CN101970460B - 功能性脂类构造物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，用于使表达于细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变，本发明还涉及在该方法中应用的功能性脂类构造物。本发明尤其涉及功能性脂类构造物以及它们在诊断和治疗应用上的使用，包括血清诊断法，其中功能性基团为碳水化合物、肽、化学反应性基团、结合体或者荧光团。

Description

功能性脂类构造物
技术领域
本发明涉及用于使表达于细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变的方法，以及在该方法中的应用的功能性脂类构造物。 
本发明尤其涉及功能性脂类构造物以及它们在诊断和治疗应用上的使用，包括血清诊断法，其中功能性基团为碳水化合物、肽、化学反应基团、结合体或者荧光团。 
背景技术
使表达于脂质体、细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变的能力具有一系列的诊断和治疗应用。功能性基团可以为碳水化合物、肽、化学反应基团(例如马来酰亚胺)、结合体(例如生物素)或者荧光团(例如荧光素)。 
国际申请号PCT/NZ2005/000052(公布号WO 2005/090368)的说明书描述了一种碳水化合物-脂类构造物的制备，该碳水化合物-脂类构造物用于使表达于细胞和多细胞结构表面的碳水化合物水平产生质变和量变的方法。描述了该构造物用于制备血液分组和诊断用质量控制细胞的用途。 
国际申请号PCT/NZ2006/000245(公布号WO 2007/035116)的说明书描述了另外一种制备碳水化合物-脂类构造物的方法，其中碳水化合物为透明质酸聚合物。描述了该构造物修饰胚胎促进其与子宫内膜细胞连接的用途。 
国际申请号PCT/NZ2007/000256(公布号WO 2008/030115)的说明书描述了荧光团-脂类构造物的制备。描述了该构造物在荧光标记细胞方法中的用途。 
使细胞表面表达的肽产生变化的已有技术包括基因调控、膜肽的化学修饰和使用脂锚例如GPI(Legler等(2004)，McHugh等(1995)，Medof等(1996)，Metzner等(2008)，Morandat等(2002)，Premkumar 等(2001)，Ronzon等(2004)，Skountzou等(2007))的“细胞表面染色”。 
在这些使内源表达的肽产生变化的方法以外，内源制备的肽可以利用生物素-亲和素结合作用结合到膜脂上。生物素结合到四聚体蛋白亲和素，其解离常数(KD)的数量级为10-15mol/L。这种强结合力得以开发于许多实验室应用中。 
在这些实验室应用中，生物素结合于分子例如碳水化合物或者结合于肽。除将肽耦合到膜脂上外，生物素亲和素结合的开发优选于一些隔离和分离的应用中。 
国际申请号PCT/NZ02/00214(公布号WO 03/039074)的说明书描述了将抗原例如肽固定到细胞表面的“两步法”。在该方法中，生物素化糖苷(BioG)与细胞悬浮液在一定的温度下接触一定的时间，足以允许BioG分子通过它们的二酰基脂尾结合到细胞的细胞膜。 
然后通过使肽接触修饰细胞，将外源性制备的亲和素化肽固定到BioG修饰细胞的表面。 
另一种方法为，通过生物素-亲和素桥将外源性制备的生物素化肽固定到修饰细胞的表面。 
“两步法”中的任一一种内，固定到修饰细胞表面的亲和素化肽的量可以通过调控为提供修饰细胞，BioG分子接触细胞悬浮液时的浓度、时间和温度来控制。然而，这种方式的利用受限于BioG在生物可溶介质例如盐水中的可获得性和分散性。 
国际申请号PCT/NZ2005/000052(公布号WO 2005/090368)的说明书描述了“一步法”，将碳水化合物抗原固定到细胞表面。“一步法”利用了碳水化合物-脂类构造物，其可在生物相容性介质内分散并因此用于制备修饰细胞而无损活性。然而，未描述在生物相容性介质内具有相对分散性的肽-脂类构造物的制备方法和肽上的普通应用方法。 
肽结合到自组装的脂类构造物例如脂质体之前，作为独立组分与磷脂的耦合这方面，进行的工作相对很少。然而，已有大量的标准技术对肽到脂质体表面的共价耦合进行了描述。 
Martin等(1990)评论了使基团包括肽结合到脂质体表面的方法。 
Blume等(1993)描述了水溶性Glu-血浆酶原耦合到脂质体上的由Kung和Redemann(1986)描述过的方法。在温育活化脂质体悬浮液和Glu-血浆酶原之前，用化学品ECDI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)活化脂质体。得到了一种蛋白-PEG包覆脂质体，其中Glu-血浆酶原共价结合到二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG-COOH的末端。 
Haselgrubler等(1995)描述了一种异双官能团交联剂，其用于促进免疫脂质体的制备。该交联剂由二胺衍生物聚(乙二醇)(PEG，平均分子量为800道尔顿(18mer))合成。该交联剂具有功能基团2-(吡啶基硫代)丙酰基(PDP)和N-羟基琥珀酸亚胺酯(NHS)。 
Ishida等(2001)描述了一种带有聚乙二醇耦合转铁蛋白的脂质体的制备方法。转铁蛋白通过DSPE-PEG-COOH的末端羧基残基结合。该脂质体被认为可用于活性细胞质内，化学治疗试剂或者质粒DNA到靶细胞的靶向定位。 
Massaguer等(2001)描述了将一种肽序列(GGRGRS)和疏水衍生物结合到化学活化的脂质体表面的方法。该结合通过N-戊二酰二棕榈酰磷脂酰胆碱(NGPE)末端的羧基基团进行。 
Massaguer等(2001)指出，就体内应用上的可能性而论，无菌和简单是最重要的要求，包括额外步骤，基于脂质体表面化学反应的制程，将更加难以在工业级水平放大。肽序列的疏水衍生物被证实能提供结合到脂质体表面的最佳特性。 
Chung等(2004)描述了抗原决定簇对DOPE-PEG结合到细胞膜的屏蔽效果，并详述了有关脂类-PEG(n)(s)调节生物细胞反应的可能性，并延续此概念到在PEG链末端引入功能分子。 
Kato等(2004)描述了一种将超大分子蛋白质锚定到活的哺乳动物细胞膜上的方法。将亲水聚(乙二醇)(PEG80)耦合的二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)衍生物用作合成膜锚。肽通过该合成膜锚的具有氨基反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺衍生物结合到PEG基团末端。 
PEG80基团促进了合成膜锚在水中的溶解性。如Kato等(2004)所述，如果锚不能溶于水，需要一个不理想的而且复杂的制程例如脂质体 制备和脂质体与细胞膜的融合，将结合体锚定到细胞膜上。 
Kato等(2004)还叙述了另一个优点，合成膜锚具有高亲水-亲脂平衡值(可归功于具有多数量氧乙烯单元的PEG间隔臂)，推定没有细胞溶解活性。无论如何，在使用具有多数量氧乙烯单元的PEG间隔臂的合成膜锚的时候产生了困难。 
首先，结合肽或者其他内源细胞表面肽的表达可能被PEG间隔壁遮盖。其次，具有多数量氧乙烯单元的PEG间隔臂可能诱发蛋白质的非特异性吸附(包括部分个体中的抗体)和/或完全级联的非特异性活化。 
Winger等(1996)描述了溴代乙酰化DSPE与硫醇末端化的十肽的结合物，所述十肽包括了在它的C-末端的一种最小人类凝血酶-受体肽激动剂(HS-SerPheLeuLeuArgAsn)。 
Hashimoto等(1986)描述了碘代乙酰化DSPE和硫代化合物的结合物。 
存在一种需求，即一种制备肽-脂类构造物的常规手段，该构造物通过“一步法”，在自组装的脂类构造物例如脂质体上，作为独立组分结合。该方法应当理想地提供肽-脂类构造物，其能在生物相容性介质中容易地分散并且自发地结合到细胞和多细胞结构的膜上。 
具有这些特性的肽-脂类构造物，除了制备功能化脂质体外，预期在一系列治疗和诊断应用上，尤其是血清诊断上都有效用。 
本发明的一个目的为提供一种能在生物相容性介质中分散且自发地结合到细胞和多细胞结构的膜上的功能性-脂类构造物。 
本发明的一个目的为提供功能性-脂类构造物，其用于制备能在生物相容性介质中分散且自发地结合到细胞和多细胞结构的膜上的肽-脂类构造物。 
本发明的一个目的为提供一种能在生物相容性介质中分散且自发地结合到细胞和多细胞结构的膜上的肽-脂类构造物。 
这些目的应该与至少给公众提供一种有用的选择的目的区分理解。 
发明内容
本发明的第一方面为提供一种结构为F-S-L的功能性脂类构造物， 其中F为功能性基团，L为二酰基或者二烃基脂类，S为共价键合F到L的隔离臂且包括亚结构： 
其中g为整数1、2或3，M为单价阳离子或者取代基，*为非H。优选的亚结构为： 
其中h为整数1、2、3或4。 
优选地，g是整数2且h为整数1、2或4。 
优选地，M为H或CH3。 
优选地，L为二酰基甘油磷脂。进一步优选地，L是磷脂酰乙醇胺。 
优选地，功能性脂类构造物的结构包括以下局部结构： 
其中v为整数3、4或5，M’为单价阳离子，R1和R2独立地选自于由脂肪酸反-3-十六碳烯酸、顺-5-十六碳烯酸、顺-7-十六碳烯酸、顺-9-十六碳烯酸、顺-6-十八碳烯酸、顺-9-十八碳烯酸、反-9-十八碳烯酸、反 -11-十八碳烯酸、顺-11-十八碳烯酸、顺-11-二十碳烯酸、顺-13-二十二碳烯酸(docsenoic acid)的烷基或者烯烃基取代物构成的群组。 
优选地，F是一种功能性基团，选自于由碳水化合物、肽、化学反应性基团、结合物或者荧光团组成的群组。 
本发明的第一方面的第一替代例提供了一种功能性脂类构造物，其结构为： 
其中F为碳水化合物，x为整数2、3或4，y为整数1、2或3，R3为该碳水化合物取代羟基的O。 
本发明的第一方面的第二替代例提供了一种功能性脂类构造物，其结构为： 
