스테롤(cholesterol) 잔기 등의 스테롤 잔기, 인지질 잔기, 당지질 잔기, 장쇄 지방족 알코올 잔기(예를 들면, 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine) 잔기 등), 폴리옥시프로필렌알킬기, 글리세린 지방산 에스테르 잔기 등을 들 수 있으나, 이들 중 특히 탄소수 10 내지 20의 지방산기 (예를 들면, 팔미토일(palmitoyl)기, 올레일(oleyl)기, 스테아릴(stearyl)기, 아라키도일(arachidoyl)기 등)가 바람직하다.

n층막 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분은 지질 이중층의 형성을 저해하지 않는 한, 특별히 한정되는 것은 아니고, 지질막 구성성분으로서는, 예를 들면, 지질, 막안정화제, 항산화제, 하전물질, 막단백질 등을 들 수 있다.

양대전성 n층막 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분의 종류 및 함유량은 n층막 리포솜이 전체로서 양으로 대전되도록 조절되고, 음대전성 n층막 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분의 종류 및 함유량은 n층막 리포솜이 전체로서 음으로 대전하도록 조절된다. 양의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로서는, 예를 들면, 양이온성 지질, 양이온성 막안정화제 등을 들 수 있고, 음의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로는 음이온성 지질, 음이온성 막안정화제 등을 들 수 있다. 또한, n층막 리포솜의 내부에 소정의 물질(예를 들면, 목적물질의 응집체)가 봉입되어 있는 경우, n층막 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분의 종류 및 함유량은 n층막 리포솜의 내부에 봉입되어 있는 물질 전체의 전하를 고려하여 조절된다.

SUV(Small Unilamellar Vesicle)형 리포솜은, 입경(직경)이 100 nm 이하인 1층막 리포솜이다. SUV형 리포솜의 입경(직경)은 100 nm 이하인 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 30 내지 100 nm, 바람직하게는 30 내지 70 nm, 보다 바람직하게는 30 내지 50 nm이다.

다중막 리포솜(MLV), SUV 이외의 1층막 리포솜(예를 들면, LUV(Large Unilamellar Vesicle), GUV(Giant Unilamellar Vesicle) 등)은 입자경이 100 nm 이상이기 때문에 (일반적으로 100 nm 이상의 입자경을 갖는 지질막은 평면막으로서 고려된다.), 막의 곡률 및 표면 에너지가 적고, 리포솜끼리의 응집이 발생하기 어렵다. 이에 대하여, SUV형 리포솜은 입자경이 100 nm 미만이기 때문에, 막의 곡률 및 표면에너지가 크고, 리포솜끼리의 응집이 발생하기 쉽다. 따라서, 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 음대전성 SUV형 리포솜을 양이온으로 처리하면, 좋은 효율로 음대전성 SUV형 리포솜끼리를 막융합시킬 수 있다. 또한, 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 양대전성 SUV형 리포솜을 음이온으로 처리하면, 좋은 효율로 양대전성 SUV형 리포솜끼리를 막융합시킬 수 있다.

SUV형 리포솜은, 예를 들면, 초음파법에 의해서 다음과 같이 하여 제조할 수 있다. 지질막의 구성성분을 유기용제에 용해한 후, 유기 용제를 증발 제거함으로써 지질막을 얻는다. 이 때, 유기용제로서는, 예를 들면, 펜탄, 헥산, 헵탄, 시클로헥산 등의 탄화수소류; 염화 메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류; 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류; 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올류; 초산 메틸, 초산 에틸 등의 에스테르류; 아세톤 등의 케톤류 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이어서, 지질막을 수화시키고, 교반 또는 초음파조를 사용한 초음파 처리에 의해 다중막 리포솜을 제조할 수 있다. 얻어진 다중막 리포솜을, 추가로 프로브(probe)형 초음파장치에 의해서 초음파처리함으로써, 작은 1층막 리포솜인 SUV형 리포솜을 제조할 수 있다.

SUV형 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분은, 지질 이중층의 형성을 저해하지 않는 한, 특별히 제한되는 것은 아니고, 지질막 구성성분으로서는, 예를 들면, 지질, 막안정화제, 항산화제, 하전물질, 막단백질 등을 들 수 있다.

양대전성 SUV형 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분의 종류 및 함유량은 SUV형 리포솜이 전체로서 양으로 대전하도록 조절되고, 음대전성 SUV형 리포솜에 있어서의 지질막 구성성분의 종류 및 함유량은 SUV형 리포솜이 전체로서 음으로 대전하도록 조절된다. 양의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로서는, 예를 들면, 양이온성 지질, 양이온성 막안정화제 등을 들 수 있고, 음의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로서는 음이온성 지질, 음이온성 막안정화제 등을 들 수 있다. 양대전성 SUV형 리포솜은 전체로서 양으로 대전하는 한, 양의 전하를 부여하는 지질막 구성성분에 추가로, 음의 전하를 부여하는 지질막 구성성분 및/또는 중성의 지질막 구성성분을 포함하고 있어도 되고, 음대전성 SUV형 리포솜은 전체로서 음으로 대전하는 한, 음의 전하를 부여하는 지질막 구성성분에 추가로, 양의 전하를 부여하는 지질막 구성성분 및/또는 중성의 지질막 구성성분을 포함하고 있어도 된다.

