WO2006095837A1 - 目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜構造体 - Google Patents

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WO2006095837A1
WO2006095837A1 PCT/JP2006/304656 JP2006304656W WO2006095837A1 WO 2006095837 A1 WO2006095837 A1 WO 2006095837A1 JP 2006304656 W JP2006304656 W JP 2006304656W WO 2006095837 A1 WO2006095837 A1 WO 2006095837A1
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lipid membrane
membrane
lipid
membrane structure
mitochondrial
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PCT/JP2006/304656
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Yuma Yamada
Hidetaka Akita
Kentaro Kogure
Hiroyuki Kamiya
Hideyoshi Harashima
Hiroshi Kikuchi
Hideo Kobayashi
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National University Corporation Hokkaido University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • Lipid membrane structure capable of delivering target substance into mitochondria
  • the present invention relates to a lipid membrane structure, and particularly to a lipid membrane structure capable of delivering a target substance into mitochondria.
  • a peptide having an ability to migrate to mitochondria for example, a mitochondrial targeting signal (MTS) such as Rat liver succinyA CoA synthetase ⁇
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • a method in which a vector capable of expressing a fusion protein is introduced into a cell and the fusion protein is expressed in the cell has been mainly employed (Non-patent Documents 1, 2, and 3).
  • the permeation of mitochondrial membranes was very limited, and there was no method for delivering oligonucleotides, plasmid DNA, etc. into mitochondria.
  • vectors and carriers for reliably delivering drugs, nucleic acids, peptides, proteins, sugars and the like to target sites has been actively conducted.
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses have been developed as vectors for introducing a target gene into target cells.
  • viral vectors have problems such as difficulty in mass production, antigenicity, and toxicity
  • ribosome vectors and peptide carriers are attracting attention because there are few such problems.
  • Ribosome vectors also have the advantage that directivity to target sites can be improved by introducing functional molecules such as antibodies, proteins, and sugar chains on the surface.
  • Patent Document 1 International Publication WO2005Z032593 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 B. W. Kong et al., “Biochimica et Biophysica ActaJ, 2003, 1625 ⁇ , 9 8-108
  • Non-Patent Document 2 T. Tamura et al., ⁇ Biochemical and Biophysical Research Communication sj, 1996, 222, 659-63 ''
  • Non-Patent Document 3 K. Diekert et al., “Proceedings of the National Academy of sciences of the United States of AmericaJ, 1999, 96 ⁇ , 11752-7.
  • Non-Patent Document 4 Kogure et al., “Journal of Controlled Release”, 2004, 98 ⁇ , 317-323
  • Non-Patent Document 5 Rikiru Ikurami et al., RYAKUGAKU ZASSHIJ, 2004, 124 ⁇ , Suppl. 4, 1 13-116
  • An object of the present invention is to provide a lipid membrane structure capable of delivering a target substance into mitochondria and a phospholipid derivative useful for the preparation of the lipid membrane structure. Means for solving the problem
  • the lipid membrane structure of the present invention comprises a lipid membrane containing a membrane-fusible lipid and having a membrane-permeable peptide (see claim 1).
  • a lipid membrane containing a membrane-fusible lipid and having a membrane-permeable peptide can be efficiently fused with a mitochondrial membrane. Therefore, the lipid membrane structure holding the target substance to be delivered into the mitochondria (see claim 16) can release the target substance into the mitochondria by membrane fusion between the lipid membrane and the mitochondrial membrane. As a result, the target substance can be delivered into the mitochondria. That is, the lipid membrane structure of the present invention can be used as a vector for delivery of a target substance in mitochondrial (see claim 17).
  • the content of the membrane-fusible lipid is 70% (molar ratio) or more of the total lipid content contained in the lipid membrane. (See claim 2).
  • Membrane By setting the content of the fusogenic lipid within the above range, the lipid membrane is compared to the mitochondrial membrane. Fusion ability can be improved.
  • the membrane-fusible lipid is, for example, a corn type lipid (see claim 3), and the corn type lipid is, for example, dioleoylphosphatidyl. Ethanolamine (see claim 4).
  • the lipid membrane structure of the present invention is, for example, a peptide having a membrane-permeable domain (see claim 5), and the membrane-permeable domain is preferably polyarginine (see claim 6).
  • polyarginine has a force of 4 to 20 consecutive arginine residues (see claim 7).
  • the lipid membrane structure of the present invention moves into the cell while retaining the target substance, and the target substance is mitochondria by membrane fusion between the lipid membrane and the mitochondrial membrane. Is released inside.
  • the membrane-permeable peptide is present on the surface of the lipid membrane (see claim 8).
  • the presence of the membrane-permeable peptide on the surface of the lipid membrane can improve the fusion ability of the lipid membrane to the mitochondrial membrane.
  • the lipid membrane preferably has a mitochondrial targeting signal (see claim 9).
  • a mitochondrial targeting signal see claim 9.
  • the mitochondrial targeting signal is, for example, a peptide shown in the following (a) or (b) (see claim 10).
  • the mitochondrial targeting signal is bound to a component of the lipid membrane, for example, directly or via a linker (claim 11). reference).
  • the C terminus of the mitochondrial targeting signal is preferably bound to a component of the lipid membrane (see claim 12).
  • the mitochondrial targeting signal is preferably present on the surface of the lipid membrane (see claim 13). Thereby, the binding ability of the lipid membrane to the mitochondrial membrane can be improved.
  • the amount of the mitochondrial targeting signal is preferably 2 to 10% (molar ratio) of the total lipid amount contained in the lipid membrane. reference). Thereby, the binding ability of the lipid membrane to the mitochondrial membrane can be improved.
  • the lipid membrane structure of the present invention is preferably a ribosome (see claim 15).
  • the target substance can be efficiently delivered into the mitochondria by encapsulating the target substance in the lipid membrane structure of the present invention.
  • the present invention provides the following formula: A—X—B [wherein A represents a residue of a mitochondrial targeting signal, X represents a direct bond or a linker, B represents a phospholipid residue.
  • A represents a residue of a mitochondrial targeting signal
  • X represents a direct bond or a linker
  • B represents a phospholipid residue.
  • the phospholipid derivative of the present invention modifies the lipid membrane structure with a mitochondrial targeting signal (for example, the ribosome surface is mitochondria). This is useful when modifying with targeting signals).
  • the C terminus of the mitochondrial targeting signal is preferably bound to the phospholipid directly or via a linker (see claim 19).
  • a linker see claim 19
  • the mitochondrial targeting signal is, for example, a peptide shown in the following (a) or (b) (see claim 20).
  • the linker is, for example, an amino acid residue, a residue of a linker peptide, or a residue of a cross linker reagent (see claim 21).
  • the phospholipid has an amino group, and the phospholipid is bound to the mitochondrial targeting signal or the linker via the amino group ( (See claim 22).
  • the phospholipid is phosphatidylethanolamine (see claim 23).
  • the present invention provides a lipid membrane structure capable of delivering a target substance into mitochondria and a phospholipid derivative useful for the preparation of the lipid membrane structure.
  • FIG. 1 is a partial cross-sectional view schematically showing an embodiment of a lipid membrane structure of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding activity (%) of EPC ribosomes to the mitochondrial membrane.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding activity (%) to the DOPE ribosome mitochondrial membrane.
  • FIG. 4 is a graph showing the fusion activity (FRET elimination rate (%)) of the EPC ribosome to the mitochondrial membrane.
  • FIG. 5 is a graph showing the fusion activity (FRET elimination rate (%)) for the DOPE ribosome mitochondrial membrane.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Western plotting.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 10 shows a synthesis scheme of SMCC-DOPE.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of HPLC.
  • FIG. 12 shows FAB-MS results.
  • FIG. 13 shows a synthesis scheme of MTS-DOPE.
  • FIG. 14 shows a result of HPLC.
  • FIG. 15 shows the results of MALDI-TOF-MS.
  • FIG. 16 is a diagram showing the ribosome translocation activity to mitochondria.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of observation with a confocal laser microscope.
  • lipid membrane structure of the present invention will be described in detail.
  • the “lipid membrane containing a membrane-fusible lipid and having a membrane-permeable peptide” is hereinafter referred to as “mitochondrial membrane-fusible lipid membrane”.
  • the lipid membrane structure of the present invention has a ribosome as long as it has a mitochondrial membrane-fused lipid membrane.
  • OZw-type emulsion OZw-type emulsion, wZoZw-type emulsion, spherical micelle, stringed micelle, amorphous layered structure, etc.
  • a ribosome is preferable.
  • the target substance can be efficiently delivered into the mitochondria by encapsulating the target substance in the lipid membrane structure of the present invention.
  • the lipid membrane structure of the present invention is a ribosome
  • it is a multilamellar vesicle (MLV), SUV (small unilamellar vesicle), LUV (large unila mellar vesicle), GUV It may be a single membrane ribosome such as (giant unilamellar vesicle)
  • the number of mitochondrial fusogenic lipid membranes of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited.
  • the lipid membrane structure of the present invention has a plurality of lipid membranes, all the lipid membranes It may be a mitochondrial fusogenic lipid membrane, or some of the lipid membranes may be mitochondrial fusogenic lipid membranes.
  • the size of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, but when the lipid membrane structure of the present invention is ribosome or emulsion, the particle diameter is usually 50 nm to 5 ⁇ m, and spherical micelles In this case, the particle size is usually 5 to: LOOnm, and in the case of string micelles or irregular layered structures, the thickness per layer is usually 5 to: LOnm. And prefer to be.
  • the constituents of the lipid membrane include, for example, lipids, membrane stabilizers, antioxidants, charged Examples include substances and membrane proteins.
  • Lipid is an essential component of the lipid membrane, and the amount of lipid contained in the lipid membrane is usually 70% (molar ratio) or more, preferably 75% (molar ratio) of the total amount of substances constituting the lipid membrane. ) Or more, more preferably 80% (molar ratio) or more.
  • the upper limit of the amount of lipid contained in the lipid membrane is 100% of the total amount of substances constituting the lipid membrane.
  • lipids examples include phospholipids, glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids exemplified below.
  • Phosphatidylcholine for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.
  • phosphatidylglycerol for example, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylcholine
  • Myristoylphosphatidylglycerol dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, etc.
  • phosphatidylethanolamine eg dilauroylphosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphine
  • Glycose glycolipid for example, sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride), Sphingo glycolipid (for example, galactosyl celeb oral side, latatosyl celeb oral side, gandarioside), etc.
  • Animal-derived sterols eg, cholesterol, cholesterol succinic acid, cholestanol, lanostero monore, dihydrolanostero monore, desmostero monore, dihydrocholesterol
  • plant-derived sterols eg, stigmasterol, Sitosterol, campesterol, brassicasterol
  • sterols derived from microorganisms eg, timosterol, ergosterol.
  • Saturated or unsaturated fatty acids having 12 to 20 carbon atoms such as normitic acid, oleic acid, stearic acid, arachidonic acid and myristic acid.
  • the membrane stabilizer is an optional component of the lipid membrane that can be contained to physically or chemically stabilize the lipid membrane or to regulate the fluidity of the lipid membrane.
  • the amount of membrane stabilizer contained in the lipid membrane is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, more preferably 20% (molar ratio) of the total amount of substances constituting the lipid membrane. ) Note that the lower limit of the content of the membrane stabilizer is zero.
  • Examples of the membrane stabilizer include sterol, glycerin or fatty acid ester thereof.
  • Specific examples of the sterol are the same as those described above, and examples of the glycerin fatty acid ester include triolein and trioctanoin.
  • the antioxidant is an optional component of the lipid membrane that can be contained to prevent lipid membrane acidification, and the amount of antioxidant contained in the lipid membrane is Is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, and more preferably 20% (molar ratio) or less.
  • the lower limit of the antioxidant content is 0.
  • the charged substance is an optional component of the lipid film that can be contained to impart a positive charge or negative charge to the lipid film.
  • the amount of the charged substance contained in the lipid film is determined by the lipid film. It is usually 30% (molar ratio) or less, preferably 25% (molar ratio) or less, and more preferably 20% (molar ratio) or less of the total amount of the substances constituting the above. The lower limit of the charged substance content is zero.
  • Examples of the charged substance imparting a positive charge include saturated or unsaturated aliphatic amines such as stearylamine and oleylamine; saturated or unsaturated cationic synthetic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane and the like.
  • Examples of the charged substance that imparts a negative charge include dicetyl phosphate, cholesteryl hemisuccinate, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidic acid.
  • a membrane protein is an optional component of a lipid membrane that can be contained in order to maintain the structure of the lipid membrane or to impart functionality to the lipid membrane, and is contained in the lipid membrane.
  • the amount of membrane protein is usually 10% (molar ratio) or less, preferably 5% (molar ratio) or less, more preferably 2% (molar ratio) or less of the total amount of substances constituting the lipid membrane.
  • the lower limit of the membrane protein content is zero.
  • membrane proteins include membrane surface proteins and membrane integral proteins.
  • lipid constituting the lipid membrane for example, a blood retention function, a temperature change sensitivity function, Lipid derivatives having a pH sensitive function and the like can be used.
  • a blood retention function for example, a blood retention function, a temperature change sensitivity function, Lipid derivatives having a pH sensitive function and the like can be used.
  • 1 type, or 2 or more types of functions among the said functions can be provided to a lipid membrane structure.
  • Improve retention of the lipid membrane structure in the blood by imparting a lipid retention function to the lipid membrane structure and reduce the capture rate by reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen Is possible.
  • reticuloendothelial tissues such as the liver and spleen Is possible.
  • the lipid membrane structure a temperature change sensitive function and a Z or PH sensitive function, the release of the target substance retained in the lipid membrane structure can be enhanced.
  • Examples of the blood-retaining lipid derivative capable of imparting a blood-retaining function include, for example, glycophorin, gandarioside GM1, phosphatidylinositol, gandarioside GM3, Glucuronic acid derivatives, glutamic acid derivatives, polyglycerin phospholipid derivatives, N- ⁇ Carbonyl-methoxypolyethyleneglycol-2000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycose mouth-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ Carbon-methoxypolyethyleneglycol-5000 ⁇ -1,2-dipalmitoyl-sn-glycephine-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbo-methoxypolyethylene glycol-750 ⁇ -1, 2- Distearoyl-sn-glycephine-3-phosphoethanolamine, N- ⁇ carbol-methoxypolyethylene glycol-2000 ⁇ -1,2-distearoyl-sn-glycep
  • Examples of the temperature change sensitive lipid derivative capable of imparting a temperature change sensitive function include dipalmitoylphosphatidylcholine and the like.
  • Examples of the pH sensitive lipid derivative capable of imparting a pH sensitive function include, for example, di And oleoylphosphatidylethanolamine.
  • the lipid membrane structure of the present invention can retain a cell containing a target mitochondria, an antibody that specifically recognizes an enzyme secreted by the cell, and the like.
  • an antibody it is preferable to use a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody one type of monoclonal antibody having specificity for a single epitope may be used, or specific for each type of epitope.
  • a combination of two or more monoclonal antibodies having properties may be used.
  • either a monovalent antibody or a multivalent antibody may be used, and any of a natural type (intact) molecule or a fragment or derivative thereof may be used.
  • Fab ', Fab, chimeric antibody or hybrid antibody having at least two antigens or epitope binding sites, or bispecific recombinant antibodies such as quadrome, triome, species Intermixed antibodies, anti-idiotype antibodies, and derivatives that have been chemically modified and processed can be used.
  • bispecific recombinant antibodies such as quadrome, triome, species Intermixed antibodies, anti-idiotype antibodies, and derivatives that have been chemically modified and processed
  • bispecific recombinant antibodies such as quadrome, triome, species Intermixed antibodies, anti-idiotype antibodies, and derivatives that have been chemically modified and processed
  • bispecific recombinant antibodies such as quadrome, triome, species Intermixed antibodies, anti-idiotype antibodies, and derivatives that have been chemically modified and processed
  • DNA recombination technology is used.
  • the obtained antibody, an antibody having a neutralizing property with respect to a target epitope or an antibody having a binding property can be used.
  • the mitochondrial fusogenic lipid membrane contains a fusogenic lipid as a constituent component.
  • the amount of fusogenic lipid contained in the mitochondrial fusogenic lipid membrane is not particularly limited, but is usually 70% (molar ratio) or more of the total lipid amount contained in the mitochondrial fusogenic lipid membrane, Preferably it is 75% (molar ratio) or more, more preferably 80% (molar ratio) or more.
  • the upper limit of the amount of fusogenic lipid contained in the mitochondrial fusogenic lipid membrane is 100% of the total amount of lipid contained in the mitochondrial fusogenic lipid membrane.
  • the fusogenic lipid contained in the mitochondrial fusogenic lipid membrane is not particularly limited as long as it can be fused with the lipid membrane.
  • the lipid membrane to which the membrane-fusible lipid can be fused is not particularly limited as long as it has a lipid bilayer structure. Examples thereof include biological membranes such as cell membranes and mitochondrial membranes, and artificial membranes such as ribosome membranes.
  • membrane-fusible lipids include corn type lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine. Lipids are roughly classified into three types, cone type, cylindrical type, and inverted cone type, according to the proportion of polar and nonpolar groups.
  • Lipids are lipids in which hydrophobic groups occupy a larger volume than hydrophilic groups, and are also referred to as nonbilayer lipids (written by Naoto Okudo, ribosome production and experimental methods, pages 27-3 3) , Hirokawa Shoten).
  • nonbilayer lipids written by Naoto Okudo, ribosome production and experimental methods, pages 27-3 3) , Hirokawa Shoten.
  • the corn-type lipid has a reverse hexagonal structure in the lipid bilayer, a reverse micelle structure is formed in the lipid bilayer, and the formed reverse micelle structure is involved in membrane fusion, membrane permeability, etc. It is considered.
  • the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane has a membrane-permeable peptide.
  • the membrane-permeable peptide is present in the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane in a state capable of binding to the mitochondrial membrane, and is preferably present on the surface of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane.
  • the membrane-permeable peptide is present on the surface of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane, it is sufficient that the membrane-permeable peptide is present on the outer surface of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane. Sex peptides may or may not be present!
  • the membrane-permeable peptide possessed by the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is not particularly limited as long as it can permeate the lipid membrane.
  • the lipid membrane through which the membrane-permeable peptide can permeate is not particularly limited as long as it has a lipid bilayer structure, and examples thereof include biological membranes such as cell membranes and mitochondrial membranes, and artificial membranes such as ribosome membranes.
  • membrane permeable peptide examples include a peptide having a membrane transduction domain (PTD).
  • membrane permeable domain examples include polyarginine, HIV-1 derived Tat (48-60) (GRKKRRQRRRPPQ), HIV-1 derived Rev (34-50) (TRQARRNRRRR WRERQR), and the like. These membrane-permeable domains are rich in arginine residues and can interact electrostatically with the negatively charged mitochondrial membrane.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide having a membrane-permeable domain is not particularly limited, but is usually 4 to 50, preferably 6 to 45, and more preferably 7 to 40. .
  • the total number of amino acid residues constituting the membrane permeable domain is not particularly limited, but is usually 4 to 40, preferably 6 to 30, and more preferably 7 to 20.
  • Polyarginine as a membrane permeable domain usually has a force of 4 to 20, preferably 6 to 12, more preferably 7 to 10 consecutive arginine residues.
  • a peptide having a membrane-permeable domain consists of only a membrane-permeable domain! / ⁇ , and has an arbitrary amino acid sequence at the C-terminus and / or N-terminus of the membrane-permeable domain. And then ⁇ .
  • the amino acid sequence added to the C-terminal and / or N-terminal of the membrane permeable domain is preferably an amino acid sequence having rigidity (for example, polyproline). Unlike polyethylene glycol (PEG), which is soft and irregularly shaped, polyproline is straight and retains some degree of rigidity.
  • amino acid residue contained in the amino acid sequence added to the C-terminal and Z- or N-terminal of the membrane permeable domain is preferably an amino acid residue other than acidic amino acids. This is because a negatively charged acidic amino acid residue may electrostatically interact with a positively charged arginine residue and attenuate the effects of arginine residues contained in the membrane-permeable domain. .
  • the amount of the membrane-permeable peptide present in the mitochondrial membrane-fused lipid membrane is usually 4 to 20% (molar ratio), preferably 6 to 16%, of the total lipid content in the mitochondrial membrane-fused lipid membrane. (Molar ratio), more preferably 8 to 12% (molar ratio).
  • Mitochondrial membrane fusion lipid membrane By making the amount of the membrane-permeable peptide present within the above range, the binding ability of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane to the mitochondrial membrane can be improved, and the binding between the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane and the mitochondrial membrane is an opportunity. In addition, membrane fusion between a mitochondrial membrane-fusible lipid membrane and a mitochondrial membrane can be efficiently induced.
  • the membrane-permeable peptide is bound to a lipid membrane component (eg, a hydrophobic group, a hydrophobic compound, etc.)
  • a lipid membrane component eg, a hydrophobic group, a hydrophobic compound, etc.
  • the lipid membrane component is retained in the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane, and part or all of the membrane-permeable peptide is exposed from the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane.
  • the lipid membrane constituent to which the membrane-permeable peptide binds is not particularly limited.
  • saturated or unsaturated fatty acid groups such as stearyl groups; cholesterol groups or derivatives thereof; phospholipids, glycolipids, Sterols; long-chain aliphatic alcohols (for example, phosphatidylethanolamine, cholesterol, etc.); polyoxypropylene alkyls; glycerin fatty acid esters, etc.
  • fatty acid groups having 10 to 20 carbon atoms for example, Normitoyl group, oleyl group, stearyl group, arachidoyl group, etc. are preferable.
  • the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane preferably has a mitochondrial targeting signal (MTS).
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • MTS is present in the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane in a state where it can exert its ability to migrate to mitochondria, and is preferably present on the surface of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane (ie, mitochondria membrane-fusible lipid membrane). The surface of the surface is exposed). By allowing MTS to be present on the surface of the mitochondria membrane-fusible lipid membrane, the ability of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane to bind to the mitochondrial membrane can be improved. If MTS is present on the surface of the mitochondrial membrane-fused lipid membrane, at least the outer surface of the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane should have MTS on the inner surface! /, Then exist!
  • the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane may have only one type of MTS, or may have two or more types of MTS.
  • the amount of MTS contained in the mitochondrial membrane fusogenic lipid membrane is not particularly limited, but is usually 2 to 10% (molar ratio), preferably 3 to 8% of the total lipid amount contained in the mitochondrial membrane fusogenic lipid membrane. (Molar ratio), more preferably 4 to 6% (molar ratio).