其中F为肽，w为整数1或2，R3为肽Cys残基的取代巯基的S。 
本发明的第一方面的第三替代例提供了一种功能性脂类构造物，其结构为： 
其中F为化学反应性基团马来酰亚胺，w为整数1或2。 
本发明的第一方面的第四替代例提供了一种功能性脂类构造物，其结构为： 
其中F为生物素结合物，k为整数2、3或4。 
本发明的第一方面的第五替代例提供了一种功能性脂类构造物，其结构为： 
其中F为荧光素(或者其衍生物中的一个)的荧光团，z为整数3、4或5，R3为荧光素(或者其衍生物中的一个)的异硫氰酸盐(或酯)衍生物的硫氰酸盐(或酯)取代基中的C。 
优选地，所述亚结构是： 
命名为MCMG(1)； 
命名为MCMG(2)； 
命名为CMG(1)；或 
命名为CMG(2)。 
本发明的第二方面提供了一可水溶的结构为F-S-L的肽-脂类构造物，其中S为通过硫化物键链接到F的隔离臂，并且包括亚结构： 
其中g为整数1、2或3，M是单价阳离子或者取代基，*为非H。优选的亚结构为： 
其中h为整数1、2、3或4。 
优选地，g和h为整数2。 
优选地，M为H或者CH3。 
优选地，L为二酰基甘油磷脂。进一步优选地，L为磷脂酰乙醇胺。优选地，肽-脂类构造物的结构包括以下局部结构： 
其中v为整数3、4或5，M’为单价阳离子，R1和R2独立地选自于由脂肪酸反-3-十六碳烯酸、顺-5-十六碳烯酸、顺-7-十六碳烯酸、顺-9-十六碳烯酸、顺-6-十八碳烯酸、顺-9-十八碳烯酸、反-9-十八碳烯酸、反-11-十八碳烯酸、顺-11-十八碳烯酸、顺-11-二十碳烯酸、顺-13-二十二碳烯酸的烷基或者烯烃基取代物构成的群组。 
优选地，肽-脂类构造物的结构包括以下部分结构： 
其中w为整数1或2，R3为肽Cys残基的取代巯基中的S。 
本发明的第二方面的一个具体实施例提供了一种肽-脂类构造物，其结构为： 
其中x与y之和大于5。 
可选地，F为一种肽，其包括一种挑选的促进肽的溶解度的近末端序列(PTS)。 
该选项下优选地，肽PTS选自于下述群组： 
SerLysLysLysLysGly 
AlaAlaAlaAla 
GlySerGlySerGly 
优选地，该Cys残基为肽末端Cys残基(Cys)。 
优选地，该肽的末端序列选自于下述群组： 
GlyLysLysLysLysSerCys
AlaAlaAlaAlaCys
GlySerGlySerGlyCys
CysSerLysLysLysLysGly 
CysAlaAlaAlaAla 
CysGlySerGlySerGly 
优选地，该Cys残基为肽羧基-末端的肽末端Cys残基。 
优选地，F为一种肽，包括一种选自于由血型糖蛋白A、血型糖蛋白B或者其变种(包括MNS血型系统)组成群组的抗原表位。进一步优选地，，F为一种选自肽清单的肽。最优选的为，F选自于由下列肽构成的群组： 
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluCys
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys
CysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGlu 
优选地，L为为一种甘油磷脂，其选自于由1,2-O-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-O-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)组成的群组。 
本发明的第二方面的第一个具体实施例提供的肽-脂类构造物结构为： 
命名为DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-PTS-Milt(K)(IX)。 
本发明的第二方面的第二个具体实施例提供的肽-脂类构造物结构为： 
命名为DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-Milt(K,M)(X)。 
本发明的第二方面的第三个具体实施例提供的肽-脂类构造物结构为： 
其中R1与R2都为(CH2)7CHCH(CH2)7，命名为DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-Mur(D14C)(XI)。 
本发明的第二方面的第四个具体实施例提供的肽-脂类构造物结构为： 
其中R1与R2都为(CH2)7CHCH(CH2)7，命名为DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-Syph(V8C)(XII)。 
本发明的第三方面提供了一种检测受试者的血清中反应性抗体的方法，包括以下步骤： 
●血清样品与细胞悬浮液接触得到一种混合物，该细胞修饰结合本发明第一方面的第一或者第二替代例中的功能性脂类构造物(F-S-L)，或者本发明第二方面中的肽-脂类构造物； 
●上述混合物在一定的温度下经一定的时间孵育，足以允许凝集； 
和 
●确定混合物中细胞的凝集程度； 
其中： 
F为碳水化合物或者肽，其包括反应性抗体的表位。 
可选地，该方法包括以下中间步骤： 
●在确定混合物中细胞的凝集程度之前，加入一种抗受试者球蛋白抗体到混合物中。 
优选地，，该抗受试者球蛋白抗体为抗人球蛋白(AHG)抗体。 
可选地，其中F为肽，该方法包括以下前置步骤： 
●在血清样品中加入一定量的肽； 
其中肽的量足以中和非特异性凝集或者确定反应抗体的特异性。 
优选地，，该反应性抗体对选自于由血型糖蛋白A、血型糖蛋白B或者其变种(包括MNS血型系统)组成的群组的抗原具有反应性。 
优选地，受试者为人类。 
优选地，细胞为红血球。 
本发明的第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的肽-脂类构造物的制备方法，包括以下步骤： 
●含有Cys残基的肽与本发明第一方面的第三替代例中的功能性脂类构造物反应。 
本发明的第四方面提供了一种使表达于细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变方法，包括以下步骤： 
●细胞或多细胞结构与本发明第一方面中的功能性脂类构造物溶液经一定的时间在一定的温度下接触，足以允许构造物结合细胞或多细胞结构。 
本发明的第五方面提供了一种固定一个或者多个细胞或多细胞结构的方法，包括以下步骤： 
●细胞或多细胞结构与本发明第一方面的第四替代例中的构造物溶液经一定的时间在一定的温度下接触，足以允许有效量的构造物结合细胞或多细胞结构，得到修饰细胞或多细胞结构；和 
●修饰细胞或多细胞结构与能可逆地固定到表面的亲和素-包被的底物(avidin-coated substrate)接触。 
优选地，亲和素-包被底物选自于由亲和素-包被的磁珠(magneticbeads)构成的群组。 
优选地，可逆地固定到表面是通过磁场的应用。 
本发明的第五方面的一个具体实施例提供了一种固定一个或者多个细胞或多细胞结构的方法，包括以下步骤： 
●细胞或多细胞结构与以下结构的构造物分散体经一定的时间在一定的温度下接触，足以允许有效量的该构造物结合到细胞或多细胞结构上，得到修饰细胞或多细胞结构； 
●修饰细胞或多细胞结构与亲和素-包被的磁珠接触；和 
●施加磁场固定珠子于表面； 
其中R1与R2都为(CH2)7CHCH(CH2)7。 
本发明的第六方面提供了一种促进细胞的第一和第二群体的聚集方法，包括以下步骤： 
●细胞的第一群体与本发明第一方面的第四替代例中的构造物溶液在一定的温度下经一定的时间接触，足以允许有效量的构造物结合到细胞上，得到第一群体的修饰细胞； 
●细胞的第二群体与本发明第一方面的第四替代例中的构造物溶液在一定的温度下经一定的时间接触，足以允许有效量的构造物结合到细胞上，以此提供第一群体的修饰细胞； 
●任一一种群体的修饰细胞与过量的亲和素接触；然后 
●第一群体和第二群体的修饰细胞接触。 
本发明的第六方面的一个具体实施例提供了一种促进细胞的第一和第二群体的聚集方法，包括以下步骤： 
●细胞的第一群体与以下结构的构造物溶液在一定的温度下经一定的时间接触，足以允许有效量的构造物结合到细胞上，得到第一群体的修饰细胞； 
●细胞的第二群体与该构造物溶液在一定的温度下经一定的时间接触，足以允许有效量的构造物结合到细胞上，得到第一群体的修饰细胞； 
●任一一种群体的修饰细胞与过量的亲和素接触；然后 
●第一群体和第二群体的修饰细胞接触。 
本发明的所有方面内，M典型为H+，但是可以替换为其他阳离子例如Na+、K+或NH4 +，或者其他单价取代基例如CH3。标记M’不包括M为单价取代基例如CH3。
在大部分情况下氨基酸残基或者肽通过日期为2007年2月7日的专利合作条约行政规程的附件C附录2中的表3来确定并与以下惯例保持一致： 
            H2N-XaaXaaXaa......XaaXaaXaa-COOH 
表格中采用了氨基酸残基对应的单字母代码以提供可接受尺寸的表格。 
在说明书的描述和权利要求中，下述简称、术语和短语所具含义如下： 
“亲和素”表示一种生物素-结合四聚体蛋白质，产于鸟类、爬行动物和两栖动物的卵细胞中，而且储存与它们蛋的蛋白里，它的生物素-结合同聚体和其生物素-结合修饰形式包括EXTRAVIDINTM、NEUTRAVIDINTM和NEUTRALITETM。 
“生物素-结合”表示一种与生物素基团的非共价结合，其解离常数(KD)在生物相容性条件下为10-15mol/L数量级。 
“诊断标记”表示一种分子，其在受试者的体液中的存在为受试者的显性或者病态条件的一种诊断。 
“在生物相容性介质内可分散”表示，在浓度足以使表达于细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变且不损失活性的条件下，在介质中形成一个稳定单一的体系的能力。 