양대전성 SUV형 리포솜이 양의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로서 양이온성 지질을 포함하는 경우, 양이온성 지질의 배합량은 지질의 총배합량의 통상 5 내지 30%(몰비), 바람직하게는 10 내지 20%(몰비), 보다 바람직하게는 10 내지 15%(몰비)이다.

음대전성 SUV형 리포솜이 음의 전하를 부여하는 지질막 구성성분으로서 음이온성 지질을 포함하는 경우, 음이온성 지질의 배합량은 지질의 총배합량의 통상 5 내지 30%(몰비), 바람직하게는 10 내지 20%(몰비), 보다 바람직하게는 10 내지 15%(몰비)이다.

양대전성 SUV형 리포솜의 제타전위는 양수인 한, 특별히 한정되는 것은 아니나, 통상 10 내지 60 mV, 바람직하게는 20 내지 50 mV, 보다 바람직하게는 20 내지 30 mV이고, 음대전성 SUV형 리포솜의 제타전위는 음수인 한, 특별히 한정되는 것은 아니나, 통상 -10 내지 -60 mV, 바람직하게는 -20 내지 -50 mV, 보다 바람직하게는 -20 내지 -30 mV이다. 제타전위의 측정 조건은 특별히 한정되는 것은 아니나, 온도 조건은 통상 25℃이다.

n층막 리포솜 또는 SUV형 리포솜에 있어서, 지질은 지질막의 필수성분이고, 그 배합량은 지질막 구성성분의 총배합량의 통상 30 내지 100%(몰비), 바람직하게는 50 내지 100%(몰비), 보다 바람직하게는 70 내지 100%(몰비)이다.

지질로서는, 예를 들면, 인지질, 당지질, 스테롤(sterol), 포화 또는 불포화 지방산 등을 들 수 있다. 인지질로서는, 예를 들면, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine) (예를 들면, 디올레오일(dioleoyl) 포스파티딜콜린, 디라우로릴(dilauroyl) 포스파티딜콜린, 디미리스토일(dimyristoyl) 포스파티딜콜린, 다팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일(distearoyl) 포스파티딜콜린 등), 포스파티딜글리세롤 (예를 들면, 디올레오일 포스파티딜글리세롤, 디라우로릴 포스파티딜글리세롤, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤, 디팔미토일 포스파티딜글리세롤, 디스테아로일 포스파티딜글리세롤 등), 포스파티딜 에탄올아민 (예를 들면, 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민, 디라우로릴 포스파티딜 에탄올아민, 디미리스토일 포스파티딜 에탄올아민, 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민, 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민 등), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티드산(phosphatidic acid), 카르디오리핀(cardiolipin), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 난황 레시틴(egg yolk lecithin), 대두 레시틴, 이들의 수소첨가물 등을 들 수 있다. 당지질로서는, 예를 들면, 글리세로당지질(glyceroglycolipid) (예를 들면, 술폭시리보실 글리세라이드 (sulfoxyribosyl glyceride), 디글리코실디글리세라이드(diglycosyl diglyceride), 디갈락토실 디글리세라이드(digalactosyl diglyceride), 갈락토실 디글리세라이드(galactosyl diglyceride), 글리코실디글리세라이드(glycosyl diglyceride)), 스핑고당지질(sphingoglycolipid) (예를 들면, 갈락토실세레브로사이드(galactosyl cerebroside), 락토실세레브로사이드(lactosyl cerebroside), 갱글리오사이드(ganglioside)) 등을 들 수 있다. 스테롤로서는, 예를 들면, 동물 유래의 스테롤 (예를 들면, 콜레스테롤, 콜레스테롤 숙신산, 라노스테롤(lanosterol), 디히드로라노스테롤, 데스모스테롤(desmosterol), 디히드로콜레스테롤), 식물 유래의 스테롤 (피토스테롤(phytosterol)) (예를 들면, 스티그마스테롤(stigmasterol), 시토스테롤(sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 브라시카스테롤(brassicasterol)), 미생물 유래의 스테롤 (예를 들면, 지모스테롤(zymosterol), 에르고스테롤(ergosterol)) 등을 들 수 있다. 포화 또는 불포화 지방산으로서는, 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키돈산 (arachidonic acid), 미리스트산(myristic acid) 등의 탄소수 12 내지 20의 포화 또는 불포화 지방산을 들 수 있다.

지질은 중성지질, 양이온성 지질 및 음이온성 지질로 분류되고, 중성지질로서는, 예를 들면, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethonolamine), 콜레스테롤, 세라마이드(ceramide), 스핑고마이엘린, 세파린(cefarin), 세레브로시드(cerebroside) 등을 들 수 있고, 양이온성 지질로서는, 예를 들면, DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA(N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium), DDAB(didodecylammonium bromide), DOTAP(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane), DC-Chol(3β-N-(N',N'-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol), DMRIE(1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium), DOSPA(2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate) 등을 들 수 있으며, 양이온성 지질로서는, 예를 들면, 카르디올리핀(cardiolipin), 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산 (diacylphosphatidic acid), N-숙시닐포스파티딜에탄올아민 (N-succinylphosphatidylethanolamine)(N-숙시닐PE), 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에틸렌글리콜, 콜레스테롤숙신산 등을 들 수 있다.

n층막 리포솜 또는 SUV형 리포솜에 있어서, 막안정화제는 지질막을 물리적 또는 화학적으로 안정화시키거나, 지질막의 유동성을 조절하기 위하여 첨가하는 임의의 성분이고, 그 배합량은 지질막 구성성분의 총배합량의 통상 10 내지 50%(몰비), 바람직하게는 20 내지 50%(몰비), 보다 바람직하게는 30 내지 50%(몰비)이다.