  • MTS is a signal peptide, many of which are already known, and the type thereof is not particularly limited. In the present invention, any peptide can be used as long as the function of MTS is maintained, and a known MTS may be used as it is, or a known MTS is mutated (one or more amino acids). Deletions, substitutions, insertions or additions) may be used. MTS usually has a force of 20-70 amino acid residues, and MTS has the ability to migrate to various regions within the mitochondrial, such as the outer mitochondrial membrane, inner mitochondrial membrane, mitochondrial intermembrane space, and mitochondrial matrix. However, any MTS can be used for the present invention!
  • MTS examples include peptides shown in the following (a) or (b).
  • the peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 1 is a peptide in which several residues on the C-terminal side of MTS of rat liver-derived succil Co A synthetase are deleted.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added to the amino acid sequence of MTS is particularly limited as long as the function of MTS is maintained. Although it is not a thing, it is 1-3 normally, Preferably it is 1-2.
  • the amino acid sequence of MTS (for example, the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 31) is further deleted,
  • the position of the amino acid to be substituted, inserted or added is not particularly limited as long as the function of MTS is maintained, but it should be on the C-terminal side (that is, the amino acid sequence on the N-terminal side must be conserved). ) Is preferred.
  • the force by which MTS is cleaved may not be exactly what region functions as MTS.
  • a peptide containing a region located on the N-terminal side of the protein cleavage site can be used as MTS.
  • Peptide force used as MTS When including a region located on the C-terminal side of the protein cleavage site, the amino acid position to be deleted, substituted, inserted, or attached is located on the C-terminal side of the protein cleavage site.
  • the amino acid sequence N-terminal to the protein cleavage site is conserved.
  • the binding mode of MTS to the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is not particularly limited.
  • MTS binds to lipid membrane components directly or via a linker.
  • the misaligned part of MTS can combine with lipid membrane components! It is preferable that the C-terminal binds to the lipid membrane component.
  • the function of MTS (ability to migrate to mitochondria) can be efficiently demonstrated.
  • the lipid membrane constituent to which MTS binds directly or through a linker is not particularly limited, but is more preferably a phospholipid, preferably a lipid.
  • lipid membrane constituents to which MTS binds directly or through a linker are lipids, especially phospholipids, MTS can be stably and easily presented on the lipid membrane surface, and MTS presented on the lipid membrane surface Control the density of!
  • Lipids to which MTS binds directly or through a linker include, for example, saturated or unsaturated fatty acids having 10 to 20 carbon atoms (for example, lauric acid, myristic acid, normitic acid, stearic acid, oleic acid).
  • lipids having one or more residues specifically, phosphatidylethanolamines, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylinositols, phosphatidylglycerols, Cardiolipins, Sphingomyelins, Ceramide phosphorylethanolamines, Ceramide phosphorylglycerols, Ceramide phosphorylglycerol phosphates, Deoxyphosphatidylcholines, Plasmalogens and phosphatidic acids, and their derivatives Etc.
  • lipids having amino groups are preferably used.
  • lipids having amino groups include dioleoylphosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine. , Distearoyl phosphatidylethanolamine, otadecenylocta decanol glyceose phosphoethanolamine, dioleoyl glyceto phosphoethanol amide (N-dode-force-luamine), dioleoylglyce phosphine phospho Ethanolamine (N-xanoylamine), Dipalmitoylglyce mouth phosphoethanolamine (N-Dodeca-Luamine), Dipalmitoyl glyce mouth phosphoethanolamine (N-Hexanolamine), Distearoyl glyce mouth fo Phoethanolamine 1 [N-amino (polyethylene glycol) 2000], stearoyl monoalkylone glyce mouth [phospho 1 L-s
  • Lipids include those in the form of salts.
  • the type of salt is not particularly limited, but mineral salts such as hydrochloride and sulfate; organic acid salts such as oxalate and tartrate; alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; And organic bases such as um salt.
  • MTS and lipid membrane constituents are directly bonded, the functional groups possessed by MTS (including functional groups artificially introduced into MTS) and the functional groups possessed by lipid membrane constituents (lipid membrane constituents) Containing functional groups artificially introduced into the components).
  • MTS and lipid membrane components are bound via a covalent bond.
  • Examples of combinations of functional groups that can form a covalent bond include amino group Z carboxyl group, hydroxyl group Z carboxyl group, maleimide group ZSH group, and the like, and the reaction between these functional groups should be performed according to a known method. Can do.
  • MTS and a lipid membrane constituent having an amino group are formed by reacting a force lpoxyl group possessed by MTS at the C-terminus with an amino group possessed by a lipid membrane constituent to form an amide bond. From this, it can be directly coupled. This reaction can be performed using an acid halide method, an active ester method, or the like.
  • MTS is treated with a halogenating agent in an inert solvent to form an acid halide.
  • the resulting acid halide is reacted with the amino group of the lipid membrane constituent.
  • the halogenating agent include thioyl chloride, thiohalides such as thio-bromide, sulfuryl chlorides such as sulfuryl chloride and sulfuryl bromide; Phosphorus trihalides such as phosphorus iodide; phosphorus pentahalides such as phosphorus pentachloride, phosphorus pentabromide and phosphorus pentaiodide; phosphorus oxyhalides such as phosphorus oxychloride, phosphorus oxybromide and phosphorus oxyiodide Can be used.
  • the reaction solvent may be appropriately determined and determined.
  • ethers such as jetyl ether, tetrahydrofuran and dioxane; amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide; halogenated hydrocarbons such as dichloromethane and chloroformate; -Tolyls such as: esters of formic acid ethyl ester and ethyl acetate, mixed solvents thereof and the like.
  • the reaction temperature may be appropriately determined, but is usually from o ° c to the reflux temperature of the solvent, preferably from room temperature to the reflux temperature of the solvent.
  • an organic base such as triethylamine or pyridine may be added, if necessary.
  • the carboxyl group of MTS is reacted with an active esterifying agent in a solvent to form an active ester, and then reacted with an amino group of a lipid membrane constituent.
  • the active esterifying agent include N hydroxy compounds such as N hydroxysuccinimide, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy 5 norbornene 2,3 dicarboximide; 1, 1, monooxalyl Diimidazoles such as diimidazole, ⁇ , ⁇ 'carbodiimidazole; 2,2, -disulfides such as dipyridyl disulfide; succinic compounds such as ⁇ , ⁇ '-disuccinimidyl carbonate; Phosphinic chloride compounds such as ⁇ , ⁇ , monobis (2-oxo-3-oxazolidyl) phosphinic chloride; ⁇ , ⁇ , monodisuccinimidyl oxalate, ⁇ , ⁇ '-diphthalimi
  • the reaction solvent may be appropriately determined and determined.
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, ethers such as jetyl ether and tetrahydrofuran; amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide Class: Benzene Aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene; esters such as ethyl acetate, mixed solvents thereof and the like can be used.
  • the reaction of the obtained active ester with the amino group of the lipid membrane component is carried out by using a condensing agent, for example, azodicarboxylate di-lower alkyl triphenylphosphine such as ethodicarboxylate-triphenylphosphine; N-ethyl-5-phenyl.
  • a condensing agent for example, azodicarboxylate di-lower alkyl triphenylphosphine such as ethodicarboxylate-triphenylphosphine; N-ethyl-5-phenyl.
  • N-lower alkyl such as -ruisoxazolium-3, -sulfonate-5-arylisoxazolium 3, monosulfonate; oxydiformate such as jetyloxydiformate ⁇ , ⁇ '-dicyclohexylcarbodiimide and other ⁇ , ⁇ '-dicycloanolequinolecanolevodiimides; diheteroarynoresidues such as di-2-pyridinoresinselenide; triphenylphosphine Triaryl phosphines such as ⁇ -trobenzenesulfol triazolide; 2-aryl 1-methyl pyridine 2-halo 1 lower alkyl pyridi-um halides such as nyumodide; diarylphosphoryl azides such as diphenylphosphoryl azide; imidazole derivatives such as ⁇ , ⁇ , and carbodiimidazole; benzotriazole derivatives such as 1-hydroxy
  • the functional group of the lipid membrane component (including a functional group artificially introduced into the lipid membrane component) and the functionality of the linker
  • the MTS has a functional group (including a functional group artificially introduced into the MTS) and a linker And a functional group (including a functional group artificially introduced into the linker).
  • the lipid membrane component and the linker are bound via a covalent bond
  • ⁇ S and the linker are bound via a covalent bond.
  • Examples of the combination of functional groups capable of forming a covalent bond include amino group ⁇ carboxyl group, hydroxyl group ⁇ carboxyl group, maleimide group ZSH group and the like, and the reaction between these functional groups is performed according to a known method. be able to.
  • MTS and lipid membrane components are combined via a linker, the lipid membrane After reacting the component and the linker, MTS may be reacted, or after reacting MTS and the linker, the lipid membrane component may be reacted.
  • linker examples include amino acid residues, linker peptides, and polyvalent (for example, divalent) crosslinker reagents.
  • the number of amino acid residues constituting the linker peptide is not particularly limited, but is usually 2 to 10, preferably 2 to 8.
  • the amino acid sequence of the linker peptide may be any amino acid sequence, but the amino acid residue contained in the amino acid sequence of the linker peptide is preferably an amino acid residue other than an acidic amino acid. This is because an acidic amino acid residue having a negative charge may electrostatically interact with a positively charged arginine residue and attenuate the effect of the arginine residue contained in the membrane permeability domain.
  • the polyvalent crosslinker reagent is not particularly limited, and examples thereof include a divalent crosslinker reagent having a reaction directivity with an amino group and an SH group.
  • examples of the divalent crosslinker reagent having reaction directivity with the following compounds include the following compounds.
  • the polyvalent cross-linker reagent can bind MTS and lipid membrane constituents by reacting with functional groups contained in MTS and functional groups of lipid membrane constituents, for example. You can.
  • M—X—L [wherein M represents a residue of MTS, X represents a residue of a crosslinker reagent, and L represents a residue of a lipid membrane component. A complex of MTS and lipid membrane components is formed.
  • the polyvalent cross-linker reagent reacts with, for example, the functional group contained in the linker peptide and the functional group of the lipid membrane constituent component, thereby causing the linker peptide and the lipid membrane constituent component to react. Can be combined. Then, the MTS and the lipid membrane component can be bound by amide bonding the carboxyl group or amino group of the linker peptide bound to the lipid membrane component and the amino group or carboxyl group of the MTS. it can.
  • Formulas (2) and (3) clearly show the binding mode in the conjugate, and “one NH — CO” in formula (2) has the amino group and linker peptide that MTS has. It is an amide bond with a carboxyl group, and “one CO—NH” in formula (3) is an amide bond between the carboxyl group of MTS and the amino group of the linker peptide.
  • the divalent crosslinker reagent having a reaction directivity with an amino group and an SH group is, for example, SH having a cysteine residue (preferably a cysteine residue located at the C-terminal of MTS) contained in MTS.
  • SH having a cysteine residue (preferably a cysteine residue located at the C-terminal of MTS) contained in MTS.
  • a divalent cross linker reagent having reaction directivity with an amino group and an SH group is, for example, the linker peptide and the lipid membrane constituent can be bound by reacting with the SH group of the cysteine residue contained in the linker peptide and the amino group of the lipid membrane constituent. Then, the carboxyl group or amino group of the linker peptide bonded to the lipid membrane constituent component and the amino group or carboxyl group of the MTS can be bonded to each other by amide bond, thereby binding the MTS and the lipid membrane constituent component.
  • L is the residue of the lipid membrane component
  • the intended reaction may be efficiently performed by introducing a protecting group.
  • protecting groups for example, “Protective Groups Inganic Synthesis” (P. G. M. Wuts and T. Green, 3rd edition 1999 Wiley, John & Sons) may be referred to.
  • the lipid membrane structure of the present invention preferably retains a target substance to be delivered into mitochondria.
  • the lipid membrane structure of the present invention includes, for example, the inside of the lipid membrane structure (for example, voids formed inside the lipid membrane structure), the surface of the lipid membrane, in the lipid membrane, in the lipid membrane layer, in the lipid membrane layer.
  • the target substance can be held on the surface or the like.
  • the lipid membrane structure is a fine particle such as a ribosome, the target substance can be encapsulated inside the fine particle.
  • the type of target substance is not particularly limited.
  • drugs, nucleic acids, peptides, Protein, sugar or a complex thereof, and the like can be appropriately selected depending on the purpose of diagnosis, treatment, prevention and the like.
  • the target substance is a substance for the purpose of diagnosing, treating, or preventing a disease
  • the lipid membrane structure retaining the target substance can be used as a component of the pharmaceutical composition.
  • the “nucleic acid” includes DNA or RNA, and analogs or derivatives thereof (for example, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.). Further, the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.
  • the lipid membrane structure preferably has a compound having a gene transfer function from the viewpoint of improving the efficiency of gene transfer into cells.
  • the compound having a gene transfer function include ⁇ , ⁇ '- ⁇ -didodecanol-N--trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine mouthlid, ⁇ , ⁇ '- ⁇ -ditetradecanol- ⁇ - (a -trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine mouthlid, ⁇ , ⁇ '- N-dihexadecanol- N- (a -trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine mouthlid, 0, Cr-N- Dioctadecenoyl-N- (a-trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine chloride, ⁇ , ⁇ ', 0 "-tridecanol- ⁇ - ( ⁇ -trimethylammo-oacetyl) -diethanolamine chlor
  • These compounds having a gene transfer function are contained in the lipid membrane structure (for example, voids formed in the lipid membrane structure), in the lipid membrane, on the lipid membrane surface, on the lipid membrane. In the layer, it can be present (bound) on the lipid membrane layer surface.
  • the target substance is preferably retained as an aggregate of the target substance in the lipid membrane structure (particularly the inside of the lipid membrane structure). As a result, the target substance can be efficiently delivered into the mitochondria.
  • the aggregate of the target substance may be composed only of the target substance, and may contain a substance other than the target substance (for example, a carrier holding the target substance)! .
  • a substance other than the target substance for example, a carrier holding the target substance
  • an aggregate of the target substance is prepared by electrostatically binding the target substance and the key substance to form a composite.
  • the target substance is negatively charged, for example, an aggregate of the target substance can be prepared by electrostatically binding the target substance and a cationic substance to form a composite. If the target substance is not negatively or positively charged, the target substance and the specified carrier are combined in an appropriate manner (for example, physical adsorption, hydrophobic bond, chemical bond, etc.) to form a complex.
  • an aggregate of the target substance can be prepared.
  • complexing an aggregate of the target substance that is positively or negatively charged as a whole can be prepared by adjusting the mixing ratio of the target substance to the cationic substance or the anionic substance.
  • an aggregate of nucleic acids can be prepared by electrostatically binding the nucleic acid and the cationic substance to form a complex.
  • an aggregate of nucleic acids that are positively or negatively charged as a whole can be prepared.
  • the cationic substance that can be used in preparing the aggregate of the target substance is not particularly limited as long as it is a substance having a cationic group in the molecule.
  • the cationic substance include a cationic lipid (eg, Lipofectamine (manufactured by Invitrogen)); a polymer having a cationic group; polylysine, polyarginine, a homopolymer of basic amino acids such as a copolymer of lysine and arginine, and the like.
  • Polymers or copolymers or derivatives thereof eg, stearylated derivatives
  • polycationic polymers such as polyethyleneimine, poly (arylamine), poly (diallyldimethylammonium chloride), darcosamine; protamine or derivatives thereof ( For example, protamine sulfate); powers such as chitosan etc.
  • stearylyporine ginin is particularly preferred.
  • the number of arginine residues constituting the polyarginine is usually 4 to 20, preferably 6 to 12, and more preferably 7 to 10.
  • the number of cationic groups possessed by the cationic substance is not particularly limited, but is preferably 2 or more.
  • the cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged.
  • an amino group for example, an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group or an ethylamino group; a dialkylamino group such as a dimethylamino group or a jetylamino group; an imino group; -Dino group etc. are mentioned.
  • An anionic substance that can be used in preparing an aggregate of the target substance is an anionic substance in the molecule.
  • the substance is not particularly limited as long as the substance has an ionic group.
  • the ionic substance include ionic lipids; polymers having ionic groups; homopolymers or copolymers of acidic amino acids such as polyaspartic acid or derivatives thereof; xanthan gum, carboxybi Diar polymers, carboxymethylcellulose polystyrene sulfonates, polysaccharides, polyarion polymers such as carrageenan, and the like can be used.
  • the terionic group is not particularly limited as long as it can be negatively charged, for example, a functional group having a terminal carboxyl group (for example, a succinic acid residue, a malonic acid residue, etc.), a phosphoric acid group, a sulfuric acid group, etc. Is mentioned.
  • the form of the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a dried mixture form, a dispersed form in an aqueous solvent, and a dried or frozen form.
  • the lipid membrane structure is produced using a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, a surfactant method, or a freezing and thawing method. can do.
  • the lipid membrane structure in the form of a dried mixture is prepared by, for example, dissolving all the components of the lipid membrane structure in an organic solvent such as chloroform and then vacuum drying with an evaporator or spraying with a spray dryer. It can be manufactured by drying.
  • the lipid membrane structure in a form dispersed in an aqueous solvent is added to the aqueous solvent after the lipid membrane structure in the form of a dry mixture is added to an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, or a high-pressure jet emulsification. It can manufacture by emulsifying with a machine etc.
  • a lipid membrane structure in a form dispersed in an aqueous solvent is well known as a method for producing ribosomes, and can be produced by a method such as a reverse phase evaporation method. If you want to control the size of the lipid membrane structure, use a membrane filter with a uniform pore size, etc., and perform extrusion (extrusion filtration) under high pressure.
  • the composition of the aqueous solvent is not particularly limited.
  • a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffered saline solution, a physiological saline solution, Cell culture A culture medium etc. are mentioned.
  • aqueous solvents can stably disperse the lipid membrane structure, but in order to disperse the lipid membrane structure more stably, monosaccharides (for example, glucose, galactose, mannose, fructose, Inositol, ribose, xylose, etc.), disaccharides (eg, lactose, sucrose, cellobiose, trehalose, maltose, etc.), trisaccharides (eg, raffinose, merezinose, etc.), polysaccharides (eg, cyclodextrin, etc.), sugar alcohols (E.g., erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, maltitol, etc.) or an aqueous solution thereof; glycerin, diglycerin, polydalyserin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycolan
  • the pH of the aqueous solvent (dispersion medium) is set from weakly acidic to near neutral (pH 3.0 to 8.0), or dissolved oxygen is removed by nitrogen publishing. I prefer to do that.
  • the lipid membrane structure in a form in which the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent is dried or frozen is dried or frozen by a known method such as freeze drying or spray drying of the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent. Can be manufactured.
  • a lipid membrane structure dispersed in an aqueous solvent is once produced and then dried, the lipid membrane structure can be stored for a long period of time, and when an aqueous solution containing the target substance is added to the dried lipid membrane structure Since the lipid mixture is efficiently hydrated, there is an advantage that the target substance can be efficiently retained in the lipid membrane structure.
  • a sugar such as maltitol or an aqueous solution thereof, the lipid membrane structure can be stably stored for a long period of time.
  • an aqueous solvent for example, the sugar or an aqueous solution thereof; glycerin, diglycerin, polyglycerin, propylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol , Ethyleneglycolenomonorequinoleetenore
  • the lipid membrane structure By adding a polyhydric alcohol such as diethylene glycol monoalkyl ether or 1,3-butylene glycol or an aqueous solution thereof, the lipid membrane structure can be stored stably for a long period of time.
  • the aqueous solvent (dispersion medium) may be mixed with sugar and a polyhydric alcohol.
  • the concentration of sugar or polyhydric alcohol in the aqueous solvent (dispersion medium) in which the lipid membrane structure is dispersed is not particularly limited, but the sugar concentration is preferably 2 to 20% (W / V). More preferably, it is 5 to 10% (W / V).
  • the concentration of the polyhydric alcohol is preferably 1 to 5% (W / V), more preferably 2 to 2.5% (W / V).
  • the concentration of the buffering agent is preferably 5 to 50 mM, more preferably 10 to 20 mM.
  • the concentration of the lipid membrane structure in the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, but it is preferably 0.1 lmM to 500 mM in terms of the total lipid concentration contained in the lipid membrane structure ImM: More preferably, it is LOOmM.
  • the lipid membrane structure retaining an antibody can be produced by producing an lipid membrane structure, adding an antibody, and binding the antibody to the surface of the lipid membrane.
  • the lipid membrane structure retaining the antibody is prepared by adding a lipid derivative capable of reacting with the antibody and a mercapto group in the antibody after the production of the lipid membrane structure, and binding the antibody to the surface of the lipid membrane. Can be manufactured.
  • the form of the pharmaceutical composition containing the lipid membrane structure retaining the target substance is not particularly limited.
  • the form of a dried mixture, the form dispersed in an aqueous solvent, or the dried or frozen form The form can be mentioned, and each form of the pharmaceutical yarn and composition can be produced in the same manner as the lipid membrane structure of each form described above.
  • a pharmaceutical composition in the form of a dried mixture is obtained by, for example, dissolving a component of a lipid membrane structure and a target substance in an organic solvent such as black mouth form, and then obtaining this mixture. It can be produced by vacuum drying with a vaporizer or spray drying with a spray dryer.
  • a method for producing a pharmaceutical composition in which a lipid membrane structure holding a target substance is dispersed in an aqueous solvent a plurality of methods are known as follows. The production method can be appropriately selected according to the retention mode of the target substance to be obtained and the properties of the mixture.
  • the components of the lipid membrane structure and the target substance are once dissolved in an organic solvent such as black mouth form to obtain a mixture, which is then dried under reduced pressure using an evaporator or spray dried using a spray dryer.
  • an organic solvent such as black mouth form
  • an evaporator or spray dried using a spray dryer To prepare a dry mixture containing the lipid membrane structure and the target substance, and then add an aqueous solvent to the mixture, and then emulsify with an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier, etc.
  • an emulsifier such as a homogenizer, an ultrasonic emulsifier, a high-pressure jet emulsifier, etc.
  • Production method 2 retains the target substance by dissolving the constituent components of the lipid membrane structure once in an organic solvent and then emulsifying by adding an aqueous solvent containing the target substance to the dried product obtained by distilling off the organic solvent.
  • This is a method for producing a pharmaceutical composition in which a lipid membrane structure is dispersed in an aqueous solvent.
  • In order to control the size (particle diameter) of the lipid membrane structure it is only necessary to perform extrusion (extrusion filtration) under a high pressure using a membrane filter having a uniform pore diameter.