“(或者它的衍生物之一)”表示一种化学结构的化学修饰，提供的一种荧光团具有大体相同物化性质，但光学特征产生变化。 
“MNS血型系统”表示血型抗原或者这些抗原的表位和变种，其呈现于血型糖蛋白A、血型糖蛋白B，或者为结果为血型糖蛋白A/B杂种的变种。 
“pcv”表示细胞体积。 
“近末端序列”表示肽序列的靠近肽(F)氨基或者羧基末端的部分。 
“反应性抗体”表示免疫球蛋白，其在受试者的体液中的存在为受试者的显性或者病态条件的一种诊断。 
“RBC”表示红血球。 
“可水溶”表示该构造物以至少100μg/ml的浓度，在没有有机溶剂或者清洁剂的情况下，与水或者盐水(例如PBS)接触时形成一个稳定单一的体系。术语“可溶”与“可分散”用作同义词。 
本发明的具体实施例将在现在参考附图页中的图详细描述。 
附图说明
图1.构造物DOPE-Ad-CMG(I)amine(11)(在2∶1D2O/CD3OD中5mg/ml，δppm)的1H-NMR谱图。 
图2.DOPE-Ad-CMG(I)-βAla-Mal-Syph(V8C)(XII)(FLEX-PC(Bruker)，DHB)的MALDI-TOF质谱。 
图3.构造物DOPE-Ad-CMG(I)-βAla-Mal-Syph(V8C)(XII)(在4∶1D2O/CD3OD中7mg/ml，pH c.7.5；600MHz，30℃，δppm)的1H-NMR谱图。 
图4.构造物Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)(在1∶1D2O/CD3OD中2.5mg/ml，δppm，600MHz)的1H-NMR谱图。 
图5.Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)(ThermoFinnigan LCQDecaXP(被动模式，30％MeOH))的ESI质谱。 
图6.储存14天后，修饰了命名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)(1mg/mL)的构造物的亲和素AF标记的红血球的荧光显微镜分析。 
图7.修饰了命名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)(0.1mg/mL)的构造物的亲和素AF标记的去透明带D3.5pc鼠类胚胎的荧光显微镜分析(放大400X)。 
图8.修饰了Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)的亲和素AF标记的鼠类胚胎的荧光共聚焦显微镜分析。 
图9.通过与命名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)的构造物孵育修饰精子后，链霉亲和素珠与精子的结合。 
图10.通过与命名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)的构造物孵育修饰RBCs后，链霉亲和素珠的保留。 
图11.命名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物的结构。 
图12.在无血清介质(A、C、E和G)和含血清介质(B、D、F和 H)中20、100和500μg/mL的Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE或单独介质来修饰的RL95-2单层。 
图13.将Avidin Alexa 488加入到修饰了Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的RL95-2单层。加入Avidin Alexa 488在37℃下孵育，4小时内荧光开始内化(C)，且在24小时内出现在细胞内部(E)的细胞的荧光显微镜图。细胞在4℃下孵育没有观察到内化(D、F)。 
发明详述 
本发明主要目的为将功能基团通过间隔臂(S)结合到二酰基或者二烃基脂类(L)以提供一种构造物(F-S-L)，其能在生物相容性介质内分散，而且也自发地结合到细胞膜或者多细胞组织的脂类双层上。 
本发明的第二个目的在于选择的结构基序(CMG)于所述的应用中的使用以及使用该结构的基序及其衍生物产生的优势。 
参考背景技术标题下引用的国际PCT申请，虽然其说明书中所述的细胞表面修饰具有优势，但是用于“一步法”的构造物特别是肽-脂类构造物的可实现性，和用于“两步法”的BioG的可实现性，使这些方法在广泛应用上产生局限。 
例如，需要一种固定肽抗原到细胞或者多细胞组织的表面的两步法，其不使用BioG或者其它从生物资源获得的结合物。 
尽管认识到国际申请号PCT/NZ2005/000052的说明书内描述的碳水化合物-脂类构造物的生物素化提供了一种“两步法”中的BioG的取代物，但仍然还需要能够使用一种生物素-脂类构造物，其具有该生物素化碳水化合物-脂类构造物的良好特性且能被用于“一步法”。 
与制备功能团(F)为碳水化合物的构造物对比，制备F为肽的构造物具有附加的技术问题。 
首先，需要一种绑于L-S或者S-L基团的肽(F)，其能在水中例如溶质的缓冲溶液例如PBS中分散，或者至少能在一种生物相容性溶剂中分散。 
克服此困难可能需要选择一种近末端序列(PTS)来促进溶解度，且 同时不改变构造物的所需生物特性。 
其次，肽-脂类构造物需要依据建议的应用要求，能在水中或者至少一种生物相容性缓冲溶液或者血清中分散(例如需要构造物为如在此定义的“可水溶”)。 
克服此困难需要选择一种间隔臂(S)来促进构造物的溶解度。 
第三方面，当建议应用为将修饰细胞例如红血球(RBCs)用于诊断应用或者作为血型质量调控品的时候，需要构造物在生物相容性缓冲溶液内可分散，且不参与非特定于诊断肽或者血型抗原的抗原抗体交叉反应。 
满足这些需求需要给间隔臂(S)和/或近末端序列(PTS)，当含有后者时，确认合适结构的基序。 
细胞或者多细胞结构(例如胚胎)的表面修饰，其使用的应用目的为促进修饰细胞或者修饰多细胞结构结合到靶表面(例如子宫内膜)时，必须避免将细胞或者多细胞结构暴露于非生物相容性溶剂或者缓冲溶液中。 
第四方面，修饰细胞或多细胞结构表面的肽脂类构造物中肽的存在，将影响与诊断标记交叉反应性的程度。 
通过肽序列内接近N末端或者C末端的残基，将肽固定到细胞或多细胞结构上，这种能力可以允许近似细胞表面有关的肽序列天然构型。 
母体聚肽(或蛋白质)的四聚体(或四元)结构内肽序列的呈现因此可被模拟。考虑到肽可以通过多种残基固定到细胞表面。例如，当接近氨基末端的残基和接近羧基末端的残基都用于固定肽，可能促进肽在表面形成“圈”构型。 
已知的肽-脂类构造物选用聚乙二醇(PEG)做间隔臂提高溶解度。但是，PEG聚合物可能影响表面肽的表达和功能。 
现未公布的国际申请号PCT/NZ2008/000239的说明书内描述了肽-脂类构造物的制备，其用于一种使细胞和多细胞组织结构表面表达的肽水平的产生质变和量变的方法，其中使用了乙烯乙二醇的低聚物作为间隔臂将构造物的脂类共价键合到肽基团。描述了使用该构造物制备用于血清诊断的细胞。 
本发明的肽-脂类构造物中，命名为CMG的结构基序作为共价键合脂类(L)和肽(F)的间隔臂(S)的组分(S1)。包含该结构基序提供了间隔臂一定程度的刚性，将肽-脂类构造物中的功能基团(肽)与修饰后细胞或者多细胞结构的表面间隔开。 
可以认可本发明的特性可以根据使用包含该结构基序的构造物，良好地应用于开发其它如本文所述的功能性脂类构造物，其中功能性基团为碳水化合物例如ABO血型的抗原糖链、荧光团例如荧光素(或者它衍生物的一种)或结合物例如生物素。 
生物素([3aS-(3aα，4β，6aα)]-六氢苯胺-2-氧-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-戊酸)是B族的水溶性维他命，也称维他命H。生物素是一种生长因子，微量存在于在每一个活细胞内。该化合物在众多天然的羧化反应中是不可或缺的，包括生产脂肪酸。 
生物素在水中的溶解度(25℃)约为22mg/100mL，在95％乙醇中约为80mg/100mL。该化合物在热水中和稀释的碱中溶解度提高，但是在其它普通有机溶剂中相对不溶。固定该功能基团到细胞和多细胞结构表面的能力提供了许多所述的应用。 
不希望被理论束缚，相信通过选择结构基序中的阳离子(M+)或者自由羧基基团的衍生物得到修饰过的结构基序，例如用甲基取代(CH3；MCMG)，功能性脂类构造物的特性可以修饰和改善来适应特殊应用。 
用于权利要求中方法的功能性脂类构造物，其特性必须为它们能稳定分散于无溶剂或者清洁剂的生物相容性介质，当构造物溶液接触到细胞或者多细胞悬浮液时，反而结合到膜的脂类双层。 
具有这些潜在冲突特性的肽-脂类构造物，除了包含未修饰(CMG)或修饰(例如MCMG)结构基序和/或包含肽(F)中的近末端序列(PTS)外，通过选择间隔臂(S)中的其它组分来制备。 
优选地，制备一种肽-脂类构造物，其通过与肽羧基末端的肽末端Cys残基(Cys)形成硫键使S链接到F，如此肽不易于氧化。 
因此可以将一系列肽制成肽-脂类构造物，用于使表达于细胞和多细胞结构表面的肽水平产生质变和量变的方法中。 
生物素-脂类构造物的一个特别的优势在于，能够使细胞或者多细胞 结构的表面固定到表面，且最小化损害细胞或多细胞结构的生物活性和生活力。 
固定细胞到表面的范例被提供出来。需要注明的是当通过亲和素包被磁珠固定到表面时，固定是可逆的，由此提供了调控细胞在表面上的选择和定位的机会。 
预期了在亚细胞分离内以及固定膜结合细胞器到表面中利用该构造物。由于可能有需求生产杂种细胞，也预期了利用该构造物促进细胞群体的聚集。 
方案I 
应了解，对于非特异性相互作用，例如二酰基或者二烃基甘油脂或甘油磷脂与膜之间的相互作用，天然存在的脂类的结构和立体异构体功能上等同。 
例如，预期二酰基甘油2-磷酸酯能被磷脂酸酯(二酰基甘油3-磷酸酯)取代。进一步预期磷脂酸的绝对构型可以为R或者S任一一个。 
结构基序(CMG)可以通过方案I和方案II中总结的方法来制备， 提供命名为MCMG(1)和CMG(2)的亚结构 