막안정화제로서는 예를 들면, 스테롤, 글리세린 또는 그 지방산 에스테르 등을 들 수 있다. 스테롤로서는 상기와 동일한 구체예를 들 수 있고, 글리세린의 지방산 에스테르로서는, 예를 들면, 트리올레인(triolein), 트리옥타노인(trioctanoin) 등을 들 수 있다.

n층막 리포솜 또는 SUV형 리포솜에 있어서, 항산화제는 지질막의 산화를 방지하기 위하여 첨가하는 임의의 성분이고, 그 배합량은 지질막 구성성분의 총배합량의 통상 5 내지 30%(몰비), 바람직하게는 10 내지 30%(몰비), 보다 바람직하게는 20 내지 30%(몰비)이다.

항산화제로서는, 예를 들면, 토코페롤, 갈산 프로필(gallic acid propyl), 팔미트산 아스코빌(palmitic acid ascorbyl), 부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene) 등을 들 수 있다.

n층막 리포솜 또는 SUV형 리포솜에 있어서, 하전물질은 지질막에 양하전 또는 음하전을 부여하기 위하여 첨가하는 임의의 성분이고, 그 배합량은 지질막 구성성분의 총배합량의 통상 5 내지 30%(몰비), 바람직하게는 10 내지 20%(몰비), 보다 바람직하게는 10 내지 15%(몰비)이다.

양하전을 부여하는 하전물질로서는, 예를 들면, 스테아릴 아민, 올레일 아민(oleyl amine) 등의 포화 또는 불포화 지방족 아민; 디오레오일트리메틸암모늄 프로판(dioleoyl trimethylammonium propane) 등의 포화 또는 불포화 양이온성 합성지질 등을 들 수 있고, 음하전을 부여하는 하전물질로서는, 예를 들면, 디세틸포스페이트(dicetyl phosphate), 콜레스테롤 숙신산, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티드산 등을 들 수 있다.

n층막 리포솜 또는 SUV형 리포솜에 있어서, 막단백질은 지질막의 구조를 유지하거나, 지질막에 기능성을 부여하기 위해 첨가하는 임의의 성분이고, 그 배합량은 지질막 구성성분의 총배합량의 통상 0.1 내지 2%(몰비), 바람직하게는 0.5 내지 2%(몰비), 보다 바람직하게는 1 내지 2%(몰비)이다.

막단백질로서는, 예를 들면, 막표재성 단백질, 막내재성 단백질 등을 들 수 있다.

양대전성 또는 음대전성 입자에 각각 음대전성 또는 양대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키는 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 온도는 통상 10 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 30℃이고, pH는 통상 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7.0 내지 7.5이며, 시간은 통상 1 내지 20분간, 바람직하게는 5 내지 10분간이다. 접촉시키는 때에, 사용하는 용매는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, HEPES 완충액, 생리식염수, 자당용액 등을 사용할 수 있다. 용매 중에 분산시키는 음대전성 또는 양대전성 SUV형 리포솜의 양은, 통상, 양대전성 또는 음대전성 입자에 대해서 과잉량이고, 예를 들면, 양대전성 또는 음대전성 입자의 봉입에 이론상 최저한 필요한 음대전성 또는 양대전성 SUV형 리포솜 양의 2 내지 4배량이다.

양대전성 입자에 음대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키면, 양대전성 입자와 음대전성 SUV형 리포솜은 정전기적 상호 작용을 매개로 결합하고, 양대전성 입자의 표면은 복수의 음대전성 SUV형 리포솜에 의해서 덮힌다. 이것에 의해, 양대전성 입자와 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 복수의 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체가 형성된다. 이 때, 제타전위가 -20 내지 -50 mV의 음대전성 복합체가 형성되는 것이 바람직하고, 제타전위가 -20 내지 -30 mV의 음대전성 복합체가 형성되는 것이 보다 바람직하다. 이것에 의해, 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 음대전성 SUV형 리포솜을 효율적으로 양이온으로 처리할 수 있다. 음대전성 복합체의 제타전위는 양대전성 입자 및 음대전성 SUV형 리포솜의 제타전위, 입경 등을 조절함으로써 조절할 수 있다.

음대전성 입자에 양대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키면, 음대전성 입자와 양대전성 SUV형 리포솜은 정전기적 상호 작용을 매개로 결합하고, 음대전성 입자의 표면은 복수의 양대전성 SUV형 리포솜에 의해서 덮힌다. 이것에 의해, 음대전성 입자와 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 복수의 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체가 형성된다. 이 때, 제타전위가 20 내지 50 mV의 양대전성 복합체가 형성되는 것이 바람직하고, 제타전위가 20 내지 30 mV의 양대전성 복합체가 형성되는 것이 보다 바람직하다. 이것에 의해 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 양대전성 SUV형 리포솜을 효율적으로 음이온으로 처리할 수 있다. 양대전성 복합체의 제타전위는 음대전성 입자 및 양대전성 SUV형 리포솜의 제타전위, 입경 등을 조절함으로써 조절할 수 있다.