  • Production method 2 is difficult to dissolve in an organic solvent, but can be dissolved in an aqueous solvent. It can be applied to specific substances.
  • Production method 2 has the advantage that the target substance can also be retained in the inner aqueous phase when the lipid membrane structure is ribosome.
  • a lipid membrane structure that holds a target substance is added to a lipid membrane structure such as a ribosome, emulsion, micelle, or layered structure dispersed in an aqueous solvent by further adding an aqueous solvent containing the target substance.
  • a lipid membrane structure such as a ribosome, emulsion, micelle, or layered structure dispersed in an aqueous solvent by further adding an aqueous solvent containing the target substance.
  • This is a method for producing a pharmaceutical composition in a form dispersed in an aqueous solvent.
  • Production method 3 can be applied to water-soluble target substances. Since production method 3 is a method of adding the target substance from the outside to the already produced lipid membrane structure, when the target substance is a polymer, the target substance cannot enter the lipid membrane structure. There is a possibility that it exists in the presence (bonding) on the surface of the lipid membrane structure.
  • lipid membrane structure force S ribosome a sandwich structure (generally called “complex” or “complex”) in which the target substance is sandwiched between ribosome particles should be formed by production method 3. It has been known. In production method 3, since the aqueous dispersion of the lipid membrane structure alone is produced by force, it is not necessary to consider the decomposition of the target substance during emulsification, and the size (particle diameter) can be easily controlled. Therefore, as compared with production method 1 and production method 2, a pharmaceutical composition in which a lipid membrane structure holding a target substance is dispersed in an aqueous solvent can be easily produced.
  • the lipid membrane structure holding the target substance is added to the dried product obtained by drying the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent by adding an aqueous solvent containing the target substance.
  • This is a method for producing a pharmaceutical composition in a form dispersed in a solvent.
  • Manufacturing method 4 can be applied to water-soluble target substances in the same manner as manufacturing method 3.
  • the difference between production method 4 and production method 3 is the presence of the lipid membrane structure and the target substance.
  • the lipid membrane structure dispersed in an aqueous solvent is once produced and then Since a dried product is produced, the lipid membrane structure exists in a solid state as a lipid membrane fragment at this stage.
  • a solvent in which sugar or an aqueous solution thereof, preferably sucrose or an aqueous solution thereof, or lactose or an aqueous solution thereof is added to an aqueous solvent may be used.
  • Aqueous solvent containing the target substance When lipids are added, the lipid membrane fragments that existed in the solid state begin to hydrate rapidly with the invasion of water, and the lipid membrane structure is reconstructed. At this time, the target substance is retained inside the lipid membrane structure. A lipid membrane structure of a different form is produced.
  • the target substance can easily be retained inside the lipid membrane structure even if it is a polymer target substance. Therefore, when the target substance is a polymer, in Production Method 3, the target substance may not enter the lipid membrane structure and may be present on the surface of the lipid membrane structure. 4 differs greatly in this respect.
  • a method for producing a pharmaceutical composition in which a lipid membrane structure holding a target substance is dispersed in an aqueous solvent a method well known as a method for producing ribosomes, for example, reverse phase An evaporation method or the like can be employed.
  • a method for producing ribosomes for example, reverse phase An evaporation method or the like.
  • Examples of the method for drying a dispersion in which a lipid membrane structure holding a target substance is dispersed in an aqueous solvent include freeze-drying and spray-drying.
  • the aqueous solvent examples include the sugar or an aqueous solution thereof, preferably sucrose. Alternatively, an aqueous solution thereof, or a solvent added with lactose or an aqueous solution thereof is preferably used.
  • a method of freezing a dispersion liquid in which a lipid membrane structure holding a target substance is dispersed in an aqueous solvent a normal freezing method may be mentioned.
  • the aqueous solvent the sugar or an aqueous solution thereof, or the polyhydric alcohol or the It is preferable to use a solvent to which an aqueous solution is added.
  • the aggregate of the target substance is positively charged as a whole, the aggregate of the target substance is retained by using a cation lipid (acidic lipid) as the lipid constituting the lipid membrane.
  • a cation lipid acidic lipid
  • lipid membranes can be produced efficiently and the aggregates of the target substance are negatively charged as a whole, if cationic lipids (basic lipids) are used as lipids constituting the lipid membrane, It is possible to efficiently produce a lipid membrane structure in which aggregates of target substances are retained.
  • Examples of key lipids include cardiolipin, diacyl phosphatidyl serine, diacyl phosphatidic acid, N-succinyl phosphatidylethanolamine (N-succinyl PE), and phosphatidic acid. , Phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethylene glycol, cholesterol succinic acid and the like.
  • Examples of the force thionic lipid include dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC).
  • the lipid membrane structure of the present invention when the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane binds to the mitochondrial membrane via a membrane-permeable peptide, the membrane fusion between the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane and the mitochondrial membrane is triggered.
  • the target substance retained in the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is released into the mitochondria.
  • the target substance is mitochondria Delivered in. Therefore, the lipid membrane structure of the present invention can be used as a vector for delivery of a target substance into mitochondria.
  • the mitochondria targeted by the lipid membrane structure of the present invention may be mitochondria from which cellular force has been separated, or may be mitochondria present in cells.
  • the biological species from which mitochondria targeted by the lipid membrane structure of the present invention are derived is not particularly limited, and examples include animals, plants, microorganisms, etc., but mammals preferred by animals are more preferable. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, hidges, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs and the like.
  • the type of cells containing mitochondria targeted by the lipid membrane structure of the present invention is not particularly limited, and examples include somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof.
  • the lipid membrane structure of the present invention is a lipid membrane in which the mitochondrial membrane-fused lipid membrane is transferred into the cell.
  • a ribosome that is one embodiment of a lipid membrane structure having a structure in which the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is located in the outermost layer of the lipid membrane structure transferred into the cell is shown in Fig. 1 (a).
  • a single membrane ribosome la comprising a lipid membrane 2a and a target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 2a, wherein the lipid membrane 2a is a mitochondrial membrane-fused lipid membrane, and the lipid membrane 2a
  • a membrane-permeable peptide present on the surface of the membrane has polyarginine as a membrane-permeable domain (preferably a membrane-permeable peptide also has a polyarginine ability).
  • Single-membrane ribosome la can also transfer extracellular force into the cell through a membrane-permeable peptide present on the surface of lipid membrane 2a while maintaining its original form (in an intact state). After translocation into the cell, when lipid membrane 2a binds to the mitochondrial membrane via a membrane-permeable peptide on its surface, this triggers membrane fusion between lipid membrane 2a and the outer membrane of the mitochondrial The target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 2a is released into the mitochondrial.
  • the lipid membrane 2a preferably has MTS on the surface. This As a result, the binding ability of the lipid membrane 2a to the mitochondrial membrane can be improved, and the membrane fusion between the lipid membrane 2a and the mitochondrial membrane can be efficiently induced by the binding between the lipid membrane 2a and the mitochondrial membrane. . In addition, since the lipid membrane 2a has MTS on the surface, the ribosome transferred into the cell can be selectively transferred to the mitochondria.
  • Ribosomes which are another embodiment of the lipid membrane structure having a configuration in which the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is located in the outermost layer of the lipid membrane structure transferred into the cell, are shown in Fig. 1 (b).
  • a bilayer ribosome lb comprising a lipid membrane 21b, a lipid membrane 22b located outside the lipid membrane 21b, and a target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21b.
  • the membranes 21b and 22b are mitochondrial membrane-fusible lipid membranes, and the membrane-permeable peptide present on the surface of the lipid membrane 22b has polyarginine as the membrane-permeable domain (preferably the membrane-permeable peptide also has polyarginine power) Bilayer ribosome lb.
  • the bilamellar ribosome lb can be transferred into the extracellular force cell while maintaining its original form (intact state) via a membrane-permeable peptide present on the surface of the lipid membrane 22b.
  • the lipid membrane 22b After translocation into the cell, when the lipid membrane 22b binds to the outer mitochondrial membrane via a membrane-permeable peptide on its surface, this leads to membrane fusion between the lipid membrane 22b and the outer mitochondrial membrane. Induced, the ribosome crosses the mitochondrial outer membrane. In the ribosome that has passed through the outer membrane of the mitochondrial, the lipid membrane 22b disappears due to membrane fusion with the outer membrane of mitochondria, but the lipid membrane 21b is retained. After passing through the outer mitochondrial membrane, the lipid membrane 21b binds to the inner mitochondrial membrane via a membrane-permeable peptide on its surface, which triggers the membrane between the lipid membrane 21b and the inner mitochondrial membrane. Fusion is induced, and target substance 3 encapsulated inside lipid membrane 21b is released into mitochondria.
  • the lipid membranes 21b and 22b preferably have MTS on the surface.
  • the binding ability of lipid membranes 21b and 22b to the mitochondrial membrane can be improved, and the membrane fusion between lipid membranes 21b and 22b and the mitochondrial membrane is efficiently triggered by the binding of lipid membranes 21b and 22b to the mitochondrial membrane. It can be induced well.
  • the lipid membrane 22b since the lipid membrane 22b has MTS on the surface, the ribosome transferred into the cell can be selectively transferred to mitochondria.
  • the ribosome which is another embodiment of the lipid membrane structure having a configuration in which the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is located in the outermost layer of the lipid membrane structure transferred into the cell, is shown in Fig. 1 (c).
  • a bilayer ribosome comprising a lipid membrane 21c, a lipid membrane 22c located outside the lipid membrane 21c, and a target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21c, the lipid membrane 21c Is a mitochondrial membrane-fused lipid membrane, and lipid membrane 22c is a bilayer ribosome lc containing a membrane-fused lipid.
  • membrane-fusible lipids contained in the lipid membrane 22c include neutral lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine; and cation lipids (acid lipids) such as cholesterol succinic acid and cardiolipin.
  • the amount of the fusogenic lipid contained in the lipid membrane 22c is usually 50% (molar ratio) or more, preferably 60% (molar ratio) or more, more preferably 70% of the total lipid content contained in the lipid membrane 22c. (Molar ratio) or more.
  • the upper limit of the content of membrane-fusible lipid is 100%.
  • the bilayer ribosome lc can move from the outside of the cell into the cell via endocytosis.
  • the bilayer ribosome lc transferred into the cell via endocytosis is taken up into the endsome, but the endosomal force can also escape by membrane fusion between the endosomal membrane and the lipid membrane 22c.
  • the lipid membrane 22c disappears due to membrane fusion with the endosomal membrane, but the lipid membrane 21c is retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21c is released into the mitochondria in the same manner as in the case of the single membrane ribosome la.
  • the bilayer ribosome lc can be transferred from the outside of the cell into the cell through membrane fusion between the lipid membrane 22c and the cell membrane.
  • the lipid membrane 22c disappears due to membrane fusion with the cell membrane, but the lipid membrane 21c is retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21c is released into the mitochondria in the same manner as in the case of the single membrane ribosome la.
  • the amount of cation lipid contained in the lipid membrane 22c is 15% (molar ratio) or more, preferably 20% of the amount of membrane-fused lipid contained in the lipid membrane 22c. (Molar ratio) or higher, the endosomal interior changes to acidic (pH 5.5-6.5) or under acidic conditions (pH 5.5-6.5) , The lipid membrane 22c can be efficiently fused with the endosomal membrane or cell membrane.
  • the lipid membrane 21c preferably has MTS on the surface.
  • the binding ability of the lipid membrane 21c to the mitochondrial membrane can be improved, and the membrane fusion between the lipid membrane 21c and the mitochondrial membrane can be efficiently induced by the binding between the lipid membrane 21c and the mitochondrial membrane. it can.
  • the ribosome transferred into the cell can be selectively transferred to the mitochondria.
  • the ribosome which is another embodiment of the lipid membrane structure having a configuration in which the mitochondrial membrane-fusible lipid membrane is located in the outermost layer of the lipid membrane structure transferred into the cell, is shown in Fig. 1 (d).
  • Fig. 1 the lipid membrane 21d, the lipid membrane 22d located outside the lipid membrane 21d, the lipid membrane 23d located outside the lipid membrane 22d, and the target substance enclosed inside the lipid membrane 21d 3
  • lipid membranes 21d and 22d are mitochondrial membrane-fused lipid membranes
  • lipid membrane 23d is a triple-membrane ribosome Id containing membrane-fused lipids.
  • the kind and amount of the fusogenic lipid contained in the lipid membrane 23d is the same as that of the lipid membrane 22c.
  • Trilamellar ribosome Id can translocate from outside the cell via endocytosis.
  • the triple membrane ribosome Id that has been transferred into the cell via endocytosis is taken up into the endsome, but the endosomal force can also escape by membrane fusion between the endosomal membrane and the lipid membrane 23d.
  • the lipid membrane 23d is lost by membrane fusion with the endosomal membrane, but the lipid membranes 21d and 22d are retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21d is released into the mitochondria in the same manner as in the case of the bilayer ribosome lb.
  • the triple membrane ribosome Id can be transferred from the outside of the cell into the cell through membrane fusion between the lipid membrane 23d and the cell membrane.
  • the lipid membrane 23d is lost by membrane fusion with the cell membrane, but the lipid membranes 21d and 22d are retained.
  • the target substance 3 encapsulated inside the lipid membrane 21d is released into the mitochondria in the same manner as in the case of the bilayer liposome lb.
  • lipid membranes 21d and 22d may have MTS on the surface. preferable. As a result, the ability of lipid membranes 21d and 22d to bind to the mitochondrial membrane can be improved, and the membrane fusion between lipid membranes 21d and 22d and the mitochondrial membrane is efficiently triggered by the binding of lipid membranes 21d and 22d to the mitochondrial membrane. It can be induced well. In addition, since the lipid membrane 22d has MTS on the surface, the ribosome transferred into the cell can be selectively transferred to mitochondria.
  • the lipid membrane structure of the present invention can be used for both in vivo and in vitro.
  • examples of the administration route include parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, and nasal administration. It can be appropriately adjusted according to the type and amount of the target substance retained in the lipid membrane structure.
  • EPC Egg yolk phosphatidylcholine
  • one lipid selected from Tables l (i) to (viii) were dissolved in an organic solvent (black mouth form) at a ratio of 9: 2 (molar ratio) Thereafter, in addition to the glass test tube, the organic solvent was removed to form a thin film on the bottom of the glass test tube.
  • Mitochondria isolated buffer hereinafter referred to as “MIB”) (250 mM sucrose, 2 mM Tris—Cl, solvent is water) was added to hydrate the lipid membrane, followed by ultrasonic treatment.
  • MIB Mitochondria isolated buffer
  • DOPE Dioleoyl phosphatidinorethananolamine
  • DOPE ribosomes of appropriate size 200 to 300 nm were prepared (total lipid concentration 0) in the same manner as (1) above. 5-0.55mM). All prepared DOPE ribosomes are single membrane ribosomes.
  • the ribosome membrane of the liposome for measuring the binding activity is labeled with 1 mol 0 / oNBD (4-nitrobenzo-2--2-oxa-1,3-diazole).
  • DOPE excitation wavelength (Ex) 470 nm, fluorescence wavelength (Em) 530 nm, manufactured by Molecular Probe
  • the ribosome membrane of the fusion activity measurement ribosome is 1 mol 0 / oNBD-labeled DO PE and 0.5 mol % Rhodamine (Rho) -labeled DOPE (excitation wavelength (Ex) 560 nm, fluorescence wavelength (Em) 590 nm) was included.
  • EPC ribosomes or DOPE ribosomes having octaargin (arginine 8 polymer) on the surface were prepared.
  • EPC-based ribosomes having no octaarginine on the surface are "STR-R8 non-modified EPC-based ribosomes”
  • EPC-based ribosomes having octa-arginine on the surface are "STR-R8-modified EPC-based ribosomes”
  • DOPE-based ribosomes that do not have octa-arginine on the surface are “STR—R8 unmodified DOPE-based ribosomes”
  • DOPE-based ribosomes that have octa-arginine on the surface The ribosome is called “STR—R8-modified DOPE ribosome”.
  • the binding activity of the ribosome to the mitochondrial membrane was evaluated as follows using a mitocondrier from which rat liver strength was also isolated and a fluorescently labeled ribosome containing 1 mol% NBD-labeled DOPE.
  • Mitochondrial was also isolated from rat liver strength and diluted to 1 mgZmL in MIB to prepare a mitochondrial solution. Samples were prepared by adding 10 L of ribosome suspension to 90 L of mitochondrial solution. Prepare two samples and incubate each sample for 30 minutes at 25 ° C, then store one sample as a F sample in the dark and refrigerated.
  • the other sample was centrifuged (16000 X g, 10 min, 4 ° C), the supernatant (the fraction containing ribosomes that did not bind mitochondria) was removed, and the precipitate (liposome bound to mitochondria) was removed. Fraction-containing fractions) were washed with MIB, re-separated (twice) by centrifugation (20400 X g, 2 minutes, 4 ° C), and stored in the dark as a F sample. Each sample was mixed with an equal amount of l% Triton, stirred, and then the fluorescence intensity was measured. The binding activity (%) was calculated based on the following formula.
  • F represents the fluorescence intensity of the F sample (fluorescence wavelength 530 nm), and F represents the F sample's fluorescence intensity.
  • Fig. 2 shows the binding activity (%) of the EPC ribosome to the mitochondrial membrane
  • Fig. 3 shows the binding activity (%) to the DOPE ribosome mitochondrial membrane.
  • the mouth indicates STR-R8 unmodified ribosome
  • the country indicates STR-R8 modified ribosome.
  • Fig. 3 (a) shows DOPE ribosomes with a mixing ratio of 9: 2 (molar ratio) between DOPE and one kind of lipid for which l (i) to (viii) forces are also selected.
  • (b) shows DOPE-based ribosomes in which the mixing ratio of DOPE to one kind of lipid for which Table l (i) to (viii) forces are also selected is 1: 1 (molar ratio).
  • STR-R8 unmodified EPC ribosome and STR-R8 unmodified DOPE ribosome showed binding activity to the mitochondrial membrane.
  • STR-R8 modified EPC ribosomes and STR-R8 modified DOPE liposomes showed binding activity to the mitochondrial membrane.
  • the fusion activity of ribosome to the mitochondrial membrane was evaluated using FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
  • the fluorescently labeled ribosome containing 1 mol% NBD-labeled DOPE and 0.5 mol% Rho-labeled DOPE binds to the mitochondria and does not fuse with the mitochondrial membrane, the fluorescently labeled ribosome exists as it is. In this case, since NBD and Rho are in close proximity, FRET is induced and the fluorescence of NBD disappears. On the other hand, when the fluorescently labeled liposome is fused with the mitochondrial membrane, NBD-labeled DOPE and Rho-labeled DOPE diffuse on the mitochondrial membrane, thus eliminating FRET and restoring NBD fluorescence. .
  • F sample was prepared by adding 10 ⁇ L of ribosome suspension to 90 ⁇ L of ton and incubating at 25 ° C. for 30 minutes. Emitted when each sample is irradiated with excitation light of 470 nm max
  • F is the fluorescence intensity of the F sample (fluorescence wavelength 530 max max
  • Fig. 5 shows DOPE ribosomes with a mixing ratio of 9: 2 (molar ratio) between DOPE and one type of lipid selected in Tables l (i) to (viii).
  • Fig. 5 shows DOPE-based ribosomes in which the mixing ratio of D OPE and one kind of lipid selected from Tables l (i) to (viii) is 1: 1 (molar ratio).
  • STR—R8-modified DOPE ribosome force Even in living cells, STR-R8-modified DOPE is introduced into HeLa cells to demonstrate fusion activity to the mitochondrial membrane and to be able to introduce ribosome-encapsulating substances into mitochondria. Intracellular kinetics were observed by introducing ribosomes. It is known that STR-R8-modified ribosomes can be introduced into cells while maintaining their original form (in an intact state) (Yakugaku Ikurami et al., “YAKUG AKU ZASSHIJ, 2004, 124 ⁇ Suppl. 4, 113-116; Kogure et al., “Journal of Controlled Release”, 2004, pp. 98, 317-323).
  • Figure 6 shows the results of observation with a confocal laser microscope.
  • Figure 6 (b) shows STR R8-modified DOPE ribosomes (DOPE: SM).
  • “Transmitted light” is the cell image by transmitted light
  • Mt is the location of mitochondria (red)
  • GFP is the localization of GFP (green)
  • “Overlapping” is superimposed on the cell image by transmitted light It shows the localization of mitochondrial (red) and GFP (green).
  • Rat liver mitochondrial solution (mitochondrial protein lOmgZ mL) was prepared in the same manner as in Example 1 and dispensed in lmL aliquots into tubes.
  • IM (+) [IM (-BSA) (70 mM sucrose, 220 mM D-manntol, 2. OmM HEPES (pH 7.4)) 50 mL with 50 mgZmL BSA solution 500 / z L] And centrifuged (20400 X g, 2 minutes, 4 ° C), and the supernatant was removed. After repeating the same operation, the precipitate was resuspended in 100 L of IM (+) to obtain a mitochondrial solution (mitochondrial protein lOOmgZmL).
  • Add an equal volume of 25% digitonin solution (dissolved with digitonin in IM (+)) to 4 ° C (JW Greenawalt.The is olation of outer and inner mitochondrial membranes.Methods Enzymoi 31: «310-23 (1974)) o IM (+) 600 1 ⁇ was added to the reaction solution to stop the reaction.
  • the mitochondrial solution was centrifuged (lOOOO X g, 10 minutes, 4 ° C), the supernatant was transferred to another tube, and the precipitate was washed with IM (+).
  • SDS-PAGE loading buffer (0.1 M Tris, 4% SDS, 12% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, BPB (appropriate amount)) is mixed with the obtained sample, and 5 ⁇ L of the denatured sample is mixed with SDS. -Applied to polyacrylamide gel (15%) and run. The gel after the electrophoresis was transferred to a PVDF membrane (Nippon Genetics) (BE-330, BIO CRAFT). PVDF membrane after transfer After blocking, antibody reaction was performed to detect the desired GFP band.
  • PVDF membrane Nippon Genetics
  • Transmitted light is the cell image of the transmitted light
  • mitochondria red
  • NBD—DOPE green
  • Dextran c ascade blue
  • superposition is mitochondria (red)
  • MTS (SEQ ID NO: 1, R. Majumdar and WA Bridger. Mitochondrial translocation and processing of the precursor to the alpha—subunit of rat liver succinyl— CoA synthetase. Biochem Cell Biol 68: 292-9 (1990)), MTS-DOPE was synthesized as an MTS-lipid derivative. Although the results are not shown, it has been confirmed that rat liver-derived succil Co A synthetase-derived MTS (SEQ ID NO: 1) exhibits the ability to migrate to human cell mitochondria.