如下叙述结构基序的制备，利用该结构基序进行的功能脂类构造物制备，以及该构造物在化学和生物应用上的使用。 
具体实施方式
命名为CMG结构基序的制备
材料和方法 
丙酮、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、甲苯和邻二甲苯购自Chimmed(俄罗斯联邦)。乙腈购自Cryochrom(俄罗斯联邦)。DMSO、DMF、CF3COOH、Et3N、N，N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺购自Merck(德国)。亚氨基二乙酸二甲酯盐酸盐购自Reakhim(俄罗斯联邦)。 
Dowex 50X4-400和Sephadex LH-20购自Amersham Biosciences AB(瑞典)。硅胶60购自(德国)。四胺(H2N-CH2)4Cx2H2SO4按照Litherland等人(1938)的说明合成。使用硅胶60F254铝片(Merck，1.05554)进行薄层层析，通过用7％H3PO4浸泡后碳化检测。 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲基酯(方案I)。 
搅拌下，向(甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲基酯盐酸盐(988mg，5mmol)的DMF(15ml)混合溶液加入Boc-GlyGlyNos(3293mg，10mmol)和(CH3CH2)3N(3475μL，25mmol)。室温下混合物搅拌过夜，然后用邻二甲苯稀释(70ml)并蒸发。 
硅胶快速柱色谱(在甲苯中填装，用乙酸乙酯洗脱)得到一种粗产物。粗产物溶解于氯仿，用水、0.5MNaHCO3和饱和KCl顺序冲洗。 
氯仿萃取液蒸发后将产品在硅胶柱(在氯仿中填装，用15∶1(v/v)的氯仿/甲醇洗脱)上纯化。馏分的蒸发和残留物的真空干燥提供一种无色的厚糖浆。产量1785mg，(95％)。TLC∶Rf＝0.49(氯仿/甲醇7∶1(v/v))。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)δ，ppm：7.826(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.979(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.348和4.095(s，2H；NCH 2COO)，3.969(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.689 和3.621(s，3H；OCH 3)，3.559(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3)。 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(方案I)。 
搅拌下，向{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲基酯(1760mg，4.69mmol)的甲醇(25ml)混合溶液加入0.2M NaOH(23.5ml)水溶液并室温下保持5min。然后用乙酸(0.6ml)酸化并蒸干。 
残留物的硅胶柱色谱(在乙酸乙酯中填装，用2∶3∶1(v/v/v)的i-PrOH/乙酸乙酯/水洗脱)得到回收的{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲基酯(63mg，3.4％)和目标化合物(1320mg)。中间体然后溶解于甲醇/水/嘧啶混合物(20∶10∶1，30ml)，并流经离子交换柱(Dowex 50X4-400，吡啶型，5ml)移除残留的钠离子。 
柱子然后用同样的溶剂混合物洗脱，洗脱液蒸发后，残余物溶解于氯仿/苯混合物(1∶1，50ml)，然后蒸发真空干燥。10的产量为1250mg(74％)，白色固体。TLC∶Rf＝0.47(4∶3∶1(v/v/v)的i-PrOH/乙酸乙酯/水)。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧基甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体混合物c.3∶1。主要构象异构体；δ，ppm：7.717(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.024(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.051(s，2H；NCH 2COOCH3)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH 2NH)，3.786(s，2H；NCH 2COOH)，3.616(s，3H；OCH 3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.381(s，9H；C(CH3)3)ppm；次要构象异构体，δ＝7.766(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.015(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.288(s，2H；NCH 2COOCH3)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH 2NH)，3.858(s，2H；NCH 2COOH)，3.676(s，3H；OCH 3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.381(s，9H；C(CH3)3)。 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧琥珀酰亚胺酯(Boc-Gly2(MCMGly)Nos)(方案I)。 
向{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(1200mg，3.32mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(420mg，3.65mmol)的DMF(10ml)冰冷却混合溶液加入N，N′-二环己基碳二亚胺(754mg，3.65mmol)。该混合溶液在0℃下搅拌30min，然后在室温下搅拌2小时。 
将N，N′-二环己基脲沉淀物过滤掉，用DMF(5ml)洗涤，过滤液蒸发到最小体积。残留物然后与(CH3CH2)2O(50ml)一起振荡1小时，用倾析法移除醚萃取液。残留物真空干燥提供了白色泡沫状的活性酯(1400mg，92％)。TLC∶Rf＝0.71(丙酮/乙酸40∶1(v/v/v))。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧基甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体混合物c.3∶2。主要构象异构体；δ，ppm：7.896(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.972(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.533(s，2H；NCH 2COON)，4.399(s，2H；NCH 2COOCH3)，3.997(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.695(s，3H；OCH 3)，3.566(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3)。 
次要构象异构体；δ，ppm：7.882(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.963(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.924(s，2H；NCH 2COON)，4.133(s，2H；NCH 2COO CH3)，4.034(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.632(s，3H；OCH 3)，3.572(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3)。 
活性酯(1380mg)溶解在DMSO中，得到体积为6ml，作为0.5M溶液使用(存储于-18℃)。 
方案II 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲基酯。 
搅拌下，向(甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲基酯盐酸盐(988mg，5mmol)的DMF(15ml)混合溶液加入Boc-GlyGlyNos(3293mg，10mmol)和Et3N(3475μL，25mmol)。 
该混合物室温下(r.t.)搅拌过夜，然后用邻二甲苯稀释(70ml)并蒸发。硅胶快速柱色谱(在甲苯中填装，用乙酸乙酯洗脱)得到一种粗产物。 
粗产物溶解于氯仿，用水、0.5M NaHCO3和饱和KCl顺序冲洗。将氯仿萃取液蒸发，将产品在硅胶柱(在氯仿中填装，用15∶1的氯仿/甲醇洗脱)上纯化。 
馏分的蒸发和残留物的真空干燥得到一种无色的厚糖浆(3)(1785mg，95％)。 