본 발명의 제 1 방법에 있어서는, 이어서, 형성된 음대전성 복합체를 양이온으로 처리한다.

본 발명의 제 2 방법에 있어서는, 이어서, 형성된 양대전성 복합체를 음이온으로 처리한다.

양이온은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, H⁺ 등의 1가 양이온; Ca²⁺, Mg² ⁺ 등의 2가 양이온; Al³ ⁺ 등의 3가 양이온 등을 들 수 있다. H⁺를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 염산, 초산 등의 산을 사용할 수 있고, Ca² ⁺를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 염화 칼슘 등을 사용할 수 있으며, Mg² ⁺를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 염화마그네슘 등을 사용할 수 있고, Al³ ⁺를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 염화 알루미늄 등을 사용할 수 있다.

음이온은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, OH^-, SO₄ ² ^-, PO₄ ³ ^-, 해리형 단쇄 지방산 등을 들 수 있다. OH^-를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 수산화 나트륨 등을 사용할 수 있고, SO₄ ² ^-를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 황산 나트륨 등을 사용할 수 있으며, PO₄ ³ ^-를 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 인산 나트륨 등을 사용할 수 있고, 해리형 단쇄 지방산을 생기게 하는 물질로서는, 예를 들면, 카프르산 (CH₃(CH₂)₆COOH) 등을 사용할 수 있다.

음대전성 복합체를 양이온으로 처리하는 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 온도는 통상 10 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 30℃이고, pH는 통상 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7.0 내지 7.5이며, 시간은 통상 1 내지 20분간, 바람직하게는 5 내지 10분간이다. 양이온 처리 시에 사용하는 용매는 수용액인 한 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, HEPES 완충액 등을 사용할 수 있다. 용매 중에 첨가하는 양이온의 양은, 양이온의 성질 등에 따라서 적의 조절할 수 있으나, 통상, 지질량의 50배량(양이온 몰/지질 몰) 이상이다.

양대전성 복합체를 음이온으로 처리하는 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 온도는 통상 10 내지 40℃, 바람직하게는 20 내지 30℃이고, pH는 통상 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7.0 내지 7.5이며, 시간은 통상 1 내지 20분간, 바람직하게는 5 내지 10분간이다. 음이온 처리 시에 사용하는 용매는 수용액인 한 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, HEPES 완충액 등을 사용할 수 있다. 용매 중에 첨가하는 음이온의 양은, 음이온의 성질 등에 따라서 적의 조절할 수 있으나, 통상, 지질량의 50배량 (음이온 몰/지질 몰) 이상이다.

음대전성 복합체를 양이온으로 처리하면, 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 음대전성 SUV형 리포솜의 표면의 음전하가 소실하고, 음대전성 SUV형 리포솜의 표면의 소수성이 증가하며, 인접한 음대전성 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발되고, 양대전성 입자가 2장의 지질막으로 피복된다. 또한 양대전성 복합체를 음이온으로 처리하면, 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 양대전성 SUV형 리포솜의 표면의 양전하가 소실하고, 양대전성 SUV형 리포솜의 표면의 소수성이 증가하며, 인접한 양대전성 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발되고, 음대전성 입자가 2장의 지질막으로 피복된다. 이렇게 하여 양대전성 또는 음대전성 입자의 외측에는, 양대전성 또는 음대전성 입자를 피복하는 2장의 지질막이 새롭게 형성되지만, 이 때, 2장의 지질막은 그 사이에 공간이 형성되도록 형성된다.

양대전성 또는 음대전성 입자로서 목적물질의 응집체를 사용한 경우, 목적물질의 응집체가 봉입되어 있고, 목적물질의 응집체를 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 2층막 리포솜이 제조되고, 양대전성 또는 음대전성 입자로서 n층막 리포솜(n은 1 이상의 정수이다.)을 사용한 경우, n층막 리포솜을 피복하는 2장의 지질막의 사이에 공간이 형성된 (n+2)층막 리포솜이 제조된다.