  • MTS—DOPE is obtained by linking the SH group of the C-terminal Cys of MTS and the amino group of DOPE via SMC (4—unaieimidomethyl) — 1—cyclohexanecarboxylic acia-hydroxysuccinimide ester). Synthesized ( Figures 10 and 13). In FIGS. 10 and 13, the structure of DOPE is schematically shown.
  • SMCC-DOPE was fractionated and subjected to mass spectrometry by FAB-MS (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry), confirming that the molecular weight was consistent with the target product (Fig. 12).
  • FAB-MS Fluji E OL JMS-HX100
  • methanol was used as a solvent
  • NBA m-nitrobenzene alcohol
  • MTS modification means that the surface of the liposome is modified with MTS.
  • HeLa cells were washed with MIB (+) [250 mM sucrose, 2 mM Tris—CI, ImM EDTA, pH 7.4] and then suspended in MIB (+) to become 1.0 mL 10 7 cells ZmL (below) On ice, operation). Using a Dounce homogenizer, homogenization was performed 20 times to prepare a homogenate solution. The obtained sample was diluted with MIB (+) to lmgZmL after measuring the protein amount using BCA protein assay kit (PIERCE) with BSA as the standard substance in the presence of 1% SDS. ,-Stored at 80 ° C.
  • MIB (+) 250 mM sucrose, 2 mM Tris—CI, ImM EDTA, pH 7.4
  • Migration activity (%) fluorescence intensity of ribosomes migrating to mitochondria [F
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • Figures 17 and 18 show the results of observation with a confocal laser microscope.
  • Figure 17 (a) shows the results for the control (GFP solution added to the cells)
  • Figure 17 (b) shows the results for STR-R8 and MTS-unmodified EPC ribosomes
  • Figure 17 (c) shows the results for STR- Figure 18 (a) shows the result of STR—R8 modified MTS unmodified EPC ribosome
  • Figure 18 (b) shows the result of STR—R8 and MTS modified EPC ribosome. Indicates.
  • Transmitted light is the cell image by transmitted light
  • Mitochondria is the localization of mitochondria (red)
  • GFP is the localization of GFP (green)
  • “Overlapping” is superimposed on the cell image by transmitted light The combined mitochondrial (red) and GFP (green) localization is shown.
  • STR-R8 and MTS-modified EPC ribosomes were used, co-localization (yellow) of mitochondria (red) and GFP (green) was confirmed.
  • the STR-R8 and MTS-modified EPC systems are considered to have no fusion ability to the mitochondrial membrane, similar to the liposome STR-R8-modified MTS-unmodified EPC ribosomes, so mitochondria (red) and GFP Co-localization (green) with (green) means that the ribosome is in close proximity to the mitochondrial membrane. In other words, it became apparent that the ribosome could be bound in close proximity to the mitochondrial membrane by modifying the ribosome surface with MTS.
  • Ribosome is Mitoko If it can be bound in close proximity to the Dodria membrane, it is likely to induce membrane fusion between the ribosome membrane and the mitochondrial membrane. In addition, since GFP (green) was hardly observed in the parts other than mitochondria (red) (cytoplasm and other organelles), the liposome surface was modified with MTS to select ribosomes into mitochondria. It became clear that it was possible to provide a transitional ability.

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Abstract

　ミトコンドリア内に目的物質を送達することができるリポソーム脂質膜構造体を提供することを目的とし、本発明のリポソーム脂質膜構造体は、膜融合性脂質を含有し、表面に膜透過性ペプチドを有するリポソーム膜脂質膜を備えることを特徴とする。

Description

明 細 書
目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜構造体
技術分野
[0001] 本発明は、脂質膜構造体、特に、 目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜 構造体等に関する。 背景技術
[0002] 従来、ミトコンドリアへのタンパク質導入技術として、ミトコンドリアへの移行能を有す るペプチド（例えば、 Rat liver succiny卜 CoA synthetase α等のミトコンドリアターゲテ イングシグナル (MTS) )と目的のタンパク質との融合タンパク質を発現可能なベクタ 一を細胞内に導入し、細胞内で融合タンパク質を発現させる方法が主に採用されて きた (非特許文献 1, 2, 3)。しかしながら、ミトコンドリア膜の物質透過は非常に制限 されており、オリゴヌクレオチド、プラスミド DNA等をミトコンドリア内へ送達する方法 は皆無であった。
[0003] 一方、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するため のベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療におい ては、 目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、ァ デノウィルス、アデノ関連ウィルス等のウィルスベクターが開発されている。しかしなが ら、ウィルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、こ のような問題点が少な 、リボソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めて 、る 。リボソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入 することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有し ている。
[0004] 最近、凝縮ィ匕 DNA封入リボソームの表面をステアリルィ匕ォクタアルギニンで修飾す ることにより、凝縮ィ匕 DNAの細胞導入効率が 1000倍、凝縮ィ匕 DNA封入リボソーム の細胞への導入効率が 100倍向上したことが報告されている（非特許文献 4)。また、 表面をステアリルィ匕ォクタアルギニンで修飾したリボソームは、原形を保ったまま (イン タクト (intact)な状態で)細胞内に導入できることが報告されて 、る (特許文献 1,非特 許文献 4, 5)。
特許文献 1：国際公開 WO2005Z032593号パンフレット
非特許文献 1 : B. W. Kong等， 「Biochimica et Biophysica ActaJ , 2003年， 1625卷， 9 8-108頁
非特許文献 2 : T. Tamura等,「Biochemical and Biophysical Research Communication sj , 1996年, 222卷, 659- 63頁
非特許文献 3 : K. Diekert等,「Proceedings of the National Academy of sciences of t he United States of AmericaJ , 1999年， 96卷， 11752- 7頁
非特許文献 4 : Kogure等，「Journal of Controlled Release] , 2004年， 98卷， 317-323 頁
非特許文献 5 :力リル'イクラミ等， rYAKUGAKU ZASSHIJ , 2004年， 124卷， Suppl.4, 1 13-116頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、ミトコンドリア内に目的物質を送達することができる脂質膜構造体、及び 当該脂質膜構造体の調製に有用なリン脂質誘導体を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するために、本発明の脂質膜構造体は、膜融合性脂質を含有し、 膜透過性ペプチドを有する脂質膜を備えることを特徴とする (請求項 1参照)。膜融合 性脂質を含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜は、ミトコンドリア膜と効率よく融 合することができる。したがって、ミトコンドリア内へ送達しょうとする目的物質を保持し ている脂質膜構造体 (請求項 16参照）は、脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合により 目的物質をミトコンドリア内に放出させることができ、これにより、目的物質をミトコンド リア内に送達することができる。すなわち、本発明の脂質膜構造体は、目的物質のミ トコンドリア内送達用ベクターとして使用することができる（請求項 17参照)。
[0007] 本発明の脂質膜構造体にお!ヽて、前記膜融合性脂質の含有量が、前記脂質膜に 含有される総脂質量の 70% (モル比）以上であることが好ま 、 (請求項 2参照)。膜 融合性脂質の含有量を上記範囲とすることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する 融合能を向上させることができる。
[0008] 本発明の脂質膜構造体にお!ヽて、前記膜融合性脂質は、例えば、コーン型脂質で あり（請求項 3参照）、前記コーン型脂質は、例えば、ジォレオイルホスファチジルエタ ノーノレアミンである（請求項 4参照)。
[0009] 本発明の脂質膜構造体にお！ヽて、前記膜透過性ペプチドは、例えば、膜透過性ド メインを有するペプチドであり（請求項 5参照）、前記膜透過性ドメインは、好ましくは ポリアルギニンであり（請求項 6参照）、前記ポリアルギニンは、例えば、連続した 4〜 20個のアルギニン残基力 なる（請求項 7参照)。膜透過性ドメインをポリアルギニン とすることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。 また、膜透過性ドメインがポリアルギニンであると、本発明の脂質膜構造体は、原形を 保ったまま (インタタト (intact)な状態で)細胞内に移行することができる。したがって、 本発明の脂質膜構造体を細胞外に投与すると、本発明の脂質膜構造体は目的物質 を保持したまま細胞内に移行し、脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合により目的物質 はミトコンドリア内に放出される。
[0010] 本発明の脂質膜構造体において、前記膜透過性ペプチドが前記脂質膜の表面に 存在することが好ま U、 (請求項 8参照)。膜透過性ペプチドを脂質膜の表面に存在 させることにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることができる。
[0011] 本発明の脂質膜構造体において、前記脂質膜が、ミトコンドリアターゲティングシグ ナルを有することが好ましい (請求項 9参照)。これにより、脂質膜のミトコンドリア膜に 対する結合能を向上させることができる。
[0012] 本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルは、例 えば、下記 (a)又は (b)に示すペプチドである（請求項 10参照)。
(a)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるペプチド
(b)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって、ミトコ ンドリアへの移行能を有するペプチド
[0013] 本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルは、例 えば、直接又はリンカ一を介して前記脂質膜の構成成分に結合している（請求項 11 参照)。この場合、前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルの C末端が前記脂質膜 の構成成分に結合していることが好ましい（請求項 12参照)。これにより、ミトコンドリ ァターゲティングシグナルの機能 (ミトコンドリアへの移行能）を効率よく発揮させること ができる。
[0014] 本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルが前記 脂質膜の表面に存在することが好ましい (請求項 13参照)。これにより、脂質膜のミト コンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。
[0015] 本発明の脂質膜構造体において、前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルの量が 、前記脂質膜に含有される総脂質量の 2〜10% (モル比)であることが好ま 、 (請求 項 14参照)。これにより、脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることが できる。
[0016] 本発明の脂質膜構造体はリボソームであることが好ましい (請求項 15参照)。本発 明の脂質膜構造体がリボソームである場合、本発明の脂質膜構造体の内部に目的 物質を封入することにより、 目的物質をミトコンドリア内に効率よく送達することができ る。
[0017] 上記課題を解決するために、本発明は、次式: A— X— B [式中、 Aはミトコンドリアタ ーゲティングシグナルの残基を表し、 Xは直接結合又はリンカ一を表し、 Bはリン脂質 の残基を表す。 ]で表されることを特徴とするリン脂質誘導体を提供する (請求項 18 参照。）本発明のリン脂質誘導体は、脂質膜構造体をミトコンドリアターゲティングシグ ナルで修飾する（例えば、リボソーム表面をミトコンドリアターゲテイングシグナルで修 飾する）際に有用である。
[0018] 本発明のリン脂質誘導体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルの C 末端が、直接又はリンカ一を介してリン脂質に結合して 、ることが好ま 、 (請求項 1 9参照)。これにより、ミトコンドリアターゲティングシグナルの機能 (ミトコンドリアへの移 行能)を効率よく発揮させることができる。
[0019] 本発明のリン脂質誘導体において、前記ミトコンドリアターゲティングシグナルは、 例えば、下記 (a)又は (b)に示すペプチドである（請求項 20参照)。
(a)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるペプチド (b)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって、ミトコ ンドリアへの移行能を有するペプチド
[0020] 本発明のリン脂質誘導体において、前記リンカ一は、例えば、アミノ酸残基、リンカ 一ペプチドの残基又はクロスリンカ一試薬の残基である（請求項 21参照)。
[0021] 本発明のリン脂質誘導体において、例えば、前記リン脂質がアミノ基を有し、前記リ ン脂質が前記アミノ基を介して前記ミトコンドリアターゲテイングシグナル又は前記リン カーに結合して 、る（請求項 22参照)。
本発明のリン脂質誘導体において、例えば、前記リン脂質はホスファチジルェタノ ールァミン類である（請求項 23参照)。
発明の効果
[0022] 本発明により、ミトコンドリア内に目的物質を送達することができる脂質膜構造体、及 び当該脂質膜構造体の調製に有用なリン脂質誘導体が提供される。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明の脂質膜構造体の実施形態を模式的に示す一部断面図である。
[図 2]EPC系リボソームのミトコンドリア膜に対する結合活性（％)を示す図である。
[図 3]DOPE系リボソームミトコンドリア膜に対する結合活性（％)を示す図である。
[図 4]EPC系リボソームのミトコンドリア膜に対する融合活性 (FRET解消率（％) )を示 す図である。
[図 5]DOPE系リボソームミトコンドリア膜に対する融合活性 (FRET解消率（％) )を示 す図である。
[図 6]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 7]ウェスタンプロットの結果を示す図である。
[図 8]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 9]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 10]SMCC— DOPEの合成スキームを示す図である。
[図 11]HPLCの結果を示す図である。
[図 12]FAB— MSの結果を示す図である。 [図 13]MTS— DOPEの合成スキームを示す図である。
[図 14]HPLCの結果を示す図である。
[図 15]MALDI— TOF— MSの結果を示す図である。
[図 16]リボソームのミトコンドリアへの移行活性を示す図である。
[図 17]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
[図 18]共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を示す図である。
符号の説明
[0024] la, lb, lc, Id' "リボソーム
2a, 21〜22b, 21〜22c, 21〜23d…脂質膜
3 · · ·目的物質
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、本発明の脂質膜構造体について詳細に説明する。なお、「膜融合性脂質を 含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜」を以下「ミトコンドリア膜融合性脂質膜」と いう。
[0026] 本発明の脂質膜構造体は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜を有する限り、リボソーム
、 oZw型エマルシヨン、 wZoZw型エマルシヨン、球状ミセル、ひも状ミセル、不 定形の層状構造物等のうち、いずれの構造体であってもよいが、リボソームであること が好ましい。本発明の脂質膜構造体がリボソームである場合、本発明の脂質膜構造 体の内部に目的物質を封入することにより、目的物質をミトコンドリア内に効率よく送 達することができる。
[0027] 本発明の脂質膜構造体がリボソームである場合、多重膜リボソーム (MLV:Multi la mellar vesicle)であって ょ ヽし、 SUV (small unilamellar vesicle)、 LUV (large unila mellar vesicle)、 GUV (giant unilamellar vesicle)等の 1枚膜リボソームであってもよい
[0028] 本発明の脂質膜構造体が有するミトコンドリア膜融合性脂質膜の数は特に限定さ れるものではなぐ本発明の脂質膜構造体が複数の脂質膜を有する場合、全ての脂 質膜がミトコンドリア膜融合性脂質膜であってもよいし、一部の脂質膜がミトコンドリア 膜融合性脂質膜であってもよ ヽ。 [0029] 本発明の脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、本発明の脂質 膜構造体がリボソーム又はエマルシヨンの場合、粒子径は通常 50nm〜5 μ mであり 、球状ミセルの場合、粒子径は通常 5〜： LOOnmであり、ひも状ミセル又は不定形の 層状構造物の場合、 1層あたりの厚みは通常 5〜： LOnmであり、このような複数の層 が積層して 、ることが好まし 、。
[0030] 本発明の脂質膜構造体において、脂質膜 (ミトコンドリア膜融合性脂質膜であるか 否力を問わない)の構成成分としては、例えば、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電 物質、膜タンパク質等が挙げられる。
[0031] 脂質は脂質膜の必須の構成成分であり、脂質膜に含有される脂質量は、脂質膜を 構成する総物質量の通常 70% (モル比）以上、好ましくは 75% (モル比）以上、さら に好ましくは 80% (モル比)以上である。なお、脂質膜に含有される脂質量の上限値 は、脂質膜を構成する総物質量の 100%である。
[0032] 脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不 飽和の脂肪酸等が挙げられる。
[リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジォレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホス ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコ リン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、 ジォレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、 ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール 、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールァミン（例え ば、ジラウロイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルェタノ ールァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチ ジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファ チジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールァミン、セ ラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスフアート、 1,2-ジミリス トイル- 1,2-デォキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシ チン、これらの水素添加物等。 [0033] [糖脂質]
グリセ口糖脂質 (例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジ ガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフインゴ 糖脂質 (例えば、ガラクトシルセレブ口シド、ラタトシルセレブ口シド、ガンダリオシド)等
[0034] [ステロ一ノレ]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタ ノーノレ、ラノステロ一ノレ、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロ一ノレ、ジヒドロコレステロ ール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シト ステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例 えば、チモステロール、エルゴステロール）等。
[0035] [飽和又は不飽和の脂肪酸]
ノルミチン酸、ォレイン酸、ステアリン酸、ァラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数 12 〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸等。
[0036] 膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調 節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質 膜に含有される膜安定化剤量は、脂質膜を構成する総物質量の通常 30% (モル比) 以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さらに好ましくは 20% (モル比）以下である。な お、膜安定化剤の含有量の下限値は 0である。
[0037] 膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が 挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪 酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
[0038] 抗酸化剤は、脂質膜の酸ィ匕を防止するために含有させることができる、脂質膜の任 意の構成成分であり、脂質膜に含有される抗酸化剤量は、脂質膜を構成する総物質 量の通常 30% (モル比）以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さらに好ましくは 20% (モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は 0である。
[0039] 抗酸化剤としては、例えば、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコ ルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。 [0040] 荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができ る、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される荷電物質量は、脂質膜を 構成する総物質量の通常 30% (モル比）以下、好ましくは 25% (モル比）以下、さら に好ましくは 20% (モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は 0であ る。