TLC∶Rf＝0.49(氯仿/甲醇7∶1)。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)δ＝7.826(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.979(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.348和4.095(s，2H；NCH 2COO)，3.969(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.689和3.621(s，3H；OCH 3)，3.559(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸。 
搅拌下，向{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲基酯(1760mg，4.69mmol)的甲醇(25ml)混合溶液加入0.2M NaOH(23.5ml)水溶液。该溶液在r.t.下保持5min。然后用乙酸(0.6ml)酸化并蒸干。 
残留物的硅胶柱色谱(在乙酸乙酯中填装，用2∶3∶1的i-PrOH/乙酸乙酯/水洗脱)得到回收的(3)(63mg，3.4％)和粗目标化合物(1320mg)。 
粗目标化合物溶解于甲醇/水/吡啶混合物(20∶10∶1，30ml)，并 流经离子交换柱(Dowex 50X4-400，吡啶型，5ml)移除残留的钠离子。 
柱子用同样的溶剂混合物洗涤，洗脱液蒸发后，溶解于氯仿/苯混合物(1∶1，50ml)，然后蒸发真空干燥提供纯化物(10)的产量为1250mg(74％)，白色固体。 
TLC∶Rf＝0.47(4∶3∶1的i-PrOH/乙酸乙酯/水)。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧基甲基-甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体混合物c.3∶1。 
主要构象异构体；δ，ppm：7.717(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.024(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.051(s，2H；NCH 2COOMe)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH 2NH)，3.786(s，2H；NCH 2COOH)，3.616(s，3H；OCH 3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.381(s，9H；C(Me)3)ppm。 
次要构象异构体：δ＝7.766(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.015(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.288(s，2H；NCH 2COOMe)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH 2NH)，3.858(s，2H；NCH 2COOH)，3.676(s，3H；OCH 3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.381(s，9H；C(Me)3)ppm。 
制备{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧琥珀酰亚胺酯Boc-Gly2(MCMGly)Nos。 
向{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(1200mg，3.32mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(420mg，3.65mmol)的DMF(10ml)冰冷却混合溶液加入N，N′-二环己基碳二亚胺(754mg，3.65mmol)。该混合溶液在0℃下搅拌30min，然后在r.t.下搅拌2小时。 
将N，N′-二环己基脲沉淀物过滤掉，用DMF(5ml)洗涤，过滤液蒸发到最小体积。 
残留物然后与Et2O(50ml)一起振荡1小时，用倾析法移除醚萃取液，真空干燥残留物，产出白色泡沫状的目标化合物(1400mg，92％)。 
TLC∶Rf＝0.71(丙酮/乙酸40∶1)。 
1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧基甲基甘氨酸单元的顺式和反式构象异构体混合物c.3∶2。 
主要构象异构体；δ，ppm：7.896(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.972(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.533(s，2H；NCH 2COON)，4.399(s，2H；NCH 2COOMe)，3.997(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.695(s，3H；OCH 3)，3.566(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。 
次要构象异构体；δ＝7.882(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.963(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.924(s，2H；NCH 2COON)，4.133(s，2H；NCH 2COOMe)，4.034(d，J＝5.1Hz，2H；COCH 2NH)，3.632(s，3H；OCH 3)，3.572(d，J＝5.9Hz，2H；COCH 2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。 
制备DOPE-Ad-CMG(I)胺(方案III)
DOPE-Ad-CMG(2)胺依据方案III自{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰基氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧琥珀酰亚胺酯Boc-Gly2(MCMGly)Nos制备。 
制备功能性脂类构造物(F-S-L)(方案IV)
制备DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-Milt(K，M)(X) 
构造物DOPE-Ad-CMG(2)-βAla-Mal-Milt(K，M)(X)依据方案IV来制备。 
DOPE-Ad-CMG(2)胺在i-PrOH-水中用5倍过量的3-马来酰亚胺丙酸氧苯并三唑酯(12)处理。 
DOPE-Ad-CMG(2)转换为马来酰亚胺衍生物(约70％)的程度有点低，推测为是由于为保持DOPE-Ad-CMG(2)于溶液要求加入了二异丙基乙胺，依据该有机碱的量，促进了中间体的快速水解。 
马来酰亚胺衍生物以40％的产率在Sephadex LH-20(i-PrOH-水，1∶2)上凝胶渗透色谱分离。 
起初马来酰亚胺-衍生物和肽的结合尝试使用i-PrOH-TRI缓冲溶液，pH8(1∶2)，但是中间体在此介质中似乎几乎不可溶解。然而，吡啶(1μl/mg中间体)的添加导致了反应物迅速溶解并且令人吃惊地干净和基本完全的转换。 
显著地，尽管没有使用还原剂防止肽的氧化灭活作用，但是整个反应混合物的质谱分析没有发现S-S二聚体的痕迹。 
所需的构造物(X)在Sephadex LH-20柱上纯化。由于含馏分的(X)轻微不透明，再次遇到溶解度问题。 
这将显示加入到洗脱剂的碱量不足以保持化合物适当带电荷且在浓度范围为1～5mg/ml时可溶解。 
纯化构造物(X)的结构由NMR和MS色谱清楚的确定。 
NMR谱显示了预期的肽：由信号比率推出的DOPE比率为最具特征的芳香族和烯烃质子。 
依据MS数据，几乎最终产物(X)的一半都自发的形成焦谷氨酰衍生物([M-17]+离子)。 
(X)的MALDI MS谱出现的峰与未修饰肽一致，但是同样物质在ESI MS色谱的相关峰消失。这归因于硫代琥珀酰胺键(逆向迈克尔反应)在MALDI离子化条件(破坏性技术)下易于断裂。 
制备肽-脂类构造物的常规方法经过微小改变，应用于制备包含了选自于下述肽清单中的肽(F)的构造物： 
依照血清诊疗法，详尽叙述肽-脂类构造物在使表达于细胞和多细胞结构表面的功能基团产生质变和量变方法中的使用。 
在下面的表格内，总结了多克隆血清和已知类型单克隆抗体与构造体DOPE-Ad-CMG(I)-βAla-Mal-Mur(D14C)(XI)修饰的红血球(RBCs)的交叉反应性(2小时，37℃)。 
  试剂   编号   类型   EIA/Miltenberger特异性
  2   T217   人类AB型血清   通过EIA与MUT-T肽反应
  3   T165   人类O型血清   通过EIA与MUR肽反应
  4   T7202   人类B型血清   通过EIA与MUT-M肽反应
  6   T6025   人类A型血清   通过EIA与MUT-T肽反应
  7   T8445   人类O型血清   不确定
  8   T5896   人类O型血清   不确定
  9   MIII   单克隆抗体   与Mi III红细胞反应
  10   Mia   单克隆抗体   与Mi III红细胞反应
  11   Mur   单克隆抗体   与Mur阳性红细胞反应
  12   Gam   IgG单克隆抗体   与Mi III红细胞反应
  13   BoxH   人类血清   不确定
  14   TAP1   人类O型血清   假定MUT-K特异性