본 발명의 제 1 방법을 사용하여 양대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 얻어지는 리포솜은 통상 음대전성이다. 단지, 음대전성 복합체의 제타전위의 크기, 양이온의 종류 등에 따라서는, 양대전성인 경우도 있다고 생각할 수 있다. 본 발명의 제 2 방법을 사용하여 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 얻어지는 리포솜은, 통상, 양대전성이다. 단지, 양대전성 복합체의 제타전위의 크기, 음이온의 종류 등에 따라서는 음대전성인 경우도 있다고 생각할 수 있다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 방법을 사용하여 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 양대전성 리포솜이 얻어진 경우, 얻어진 양대전성 리포솜을 본 발명의 제 1 방법에 있어서의 양대전성 입자로서 사용할 수 있다. 음대전성 리포솜 또는 중성 리포솜이 얻어진 경우, 얻어진 음대전성 리포솜 또는 중성 리포솜의 표면을 양이온성 물질로 수식하여 양대전성 리포솜을 제조하고, 제조된 양대전성 리포솜을 본 발명의 제 1 방법에 있어서의 양대전성 입자로서 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 방법을 반복하여 행함으로써, 지질막의 수를 제어하면서 다중막 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 방법을 사용하여 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 음대전성 리포솜이 얻어진 경우, 얻어진 음대전성 리포솜을 본 발명의 제 2 방법에 있어서의 음대전성 입자로서 사용할 수 있다. 양대전성 리포솜 또는 중성 리포솜이 얻어진 경우, 양대전성 리포솜 또는 중성 리포솜의 표면을 음이온성 물질로 수식하여 음대전성 리포솜을 제조하고, 제조된 음대전성 리포솜을 본 발명의 제 2 방법에 있어서의 음대전성 입자로서 사용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 제 1 및/또는 제 2 방법을 반복하여 수행함으로써, 이미 형성되어 있는 2장의 지질막의 외측에 새로운 2장의 지질막을 형성시킬 수 있고, 지질막의 수를 제어하면서 다중막 리포솜을 제조할 수 있다. 또한, 이미 형성되어 있는 2장의 지질막의 외측에 새로운 2장의 지질막이 형성된 때, 이미 형성되어 있는 2장의 지질막 및 당해 2장의 지질막의 사이에 형성되어 있는 공간은 그대로 유지된다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 방법에 의해서 양대전성 또는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복함으로써 얻어지는 리포솜에는 목적물질이 봉입되어 있는 것이 바람직하다. 목적물질이 세포 내 또는 핵 내에 전달될 물질 (예를 들면, 핵산, 펩티드, 단백질, 약물, 당, 이들의 복합체 등)인 경우, 목적물질이 봉입된 리포솜을, 목적물질의 세포 내 또는 핵 내 전달용 벡터로서 사용할 수 있다. 목적물질이 봉입된 리포솜은 양대전성 또는 음대전성 입자로서 목적물질의 응집체를 사용함으로써, 또한, 양대전성 또는 음대전성 입자로서 목적물질이 봉입된 n층막 리포솜을 사용함으로써 얻을 수 있다. 또한, 양대전성 또는 음대전성 입자의 외측에 새롭게 형성된 2장의 지질막의 사이에 목적물질을 유지시킴으로써 (예를 들면, 목적물질을 함유하는 액체를 유지시킴으로써) 얻을 수 있다.

목적물질을 전달할 세포가 유래한 생물종은 특별히 한정되는 것은 아니고, 동물, 식물, 미생물 등의 어느 것이어도 되지만, 동물인 것이 바람직하며, 포유동물인 것이 보다 바람직하다. 포유동물로서는, 예를 들면, 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 말, 돼지, 토끼, 개, 고양이, 래트(rat), 마우스, 모르모트(marmot) 등을 들 수 있다. 또한, 목적물질을 전달할 세포의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 체세포, 생식세포, 간세포 또는 이들의 배양세포 등을 들 수 있다.

목적물질이 봉입된 리포솜은, 예를 들면, 분산액의 상태에서 사용할 수 있다. 분산용매로서는, 예를 들면, 생리식염수, 인산완충액, 시트릭 완충액(citric buffer), 초산완충액 등의 완충액을 사용할 수 있다. 분산액에는, 예를 들면, 당류, 다가알코올, 수용성 고분자, 비이온 계면활성제, 항산화제, pH 조절제, 수화촉진제 등의 첨가제를 첨가하여 사용하여도 된다.

목적물질이 봉입된 리포솜은, in vivo 및 in vitro의 어느 경우에 있어서도 사용할 수 있다. in vivo에 있어서 사용하는 경우, 투여경로로서는 예를 들면, 정맥, 복강 내, 피하, 경비(經鼻) 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 투여량 및 투여 횟수는 리포솜에 봉입된 목적물질의 종류나 양 등에 따라서 적절히 조절할 수 있다.

[도 1](a)는 각 단편의 DNA 함량을 DNA 아가로스겔 전기영동에 의해서 측정한 결과를 나타내는 도면이고, (b)는 각 단편의 로다민 함량 및 NBD 함량을 형광강도에 의해서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

[도 2](a)는 각 단편의 DNA 함량을 DNA 아가로스겔 전기영동에 의해서 측정한 결과를 나타내는 도면이고, (b)는 각 단편의 로다민 함량 및 NBD 함량을 형광강도에 의해서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

[도 3] 각종 다중 리포솜에 의해서 세포 내에 도입된 루시페라제 유전자의 발현 활성을 나타내는 도면이다.

[실시예 1]

(1) DNA/폴리-L-리신 복합체의 형성

DNA 및 폴리-L-리신을 각각 5 mM HEPES 버퍼 (pH 7.4)에 용해하였다. 또한, DNA로서, 플라스미드 DNA (CMV 프로모터 및 그 하류에 연결된 루시페라제(luciferase) 유전자를 함유하는 전장 약 7 kbp의 플라스미드 DNA)를 사용하였 다. 이어서, DNA 용액(0.1 mg/mL) 및 폴리-L-리신 용액(0.1 mg/mL)를 혼합하고, 실온 하, 보텍스(vortex)를 사용하여 교반하고, DNA/폴리-L-리신 복합체 함유액(DNA 농도 0.05 mg/mL)를 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 DNA/폴리-L-리신 복합체의 입경은 약 70 내지 100 nm이고, 제타전위는 약 30 내지 40 mV였다. 또한, 유체역학적 직경은 준탄성 광산란 방법에 의해서 측정하고, 제타전위는 전기영동적 광산란 분광 측광기(ELS-8000)에 의해서 분석하였다 (이하 동일).