[0041] 正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルァミン、ォレイルァミン等の 飽和又は不飽和脂肪族ァミン；ジォレオイルトリメチルアンモ -ゥムプロパン等の飽和 又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては 、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルへミスクシネート、ホスファチジルセリン 、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
[0042] 膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするた めに含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、脂質膜に含有される 膜タンパク質量は、脂質膜を構成する総物質量の通常 10% (モル比)以下、好ましく は 5% (モル比）以下、さらに好ましくは 2% (モル比）以下である。なお、膜タンパク質 の含有量の下限値は 0である。
[0043] 膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げ られる。
[0044] 本発明の脂質膜構造体において、脂質膜 (ミトコンドリア膜融合性脂質膜であるか 否力を問わない)を構成する脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受 性機能、 pH感受性機能等を有する脂質誘導体を使用することができる。これにより、 上記機能のうち 1種又は 2種以上の機能を脂質膜構造体に付与することができる。脂 質膜構造体に血中滞留性機能を付与することにより、脂質膜構造体の血液中での滞 留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させることが できる。また、脂質膜構造体に温度変化感受性機能及び Z又は PH感受性機能を付 与することにより、脂質膜構造体に保持された目的物質の放出性を高めることができ る。
[0045] 血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、 グリコフォリン、ガンダリオシド GM1、ホスファチジルイノシトール、ガンダリオシド GM3、 グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、 N-{カルボ 二ル-メトキシポリエチレングリコール- 2000}-1,2-ジパルミトイル -sn-グリセ口- 3-ホスフ ォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 5000}-1,2-ジパ ルミトイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチ レングリコール- 750}-1, 2-ジステアロイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン、 N -{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 2000}-1,2-ジステアロイル -sn-グリセ口 -3-ホスフォエタノールァミン、 N-{カルボ-ル-メトキシポリエチレングリコール- 5000}- 1,2-ジステアロイル -sn-グリセ口- 3-ホスフォエタノールァミン等のポリエチレングリコ ール誘導体等が挙げられる。
[0046] 温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては 、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、 pH感受性機能を付与 することができる pH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジォレオイルホスファチジ ルエタノールァミン等が挙げられる。
[0047] 本発明の脂質膜構造体には、標的とするミトコンドリアを含有する細胞、当該細胞 が分泌する酵素等を特異的に認識する抗体を保持させることができる。抗体としては 、モノクローナル抗体を使用することが好ましぐモノクローナル抗体としては、単一の ェピトープに対して特異性を有する 1種のモノクローナル抗体を使用してもよいし、各 種ェピトープに対して特異性を有する 2種以上のモノクローナル抗体を組み合わせ て使用してもよい。また、抗体としては、 1価抗体又は多価抗体のいずれを使用しても よいし、天然型 (intact)分子又はそのフラグメント若しくは誘導体のいずれを使用して もよぐ例えば、 F(ab')
2、 Fab'、 Fab、少なくとも二つの抗原又はェピトープ (epitope)結 合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又はクヮドローム (quadrome)、トリオ一 ム (triome)等の二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディォタイプ抗体、さら には化学的に修飾、加工等が施された誘導体を使用することができる。また、公知の 細胞融合、ハイプリドーマ技術、抗体工学等を適用し、合成又は半合成技術によつ て得られる抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、 DNA組換え 技術によって得られる抗体、あるいは標的ェピトープに対して中和特性を有する抗体 又は結合特性を有する抗体等を使用することができる。 [0048] ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、その構成成分として膜融合性脂質を含有する。ミ トコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質量は特に限定されるもので はないが、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の通常 70% (モル比 )以上、好ましくは 75% (モル比）以上、さらに好ましくは 80% (モル比）以上である。ミ トコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質量を上記範囲とすることによ り、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する融合能を向上させることが できる。なお、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質量の上限値 は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質量の 100%である。
[0049] ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される膜融合性脂質は、脂質膜と融合可能で ある限り特に限定されるものではない。膜融合性脂質が融合可能である脂質膜は、 脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではなぐ例えば、細胞膜、ミトコン ドリア膜等の生体膜、リボソーム膜等の人工膜が挙げられる。膜融合性脂質としては 、例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン等のコーン型脂質が挙げられ る。なお、脂質は、極性基と非極性基の占める割合に従って、コーン (cone)型、シリ ンダー（cylindrical)型、逆コーン（inverted cone)型の 3種類に大別され、そのうち、コ ーン型脂質は、疎水性基が親水性基に比べて大きな容積を占める脂質であり、非二 重層脂質 (nonbilayer lipid)とも称される（奥直人著，リボソームの作成と実験法， 27-3 3頁，広川書店)。脂質二重層中でコーン型脂質が逆へキサゴナル構造をとることに より、脂質二重層中に逆ミセル構造が形成され、形成された逆ミセル構造は、膜融合 、膜の透過性等に関与すると考えられている。
[0050] ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、膜透過性ペプチドを有する。膜透過性ペプチドは 、ミトコンドリア膜と結合可能な状態でミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在し、好まし くはミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する。膜透過性ペプチドをミトコンドリ ァ膜融合性脂質膜の表面に存在させることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミ トコンドリア膜に対する融合能が向上させることができる。
[0051] 膜透過性ペプチドがミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する場合、少なくと もミトコンドリア膜融合性脂質膜の外表面に膜透過性ペプチドが存在すればよぐ内 表面には膜透過性ペプチドが存在して 、てもよ 、し存在して 、なくてもよ!、。 [0052] ミトコンドリア膜融合性脂質膜が有する膜透過性ペプチドは、脂質膜を透過可能で ある限り特に限定されるものではない。膜透過性ペプチドが透過可能である脂質膜 は、脂質二重層構造を有する限り特に限定されるものではなぐ例えば、細胞膜、ミト コンドリア膜等の生体膜、リボソーム膜等の人工膜が挙げられる。膜透過性ペプチド としては、例えば、膜透過性ドメイン（Protein Transduction Domain (PTD))を有する ペプチドが挙げられる。膜透過性ドメインとしては、例えば、ポリアルギニン、 HIV-1由 来の Tat(48— 60) (GRKKRRQRRRPPQ)、 HIV-1由来の Rev(34— 50) (TRQARRNRRRR WRERQR)等が挙げられる。これらの膜透過性ドメインは、アルギニン残基に富んで おり、負電荷を有するミトコンドリア膜と静電的に相互作用することができる。
[0053] 膜透過性ドメインを有するペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定され るものではないが、通常 4〜50個、好ましくは 6〜45個、さらに好ましくは 7〜40個で ある。膜透過性ドメインを構成するアミノ酸残基の総数は特に限定されるものではな いが、通常 4〜40個、好ましくは 6〜30個、さらに好ましくは 7〜20個である。膜透過 性ドメインとしてのポリアルギニンは、通常 4〜20個、好ましくは 6〜12個、さらに好ま しくは 7〜 10個の連続したアルギニン残基力もなる。
[0054] 膜透過性ドメインを有するペプチドは、膜透過性ドメインのみからなって!/ヽてもよ!/ヽ し、膜透過性ドメインの C末端及び/又は N末端に任意のアミノ酸配列を有して 、て もよ ヽ。膜透過性ドメインの C末端及び/又は N末端に付加されるアミノ酸配列は、 剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン)であることが好ましい。ポリプロリ ンは、柔ら力べて不規則な形をとつているポリエチレングリコール (PEG)と異なり、直 線的で、ある程度の堅さを保持している。また、膜透過性ドメインの C末端及び Z又 は N末端に付加されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸性アミノ酸以外のアミ ノ酸残基であることが好ましい。負電荷を有する酸性アミノ酸残基が、正電荷を有す るアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含まれるアルギニン残 基の効果を減弱させる可能性があるためである。
[0055] ミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在する膜透過性ペプチド量は、ミトコンドリア膜融 合性脂質膜に含有される総脂質量の通常 4〜20% (モル比）、好ましくは 6〜16% ( モル比）、さらに好ましくは 8〜12% (モル比)である。ミトコンドリア膜融合性脂質膜に 存在する膜透過性ペプチド量を上記範囲とすることにより、ミトコンドリア膜融合性脂 質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、ミトコンドリア膜融合 性脂質膜とミトコンドリア膜との結合を契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミト コンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。
[0056] ミトコンドリア膜融合性脂質膜における膜透過性ペプチドの存在態様としては、例え ば、膜透過性ペプチドが脂質膜構成成分 (例えば、疎水性基、疎水性化合物等）に 結合しており、脂質膜構成成分がミトコンドリア膜融合性脂質膜内に保持され、膜透 過性ペプチドの一部又は全部がミトコンドリア膜融合性脂質膜から露出している態様 が挙げられる。
[0057] 膜透過性ペプチドが結合する脂質膜構成成分は特に限定されるものではなぐ例 えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸基;コレステロール基又はその誘 導体;リン脂質、糖脂質又はステロール;長鎖脂肪族アルコール (例えば、ホスファチ ジルエタノールァミン、コレステロール等）；ポリオキシプロピレンアルキル；グリセリン 脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらのうち特に炭素数 10〜20の脂肪酸基 (例 えば、ノルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキドイル基等）が好ましい。
[0058] ミトコンドリア膜融合性脂質膜はミトコンドリアターゲデイングシグナル (MTS)を有す ることが好ましい。これにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対す る結合能を向上させることができ、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との 結合を契機として、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合を効率 よく誘起することができる。
[0059] MTSは、ミトコンドリアへの移行能を発揮し得る状態でミトコンドリア膜融合性脂質 膜に存在し、好ましくはミトコンドリア膜融合性脂質膜の表面に存在する (すなわち、ミ トコンドリア膜融合性脂質膜の表面カゝら露出した状態で存在する)。 MTSをミトコンド リア膜融合性脂質膜の表面に存在させることにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜の ミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができる。 MTSがミトコンドリア膜融 合性脂質膜の表面に存在する場合、少なくともミトコンドリア膜融合性脂質膜の外表 面に MTSが存在すればよぐ内表面には MTSが存在して!/、てもよ!/、し存在して!/ヽ なくてもよい。 [0060] ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、 1種類のみの MTSを有していてもよいし、 2種類 以上の MTSを有して 、てもよ 、。ミトコンドリア膜融合性脂質膜が有する MTS量は 特に限定されるものではないが、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に含有される総脂質 量の通常 2〜10% (モル比）、好ましくは 3〜8% (モル比）、さらに好ましくは 4〜6% ( モル比)である。ミトコンドリア膜融合性脂質膜に存在する MTS量を上記範囲とする ことにより、ミトコンドリア膜融合性脂質膜のミトコンドリア膜に対する結合能を向上させ ることができ、ミトコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との結合を契機として、ミ トコンドリア膜融合性脂質膜とミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することがで きる。
[0061] MTSはシグナルペプチドであり、多くのものが既に知られ、その種類は特に限定さ れるものではない。本発明においては、 MTSの機能が保持されている限り、いかなる ペプチドも使用することができ、公知の MTSをそのまま使用してもよいし、公知の M TSに変異（1又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）を加えたものを使 用してもよい。 MTSは通常 20〜70個のアミノ酸残基力もなり、 MTSには、ミトコンドリ ァ外膜、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア膜間腔、ミトコンドリアマトリックス等のミトコン ドリア内の様々な領域への移行能を有するものが含まれるが、本発明にお ヽては ヽ ずれの MTSを使用してもよ!、。
[0062] MTSとしては、例えば、下記（a)又は（b)に示すペプチドが挙げられる。
(a)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるペプチド
(b)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって、ミトコ ンドリアへの移行能を有するペプチド
[0063] 配列番号 1記載のアミノ酸配列力 なるペプチドは、ラット肝臓由来のスクシ-ル Co Aシンテターゼの MTSの C末端側の数残基が欠失したものである。
[0064] MTS (例えば配列番号 1〜31記載のアミノ酸配列）のアミノ酸配列にぉ 、て欠失、 置換、挿入又は付加されるアミノ酸の個数は、 MTSの機能が保持される限り特に限 定されるものではないが、通常 1〜3個、好ましくは 1〜2個である。
[0065] MTS (例えば配列番号 1〜31記載のアミノ酸配列）のアミノ酸配列にぉ 、て欠失、 置換、挿入又は付加されるアミノ酸の位置は、 MTSの機能が保持される限り特に限 定されるものではないが、 C末端側であること (すなわち、 N末端側のアミノ酸配列が 保存されること）が好ましい。
[0066] MTSを有するタンパク質がミトコンドリアに送達された後、 MTSはタンパク質力 切 断される力 厳密にどの領域が MTSとしての機能を果たすか明確になっていない場 合もある。この場合、タンパク質の切断部位よりも N末端側に位置する領域を含むぺ プチドを MTSとして使用することができる。 MTSとして使用するペプチド力 タンパク 質の切断部位よりも C末端側に位置する領域を含む場合、欠失、置換、挿入又は付 カロされるアミノ酸の位置は、タンパク質の切断部位よりも C末端側である（すなわち、タ ンパク質の切断部位よりも N末端側のアミノ酸配列は保存される）ことが好ま 、。
[0067] ミトコンドリア膜融合性脂質膜に対する MTSの結合態様は特に限定されるものでは なぐ例えば、 MTSは脂質膜構成成分に直接又はリンカ一を介して結合する。 MTS の ヽずれの部分が脂質膜構成成分と結合してもよ！ヽが、 C末端が脂質膜構成成分と 結合することが好ましい。これにより、 MTSの機能 (ミトコンドリアへの移行能）を効率 よく発揮させることができる。
[0068] MTSが直接又はリンカ一を介して結合する脂質膜構成成分は特に限定されるもの ではないが、脂質であることが好ましぐリン脂質であることがさらに好ましい。 MTSが 直接又はリンカ一を介して結合する脂質膜構成成分が脂質、特にリン脂質であると、 MTSを安定かつ簡便に脂質膜表面に提示することができるとともに、脂質膜表面に 提示される MTSの密度をコントロールしゃす!/、。
[0069] MTSが直接又はリンカ一を介して結合する脂質としては、例えば、炭素数 10〜20 の飽和又は不飽和の脂肪酸 (例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ノルミチン酸、ステア リン酸、ォレイン酸、リノール酸等)の残基 (ァシル基)を 1個又は 2個以上有する脂質 が挙げられ、具体的には、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類 、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール 類、カルジォリピン類、スフインゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セ ラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、デォキ シホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類やホスファチジン酸類、これらの誘導体 等が挙げられる。これらのうち、後述するように、アミノ基を有する脂質が好適に使用 され、アミノ基を有する脂質としては、例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノール ァミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールァミン、ジパルミトイルホスファチジルェ タノールァミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン、オタタデセニルォクタ デカノィルグリセ口ホスフォエタノールァミン、ジォレオイルグリセ口ホスフォエタノール ァミン一（N—ドデ力-ルァミン）、ジォレオイルグリセ口ホスフォエタノールァミン一（N キサノィルァミン）、ジパルミトイルグリセ口ホスフォエタノールァミン一（N—ドデカ -ルァミン）、ジパルミトイルグリセ口ホスフォエタノールァミン一（N—へキサノィルアミ ン）、ジステアロイルグリセ口ホスフォエタノールァミン一 [N—ァミノ（ポリエチレングリコ ール） 2000]、ステアロイル一ァラキドノィル一グリセ口 [ホスフォ一 L—セリン]、ォクタ デシルーァセチルーグリセ口ホスフォエタノールァミン、アルカェチジルエタノールァ ミン、ヒドロキシアルカェチジルエタノールァミン、サイクリックアルカェチジルエタノー ルァミン、カルダルカェチジルエタノールァミン等が挙げられる。なお、脂質には、塩 の形態のものも含まれる。塩の種類は特に限定されるものではないが、塩酸塩、硫酸 塩等の鉱酸塩;シユウ酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩;ナトリウム塩、カリウム塩等のァ ルカリ金属塩；アンモ-ゥム塩等の有機塩基等が挙げられる。
[0070] MTSと脂質膜構成成分とを直接結合させる場合、 MTSが有する官能基 (MTSに 人為的に導入された官能基を含む。）と、脂質膜構成成分が有する官能基 (脂質膜 構成成分に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させる。これにより MTSと 脂質膜構成成分とは共有結合を介して結合する。共有結合を形成できる官能基の 組み合わせとしては、例えば、アミノ基 Zカルボキシル基、水酸基 Zカルボキシル基 、マレイミド基 ZSH基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知の方法に従 つて行うことができる。
[0071] 例えば、 MTSと、アミノ基を有する脂質膜構成成分とは、 MTSが C末端に有する力 ルポキシル基と、脂質膜構成成分が有するァミノ基とを反応させてアミド結合を形成 させること〖こより、直接結合させることができる。この反応は、酸ハライド法、活性エス テルィ匕法等を利用して行うことができる。
[0072] 酸ハライド法では、不活性溶媒中で MTSをハロゲン化剤で処理して酸ノヽライドとし た後、得られた酸ハライドと脂質膜構成成分のァミノ基と反応させる。ハロゲン化剤と しては、例えば、チォユルク口リド、チォ -ルブロミドのようなチォ-ルハライド類、スル フリルクロリド、スルフリルブロミド等のスルフリルノヽライド類；三塩ィ匕燐、三臭化燐、三 沃化燐等の三ハロゲン化燐類;五塩化燐、五臭化燐、五沃化燐等の五ハロゲン化燐 類;ォキシ塩化燐、ォキシ臭化燐、ォキシ沃化燐等のォキシハロゲン化燐類等を使 用することができる。反応溶媒は、適宜検討して決めればよいが、例えば、ジェチル エーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメ チルァセトアミド等のアミド類；ジクロロメタン、クロ口ホルム等のハロゲンィ匕炭化水素 類；ァセトニトリル等の-トリル類；ギ酸ェチルエステル、酢酸ェチルエステル等のエス テル類、これらの混合溶媒等を使用することができる。反応温度は、適宜検討すれば よいが、通常 o°c〜溶媒の還流温度であり、好ましくは室温〜溶媒の還流温度である
。酸ハライドとリン脂質のァミノ基との反応では、必要に応じて、トリェチルァミン、ピリ ジン等の有機塩基を添加してもよ 、。
活性エステル化法では、溶媒中で MTSのカルボキシル基を活性エステル化剤と反 応させて活性エステルとした後、脂質膜構成成分のァミノ基と反応させる。活性エス テル化剤としては、例えば、 N ヒドロキシスクシイミド、 1—ヒドロキシベンゾトリァゾー ル、 N—ヒドロキシ 5 ノルボルネン 2, 3 ジカルボキシイミド等の N ヒドロキシ 化合物類； 1, 1，一ォキザリルジイミダゾール、 Ν,Ν' カルボ-ルジイミダゾール等の ジイミダゾール類； 2,2，—ジピリジルジサルファイド等のジサルファイド類； Ν,Ν'—ジ スクシンィミジルカーボネート等のコハク酸化合物類； Ν,Ν，一ビス（2 ォキソ 3— ォキサゾリジ-ル）ホスフィニッククロライド等のホスフィニッククロライド化合物類; Ν,Ν ，一ジスクシンィミジルォキザレート、 Ν,Ν'ージフタルイミドォキザレート、 Ν,Ν'ービ ス（ノルボルネニルスクシンィミジル）ォキザレート、 1,1，—ビス（ベンゾトリアゾリル）ォ キザレート、 1,1，一ビス（6 クロ口べンゾトリァゾリル）ォキザレート、 1, 1，一ビス（6— トリフルォロメチルベンゾトリァゾリル)ォキザレートのようなォキザレートイ匕合物類等を 使用することができる。反応溶媒は、適宜検討して決めればよいが、例えば、メチレン クロリド、クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素類；ジェチルエーテル、テトラヒドロフラ ン等のエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルァセトアミド等のアミド類；ベンゼン 、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;酢酸ェチルエステル等のエステル類、 これらの混合溶媒等を使用することができる。得られた活性エステルと脂質膜構成成 分のアミノ基との反応は、縮合剤、例えば、ァソジカルボン酸ジェチル—トリフエニル ホスフィン等のァゾジカルボン酸ジ低級アルキル トリフエ-ルホスフィン類； N ェ チル— 5—フエ-ルイソォキサゾリゥム— 3，—スルホナート等の N -低級アルキル - 5ーァリールイソォキサゾリゥム 3，一スルホナート類；ジェチルォキシジフオルメート 等のォキシジフオルメート類； Ν,Ν'—ジシクロへキシルカルボジイミド等の Ν,Ν'—ジ シクロアノレキノレカノレボジイミド類；ジ 2—ピリジノレジセレニド等のジヘテロァリーノレジ セレ -ド類；トリフエ-ルホスフィン等のトリァリールホスフィン類； ρ -トロベンゼンス ルホ -ルトリアゾリド等のァリールスルホ -ルトリアゾリド類； 2—クロル 1 メチルピリ ジニゥムョーダイド等の 2—ハロー 1 低級アルキルピリジ-ゥムハライド類；ジフエ- ルホスホリルアジド等のジァリールホスホリルアジド類； Ν,Ν，—カルボジイミダゾール 等のイミダゾール誘導体； 1ーヒドロキシベンゾトリアゾール等のベンゾトリアゾール誘 導体； Ν -ヒドロキシ 5 ノルボルネン 2, 3 ジカルボキシイミド等のジカルボキ シイミド誘導体； 1ーェチルー 3—（3 ジメチルァミノプロピル)カルボジイミド等の力 ルボジイミド誘導体； 1 プロパンホスホン酸環状無水物等のホスホン酸環状無水物 類等の存在下で行えばよい。反応温度は、適宜検討すればよいが、室温付近が好ま しい。
MTSと脂質膜構成成分とをリンカ一を介して結合させる場合、脂質膜構成成分が 有する官能基 (脂質膜構成成分に人為的に導入された官能基を含む。）と、リンカ一 が有する官能基 (リンカ一に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させるとと もに、 MTSが有する官能基 (MTSに人為的に導入された官能基を含む。）と、リンカ 一が有する官能基 (リンカ一に人為的に導入された官能基を含む。）とを反応させる。 これにより、脂質膜構成成分とリンカ一とが共有結合を介して結合するとともに、 ΜΤ Sとリンカ一とが共有結合を介して結合する。共有結合を形成できる官能基の組み合 わせとしては、例えば、アミノ基 Ζカルボキシル基、水酸基 Ζカルボキシル基、マレイ ミド基 ZSH基等が挙げられ、これらの官能基同士の反応は公知の方法に従って行う ことができる。 MTSと脂質膜構成成分とをリンカ一を介して結合させる場合、脂質膜 構成成分とリンカ一とを反応させた後、 MTSを反応させてもよいし、 MTSとリンカ一と を反応させた後、脂質膜構成成分を反応させてもよい。
[0075] リンカ一としては、例えば、アミノ酸残基、リンカ一ペプチド、多価 (例えば 2価）のク ロスリンカー試薬等が挙げられる。