  15   TAP2   人类血清   假定MUR特异性
用肽-脂类构造物修饰红血球
混合1体积的洗涤填装红血球和1体积的肽-脂类构造物以修饰红血球，其中肽-脂类构造物浓度为10～1000μg/ml，分散于细胞介质(CelpresolTM)内的。 
悬浮液为下列任一一种： 
1.在洗涤之前37℃孵育2小时，并以浓度0.8～3％悬浮在用于血清诊断分析的细胞介质内(方法1)；或 
2.在洗涤之前室温下(约25℃)孵育3～4小时，然后4℃温育18小时，然后洗涤并以浓度0.8～3％悬浮在用于血清诊断分析的细胞介质中(方法2)。 
修饰红血球的试管血清测试
血清反应通过两种确立的系统中的任一种分级和评分(0或‘-’＝无凝集，1+或者3＝非常弱的凝集，2+或者5＝弱凝集，3+或者8＝中度的强烈凝集，4+或者10/12＝强烈凝集) 
血清平台使用试管(将试剂和反应物加入塑料或玻璃血清试管，正确孵育后，洗涤并离心，通过眼睛目视观察和10倍放大目镜观察反应，并评分)和BioVue(将反应物加入带有珠子的盒子(包含一些反应物)，正确孵育后离心，观察捕获于凝胶基质的反应模式)。BioVue是Ortho-Clinical Diagnostics公司的一种血清柱凝集平台。Diamed是Diamed公司的血清柱凝集平台。 
血清样品从47位筛选状态为抗体阴性的血液捐献者获得。这些样品命名为“阴性样品”，但是未确定是否不含抗Miltenberger抗体。 
三种血清样品T217、T6025、T5896已知具有Miltenberger相关抗体。这些样品命名为“阳性样品”，但是未确定是否含有抗命名为 DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)(M00)的构造物肽的抗肽抗体。 
3％修饰RBCs悬浮液在PBS中制备和30μl悬浮液和30μl血清样品混合。混合物然后37℃孵育45分钟。孵育后，RBCs用ImmufugeTM(设置：“高”)离心10s，在用PBS洗涤3遍前观察凝集。 
洗涤后，加入一滴EpicloneTM抗人球蛋白(AHG)，试管用ImmufugeTM(设置：“高”)离心10s。然后判读试管并记录血清得分。 
下表的图例提供了观察到的血清得分的评价。 
表1.从47位血液捐献者获得，预期不具有抗Miltenberger活性(“阴性样品”)的血清样品反应性的总表。AHG+表示样品在抗人球蛋白测试中有反应。AHG-表示样品不反应。RBCs用所述浓度的命名为DOPE-PEG6-βAla-Mal-Milt(K)的肽-脂类构造物修饰。血清抗修饰RBCs测试在其存储3天后进行。 
表2.3种已知含有抗Miltenberger复合物抗原的抗体的血清的试管血清学结果。得分结果显示了样品抗人球蛋白测试的反应性，1+＝弱，2+＝中等，3+＝中等/强，4+＝强，-表示样品不反应。RBCs用所述浓度的肽-脂类构造物修饰。血清抗修饰RBCs测试在其存储3天和24天后进行。(n.t.-未测试)。 
表3.3种已知含有抗Miltenberger复合物抗原的抗体的血清的Diamed柱血清学结果。得分结果显示了样品抗人球蛋白测试的反应性，1+＝弱，2+＝中等，3+＝中等/强，4+＝强，-表示样品不反应。RBCs用所述浓度的肽-脂类构造物修饰。血清抗修饰RBCs测试在其存储3天和24天后进行。 
  样品号   22  (50  μg/ml)   17  (200  μg/ml)   24  (200  μg/ml)   判读
  488-6   10       K
  9327986660   8   3   0   K
  9325490091   5   5   0   K
  9328791834   5   3   0   K
  621-3   5       K
  922390844-5   0   12   0   Mur
  9322338631   0   10   0   Mur
  914146821-8   0   10   0   Mur
  932809044-1   0   8   0   Mur
  942433813-3   0   8   0   Mur
  942404708-4   0   5   0   Mur
  942421413-0   0   5   0   Mur
  942223755-1   0   5   0   Mur
  942442720-2   0   5   0   Mur
  927619701-8   0   3   0   Mur
  912485657-9   0   3   0   Mur
  926190919-0   0   3   0   Mur
  9328154853   0   10   3   Mur+Hil
  9328118428   0   10   5   Mur+Hil
  9425256505   0   8   8   Mur+Hil
  942433855-3   0   8   8   Mur+Hil
  942753165-4   0   8   8   Mur+Hil
  9424292604   0   8   5   Mur+Hil
  9427455417   0   5   5   Mur+Hil
  S-3   0   3   5   Mur+Hil
  942448627-8   0   0   5   Hil
  942423002-4   0   0   3   Hil
  942762589-1   0   0   3   Hil
  9424248012   0   0   0   其它
  9427615156   0   0   0   其它
  9424396133   0   0   0   其它
  样品号   22  (50  μg/ml)   17  (200  μg/ml)   24  (200  μg/ml)   判读
  9427613497   0   0   0   其它
  927175131-4   0   0   0   其它
  932467774-5   0   0   0   其它
  927299700-1   0   0   0   其它
  926555294-1   0   0   0   其它
  932360876-4   0   0   0   其它
  927516053-2   0   0   0   其它
  942404708-4   0   0   0   其它
  589-6   0       其它
表11.阳性血清反应性。Miltenberger阴性红细胞，用转化浓度为50μg/ml的肽-脂类构造物M22、转化浓度为200μg/ml的M17和转化浓度为200μg/ml的M24修饰，进行抗范围内的具有天然Mi III抗体反应活性的人类血清测试，来确定反应活性的比率。同样体积的填装RBCs和含有50μg/ml构造物的溶液在室温下接触3小时，然后4℃接触18小时。三种不同的构造MUT、MUR和HIL能够将大多数天然Mi III反应活性多克隆抗体区分为特异性反应活性属性。十二种血清与修饰细胞不具有反应活性，意味着它们可能具有对其它Mi III抗原的特异性。 
表12.抗-MUT血清反应活性。Miltenberger阴性RBCs用浓度为10～200μg/ml的肽-脂类构造物M22、浓度为50μg/ml的M17和浓度为50μg/ml的M24来修饰。修饰细胞进行抗具有天然Mi III抗体反应活性，范围内的台湾人类血清(TAP1)测试来确定反应活性属性。反应活性与天然Mi III抗原阳性细胞相比较。TAP1(台湾Miltenberger抗体阳性样品)。TAP1血清显示含有IgG和IgM抗体(后者在盐水内具有反应性)导致抗天然Mi III阳性细胞。由对AbtectcellTM和PhenocellTM抗体筛选和确认平板缺少反应活性，得知不存在其它抗红细胞抗体。由与转化浓度10～200μg/ml的M22修饰细胞的反应活性(且没有与未转化细胞-0μg/ml)得知存在导致抗MUT的抗体。由M22修饰细胞检测盐水中反应的失败得知该试验对IgG类型的抗体灵敏且不对IgM灵敏-一个临床有用的结果。由与M17和M24转化细胞的反应活性的缺少得知缺少对MUR和HIL变异的抗体。 
表13.抗-MUT血清反应活性。Miltenberger阴性红细胞用浓度为100μg/ml的肽-脂类构造物M28和浓度为100μg/ml的M22来转化，进行抗具有天然Mi III抗体反应活性，检测的范围内的台湾人类血清(TAP2)测试来确定反应活性属性。反应活性与天然Mi III抗原阳性细胞相比较。TAP2(台湾Miltenberger抗体阳性样品)。TAP2血清显示含有IgG抗体抗体导致抗天然MiIII阳性细胞。由对AbtectcellTM抗体筛选和确认平板缺少反应活性，得知不存在其它抗红细胞抗体。由与M28修饰细胞具有反应活性同时不与M22修饰细胞具有反应活性，得知存在导致抗MUR肽的抗体。 
表15.抗-MUT(TAP1)反应活性。Miltenberger阴性红细胞用浓度为50μg/ml的肽-脂类构造物M22、M33、M34、M35、M36、M37、M40和M41来修饰(2小时，37℃)。修饰细胞进行抗台湾Mi III抗体阳性血清TAP 1测试来检测它的MUT反应活性属性。TAP1(台湾Miltenberger抗体阳性样板)。TAP1能够检测出一些，但不是所有MUT变异体。预期缺少与M40和M41(HIL肽)修饰细胞和未转化细胞的反应活性。 
                             平板血清#7(T8445)
  30   Mur 9   D   T   Y   P   A   H   T   A   N   E       8
  17   Mur 2     T   Y   P   A   H   T   A   N   E   V     10
  28   Mur 6     T   Y   P   A   H   T   A   N   E       8