(2) SUV형 리포솜의 제조

난황 포스파티딜 콜린/콜레스테롤 숙신산(9:2(몰비))을 클로로포름 0.5 mL에 용해하고, 용해액을 유리 시험관에 수용하였다. 질소 가스의 분무 부착에 의해 용매를 제거한 후, 데시케터(dasicator) 내에 1 시간 수납하여 건조시켰다. 얻어진 지질막(0.55 μ몰)을, 미리 25℃까지 데워 둔 HEPES 완충액 1 mL를 사용하여 수화시키고, 초음파조에서 초음파처리함으로써 지질막을 박리하였다. 추가로 프로브형 초음파장치에 의해서 10분간 초음파처리를 행함으로써, SUV형 리포솜을 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 SUV형 리포솜의 입경은 약 50 내지 100 nm이고, 제타전위는 약 -30 mV였다.

SUV형 리포솜의 형광표식은 로다민(적) 또는 NBD(4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole) 표식화 디오레오일포스파티딜에탄올아민(청)을 넣음으로써 행하였다. 이 때 수상 마커로서의 로다민은 지질막을 수화하는 용매 중에 녹이고(10 mM), 지질 마커로서의 NBD 표식화 지질은 클로로포름 용매에 녹였다 (총 지질에 대해서 0.1 몰%).

(3) DNA/폴리-L-리신 복합체의 지질막에 의한 피복

DNA/폴리-L-리신 복합체 함유액 250 μL에 SUV형 리포솜 500 μL를 첨가하여, 양자를 접촉시켰다. 이것에 의해 DNA/폴리-L-리신 복합체와, DNA/폴리-L-리신 복합체에 정전기적으로 결합한 복수의 SUV형 리포솜을 포함하는 복합체가 형성된 것으로 생각할 수 있다. 이 복합체의 입경은 약 500 내지 3000 nm이고, 제타전위는 약 -30 mV였다. 또한 접촉은 실온(약 25℃)에서 5분간 행하였다.

접촉 후, 0.1 N 염산 55 μL를 첨가하고, 상기 복합체를 H⁺로 처리하였다. 이것에 의해 DNA/폴리-L-리신 복합체에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜의 표면의 음전하가 소실하고, SUV형 리포솜의 표면의 소수성이 증가하며, 인접한 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발된다고 생각할 수 있다. H⁺ 처리 후의 입경은 약 85 내지 130 nm이고, 제타전위는 약 -20 내지 -40 mV였다. H⁺ 처리에 의해서 입경이 적어지기 때문에, DNA/폴리-L-리신 복합체에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발되고, DNA/폴리-L-리신 복합체가 지질막으로 피복되고, DNA/폴리-L-리신 복합체가 봉입된 리포솜이 형성된 것이 나타났다. H⁺ 처리 후의 현탁액을 불연속 자당 밀도 구배(0, 30, 60%) 상에 중층(重層)하고, 20℃, 160,000 g의 조건에서 2시간, 초원심 분리를 행하였다. 상부에서부터 1 mL 씩 화분(畵分)을 회수하 고, 형광강도를 측정하였다. 불연속 자당 밀도 구배 초원심분리에 의해서 회수한 화분 중, DNA 함량이 높은 화분을 리포솜 함유 화분으로 하였다. 리포솜 함유 화분은 자당 30 내지 60%의 경계로부터 회수할 수 있었다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일하게 하여, DNA/폴리-L-리신 복합체를 지질막으로 피복하고, DNA/폴리-L-리신 복합체가 봉입된 리포솜 (이하 「제 1 리포솜」이라 한다)을 제조하였다. 또한, 이 때 SUV형 리포솜으로서 NBD 표식화 지질(청)로 형광 표식한 것을 사용하였다.

제 1 리포솜의 외액에 1 mg/mL 스테아릴화 옥타아르기닌(octaarginie) 용액 12 μL을 첨가하고, 실온에서 30분간 방치함으로써, 제 1 리포솜의 표면에 옥타아르기닌 (총 지질의 5 몰%)을 도입하였다 (이하, 「제 2 리포솜」이라 한다). 또한, 제 1 리포솜의 제타전위는 음(약 -30 mV)이었지만, 제 1 리포솜의 표면에 옥타아르기닌을 도입하여 얻어진 제 2 리포솜의 제타전위는 양(약 30 내지 50 mV)였다.

실시예 1과 동일하게 하여, 제 2 리포솜 함유액(0.37 mM, 750 μL)에 SUV형 리포솜(입경: 약 50 내지 100 nm, 제타전위: 약 -30 mV, 지질농도: 0.55 mM, 첨가량: 1.5 mL)을 첨가하고, 양자를 접촉시켰다. 이것에 의해, 제 2 리포솜과 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 복수의 SUV형 리포솜을 포함하는 복합체가 형성된다고 생각할 수 있다. 또한, 이 때 SUV형 리포솜으로서 로다민으로 내수상을 형광표식한 것을 사용하였다. 형성된 복합체의 입경은 약 340 내지 1500 nm이고, 제타전 위는 약 -30 mV였다.