[0076] リンカ一ペプチドを構成するアミノ酸残基の個数は特に限定されるものではないが、 通常 2〜10個、好ましくは 2〜8個である。リンカ一ペプチドのアミノ酸配列は任意の アミノ酸配列でよいが、リンカ一ペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は酸 性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好ましヽ。負電荷を有する酸性アミノ酸残 基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、膜透過性ドメインに含 まれるアルギニン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。
[0077] 多価のクロスリンカ一試薬は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基及び SH基との反応指向性を有する 2価のクロスリンカ一試薬が挙げられ、アミノ基及び S H基との反応指向性を有する 2価のクロスリンカ一試薬としては、例えば、以下の化合 物が挙げられる。
[0078] [化 1]
Figure imgf000021_0001
M8$
M.W. 314.2
SpacerArm 9.9 A
[0079] [化 2]
Figure imgf000021_0002
[0080] [化 3] \ /、、
Figure imgf000022_0001
SMCC
M.W. 334.33 Spacer Arm 11.6 A
[0081] [化 4]
Figure imgf000022_0002
SMPB
M.W. 356.32 Spacar Artn 14.5 A
Figure imgf000022_0003
Spacer Arm 6.6 A
[0083] [ィ匕 6]
Figure imgf000022_0004
SulfO-QMBS
M.W. 3B2.24
Spacer Arm 10.2 A
[0084] [化 7]
Figure imgf000023_0001
Sulfo-LC-SPDP
M. . 527.56
Figure imgf000023_0002
SulfQ- BS
M.W. 416.24
Spacer Arm 9.9 k
[0086] [化 9]
NaOjS
Figure imgf000023_0003
Sulfo-SMCC
M.W. 438.37
Spa cer Arm 11.6 A
[0087] [化 10]
Figure imgf000023_0004
Sulfo-SMPB
M.W. 458.36
Spacer Arm 14.5 Λ
[0088] 多価のクロスリンカ一試薬は、例えば、 MTSに含まれる官能基、及び脂質膜構成 成分が有する官能基と反応することにより、 MTSと脂質膜構成成分とを結合させるこ とができる。こうして、次式（1)： M— X— L [式中、 Mは MTSの残基を表し、 Xはクロス リンカ一試薬の残基を表し、 Lは脂質膜構成成分の残基を表す。 ]で表される、 MTS と脂質膜構成成分との結合体が形成される。
[0089] また、多価のクロスリンカ一試薬は、例えば、リンカ一ペプチドに含まれる官能基、 及び脂質膜構成成分が有する官能基と反応することにより、リンカ一ペプチドと脂質 膜構成成分とを結合させることができる。そして、脂質膜構成成分に結合したリンカ一 ペプチドが有するカルボキシル基又はアミノ基と、 MTSが有するアミノ基又はカルボ キシル基とをアミド結合させることにより、 MTSと脂質膜構成成分とを結合させること ができる。こうして、次式（2)： M -NH-CO-Y—X— L又は次式（3)： M—CO -NH-Y—X— L [式中、 Mは MTSの残基を表し、 Xはクロスリンカ一試薬の残 基を表し、 Yはリンカ一ペプチドの残基を表し、 Lは脂質膜構成成分の残基を表す 。 ]で表される、 MTSと脂質膜構成成分との結合体が形成される。なお、式 (2)及び（ 3)は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、式（2)における「一 NH — CO 」は、 MTSが有するァミノ基とリンカ一ペプチドが有するカルボキシル基との アミド結合であり、式（3)における「一 CO— NH 」は、 MTSが有するカルボキシル 基とリンカ一ペプチドが有するァミノ基とのアミド結合である。
[0090] アミノ基及び SH基との反応指向性を有する 2価のクロスリンカ一試薬は、例えば、 MTSに含まれるシスティン残基 (好ましくは MTSの C末端に位置するシスティン残 基)が有する SH基、及び脂質膜構成成分が有するァミノ基と反応することにより、 M TSと脂質膜構成成分とを結合させることができる。こうして、次式 (4)： M -S -X
2 2
NH-L [式中、 Mは MTSの残基を表し、 Xはクロスリンカ一試薬の残基を表し、 L
2 2 2 2 は脂質膜構成成分の残基を表す。 ]で表される、 MTSと脂質膜構成成分との結合体 が形成される。なお、式 (4)は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、 「一 S— X—」は、 MTSが有する SH基とクロスリンカ一試薬が有する官能基 (例えば
2
マレイミド基）との反応により形成され、「― X— NH 」は、クロスリンカ
2 一試薬が有す る官能基 (例えば COOR[Rは脱離基を表す。 ])と脂質膜構成成分が有するァミノ 基との反応により形成される。
[0091] また、アミノ基及び SH基との反応指向性を有する 2価のクロスリンカ一試薬は、例え ば、リンカ一ペプチドに含まれるシスティン残基が有する SH基、及び脂質膜構成成 分が有するァミノ基と反応することにより、リンカ一ペプチドと脂質膜構成成分とを結 合させることができる。そして、脂質膜構成成分に結合したリンカ一ペプチドが有する カルボキシル基又はアミノ基と、 MTSが有するアミノ基又はカルボキシル基とをアミド 結合させることにより、 MTSと脂質膜構成成分とを結合させることができる。こうして、 次式（5)： M -NH-CO-Y -S-X -NH-L又は次式（6)： M—CO— NH
3 3 3 3 3
-Y -S -X -NH-L [式中、 Mは MTSの残基を表し、 Xはクロスリンカ一試薬
3 3 3 3 3
の残基を表し、 Yはリンカ
3 一ペプチドの残基を表し、 Lは脂質膜構成成分の残基を
3
表す。 ]で表される、 MTSと脂質膜構成成分との結合体が形成される。なお、式 (5) 及び (6)は、結合体における結合様式を明確に示したものであり、式（5)における「 —NH— CO 」は、 MTSが有するァミノ基とリンカ一ペプチドが有するカルボキシル 基とのアミド結合であり、式（6)における「一 CO— NH 」は、 MTSが有するカルボ キシル基とリンカ一ペプチドが有するァミノ基とのアミド結合であり、式（5)及び (6)に おける「一 S— X—」は、 MTSが有する SH基とクロスリンカ
3 一試薬が有する官能基（ 例えばマレイミド基）との反応により形成され、「― X— NH―」は、クロスリンカ
3 一試薬 が有する官能基 (例えば COOR[Rは脱離基を表す。 ])と脂質膜構成成分が有す るァミノ基との反応により形成される。
[0092] なお、上記反応において、保護基を導入することにより目的とする反応を効率的に 行えることがある。保護基の導入は、例えば、「プロテクティブ グループス イン ォ ーガニック シンセシス」 (P. G. M. Wuts and T. Green,第 3版 1999年 Wiley, Joh n & Sons)等を参照すればよい。
[0093] 本発明の脂質膜構造体には、ミトコンドリア内に送達しょうとする目的物質が保持さ れていることが好ましい。本発明の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の内部（ 例えば、脂質膜構造体の内部に形成された空隙)、脂質膜の表面、脂質膜中、脂質 膜層中、脂質膜層表面等に目的物質を保持することができる。脂質膜構造体が例え ばリボソーム等の微粒子である場合、微粒子内部に目的物質を封入することができる
[0094] 目的物質の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、薬物、核酸、ペプチド、タ ンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療、予防等の目的に応じて 適宜選択することができる。目的物質が疾病の診断、治療、予防等を目的とした物質 である場合、目的物質を保持した脂質膜構造体は、医薬組成物の構成成分として使 用することができる。なお、「核酸」には、 DNA又は RNAにカロえ、これらの類似体又 は誘導体 (例えば、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロチォエート DNA等）が含まれる。 また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれ であってもよい。
[0095] 目的物質が遺伝子である場合、細胞内への遺伝子導入効率を向上させる点から、 脂質膜構造体は、遺伝子導入機能を有する化合物を有することが好ましい。遺伝子 導入機能を有する化合物としては、例えば、 Ο,Ο'-Ν-ジドデカノィル -N- -トリメチ ルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンク口リド、 Ο,Ο'- Ν-ジテトラデカノィル- Ν-( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンク口リド、 Ο,Ο'- N-ジへキサデ カノィル- N- ( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンク口リド、 0,Cr-N- ジォクタデセノィル- N-( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンクロリド 、 Ο,Ο', 0"-トリデカノィル- Ν-( ω -トリメチルアンモ -ォデカノィル)ァミノメタンブロミド 、ノル [ α -トリメチルアンモ-オアセチル]-ジドデシル- D-グルタメート、ジメチルジォ クタデシルアンモ-ゥムブロミド、 2,3-ジォレイルォキシ- Ν-[2- (スペルミンカルボキサ ミド)ェチル]- Ν,Ν-ジメチル- 1-プロパンアンモ-ゥムトリフルォロアセテート、 1,2-ジミ リスチルォキシプロピル- 3-ジメチルーヒドロキシェチルアンモ-ゥムブロミド、 3- β -[η -(Ν',Ν'-ジメチルアミノエタン)力ルバモイル]コレステロール等が挙げられる。これらの 遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の内部 (例えば、脂質膜構造体 の内部に形成された空隙)、脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜層中、脂質膜層表面に 存在 (結合)させることができる。
[0096] 目的物質は、脂質膜構造体 (特に脂質膜構造体の内部）に、目的物質の凝集体と して保持されていることが好ましい。これにより、目的物質を効率よくミトコンドリア内に 送達することができる。
[0097] 目的物質の凝集体は、目的物質のみ力も構成されて 、てもよ 、し、目的物質以外 の物質 (例えば、目的物質を保持する担体)を含んで!/、てもよ!、。 [0098] 目的物質が正に帯電している場合、例えば、 目的物質とァ-オン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負に帯電している場合、例えば、 目的物質とカチオン性物質とを静電 的に結合させて複合体ィ匕することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる 。 目的物質が負及び正のいずれにも帯電していない場合、 目的物質と所定の担体と を適当な様式 (例えば、物理的吸着、疎水結合、化学結合等)で結合させて複合体 ィ匕することにより、 目的物質の凝集体を調製することができる。複合体化の際、 目的 物質とカチオン性物質又はァニオン性物質との混合比率を調整することにより、全体 として正又は負に帯電する目的物質の凝集体を調製することができる。
[0099] 目的物質が核酸である場合、核酸とカチオン性物質と静電的に結合させて複合体 化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチ オン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸 の凝集体を調製することができる。
[0100] 目的物質の凝集体を調製する際に使用できるカチオン性物質は、分子中にカチォ ン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。カチオン性物質として は、例えば、カチオン性脂質（例えば、 Lipofectamine (Invitrogen社製））；カチオン性 基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の 塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体 (例えばステアリ ル化誘導体）；ポリエチレンィミン、ポリ（ァリルァミン）、ポリ（ジァリルジメチルアンモ- ゥムクロライド）、ダルコサミン等のポリカチオン性ポリマー；プロタミン又はその誘導体 (例えば硫酸プロタミン）；キトサン等が挙げられる力 これらのうち特にステアリルィ匕ポ リアルギニンが好まし 、。ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は通常 4〜2 0個であり、好ましくは 6〜12個、さらに好ましくは 7〜10個である。カチオン性物質が 有するカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、好ましくは 2個以上であ る。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなぐ例えば、ァミノ 基;メチルァミノ基、ェチルァミノ基等のモノアルキルアミノ基;ジメチルァミノ基、ジェ チルァミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グァ-ジノ基等が挙げられる。
[0101] 目的物質の凝集体を調製する際に使用できるァニオン性物質は、分子中にァニォ ン性基を有する物質である限り特に限定されるものではない。ァ-オン性物質として は、例えば、ァ-オン性脂質;ァ-オン性基を有する高分子;ポリアスパラギン酸等の 酸性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；キサンタンガム、 カルボキシビ二ルポリマー、カルボキシメチルセルロースポリスチレンスルホン酸塩、 ポリサッカライド、カラギーナン等のポリア-オン性ポリマー等を使用することができる 。ァ-オン性物質が有するァ-オン性基の数は特に限定されるものではないが、好ま しくは 2個以上である。ァ-オン性基は負に荷電し得る限り特に限定されるものでは なぐ例えば、末端カルボキシル基を有する官能基 (例えば、コハク酸残基、マロン酸 残基等)、リン酸基、硫酸基等が挙げられる。
[0102] 本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されるものではなぐ例えば、乾燥した 混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態又はこれを乾燥若しくは凍結した 形態等が挙げられ、各形態の脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、ェ タノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結'融解法等の 公知の方法を用いて製造することができる。
[0103] 以下、各形態の脂質膜構造体の製造方法を説明するが、本発明の脂質膜構造体 の形態及びその製造方法はこれらに限定されるものではない。
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全 てをー且クロ口ホルム等の有機溶媒に溶解させた後、エバポレータによる減圧乾固 又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
[0104] 水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体は、乾燥した混合物の形態の脂質膜構 造体を水系溶媒に添加した後、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴 射乳化機等により乳化することによって製造することができる。また、水系溶媒に分散 した形態の脂質膜構造体は、リボソームを製造する方法としてよく知られて 、る方法、 例えば逆相蒸発法等によって製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御し たい場合には、孔径のそろったメンブランフィルタ一等を使用して、高圧下でイクスト ルージョン (押し出し濾過）を行えばょ 、。
[0105] 水系溶媒 (分散媒)の組成は、特に限定されるべきものではなぐ例えば、リン酸緩 衝液、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝ィ匕生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培 養用の培地等が挙げられる。これら水系溶媒 (分散媒)は脂質膜構造体を安定に分 散させることができるが、脂質膜構造体をさらに安定して分散させるために、単糖類（ 例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、 キシロース等）、二糖類 (例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトー ス等）、三糖類 (例えば、ラフイノース、メレジノース等）、多糖類 (例えば、シクロデキス トリン等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マン-ト ール、マルチトール等）等の糖又はその水溶液;グリセリン、ジグリセリン、ポリダリセリ ン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコーノレ、ジエチレン グリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコーノレモノ アルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、 1,3-ブチレングリコ ール等の多価アルコール又はその水溶液等を加えてもよい。水系溶媒 (分散媒）に 分散した形態の脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、物理的安定性の面（ 例えば、凝集等を防止する面)から、水系溶媒 (分散媒）中の電解質を極力なくすこと が好ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒 (分散媒)の pHを弱酸 性から中性付近 (pH3. 0〜8. 0)に設定すること、又は窒素パブリングにより溶存酸 素を除去することが好まし 、。
[0106] 水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥又は凍結させた形態の脂質膜構造体は 、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法により 乾燥又は凍結することによって製造することができる。水系溶媒に分散した脂質膜構 造体を一旦製造した後、これを乾燥する場合、脂質膜構造体の長期保存が可能とな る他、乾燥した脂質膜構造体に目的物質含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混 合物が水和されるため、目的物質を効率よく脂質膜構造体に保持させることが可能と なる等の利点がある。
[0107] 凍結乾燥又は噴霧乾燥する場合、水系溶媒 (分散媒)に、例えば、単糖類 (例えば 、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロ ース等）、二糖類 (例えば、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等） 、三糖類 (例えば、ラフイノース、メレジノース等）、多糖類 (例えば、シクロデキストリン 等）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マン-トール 、マルチトール等)等の糖又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を 安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合、水系溶媒 (分散媒)に、例 えば、上記糖又はその水溶液;グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレンダリ コーノレ、ポリプロピレングリコール、エチレングリコーノレ、ジエチレングリコール、トリエ チレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコーノレモノァノレキノレエーテノレ
、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、 1,3-ブチレングリコール等の多価アル コール又はその水溶液を加えておくことにより、脂質膜構造体を安定に長期間保存 することができる。水系溶媒 (分散媒）には、糖と多価アルコールとを組み合わせてカロ えてもよい。脂質膜構造体が分散した水系溶媒 (分散媒)における糖又は多価アルコ ールの濃度は特に限定されないが、糖の濃度は 2〜20% (W/V)であることが好まし く、 5〜10% (W/V)であることがさらに好ましい。また、多価アルコールの濃度は、 1 〜5% (W/V)であることが好ましぐ 2〜2. 5% (W/V)であることがさらに好ましい。 水系溶媒 (分散媒)として緩衝液を用いる場合、緩衝剤の濃度は 5〜50mMであるこ と力 子ましく、 10〜20mMであることがさらに好ましい。水系溶媒 (分散媒）における 脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体に含有される脂質総量 の濃度に換算して 0. lmM〜500mMであることが好ましぐ ImM〜： LOOmMである ことがさらに好ましい。
[0108] 抗体を保持させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体を添加し、 抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製造することができる。また、抗体を保持 させた脂質膜構造体は、脂質膜構造体を製造した後、抗体及び抗体中のメルカプト 基と反応し得る脂質誘導体を添加し、抗体を脂質膜の表面に結合させることにより製 造することができる。
[0109] 目的物質を保持する脂質膜構造体を含有する医薬組成物の形態は特に限定され るものではなぐ例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散した形態 又はこれを乾燥若しくは凍結した形態が挙げられ、各形態の医薬糸且成物は、上記し た各形態の脂質膜構造体と同様に製造することができる。
[0110] 乾燥した混合物の形態の医薬組成物は、例えば、脂質膜構造体の構成成分と目 的物質とを一旦クロ口ホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをェ バポレータによる減圧乾固又は噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造 することができる。
[0111] 目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物の製 造方法としては、以下のように複数の方法が公知となっており、脂質膜構造体におけ る目的物質の保持様式、混合物の性状等に応じて、製造方法を適宜選択することが できる。
[0112] 〔製造方法 1〕
製造方法 1は、脂質膜構造体の構成成分と目的物質とを一旦クロ口ホルム等の有 機溶媒で溶解させて混合物を得た後、これをエバポレータによる減圧乾固又は噴霧 乾燥機による噴霧乾燥に付することにより、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥 混合物を製造し、次いで、これに水系溶媒を添加した後、ホモジナイザー等の乳化 機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行うことにより、目的物質を保持 する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である 。脂質膜構造体の大きさ (粒子径)を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフ ィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行えばよい。製造 方法 1は、脂質膜構造体及び目的物質を含む乾燥混合物を製造するために、脂質 膜構造体の構成成分及び目的物質を有機溶媒に溶解する必要があるが、脂質膜構 造体の構成成分と目的物質との相互作用を最大限に利用することができる利点があ る。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、目的物質は多重層の内 部にまで入り込むことが可能であり、目的物質の脂質膜構造体への保持率を向上さ せることができる利点がある。
[0113] 〔製造方法 2〕
製造方法 2は、脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を 留去した乾燥物に目的物質を含む水系溶媒を添加して乳化を行うことにより、目的 物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する 方法である。脂質膜構造体の大きさ (粒子径)を制御する場合には、孔径のそろった メンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン (押し出し濾過）を行え ばよい。製造方法 2は、有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る目 的物質に適用することができる。製造方法 2は、脂質膜構造体がリボソームの場合に 内水相部分にも目的物質を保持させることができる利点がある。
[0114] 〔製造方法 3〕
製造方法 3は、水系溶媒に分散したリボソーム、エマルシヨン、ミセル、層状構造物 等の脂質膜構造体に、さらに目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的 物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する 方法である。製造方法 3は、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法 3 は、既に製造された脂質膜構造体に外部から目的物質を添加する方法であることか ら、目的物質が高分子の場合、目的物質が脂質膜構造体の内部に入り込めず、脂 質膜構造体の表面に存在 (結合)した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体 力 Sリボソームである場合、製造方法 3によって、目的物質がリボソーム粒子同士の間 に挟まったサンドイッチ構造 (一般的には「複合体」又は「コンプレックス」と呼ばれる） を形成されることが知られている。製造方法 3は、脂質膜構造体単独の水系分散液を あら力じめ製造するため、乳化時における目的物質の分解等を考慮する必要がなく 、大きさ (粒子径)の制御を行い易い。したがって、製造方法 1及び製造方法 2に比べ て、目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を 容易に製造することができる。
[0115] 〔製造方法 4〕
製造方法 4は、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥することにより得られた乾 燥物に、目的物質を含む水系溶媒を添加することにより、目的物質を保持する脂質 膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製造する方法である。製造方 法 4は、製造方法 3と同様に、水溶性の目的物質に適用することができる。製造方法 4と製造方法 3との相違点は、脂質膜構造体と目的物質との存在様式にあり、製造方 法 4では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した後、これを乾燥させた 乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状 態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、上述したように 水系溶媒に糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、あるいは乳糖又 はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質を含む水系溶媒 を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに 水和し始め、脂質膜構造体が再構築され、このとき、目的物質が脂質膜構造体内部 に保持された形態の脂質膜構造体が製造される。