  27   Mur 5     T   Y   P   A   H   T   A   N         -
  25   Mur 4       Y   P   A   H   T   A   N   E       3
  26   Mur 7       Y   P   A   H   T   A   N   E   V     10
  31   Mur 10       Y   P   A   H   T   A   N   E   V   S   8
  19   Mur 3         P   A   H   T   A   N   E   V     8
  29   Mur 8         P   A   H   T   A   N   E   V   S   8
表16.抗-MUR(TAP1)反应活性。Miltenberger阴性红细胞用浓度为50μg/ml的肽-脂类构造物M17、M19、M25、M26、M27、M28、M29、M30和M31来修饰(2小时，37℃)。修饰细胞进行抗Miltenberger抗体阳性板的抗体阳性血清#7测试来检测它的MUR反应活性属性。 
表18.假阳性MUR M17构造物与102阴性血清的反应。肽-脂类构造物M17修饰细胞进行抗102阴性血清样品的测试。肽-脂类构造物M17修饰细胞与阴性血清给出最高“假阳性”反应构造物显示达到36％假阳性率。 
T系列反应性(n＝58) 
    2   4   31   44   61   18   21   28   55   42   63   62   7   20   48   22   39   23   30   阳性％
 M17   10   8   8   10   10   12   12   12   12   10   10   8   8   8   8   8   5   3   3   33％
 M28   10   8   8   10   10   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   9％
 M30   10   8   8   10   10   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   0   9％
39T阴性样品与所有3种构造物呈阴性。大序列＝102 
                              T18   T21   T28   T55   T78   T92
  30   Mur 9   D   T   Y   P   A   H   T   A   N   E       -   -   -   -   -   -
  17   Mur 2     T   Y   P   A   H   T   A   N   E   V     12   12   12   12   12   12
  28   Mur 6     T   Y   P   A   H   T   A   N   E       -   -   -   -   -   -
  27   Mur 5     T   Y   P   A   H   T   A   N         -   -   -   -   -   -
  25   Mur 4       Y   P   A   H   T   A   N   E       -   -   -   -   5   -
  26   Mur 7       Y   P   A   H   T   A   N   E   V     5   10   12   10   10   12
  31   Mur 10       Y   P   A   H   T   A   N   E   V   S   -   10   12   -   8   12
  19   Mur 3         P   A   H   T   A   N   E   V     -   -   -   12   -   -
  29   Mur 8         P   A   H   T   A   N   E   V   S   -   -   5   -   -   8
5种样品与所有3种构造物反应 
                              平板血清#7   (T8445)   假阳性
  30   Mur 9   D   T   Y   P   A   H   T   A   N   E       8   -
  17   Mur 2     T   Y   P   A   H   T   A   N   E   V     10   +++
  28   Mur 6     T   Y   P   A   H   T   A   N   E       8   -
  27   Mur 5     T   Y   P   A   H   T   A   N         -   -
  25   Mur 4       Y   P   A   H   T   A   N   E       3  
  26   Mur 7       Y   P   A   H   T   A   N   E   V     10   +++
  31   Mur 10       Y   P   A   H   T   A   N   E   V   S   8   ++
  19   Mur 3         P   A   H   T   A   N   E   V     8   +
  29   Mur 8         P   A   H   T   A   N   E   V   S   8   +
表19.“M17假阳性”阴性血清抗其它Mur构造物的反应活性。6种最高的抗肽-脂类构造物M17修饰细胞为假阳性的阴性血清，进行抗修饰细胞(2小时，37℃)的测试，所述修饰细胞用浓度为50μg/ml的肽-脂类构造物M19、M25、M26、M27、M28、M29、M30和M31修饰。修饰细胞在BioVue AHG卡内测试。肽-脂类构造物M17修饰细胞提供了与阴性血清最多“假阳性”反应。6种最多假阳性样品的反应活性，在进行抗其它修饰细胞的测试时，显示部分不具有反应性(M28、M29)，部分反应性很弱或者显示了单一不连续的反应(M5、M29、M19)，同时其它的为反应活性更强(M31、M26)。氨基酸序列的微小变化能够影响假阳性反应率。构造物M30和M28修饰细胞都显示出特异性和低非特异性。 
表20.通过500μg/ml的构造物分散液接触细胞(方法1)，修饰结合了M1肽-脂类构造物或M2肽-脂类构造物的RBCs，其与血清的反应性用肽QTNDKHKRDTY“中和”，并重新进行抗修饰细胞的测试。通过加入10μL 1mg/ml的肽溶液至50μL体积的血清，在37℃下孵育30分钟 来将血清中和。测试在BioVue AHG卡内进行。 
表21.通过500μg/ml的构造物分散液接触细胞(方法1)，修饰结合了M13肽-脂类构造物的RBCs，其与血清的反应性用肽SSQTNDKHKRDTY“中和”，并重新进行抗修饰细胞的测试。通过加入10μL 1mg/ml的肽溶液至50μL体积的血清，在37℃下孵育30分钟来中和血清。测试使用BioVueTM进行。 
表22.细胞用肽-脂类构造物M22修饰(2小时，37℃)且确认具有两种阳性反应。然后进行中和实验。40μl A体积的血浆与10μl肽或者Ar-C以浓度1.0mg/ml在37℃下孵育30分钟。然后在BioVueTM内进行标准AHG测试。PAC74的假阳性反应证实是一个未被添加的肽中和的反应。TAP1的真阳性反应确认是被肽和整个构造物中和的反应，但是不包括仅含有乙酰化半胱氨酸的构造物。 
表23.细胞用肽-脂类构造物M28修饰(2小时，37℃)且确认具有四种阳性反应。然后进行中和实验。40μl A体积的血浆与10μl肽或者Ar-C以浓度1.0mg/ml在37℃下孵育30分钟。然后在BioVueTM内进行标准AHG测试。PAC70、71和72与M28肽的中和反应显示特异性。事实为，不相关的肽M22也能够导致血清PAC71和PAC72中和，同时减少与其它不相关结构的分数，改变这两种血浆在假阳性反应活性上的结果。PAC70不和Miltenberger阳性细胞反应的事实表明，尽管抗体看起来存在于肽序列，但这并非血型特异性。相反的是，尽管TAP2没有完全被肽抑制，得分上大量的减少表明了特异性，尽管有可能该特异性可以显示的同时具有低水平的非特异性，如抗Cys-CMG-DE反应得分下降显示那样。 
考虑到前述表格展示的MUT肽反应活性，表明肽M22、M36和M37当与序列1相比时，该序列在在先文献中(Reid和Lomas-Francis(2005))被确定，对人类多克隆抗体平板都具有高灵敏度和高特异性。 
用替代例中肽的肽-脂类构造物修饰红血球
制备肽-脂类构造物，包含CMG(2)和下述肽： 
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluCys(M44)和 
CysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGlu(M45) 
肽的末端被甲酰化并且酰胺化来提供“封端”肽。测试任意Miltenberger抗体阳性样品以及三种假阳性抗体阴性样品的抗RBCs的反应活性(50μg/ml，2小时，37℃)，所述RBCs修饰结合了这些“封端”肽-脂类构造物。 
评估并记录了反应活性于表24。肽的封端没有影响阳性样品的反应活性，也没有显示出影响假阳性抗体阴性样品的反应活性。然而，通过位于氨基末端(相对于羧基末端)的Cys残基的肽键合看起来减少了与假阳性抗体阴性样品具有反应活性的可能性，并提高已有抗体阳性样品的反应活性。 
不希望受理论束缚，考虑到通过修饰结合M45的细胞，肽的呈现可能更加类似于天然抗原表达的对应肽序列的呈现。 
表24. 