접촉 후, 0.1 N 염산 165 μL를 첨가하고, 상기 복합체를 H⁺로 처리하였다. 이것에 의해, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜의 표면의 음전하가 소실하고, SUV형 리포솜의 표면의 소수성이 증가하며, 인접한 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발된다고 생각할 수 있다. H⁺ 처리 후의 입경은 약 170 내지 240 nm이고, 제타전위는 약 -60 mV였다. H⁺ 처리에 의해서 입경이 작아지기 때문에, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜끼리의 막융합이 유발되고, 제 2 리포솜이 지질막으로 피복된 것이 나타났다.

H⁺ 처리 후의 현탁액을 불연속 자당 밀도 구배(0, 5, 30%) 상에 중층하고, 20℃, 160,000 g의 조건에서 2 시간, 초원심분리를 행하였다. 상부로부터 1 mL 씩 화분을 회수하였다. 각 단편(fraction)의 DNA 함량을 DNA 아가로스겔 전기영동에 의해서 측정함과 동시에(도 1(a) 참조), 로다민 및 NBD의 형광강도를 측정하여 로다민 함량 및 NBD 함량을 산출하였다 (도 1(b) 참조).

불연속 자당 밀도 구배 초원심 분리에 의해서 회수된 화분 중, DNA 함량이 높은 화분(단편 11)을 리포솜 함유 화분으로 하였다. 리포솜 함유 화분은 자당 5 내지 30%의 경계로부터 회수할 수 있었다.

또한, 리포솜 함유 화분에 있어서, NBD, 로다민 및 DNA가 공존하고 있기 때문에, SUV형 리포솜은 로다민을 함유하는 내수상을 유지한 채로 융합하고, 융합 후 의 리포솜에 있어서, 로다민을 함유하는 내수상이 유지된 공간이 형성되어 있는 것이 나타났다.

추가로, 리포솜 함유 화분에 있어서, NBD와 로다민과의 사이에 형광 에너지 이동은 관측되지 않았다. 제 2 리포솜의 지질막에는 NBD 표식화 지질(청)이 함유되어 있기 때문에, 제 2 리포솜의 지질막과, 로다민을 함유하는 내수상과는 접촉하고 있지 않은 것이 나타났다. 즉, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜끼리의 막융합에 의해, 제 2 리포솜은 2장의 지질막으로 피복되고, 로다민을 함유하는 내수상은 제 2 리포솜의 외측에 새롭게 형성된 2장의 지질막의 사이의 공간에 유지되어 있는 것이 나타났다. 만일, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜끼리의 막융합에 의해, 제 2 리포솜이 1장의 지질막으로 피복되었다고 하면, 로다민을 함유하는 내수상은 제 2 리포솜의 지질막과 제 2 리포솜의 외측에 형성된 지질막과의 사이에 유지되고 있다고 생각할 수 있지만, 그렇게 하면, NBD와 로다민과의 사이에 형광 에너지 이동이 관측될 것이다. 또한, 만일 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜끼리의 막융합에 의해, 제 2 리포솜의 지질막과 SUV형 리포솜의 지질막이 융합하였다고 하면(지질막의 수는 변화하지 않음), 로다민을 함유하는 내수상은, 제 2 리포솜의 내부에 유지되어 있다고 생각할 수 있지만, 그렇게 하면, NBD와 로다민과의 사이에 형광 에너지 이동이 관측될 것이다.

[실시예 3]

DNA/폴리-L-리신 복합체를 지질막으로 피복하고, DNA/폴리-L-리신 복합체가 봉입된 리포솜 (제 1 리포솜)을 제조하는 때, SUV형 리포솜으로서 로다민으로 내수상을 형광표식한 것을 사용한 점, 및 제 2 리포솜과, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 복수의 SUV형 리포솜을 포함하는 복합체를 형성한 때에, SUV형 리포솜으로서 NBD 표식화 지질로 형광 표식한 것을 사용한 점을 제외하고, 실시예 2와 동일하게 시험을 수행하였다.

또한, 실시예 2의 결과로부터, 제 1 리포솜 및 제 2 리포솜에 있어서는 DNA/폴리-L-리신 복합체가 2장의 지질막으로 피복되어 있고, 이 2장의 지질막의 사이에 로다민을 함유하는 내수상이 유지되어 있다고 생각할 수 있다.

H⁺ 처리 후의 현탁액을 불연속 자당 밀도 구배(0, 5, 30%) 상에 중층하고, 20℃, 160,000 g의 조건에서 2 시간, 초원심 분리를 행하였다. 상부로부터 1 mL 씩 화분을 회수하였다. 각 단편의 DNA 함량을 DNA 아가로스겔 전기영동에 의해서 측정함과 동시에(도 2(a) 참조), 로다민 및 NBD의 형광강도를 측정하여 로다민 함량 및 NBD 함량을 산출하였다 (도 2(b) 참조).