[0116] 製造方法 4では、脂質膜構造体単独の水系分散液をあらかじめ製造するため、乳 化時の目的物質の分解等を考慮する必要がなぐ大きさ (粒子径)の制御も行い易い 。したがって、製造方法 1及び製造方法 2に比べて、目的物質を保持する脂質膜構 造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を容易に製造することができる。また 、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組成物)としての保存安定性を 保証し易ぐ乾燥製剤を目的物質の水溶液で再水和しても大きさ (粒子径)を元に戻 せることや、高分子の目的物質であっても、脂質膜構造体内部に目的物質を保持さ せ易いこと等の利点がある。したがって、目的物質が高分子の場合、製造方法 3では 、目的物質が脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した 存在様式をとる可能性があるが、製造方法 4ではこの点で大きく異なる。
[0117] 目的物質を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態の医薬組成物を製 造するための他の方法としては、リボソームを製造する方法としてよく知られた方法、 例えば逆相蒸発法等を採用することができる。脂質膜構造体の大きさ (粒子径)を制 御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクスト ルージョン (押し出し濾過)を行えばよ ヽ。目的物質を保持する脂質膜構造体が水系 溶媒に分散した分散液を乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等が挙げら れ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、好ましくはショ糖又はその水溶液、 あるいは乳糖又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。目的物質 を保持する脂質膜構造体が水系溶媒に分散した分散液を凍結させる方法としては、 通常の凍結方法が挙げられ、水系溶媒としては、上記糖又はその水溶液、あるいは 上記多価アルコール又はその水溶液を添加した溶媒を使用することが好ましい。
[0118] 目的物質の凝集体が全体として正に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質と してァ-オン性脂質 (酸性脂質)を使用すれば、目的物質の凝集体が保持され脂質 膜を効率よく製造することができ、目的物質の凝集体が全体として負に帯電している 場合、脂質膜を構成する脂質としてカチオン性脂質 (塩基性脂質)を使用すれば、目 的物質の凝集体が保持された脂質膜構造体を効率よく製造することができる。ァ-ォ ン性脂質 (酸性脂質）としては、例えば、カルジォリピン、ジァシルホスファチジルセリ ン、ジァシルホスファチジン酸、 N—スクシ-ルホスファチジルエタノールァミン（N— スクシ-ル PE)、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセ ロール、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられ、力 チオン性脂質 (塩基性脂質)としては、例えば、ジォクタデシルジメチルアンモ -ゥム クロリド（dioctadecyldimethylammonium chloride： DODAC)、 N- (2,3-ジォレイルォキ シ)プロピル- Ν,Ν,Ν-トリメチルアンモ -ゥム（N- (2,3- dioleyloxy)propyl- Ν,Ν,Ν- trimeth ylammonium： DuTM/ノ、ンドアンル ンモ-ゥムブロ ト (diaodecylammonium brom ide : DDAB)、 1,2-ジォレオイルォキシ -3-トリメチルアンモ-ォプロパン（1,2- dioleoyl oxy-3-trimethylammonio propane： DOTAP)、 3 β - Ν- (Ν',Ν',-ジメチル-アミノエタン )—カノレノ モノレコレステロ一ノレ (3 β— Ν— (Ν',Ν',— dimethy卜 aminoethane)— carbamol chole sterol： DC Choi)、 1 ,2-ジミリストイルォキシプロピル- 3-ジメチルヒドロォキシェチ ノレアンモニゥム ( 1 , 2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium： DM RIE)、 2,3-ジォレイルォキシ- N-[2(スペルミネカルボキシアミド)ェチル]- Ν,Ν-ジメチ ノレ- 1-プロパナミゥムトリフノレオ口アセテート（2,3- dioleyloxy- Ν- [2 (sperminecarboxami do) ethyl]— Ν,Ν— dimethv卜 1 -propanaminum trifluoroacetate : DOSPA)、 0,0し1^—ンド デカノィル- N- ( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンク口リド、 0,0'- N-ジテトラデカノィル- N-( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノールァミンクロリ ド、 Ο,Ο'-Ν-ジへキサデカノィル- N-( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジエタノール ァミンク口リド、 Ο,Ο'- N-ジォクタデセノィル- N-( a -トリメチルアンモ-オアセチル)-ジ エタノールァミンク口リド、 0,0', 0"-トリデカノィル- Ν-( ω -トリメチルアンモ -ォデカノ ィル)ァミノメタンブロミド、ノル [ (X -トリメチルアンモ-オアセチル] -ジドデシル- D-グル タメート、ジメチルジォクタデシルアンモ-ゥムブロミド等が挙げられる。
本発明の脂質膜構造体において、ミトコンドリア膜融合性脂質膜が膜透過性ぺプ チドを介してミトコンドリア膜と結合すると、これを契機として、ミトコンドリア膜融合性脂 質膜とミトコンドリア膜との膜融合が誘起され、ミトコンドリア膜融合性脂質膜に保持さ れた目的物質は、ミトコンドリア内に放出される。この結果、目的物質はミトコンドリア 内に送達される。したがって、本発明の脂質膜構造体は、目的物質のミトコンドリア内 送達用ベクターとして使用することができる。
[0120] 本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアは、細胞力も分離されたミトコンド リアであってもよいし、細胞内に存在するミトコンドリアであってもよい。本発明の脂質 膜構造体が標的とするミトコンドリアが由来する生物種は特に限定されるものではなく 、例えば、動物、植物、微生物等が挙げられるが、動物が好ましぐ哺乳動物がさらに 好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ、ブタ、ゥサ ギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。本発明の脂質膜構造体が 標的とするミトコンドリアを含有する細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例え ば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
[0121] 本発明の脂質膜構造体が標的とするミトコンドリアが細胞内に存在するミトコンドリア である場合、本発明の脂質膜構造体は、ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移 行した脂質膜構造体の最外層に位置するように構成されることが好ま 、。これによ り、ミトコンドリア膜融合性脂質膜は、細胞内に存在するミトコンドリアと効率よく膜融合 することができる。
[0122] ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置 するような構成を有する脂質膜構造体の一実施形態であるリボソームとしては、図 1 ( a)に示すように、脂質膜 2aと、脂質膜 2aの内側に封入された目的物質 3とを備えた 1 枚膜リボソーム laであって、脂質膜 2aがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜 2aの表面に存在する膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有 する（好ましくは膜透過性ペプチドがポリアルギニン力もなる） 1枚膜リボソーム laが挙 げられる。 1枚膜リボソーム laは、脂質膜 2aの表面に存在する膜透過性ペプチドを 介して、原形を保ったまま (インタク Hintact)な状態で)、細胞外力も細胞内に移行す ることができる。細胞内に移行した後、脂質膜 2aが、その表面に有する膜透過性べ プチドを介してミトコンドリア膜と結合すると、これを契機として、脂質膜 2aとミトコンドリ ァの外膜との膜融合が誘起され、脂質膜 2aの内側に封入された目的物質 3は、ミトコ ンドリア内に放出される。
[0123] 1枚膜リボソーム laにお 、て、脂質膜 2aが MTSを表面に有することが好ま 、。こ れにより、脂質膜 2aのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂質 膜 2aとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜 2aとミトコンドリア膜との膜融合を 効率よく誘起することができる。また、脂質膜 2aが MTSを表面に有することにより、細 胞内に移行したリボソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができる。
[0124] ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置 するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリボソームとしては、図 1 (b)に示すように、脂質膜 21bと、脂質膜 21bの外側に位置する脂質膜 22bと、脂 質膜 21bの内側に封入された目的物質 3とを備えた 2枚膜リボソーム lbであって、脂 質膜 21b及び 22bがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜 22bの表面に存在 する膜透過性ペプチドが膜透過性ドメインとしてポリアルギニンを有する (好ましくは 膜透過性ペプチドがポリアルギニン力もなる） 2枚膜リボソーム lbが挙げられる。 2枚 膜リボソーム lbは、脂質膜 22bの表面に存在する膜透過性ペプチドを介して、原形 を保ったまま (インタタト (intact)な状態で)、細胞外力 細胞内に移行することができ る。細胞内に移行した後、脂質膜 22bが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介 してミトコンドリアの外膜と結合すると、これを契機として、脂質膜 22bとミトコンドリアの 外膜との膜融合が誘起され、リボソームはミトコンドリアの外膜を通過する。ミトコンドリ ァの外膜を通過したリボソームにおいて、脂質膜 22bはミトコンドリアの外膜との膜融 合により消失しているが、脂質膜 21bは保持されている。ミトコンドリアの外膜を通過し た後、脂質膜 21bが、その表面に有する膜透過性ペプチドを介してミトコンドリアの内 膜と結合すると、これを契機として、脂質膜 21bとミトコンドリアの内膜との膜融合が誘 起され、脂質膜 21bの内側に封入された目的物質 3は、ミトコンドリア内に放出される
[0125] 2枚膜リボソーム lbにおいて、脂質膜 21b及び 22bが MTSを表面に有することが 好ましい。これにより、脂質膜 21b及び 22bのミトコンドリア膜に対する結合能を向上 させることができ、脂質膜 21b及び 22bとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質 膜 21b及び 22bとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、 脂質膜 22bが MTSを表面に有することにより、細胞内に移行したリボソームをミトコン ドリアへ選択的に移行させることができる。 [0126] ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置 するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリボソームとしては、図 1 (c)に示すように、脂質膜 21cと、脂質膜 21cの外側に位置する脂質膜 22cと、脂質 膜 21cの内側に封入された目的物質 3とを備えた 2枚膜リボソーム であって、脂質 膜 21cがミトコンドリア膜融合性脂質膜であり、脂質膜 22cが膜融合性脂質を含有す る 2枚膜リボソーム lcが挙げられる。脂質膜 22cに含有される膜融合性脂質としては 、例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン等の中性脂質；コレステロ一 ルコハク酸、カルジォリピン等のァ-オン性脂質 (酸性脂質)が挙げられ、脂質膜 22c に含有される膜融合性脂質量は、脂質膜 22cに含有される総脂質量の通常 50% ( モル比）以上、好ましくは 60% (モル比）以上、さらに好ましくは 70% (モル比）以上で ある。なお、膜融合性脂質の含有量の上限値は 100%である。
[0127] 2枚膜リボソーム lcは、エンドサイト一シスを介して、細胞外から細胞内に移行する ことができる。エンドサイト一シスを介して細胞内に移行した 2枚膜リボソーム lcは、ェ ンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と脂質膜 22cとが膜融合することにより 、エンドソーム力も脱出することができる。エンドソーム力も脱出したリボソームにおい て、脂質膜 22cはエンドソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21cは保 持されている。エンドノームから脱出した後、脂質膜 21cの内側に封入された目的物 質 3は、 1枚膜リボソーム laの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。
[0128] また、 2枚膜リボソーム lcは、脂質膜 22cと細胞膜との膜融合を介して、細胞外から 細胞内に移行することができる。細胞内に移行したリボソームにおいて、脂質膜 22c は細胞膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21cは保持されている。細胞内に 移行した後、脂質膜 21cの内側に封入された目的物質 3は、 1枚膜リボソーム laの場 合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。
[0129] 2枚膜リボソーム lcにおいて、脂質膜 22cに含有されるァ-オン性脂質量が、脂質 膜 22cに含有される膜融合性脂質量の 15% (モル比）以上、好ましくは 20% (モル比 )以上である場合、エンドソーム内が酸性 (pH5. 5〜6. 5)に変化することにより、又 は酸性条件下 (pH5. 5〜6. 5)で 2枚膜リボソーム lcと細胞とを接触させることにより 、脂質膜 22cとエンドソーム膜又は細胞膜とは効率よく膜融合することができる。 [0130] 2枚膜リボソーム lcにおいて、脂質膜 21cが MTSを表面に有することが好ましい。 これにより、脂質膜 21cのミトコンドリア膜に対する結合能を向上させることができ、脂 質膜 21cとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質膜 21cとミトコンドリア膜との膜 融合を効率よく誘起することができる。また、脂質膜 21cが MTSを表面に有すること により、細胞内に移行したリボソームをミトコンドリアへ選択的に移行させることができ る。
[0131] ミトコンドリア膜融合性脂質膜が細胞内に移行した脂質膜構造体の最外層に位置 するような構成を有する脂質膜構造体の別の実施形態であるリボソームとしては、図 1 (d)に示すように、脂質膜 21dと、脂質膜 21dの外側に位置する脂質膜 22dと、脂 質膜 22dの外側に位置する脂質膜 23dと、脂質膜 21dの内側に封入された目的物 質 3とを備えた 3枚膜リボソーム Idであって、脂質膜 21d及び 22dがミトコンドリア膜融 合性脂質膜であり、脂質膜 23dが膜融合性脂質を含有する 3枚膜リボソーム Idが挙 げられる。脂質膜 23dに含有される膜融合性脂質の種類及び量は、脂質膜 22cと同 様である。
[0132] 3枚膜リボソーム Idは、エンドサイト一シスを介して、細胞外から細胞内に移行する ことができる。エンドサイト一シスを介して細胞内に移行した 3枚膜リボソーム Idは、ェ ンドソーム内に取り込まれるが、エンドソーム膜と脂質膜 23dとが膜融合することにより 、エンドソーム力も脱出することができる。エンドソーム力も脱出したリボソームにおい て、脂質膜 23dはエンドソーム膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21d及び 22dは保持されている。エンドノームから脱出した後、脂質膜 21dの内側に封入され た目的物質 3は、 2枚膜リボソーム lbの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出され る。
[0133] また、 3枚膜リボソーム Idは、脂質膜 23dと細胞膜との膜融合を介して、細胞外から 細胞内に移行することができる。細胞内に移行したリボソームにおいて、脂質膜 23d は細胞膜との膜融合により消失しているが、脂質膜 21d及び 22dは保持されている。 細胞内に移行した後、脂質膜 21dの内側に封入された目的物質 3は、 2枚膜リポソ一 ム lbの場合と同様にして、ミトコンドリア内に放出される。
[0134] 3枚膜リボソーム Idにおいて、脂質膜 21d及び 22dが MTSを表面に有することが 好ましい。これにより、脂質膜 21d及び 22dのミトコンドリア膜に対する結合能を向上 させることができ、脂質膜 21d及び 22dとミトコンドリア膜との結合を契機として、脂質 膜 21d及び 22dとミトコンドリア膜との膜融合を効率よく誘起することができる。また、 脂質膜 22dが MTSを表面に有することにより、細胞内に移行したリボソームをミトコン ドリアへ選択的に移行させることができる。
[0135] 本発明の脂質膜構造体は、 in vivo及び in vitroの ヽずれにお ヽても使用することも できる。本発明の脂質膜構造体を in vivoにおいて使用する場合、投与経路としては 、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与 回数は、本発明の脂質膜構造体に保持された目的物質の種類や量等に応じて適宜 調節することができる。
実施例
[0136] 〔実施例 1〕ミトコンドリア膜に対する結合活性及び融合活性を有するリボソームのスク リーニング
(l) EPC系リボソームの調製
卵黄ホスファチジルコリン（egg yolk phosphatidyl choline： EPC)と表 l(i)〜(viii)から 選択される 1種の脂質とを 9： 2 (モル比）の割合で有機溶媒 (クロ口ホルム）に溶解した 後、ガラス試験管に加え、有機溶媒を除去してガラス試験管底に薄膜を形成させた。 そこに、ミトコンドリア単離液（mitochondria isolated buffer,以下「MIB」という。 ) (250 mMショ糖， 2mM Tris— Cl,溶媒は水）を加え、脂質膜を水和させた後、超音波処 理を行い、適当な大きさ（200〜300nm)の EPC系リボソームを調製した (総脂質濃 度 0. 5〜0. 55mM)。なお、調製した EPC系リボソームはいずれも 1枚膜リボソーム である。
[0137] (2) DOPE系リボソームの調製
ジォレオイノレホスファチジノレエタノーノレアミン (dioleoyl phosphatidyl ethanolamine： DOPE)と表 l(i)〜(viii)力 選択される 1種の脂質とを 9： 2 (モル比）又は 1： 1 (モル比 )の割合で有機溶媒 (クロ口ホルム）に溶解した後、上記（1)と同様にして、適当な大 きさ（200〜300nm)の DOPE系リボソームを調製した（総脂質濃度 0. 5〜0. 55m M)。なお、調製した DOPE系リボソームはいずれも 1枚膜リボソームである。 [0138] [表 1] 中性脂質
(i) コレステロール （cholesterol:Chol)
(ii) スフインゴミエリン （sphingomyelin:SM)
負電荷脂質
(iii) コレステリルへミスクシネート （cholestelyl hemisuccinate:CHEMS)
(iv) ホスファチジン酸 (phosphatidic acid:PA)
(v) ホスファチジルセリン （phosphatidyl serine ： PS)
(vi) ホスファチジルグリセロール （phosphatidyl glycerol： PG)
(vii) ホスファチジルイノシトール （phosphatidyl inos i tol： PI)
(vi i i) カルジォリピン (cardiolipin:CL)
[0139] なお、 EPC系リボソーム又は DOPE系リボソームの調製の際、結合活性測定用リポ ノームのリボソーム膜には、 1モル0 /oNBD (4- nitrobenzo- 2- oxa- 1,3- diazole)標識化 DOPE (励起波長（Ex)470nm,蛍光波長（Em) 530nm, Molecular Probe社製）を 含有させ、融合活性測定用リボソームのリボソーム膜には、 1モル0 /oNBD標識ィ匕 DO PE及び 0.5モル％ローダミン (Rho)標識ィ匕 DOPE (励起波長（Ex)560nm,蛍光 波長 (Em) 590nm)を含有させた。
[0140] (3)リボソーム表面のステアリル化ォクタアルギニン（STR— R8)による修飾
EPC系リボソーム又は DOPE系リボソーム懸濁液 100 μ Lに、ステアリル化ォクタァ ルギニン溶液 (ステアリルィ匕ォクタアルギニン濃度： 2mgZmL，溶媒:水) 4.64 L ( EPC系リボソーム， DOPE系リボソーム [DOPE :X= 9 :2]の場合）又は 4.23iuL(D OPE系リボソーム [DOPE :X= 1： 1]の場合）を添加し、室温で一定時間インキュべ ートすることにより、リボソーム膜にステアリルィ匕ォクタアルギニンを分配させた (ステア リル化ォクタアルギニンの分配量：総脂質量の 10モル0 /0)。こうして、ォクタアルギ- ン（アルギニン 8重合体）を表面に有する EPC系リボソーム又は DOPE系リボソームを 調製した。
[0141] 以下、ォクタアルギニンを表面に有しない EPC系リボソームを「STR—R8非修飾 E PC系リボソーム」、ォクタアルギニンを表面に有する EPC系リボソームを「STR—R8 修飾 EPC系リボソーム」、ォクタアルギニンを表面に有しない DOPE系リボソームを「 STR—R8非修飾 DOPE系リボソーム」、ォクタアルギニンを表面に有する DOPE系 リボソームを「STR—R8修飾 DOPE系リボソーム」という。
[0142] (4)結合活性測定
リボソームのミトコンドリア膜に対する結合活性は、ラット肝臓力も単離したミトコンドリ ァと、 1モル％NBD標識ィ匕 DOPEを含有する蛍光標識リボソームとを用いて、以下 のように評価した。
ラット肝臓力もミトコンドリアを単離し、 MIB中に lmgZmLとなるように希釈してミトコ ンドリア溶液を調製した。ミトコンドリア溶液 90 Lにリボソーム懸濁液 10 Lを添カロし てサンプルを調製した。 2つのサンプルを調製しておき、各サンプルを 25°Cで 30分 間インキュベーションした後、一方のサンプルは F サンプルとして遮光冷蔵保存し、
all
他方のサンプルは遠心分離（16000 X g, 10分， 4°C)後、上清 (ミトコンドリアと結合 しな力つたリボソームを含有する画分)を除去し、沈殿 (ミトコンドリアと結合したリポソ ームを含有する画分)を MIBで洗浄し、遠心分離 (20400 X g, 2分， 4°C)で再分離 (2回）し、 Fサンプルとして遮光冷蔵保存した。各サンプルに等量の l%Tritonをカロ え、撹拌した後、蛍光強度を測定し、次式に基づいて結合活性 (％)を算出した。
[0143] [数 1] 結合活性（％) = [ F ] [ F a l X 1 0 0
[0144] [式中、 Fは Fサンプルの蛍光強度（蛍光波長 530nm)を表し、 F は F サンプルの
all all
蛍光強度 (蛍光波長 530nm)を表す。 ]
[0145] EPC系リボソームのミトコンドリア膜に対する結合活性（％)を図 2に示し、 DOPE系 リボソームミトコンドリア膜に対する結合活性（％)を図 3に示す。なお、図 2及び図 3中 、口は STR—R8非修飾リボソーム、國は STR—R8修飾リボソームを示す。また、図 3 (a)は、 DOPEと表 l(i)〜(viii)力も選択される 1種の脂質との混合比が 9： 2 (モル比） である DOPE系リボソームを示し、図 3 (b)は、 DOPEと表 l(i)〜(viii)力も選択される 1 種の脂質との混合比が 1： 1 (モル比）である DOPE系リボソームを示す。
[0146] 図 2及び図 3に示すように、 STR— R8非修飾 EPC系リボソーム及び STR— R8非 修飾 DOPE系リボソームにおいては、ミトコンドリア膜に対する結合活性が認められ なかったが、 STR—R8修飾 EPC系リボソーム及び STR—R8修飾 DOPE系リポソ一 ムにおいては、ミトコンドリア膜に対する結合活性が認められた。
[0147] (5)融合活性測定
リボソームのミトコンドリア膜に対する融合活性を FRET (Fluorescence Resonance E nergy Transfer)を利用して評価した。
1モル％NBD標識化 DOPE及び 0. 5モル％Rho標識化 DOPEを含有する蛍光 標識リボソームがミトコンドリアと結合してもミトコンドリア膜と融合しなければ、蛍光標 識リボソームはそのままの状態で存在する。この場合、 NBDと Rhoとが非常に近接し て存在するので、 FRETが誘導され、 NBDの蛍光が消失する。一方、蛍光標識リポ ノームがミトコンドリア膜と融合している場合には、ミトコンドリア膜上に NBD標識ィ匕 D OPE及び Rho標識化 DOPEが拡散するので、 FRETが解消され、 NBDの蛍光が回 復する。
[0148] ミトコンドリア溶液 90 μ Lにリボソーム懸濁液 10 μ Lを添カ卩し、 25°Cで 30分間インキ ュベーシヨンし、 Fサンプルを調製した。 MIB90 μ Lにリボソーム懸濁液 10 μ Lを添 加し、 25°Cで 30分間インキュベーションし、 Fサンプルを調製した。また、 0. 5%Tri
0
ton90 μ Lにリボソーム懸濁液 10 μ Lを添カ卩し、 25°Cで 30分間インキュベーションし 、 F サンプルを調製した。各サンプルに 470nmの励起光を照射したときに発せら max
れる蛍光スペクトル (蛍光波長 530nm)を測定し、次式に基づ!/、て FRET解消率（％ )を算出し、 Tritonによってリボソームを破壊したときの FRET解消率を 100%として 、リボソームのミトコンドリア膜に対する融合活性を評価した。
[0149] [数 2]
? £丁解消率（％) = —？。） 111 — ?。） 1 0 0 [0150] [式中、 Fは Fサンプルの蛍光強度（蛍光波長 530nm)を表し、 Fは Fサンプルの蛍
0 0
光強度（蛍光波長 530nm)を表し、 F は F サンプルの蛍光強度（蛍光波長 530 max max
nm)を表す。]
[0151] Fサンプルでは、 FRETが誘導されているため NBDの蛍光が消光する。 F サン
0 max プルでは、 Tritonによりリボソームが破壊され、 NBDと Rhoとの分子間距離が大きく なっているため FRETが解消され、 NBDの蛍光が回復する。 Fサンプルでは、リポソ ームがミトコンドリア膜と融合したときに FRETが解消され、 NBDの蛍光が回復する。
[0152] EPC系リボソームのミトコンドリア膜に対する融合活性 (FRET解消率（％) )を図 4 に示し、 DOPE系リボソームミトコンドリア膜に対する融合活性 (FRET解消率（％) ) を図 5に示す。なお、図 4及び図 5中、口は STR—R8非修飾リボソーム、國は STR— R8修飾リボソームを示す。また、図 5 (a)は、 DOPEと表 l(i)〜(viii)力 選択される 1 種の脂質との混合比が 9 : 2 (モル比）である DOPE系リボソームを示し、図 5 (b)は、 D OPEと表 l(i)〜(viii)力 選択される 1種の脂質との混合比が 1： 1 (モル比）である DO PE系リボソームを示す。