또한 리포솜 함유 화분에 있어서, NBD, 로다민 및 DNA가 공존하고 있는 것, 및 NBD와 로다민의 사이에 형광 에너지 이동은 관측되지 않았던 점으로부터, 제 2 리포솜에 정전기적으로 결합한 SUV형 리포솜이 막융합하는 때, 제 2 리포솜에 있어 서 2장의 지질막의 사이에 형성된 공간(로다민을 함유하는 내수상이 유지된 공간)이 유지된 것이 나타났다.

[실시예 4]

실시예 1(1)에 따라서, DNA/폴리-L-리신 복합체를 형성하였다. 또한, DNA로서는, 실시예 (1)과 동일하게, 플라스미드 DNA(CMV 프로모터 및 그 하류에 연결된 루시페라제 유전자를 함유하는 전장 7037 bp의 플라스미드 DNA(CMV 프로모터를 갖는 pcDNA 3.1 플라스미드에 루시페라제 유전자를 넣은 것)을 사용하였다.

실시예 1(2)에 따라서, 난황 포스파티딜콜린/콜레스테롤 숙신산(9:2(몰비))로 되는 지질막을 갖는 SUV형 리포솜(이하 「제 1 SUV형 리포솜」이라 한다.), 디오레오일포스파티딜에탄올아민/콜레스테롤 숙신산(9:2(몰비))로 되는 지질막을 갖는 SUV형 리포솜(이하 「제 2 SUV형 리포솜」이라 한다.)를 제조하였다.

실시예 1(3)에 따라서, 제 1 SUV형 리포솜을 사용하여 DNA/폴리-L-리신 복합체를 지질막으로 피복하고, 리포솜 A(2층막)을 제조하였다. 또한, 제 2 SUV형 리포솜을 사용하여 DNA/폴리-L-리신 복합체를 지질막으로 피복하고, 리포솜 B(2층막)을 제조하였다. 또한 제 2 SUV형 리포솜을 사용하여 리포솜 A를 지질막으로 피복하고, 리포솜 C(4층막)를 제조하였다. 또한 제 1 SUV형 리포솜을 사용하여 리포솜 B를 지질막으로 피복하고, 리포솜 D(4층막)를 제조하였다.

리포솜 A 내지 D의 외액에 1 mg/mL 스테아릴화 옥타아르기닌 용액 12 μL를 첨가하고, 실온에서 30분간 방치함으로써, 각 리포솜의 표면에 옥타아르기닌(총 지 질의 5 몰%)를 도입하였다. 또한, 각 리포솜의 표면에 옥타아르기닌을 도입함으로써, 전체 리포솜의 세포 내 이행 경로는 통일되었다 (거대음세포(macropinocytosis)).

각 리포솜 (DNA 0.4 μg 상당)을 현탁한 0.25 mL의 혈청불함 DMEM 배지를 24 웰 플레이트에서 배양한 NIH3T3 세포 (4×10⁴ 세포/웰)에 첨가하고, 37℃에서 3시간 배양하였다. 3 시간 후, 10% FBS(Featal Bovine Serum)을 포함하는 배지 1 mL를 첨가하고, 추가로 45 시간 배양하였다. 그 후, 세포를 용해하고, 세포 용해액에 루시페라제 활성 측정 시약(luciferase assay system, Promega사제)를 첨가하고, 루시페라제 활성을 발광분석기(luminometer)(LuminescencerPSN, ATTO)를 사용하여 측정하였다. 세포 용해액 중의 단백질량은 BCA 단백질 정량 키트(PIERCE, ROCKFORD(IL))를 사용하여 측정하였다.

그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타난 것처럼, 리포솜을 구성하는 지질막의 조성, 수 등을 변화시킴으로써, 리포솜의 기능(유전자 도입 능력)이 변화하는 것이 나타났다.

Claims

양대전성 입자에 복수의 음대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키고, 상기 양대전성 입자와 상기 양대전성 입자에 정전기적으로 결합한 상기 음대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 음대전성 복합체를 형성시키며, 상기 음대전성 복합체를 양이온으로 처리하는 것을 특징으로 하는 양대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 양대전성 입자가 목적물질의 응집체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 양대전성 입자가 양대전성 n층막 리포솜 (n은 1 이상의 정수이다.)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 양대전성 입자의 제타전위가 20 내지 30 mV이고, 상기 음대전성 SUV형 리포솜의 제타전위가 -20 내지 -30 mV인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 양대전성 입자의 입경이 50 nm 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
음대전성 입자에 복수의 양대전성 SUV형 리포솜을 접촉시키고, 상기 음대전성 입자와 상기 음대전성 입자에 정전기적으로 결합한 상기 양대전성 SUV형 리포솜을 포함하는 양대전성 복합체를 형성시키며, 상기 양대전성 복합체를 음이온으로 처리하는 것을 특징으로 하는 음대전성 입자를 2장의 지질막으로 피복하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 음대전성 입자가 목적물질의 응집체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 음대전성 입자가 음대전성 n층막 리포솜 (n은 1 이상의 정수이다.)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 음대전성 입자의 제타전위가 -20 내지 -30 mV이고, 상기 양대전성 SUV형 리포솜의 제타전위가 20 내지 30 mV인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서,

상기 음대전성 입자의 입경이 50 nm 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
양대전성 입자를 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 2장의 지질막으로 피복하여 얻어진 리포솜.
음대전성 입자를 제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 2장의 지질막으로 피복하여 얻어진 리포솜.