[0153] 図 4及び図 5に示すように、 STR— R8非修飾 EPC系リボソーム、 STR— R8修飾 E PC系リボソーム及び STR—R8非修飾 DOPE系リボソームにおいて、ミトコンドリア膜 に対する融合活性はほとんど認められな力つた力 STR— R8修飾 DOPE系リポソ一 ムにおいて、ミトコンドリア膜に対する顕著な融合活性が認められた。
[0154] 以上の結果から、リボソーム膜がミトコンドリア膜と融合するためには、リボソーム膜 表面に存在するォクタアルギニンを介したリボソーム膜とミトコンドリア膜との結合、及 びリボソーム膜に含有される膜融合性脂質 DOPEを介したリボソーム膜とミトコンドリ ァ膜との融合が必要であることが明らかとなった。また、リボソーム膜に含有される DO PE量の比率を低下させた場合（図 4 (b)参照）、リボソーム膜のミトコンドリア膜に対す る融合活性が低下したことから、リボソーム膜のミトコンドリア膜に対する融合活性は、 リボソーム膜に含有される DOPE量の比率によって変動することが明ら力となった。
[0155] 〔実施例 2〕生細胞内におけるリボソームの動態解析
STR—R8修飾 DOPE系リボソーム力 生細胞内においても、ミトコンドリア膜に対 する融合活性を発揮し、リボソーム内封物質をミトコンドリア内に導入できることを確認 するために、 HeLa細胞内に STR— R8修飾 DOPE系リボソームを導入して細胞内 動態を観察した。なお、 STR— R8修飾リボソームは、原形を保ったまま (インタクト (in tact)な状態で)細胞内に導入できることが知られている（力リル'イクラミ等， 「YAKUG AKU ZASSHIJ , 2004年， 124卷 Suppl. 4, 113- 116頁； Kogure等，「Journal of Contro lied Release] , 2004年，第 98卷， 317- 323頁）。 [0156] 前日に 4 X 104細胞/ mLの濃度で 6cmディッシュに播種した HeLa細胞の培地を 無血清培地と交換した後に、 10モル％STR—R8修飾 DOPE系リボソーム（リポソ一 ムの内部に GFPタンパク質（Green Fluorescent Protein)を封入）を最終総脂質濃度 力 75 Mとなるようにカロえ、 37°C, 5%CO存在下で 1時間インキュベーションし
2
た。その後、血清添加培地と交換し、さらに 37°Cで 1時間インキュベーションした。共 焦点レーザー顕微鏡による観察の前に、培地に ImM mitofluor (Molecular Probe社 製)を最終濃度が ΙΟΟηΜとなるようにカ卩え、 37°C, 5%CO存在下で 20分間インキ
2
ュベーシヨンし、ミトコンドリアを染色した。リボソームの細胞内動態は共焦点レーザー 顕微鏡（LMS 510, Carl Zeiss Co., Ltd.)を用いて観察し、ミトコンドリア（赤）とリポソ一 ムの内封物 GFP (緑)の局在を確認した (共局在する場合、黄色)。
[0157] 共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図 6に示す。なお、図 6 (a)は、 STR—R8 修飾EPC系リポソーム（EPC : Chol= 9 : 2)を用ぃた場合の結果、図 6 (b)は、 STR R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE： SM = 9 : 2)を用いた場合の結果、図 6 (c)は 、 STR—R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE： PA = 9： 2)を用いた場合の結果を示 す。また、「透過光」は透過光による細胞像、「Mt」はミトコンドリア (赤）の局在、「GFP 」は GFP (緑)の局在、「重ね合わせ」は透過光による細胞像に重ね合わせたミトコン ドリア（赤)及び GFP (緑)の局在を示す。
[0158] STR— R8修飾 EPC系リボソームを用いた場合には、ミトコンドリアと内封物質 GFP との共局在（黄色）は確認されなかった力 STR— R8修飾 DOPE系リボソームを用 いた場合には、ミトコンドリアと内封物質 GFPとの共局在 (黄色）が確認された。このこ と力ら、 STR—R8修飾 DOPE系リボソームによれば、内封物質 GFPをミトコンドリア 内に導入できることが明らかとなつた。
[0159] 〔実施例 3〕ミトコンドリア内へのタンパク質送達
(1)リボソームのミトコンドリアへの導入
実施例 1と同様にしてラット肝臓ミトコンドリア溶液 (ミトコンドリアタンパク質 lOmgZ mL)を調製し、 lmLずつチューブに分注した。実施例 1と同様にして、 10モル％ST R— R8修飾 EPC系リボソーム (EPC： SM = 9： 2, EPC： PA= 9： 2)及び 10モル0 /0S TR—R8修飾DOPE系リポソーム（DOPE : SM = 9 : 2, DOPE : PA= 9 : 2) (いずれ のリボソームの内部にも GFP (Green Fluorescent Protein)が封入されている）を調製 し、リボソーム溶液 100 /z UGFP 125ngZ w L,総脂質 0. 55mM)をラット肝臓ミト コンドリア溶液に添カ卩した後、 25°Cで 30分間インキュベーションした。この時、ネガテ イブコントロールには同量の GFPを添カ卩した。その後、遠心分離し（16000 X g, 10 分， 4°C)、上清を除去した。沈殿を IM ( + ) [IM (-BSA) (70mMスクロース， 220 mM D—マン-トール， 2. OmM HEPES (pH7. 4) ) 50mLに 50mgZmL BSA 溶液 500 /z Lを添カ卩したもの]で洗浄し、遠心分離し（20400 X g, 2分， 4°C)、上清 を除去した。同様の操作を繰り返した後、沈殿を IM ( + ) 100 Lに再懸濁し、ミトコ ンドリア溶液 (ミトコンドリアタンパク質 lOOmgZmL)とした。
[0160] (2)ミトコンドリア内分画
(1)で調製したミトコンドリア溶液 100 /z Lをバイアル瓶に分注し、 1. 25%ジギトニ ン溶液 (ジギトニンを IM ( + )で溶解したもの）をミトコンドリア溶液に等量加え、 4°Cで 15分間穏やかに撹拌し、ミトコンドリア外膜の剥離を行った (J. W. Greenawalt. The is olation of outer and inner mitochondrial membranes. Methods Enzymoi 31: «310- 23 ( 1974)) oその後、 IM ( + ) 600 1^を反応溶液に加え、反応を停止させた。反応終了 後、ミトコンドリア溶液を遠心分離し（lOOOO X g, 10分， 4°C)、上清を別のチューブ に移し、沈殿を IM ( + )で洗浄した。同様の条件で遠心分離し、上清を別のチューブ に移した。得られた上清を合わせ、遠心分離し（144000 X g, 10分， 4°C)、得られ た沈殿を IM ( + ) 100 Lに再懸濁し、外膜（OM : outer membrane)画分とした。また 、上清を再び同条件で遠心分離し、得られた上清を膜間腔 (IMS ntermembrane sp ace)画分とした。得られたサンプルは、 1%SDS存在下、 BSAを標準物質として BCA protein assay kit (PIERCE)を用いてタンパク量を測定した後、 lmgZmLとなるよう に IM ( + )を用いて希釈し、— 80°Cで保存した。
[0161] (3)ウェスタンブロット
得られたサンプルと等量の SDS- PAGE loading buffer (0.1 M Tris, 4% SDS, 12% 2 - mercaptoethanol, 20% glycerol, BPB (適量)）を混合し、変性させたサンプル 5 μ L を SDS-ポリアクリルアミドゲル（15%)にアプライし、泳動した。泳動後のゲルを PVD F膜（日本ジヱネテイクス）に転写した（BE- 330, BIO CRAFT)。転写後の PVDF膜を ブロッキング後、抗体反応を行い、目的の GFPのバンドを検出した。 1次抗体 (Anti- GFP, N- Terminal (SIGMA))、 2次抗体（HRP結合ロバ抗ゥサギ IgG抗体）を各々 10 00倍希釈して用い、 ECL+plus Western Blotting Detection System (Amersham)によ つてバンドを検出した。
[0162] (4)結果
結果を図 7に示す。なお、図 7中、「OM」は OM画分の結果、「IMS」は IMS画分の 結果を示し、（a)はネガティブコントロールの結果、（b)は STR—R8修飾 EPC系リポ ソーム（EPC： SM = 9： 2)の結果、（c)は STR—R8修飾 EPC系リボソーム（EPC： P A= 9 : 2)の結果、（d)は STR—R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE： SM = 9： 2)の 結果、（e)は STR—R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE： PA= 9： 2)の結果を示す
[0163] 図 7に示すように、 STR—R8修飾EPC系リポソーム（EPC : SM = 9 : 2, EPC : PA
= 9 : 2)を用いた場合、 OM画分では GFPの 33kDaのバンドが観察された力 IMS 画分では観察されなかった。一方、 STR—R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE: S M = 9 : 2, DOPE : PA= 9 : 2)を用いた場合、 OM画分及び IMS画分の両方で GF Pの 33kDaのバンドが観察された。なお、 STR— R8修飾 DOPE系リボソームを用い た場合に OM画分及び IMS画分で観察された 28kDaのバンドも GFPのバンドであ る可能性がある。この結果から、 STR—R8修飾 DOPE系リボソームによれば、内封 物質 GFPをミトコンドリアの膜間腔に導入できることが明らかとなった。
[0164] 〔実施例 4〕生細胞ミトコンドリアに対するリボソームの膜融合能の評価
(1)リボソームの調製
実施例 1と同様にして、 10モル0 /0STR—R8修飾 EPC系リボソーム（EPC : SM = 9 ： 2)及び 10モル0 /oSTR— R8修飾 DOPE系リボソーム（DOPE： SM = 9 : 2)を調製 した。ただし、総脂質量の 0. 5モル0 /0の NBD— DOPE (緑色）を脂質膜に含有させ た。また、リボソーム内部の水相マーカーとして lmgZmL Dextran cascade blue (Mo lecular Probe社）（青色）を封入した。
[0165] (2)共焦点レーザースキャン顕微鏡観察
2. 5cmディッシュ（2mL培養液）に 4 X 104細胞 ZmLで細胞を播き、 24時間培養 した。培養後、培養液を除去し、無血清培地 (抗生物質を含まない） lmLを添加し、リ ポソーム（脂質量 0. 55mM) 25 μ Lを添カ卩後、インキュベーションした（37°C, 1時間 , 5%CO )0次に、 lmL PBS ( -)で 3回洗浄し、血清添加培地と交換して 1時間同
2
条件でインキュベーションした。その後に mito fluor (Molecular Probe社製）によってミ トコンドリアを染色し、共焦点レーザー顕微鏡（LMS 510, Carl Zeiss Co., Ltd.)による 観察を行った。
[0166] (3)結果
結果を図 8及び 9に示す。なお、図 8は、 STR—R8修飾 EPC系リボソーム（EPC : S M = 9 : 2)の結果、図 9は、 STR—R8修飾DOPE系リポソーム（DOPE : SM = 9 : 2) の結果を示す。また、「透過光」は透過光による細胞像、「ミトコンドリア（赤）」はミトコン ドリア（赤）の局在、「NBD— DOPE (緑）」はNBD— DOPE (緑）の局在、「Dextran c ascade blue (青）」は Dextran cascade blue (青）の局在、「重ね合わせ」は透過光によ る細胞像に重ね合わせたミトコンドリア（赤）、 NBD— DOPE (緑)及び Dextran casca de blue (青）の局在を示す。
[0167] STR— R8修飾 EPC系リボソームを用いた場合、 NBD— DOPE (緑）と Dextran cas cade blue (青）とが、ミトコンドリア（赤）の外側に共局在 (水色）していた。このことから、 STR— R8修飾 EPC系リボソームは、ミトコンドリア膜に結合できる力 ミトコンドリア膜 と融合できず、内封物質 Dextran cascade blueをミトコンドリア内に導入できないことが 明ら力となった。一方、 STR—R8修飾 DOPE系リボソームを用いた場合、 Dextran c ascade blue (青）が単独でミトコンドリア（赤）の内側に局在していた。また、ミトコンドリ ァ（赤）と Dextran cascade blue (青）とが共局在（ピンク色）して!/、た。これらのことから 、 STR— R8修飾 DOPE系リボソームは、ミトコンドリア膜に結合できるとともに、ミトコ ンドリア膜と融合でき、内封物質 Dextran cascade blueをミトコンドリア内に導入できる ことが示された。
[0168] 〔実施例 5〕ミトコンドリアターゲティング (MTS)—脂質誘導体の合成
リボソーム表面をラット肝臓由来のスクシ-ル CoAシンテターゼ由来 MTS (配列番 号 1, R. Majumdar and W. A. Bridger. Mitochondrial translocation and processing of the precursor to the alpha— subunit of rat liver succinyl— CoA synthetase. Biochem Cell Biol 68: 292-9 (1990))で修飾するために、 MTS—脂質誘導体として MTS— D OPEを合成した。なお、結果は示さないが、ラット肝臓由来のスクシ-ル Co Aシンテ ターゼ由来 MTS (配列番号 1)がヒト細胞ミトコンドリアへの移行能を示すことは確認 済みである。
[0169] MTS— DOPEは、 MTSの C末端 Cysの SH基と DOPEのァミノ基とをクロスリンカ 試薬 SMCし (4— unaieimidomethyl)— 1— cyclohexanecarboxylic acia -hydroxysucci nimide ester)を介して連結させることにより合成した（図 10及び 13)。なお、図 10及 び 13中、 DOPEの構造は模式的に示される。
[0170] (l) SMCC— DOPEの合成（図 10)
エツペンドルフチューブに CHC1 200 μ L、 DOPE 500nmol、 SMCC 500nmol
3
及びトリェチルァミン 1 molを加え、室温で 12時間遮光振とうし、反応させた (反応 液 A)。反応終了後、凍結乾燥し、溶媒を除去し、メタノール 50 Lを用いて再度溶 解した。 HPLC分析より目的生成物が得られていることを確認した（図 11)。なお、 H PLC分析において、移動相として A緩衝液 [0. 1% TFAの再蒸留水（DDW)溶液] 及び B緩衝液 [0. 1% TFAの CH CN溶液]を使用し、 30〜70% B緩衝液で 10分
3
、次いで 90〜100% B緩衝液で 10分、次いで 100% B緩衝液で 10分のグラジェン トを力けた。さらに、 SMCC— DOPEを分取し、 FAB— MS (Fast Atom Bombardmen t Mass Spectrometry)による質量分析を行い、分子量も目的生成物と一致することを 確認した（図 12)。なお、 FAB— MSによる質量分析において、測定機器として〖お E OL JMS— HX100を使用し、溶剤としてはメタノールを使用し、マトリックスとしては NBA (m—二トロべンジルアルコール）を使用した。
[0171] (2) MTSと SMCC— DOPEとの結合（図 13)
SMCC— DOPEの合成後、反応液 Aのうち半量の 100 L (250nmol)、及び MT Sの DMSO溶液（脱気済み） 100 /ζ Ι^ (125ηπιο1)をエツペンドルフチューブに加え、 室温で 1時間遮光静置し、反応させた。反応終了後、凍結乾燥し、溶媒を除去し、メ タノールZDMSO (l : 3) 100 iu Lを用ぃて再度溶解した。その後、 HPLC精製を行 つた（図 14)。なお、 HPLCは上記と同様にして行った。精製した MTS— DOPEの 質量分析を] ^\し01—丁0?— ]\ [3 (\1&1：1^— 3313 6(1 Laser Desorption Ionization Ti me- Of- Flight Mass Spectrometry)により行い、分子量が目的生成物と一致すること を確認した (図 15)。なお、 MALDI— TOF— MSによる質量分析において、測定機 器としては VOYAGER DEPROを使用し、溶剤としては 10% TFAの CH CN溶液
3 を使用し、マトリックスとしては CHCAを使用した。質量分析の結果より、得られた生 成物を MTS— DOPEとした。
[0172] 〔実施例 6〕 MTS修飾リボソームのミトコンドリアへの移行能の評価
(1)リボソームの調製
試験管内に 5モル％ MTS— DOPEを含む脂質膜を形成後、脂質膜を水和させ、 超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例 1と同様）、 STR—R8非修飾 MT S修飾EPC系リポソーム（EPC : Chol= 9 : 2)を調製した。なお、「MTS修飾」とは、リ ポソーム表面が MTSで修飾されていることを意味する。また、実施例 1と同様にして 、 5モル％STR—R8修飾MTS非修飾EPC系リポソーム（DOPE : Chol= 9 : 2)、 S TR— R8及び MTS非修飾 EPC系リボソーム（EPC； DDAB = 9： 2, EPC： Chol= 9 : 2)を調製した。
[0173] (2)ホモジネート溶液の調製
HeLa細胞を MIB ( + ) [250mMスクロース， 2mM Tris— CI, ImM EDTA, pH 7. 4]で洗浄後、 1. 0 X 107細胞 ZmLとなるように MIB ( + )に懸濁した (以下、氷上 操作)。ダウンスホモジナイザーで、 20回ホモジネートし、ホモジネート溶液を調製し た。得られたサンプルは、 1% SDS存在下、 BSAを標準物質として BCA protein ass ay kit (PIERCE)を用いてタンパク量を測定した後に、 lmgZmLとなるように MIB ( + )を用 、て希釈し、 - 80°Cで保存した。
[0174] (3)ミトコンドリアへの移行能の評価
540 μ Lホモジネート溶液 [1 gZ Lタンパク質]に 60 μ Lリボソーム（1モル0 /0 NBD— DOPE含有）を添カ卩した。コントロールとして 60 L MIB ( + )を添カ卩したも のを調製した。 25°Cで 30分間インキュベーションした後、 100 Lを分注し [F ]、残
all りは遠心分離操作に用いた。 500 Lのサンプルを遠心分離後（700 X g, 10分， 4°C )、得られた上清 400 μ Lを遠心分離し（16000 X g, 10分， 4°C)、得られた沈殿 40 0 iu LをMIB ( + )で懸濁した[F ]。 [0175] 100 μ Lのサンプルに同量の 1% Triton溶液（99 μ L MIB ( -) , 1 ^ L Triton) を加えて懸濁し、最終濃度 0. 5% Tritonとなるように調整した後、蛍光強度測定 (e x : 470 nm, em : 530nm)を行い、下記式から算出したミトコンドリアへの移行活性（ %)に基づいて、リボソームのミトコンドリアへの移行能を評価した。
[0176] 移行活性（％) =ミトコンドリアに移行したリボソームの蛍光強度 [F
mt ]Z添加した全て のリボソームの蛍光強度 [F ] X 100
all
[0177] 結果を図 16に示す。図 16に示すように、リボソーム表面を MTSで修飾することによ り、リボソームにミトコンドリアへの選択的な移行能を付与できることが明ら力となった。
[0178] 〔実施例 7〕生細胞内におけるリボソームの動態解析
(1)リボソームの調製
試験管内に脂質膜を形成後、 GFP溶液 (125ngZ ^ L,以下同様)を加えて脂質 膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例 1と同様)、 STR— R8及び MTS非修飾 EPC系リボソーム（EPC： Choi = 9： 2)を調製した。
[0179] 試験管内に 5モル％ MTS— DOPEを含む脂質膜を形成後、 GFP溶液を加え脂 質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例 1と同様)、 STR —R8非修飾MTS修飾EPC系リポソーム（EPC : Chol= 9 : 2)を調製した。なお、「 MTS修飾」とは、リボソーム表面が MTSで修飾されていることを意味する。
[0180] 試験管内に 10モル％STR— R8を含む脂質膜を形成後、 GFP溶液を加えて脂質 膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例 1と同様)、 STR— R8修飾 MTS非修飾 EPC系リボソーム（EPC： Choi = 9： 2)を調製した。
[0181] 試験管内に 5モル0 /oMTS— DOPEを含む脂質膜を形成後、 GFP溶液を加えて脂 質膜を水和させ、超音波処理を行うことにより（詳細な条件は実施例 1と同様)、 MTS 修^^?じ系リポソーム ？じ：0101= 9 : 2)を形成させた。その後、リボソーム溶液に STR— R8を総脂質量の 10モル0 /0となるように添カ卩し、 STR— R8及び MTS修飾 EP C系リボソーム（EPC： Choi = 9： 2)を調製した。
[0182] なお、いずれのリボソームの内部にも GFP (Green Fluorescent Protein)が封入され ている。
[0183] 実施例 2と同様にして、 HeLa細胞内にリボソームを導入し、共焦点レーザー顕微 鏡を用いて細胞内動態を観察し、ミトコンドリア（赤）とリボソームの内封物 GFP (緑） の局在を確認した (共局在する場合、黄色)。
[0184] 共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図 17及び 18に示す。なお、図 17 (a)は、 コントロール（GFP溶液を細胞に添加）の結果、図 17 (b)は、 STR—R8及び MTS非 修飾 EPC系リボソームの結果、図 17 (c)は、 STR— R8非修飾 MTS修飾 EPC系リポ ノームの結果、図 18 (a)は、 STR— R8修飾 MTS非修飾 EPC系リボソームの結果、 図 18 (b)は、 STR—R8及び MTS修飾 EPC系リボソームの結果を示す。また、「透 過光」は透過光による細胞像、「ミトコンドリア」はミトコンドリア (赤）の局在、「GFP」は GFP (緑)の局在、「重ね合わせ」は透過光による細胞像に重ね合わせたミトコンドリ ァ（赤)及び GFP (緑)の局在を示す。
[0185] STR— R8及び MTS非修飾 EPC系リボソーム、 STR— R8非修飾 MTS修飾 EPC 系リボソームを用いた場合、細胞内に GFP (緑)の局在は確認されな力つた。このこと から、リボソーム表面を MTSで修飾したただけでは、リボソームを細胞内に導入でき ないことが明ら力となった。
[0186] STR— R8修飾 MTS非修飾 EPC系リボソームを用いた場合、細胞内に GFP (緑） の局在が確認されるとともに、ミトコンドリア（赤)周辺に GFP (緑)の局在が確認された 。このこと力ら、リボソーム表面を STR—R8で修飾することにより、リボソームを細胞内 に導入できること、及び細胞内に移行したリボソームがミトコンドリア膜に結合できるこ とが明らかとなった。但し、ミトコンドリア (赤）と GFP (緑)との共局在 (黄色）は観察さ れなかったことから、リボソーム表面を STR— R8で修飾しただけでは、リボソームにミ トコンドリア膜に対する融合能を付与できないことが明らかとなった。
[0187] STR—R8及び MTS修飾 EPC系リボソームを用いた場合、ミトコンドリア（赤）と GF P (緑）との共局在（黄色）が確認された。 STR—R8及び MTS修飾 EPC系は、リポソ ーム STR—R8修飾 MTS非修飾 EPC系リボソームと同様に、ミトコンドリア膜に対す る融合能は有しな 、と考えられるので、ミトコンドリア (赤）と GFP (緑)との共局在 (黄 色）は、リボソームがミトコンドリア膜に極めて近接して存在することを意味する。すな わち、リボソーム表面を MTSで修飾することにより、リボソームをミトコンドリア膜に極 めて近接した状態で結合させることができることが明ら力となった。リボソームがミトコ ンドリア膜に極めて近接した状態で結合できれば、リボソーム膜とミトコンドリア膜との 膜融合を誘起しやすくなると考えられる。また、 GFP (緑)がミトコンドリア (赤)以外の 部分 (細胞質、その他のオルガネラ）にはほとんど観察されな力つたことから、リポソ一 ム表面を MTSで修飾することにより、リボソームにミトコンドリアへの選択的な移行能 を付与できることが明らかとなった。

Claims

請求の範囲
[I] 膜融合性脂質を含有し、膜透過性ペプチドを有する脂質膜を備えることを特徴とす る脂質膜構造体。
[2] 前記膜融合性脂質の含有量が、前記脂質膜に含有される総脂質量の 70% (モル 比)以上であることを特徴とする請求項 1記載の脂質膜構造体。
[3] 前記膜融合性脂質がコーン型脂質であることを特徴とする請求項 1記載の脂質膜 構造体。
[4] 前記コーン型脂質がジォレオイルホスファチジルエタノールァミンであることを特徴 とする請求項 3記載の脂質膜構造体。
[5] 前記膜透過性ペプチドが、膜透過性ドメインを有するペプチドであることを特徴とす る請求項 1記載の脂質膜構造体。
[6] 前記膜透過性ドメインがポリアルギニンであることを特徴とする請求項 5記載の脂質 膜構造体。
[7] 前記ポリアルギニン力 連続した 4〜20個のアルギニン残基力もなることを特徴とす る請求項 6記載の脂質膜構造体。
[8] 前記膜透過性ペプチドが前記脂質膜の表面に存在することを特徴とする請求項 1 記載の脂質膜構造体。
[9] 前記脂質膜が、ミトコンドリアターゲティングシグナルを有することを特徴とする請求 項 1記載の脂質膜構造体。
[10] 前記ミトコンドリアターゲティングシグナル力 下記 (a)又は (b)に示すペプチドであ ることを特徴とする請求項 9記載の脂質膜構造体。
(a)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるペプチド
(b)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって、ミトコ ンドリアへの移行能を有するペプチド
[II] 前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルが直接又はリンカ一を介して前記脂質膜 の構成成分に結合していることを特徴とする請求項 9記載の脂質膜構造体。
[12] 前記ミトコンドリアターゲテイングシグナルの C末端が前記脂質膜の構成成分に結 合して!/ヽることを特徴とする請求項 11記載の脂質膜構造体。
[13] 前記ミトコンドリアターゲティングシグナルが前記脂質膜の表面に存在することを特 徴とする請求項 9記載の脂質膜構造体。
[14] 前記ミトコンドリアターゲティングシグナルの量が、前記脂質膜に含有される総脂質 量の 2〜10% (モル比)であることを特徴とする請求項 9記載の脂質膜構造体。
[15] リボソームであることを特徴とする請求項 1記載の脂質膜構造体。
[16] ミトコンドリア内へ送達しょうとする目的物質を保持していることを特徴とする請求項
1記載の脂質膜構造体。
[17] 前記目的物質のミトコンドリア内送達用ベクターであることを特徴とする請求項 16記 載の脂質膜構造体。
[18] 次式: A— X— B
[式中、 Aはミトコンドリアターゲテイングシグナルの残基を表し、 Xは直接結合又はリ ンカーを表し、 Bはリン脂質の残基を表す。 ]
で表されることを特徴とするリン脂質誘導体。
[19] 前記ミトコンドリアターゲティングシグナルの C末端力 直接又はリンカ一を介してリ ン脂質に結合していることを特徴とする請求項 18記載のリン脂質誘導体。
[20] 前記ミトコンドリアターゲティングシグナル力 下記 (a)又は (b)に示すペプチドであ ることを特徴とする請求項 18記載のリン脂質誘導体。
(a)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなるペプチド
(b)配列番号 1〜31のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数個のァミノ 酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって、ミトコ ンドリアへの移行能を有するペプチド
[21] 前記リンカ一力 アミノ酸残基、リンカ一ペプチドの残基又はクロスリンカ一試薬の 残基であることを特徴とする請求項 18記載のリン脂質誘導体。
[22] 前記リン脂質がアミノ基を有し、前記リン脂質が前記アミノ基を介して前記ミトコンドリ ァターゲティングシグナル又は前記リンカ一に結合していることを特徴とする請求項 1 8記載のリン脂質誘導体。
[23] 前記リン脂質がホスファチジルエタノールアミン類であることを特徴とする請求項 18 記載のリン脂質誘導体。
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