用生物素-脂类构造物修饰细胞和多细胞结构
使用Avidin-Alexafluor(Avidin AF)，通过名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造体修饰红血球(RBCs)和鼠科动物胚胎。 
材料 
在水中制备浓度为10mg/ml的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(100μl)构造物储备溶液。在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)内制备浓度为2mg/ml的Avidin-Alexafluor(Avidin AF)储备溶液。在无菌PBS内制备浓度为5mg/ml生物素化糖苷(BioG)溶液。 
红血球 
用CelpresolTM制备名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物和BioG(正调节)稀释系列，浓度为0.001、0.1、0.1和1mg/mL。0组红血球(RBCs)用15μL储备RBCs和5μL名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE构造物或BioG稀释溶液孵育来制备。孵育在一个标准体积为1.5mL塑料Ependorf试管内水浴37℃下进行2小时。0组RBCs与浓度为0.33mg/mL的BioG溶液孵育，作为正调节。 
孵育的RBCs在小型离心机内用PBS洗涤三遍。通过加入10μL的浓度为0.1mg/mL的Avidin AF溶液，对洗涤后修饰RBCs进行荧光标记。然后RBCs在黑暗中水浴37℃下孵育1小时，用PBS洗涤三遍。 
洗涤后荧光标记的RBCs85％溶液，在荧光显微镜下488nm处于带盖玻片的载玻片上观察，摄影曝光1.903(图6)。荧光信号的强度使用0(未观察到荧光)到4(观察到的最大荧光)记录系统来记录。 
从与名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物孵育而获得的洗涤后修饰RBCs，浓度为1mg/mL，其分样保留并在14℃存储14天。RBCs对构造物的保留量，通过与Avidin-AF照之前孵育来评估。 
荧光度的评估记录于表25。 
  稀释液   (mg/ml)   1   0.1   0.01   0.001   0
  Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE   0天   4   2   1   0   0
  Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE   14天   4   -   -    -   -
  BioG   0天   3   2   0   0   0
表25. 
鼠类胚胎 
鼠类胚胎(桑葚胚/早期胚泡阶段，3.5天)在50微升微滴BlastassistTM培育介质内孵育。胚胎与浓度为0.1、1或2mg/mL的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物或者浓度为0.5mg/mL的BioG孵育(正调节)。 
胚胎的透明带通过用0.5％的霉链蛋白酶处理(4分钟孵育)移除，且在引入微滴前在胚胎处理介质中洗涤3遍。每种微滴在引入胚胎前5％CO2内37℃下过夜平衡。 
含有胚胎的微滴与名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物37℃下5％CO2内孵育2小时。含有胚胎的微滴与BioG37℃下5％CO2内孵育40分钟。 
孵育后，每组胚胎都在处理介质中洗涤3遍，转移到含有2mg/mLAvidin-AF微滴的50微升微滴，用于荧光标记。含有胚胎的微滴37℃下黑暗中孵育30分钟。 
每组胚胎都在处理介质中洗涤3遍，装于带盖玻片的载玻片上用显微镜观察。胚胎在荧光显微镜下488nm处被观察。荧光信号的强度使用0(未观察到荧光)到4(观察到的最大荧光)记录系统来记录。 
  Biotin-CMG(2)-Ad-   DOPE   0.1mg/mL   Biotin-CMG(2)-Ad-   DOPE   1mg/mL   Biotin-CMG(2)-Ad-   DOPE   2mg/mL   BioG   0.5mg/mL   仅有介质
  2   1   1   3   1
  n＝21   n＝19   n＝19   n＝19   n＝19
表26. 
固定精子和细胞
通过使用名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物和链霉亲和素珠子( M-280)，固定精子和红血球(RBCs)。 
材料 
在水中制备浓度为10mg/ml的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(100μl)构造物储备溶液并在培育介质内(Medicult 10310060A)稀释提供0.1mg/ml的测试稀释液。 
通过在培育介质内稀释10倍(Medicult 10310060A；预先在37℃下5％CO2大气内孵育至少2小时)，评估新鲜精液(少于1天)中的精子的游动性(80％，级别3(快速，向前推进))。通过去离子水10倍稀释液来进行精子计数(91.5×106/mL)。 
放置1.1mL新鲜精液于梯度SpermGrad 125(Vitrolife 10099；2mL40％溶液在2mL80％溶液上，15mL圆底试管)并500xg离心20min，以此冲洗并分离精子。 
梯度的底层(c.0.7mL转移到4mL圆底试管内，加入c.2mL冲洗(处理)介质(Medicult 10840125A)。试管在300x g离心10min，精子再洗涤两次(通过试管倒置混合)。 
洗涤的精子样品37℃下5％CO2大气内过夜。过夜后通过去离子水10倍稀释液来进行精子计数(c.25×106/mL)。 
精子 
4个0.6mL Ependorf试管(A-D)中，分别加入100μl量的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)的构造物测试稀释液，在1个0.6mL Ependorf试管(E)中加入100μl的培育介质。 
在向每个试管加入c.70μL精子(c.25×106/mL)，并孵育120min(A)、60min(B)、30min(C)、10min(B)和120min(E)之前，开口试管37℃下5％CO2气氛内孵育。 
孵育后，加入几滴冲洗介质，试管在300x g离心5min。精子在重新悬浮于培育介质之前用冲洗介质再洗涤两次，最终体积为100μl。 
浓度为c.6.25×106/100μl的链霉亲和素珠子在BSA加冲洗介质内稀释35倍，当等体积混合稀释的修饰精子悬浮液时，提供珠子/精子比率为0.1。 
5μl量的修饰精子稀释悬浮液在载玻片上与5μl的链霉亲和素珠子 稀释悬浮液混合，盖上盖玻片。 
混合物在显微镜下放大400x观察。图9提供了该混合物与0.1mg/mL的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE(I)的构造物孵育60min后，得到的混合物显微照片(B)。 
评估链霉亲和素珠子与修饰精子的结合记录于表27。 
表27. 
观察到精子尽管结合了珠子，还是保留了运动性(没有顶体反应就是证据)，其优先结合到运动精子上。 
红血球 
用CelpresolTM制备1mg/mL的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物。60μL量的洗涤组红血球(RBCs)通过与20μL该构造物的稀释液37℃下孵育2小时来修饰。 
修饰RBCs用PBS洗涤两遍，用上述的CelpresolTM洗涤一遍。在CelpresolTM中制备洗涤细胞(修饰的或者调控)的2％细胞悬浮液，使用血细胞计数器确定细胞浓度为(150×106/mL)。同样地确定链霉亲和素珠子的浓度为(134×106/mL)。 
往带有附于基体上的钕(稀土)超强磁铁(Magnets NZ Limited)的96-孔平板的孔中加入50μL体积的链霉亲和素珠子悬浮液。加入50μL体积的RBCs悬浮液以提供珠子对RBC比率为c.1∶1，室温下孵育1小时以允许RBCs固定， 
孔用PBS洗涤三遍，用移液管吸出洗涤溶液。洗涤后的孔在显微镜 下观察，确定RBCs被保留(图10)。 
分类细胞群体
在CelpresolTM中制备0.5mg/mL的名为Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE的构造物，使用10μL体积修饰在1ml Eppendorf试管内的30μL填装细胞量的0组RBCs，提供细胞的第一群体。未修饰群体A RBCs用做细胞的第二群体。 
细胞的两个群体都在水浴37℃下孵育2小时，然后使用Immufuge II(低速，1min)在PBS内洗涤两遍，在Celpresol内洗涤一遍。每种悬浮液的细胞浓度通过加入1.5mL制成2％。 
RBCs与亲和素化磁性Dynabeads以RBC：珠子大致为1的比例混合，室温下回转器上孵育10min。 
RBCs第一群体和第二群体样品然后以相同体积(每种35μL)在Ependorf试管内混合2分钟。 
Ependorf的内容物转化到了96-孔板的孔中，在孔的上面施加磁场1分钟。在施加磁场时仔细移除上清液，不破坏珠子。然后通过加入30μL的上清液和30μL抗-A抗体于DynamedTM凝胶卡中，评估上清液中细胞的血型。0组RBCs利用磁场的保留可以通过0组细胞微粒的缺失得以证明。 
用生物素-脂类构造物修饰细胞层
评估了在无血清和含血清介质内，细胞系RL95-2(从人类子宫内膜腺癌建立(ATCC HTB CRL 1671))单层的修饰。 
含有1％青霉素/链霉素(Gibco 15140-122，Invitrogen NZ)的D-MEM/F12(Gibco 11320-033，Invitrogen NZ)用做无血清介质。含1％青霉素/链霉素的D-MEM/F12 10％FBS(Gibco 10091-130，Invitrogen NZ)和5μg/mL胰岛素(Gibco 12585-014，Invitrogen NZ)用做含血清介质。 
细胞系RL95-2悬浮液在预先温暖的含血清介质内稀释到所需浓度例如4×105细胞/mL。25μl量的悬浮液用接种于所需Terasaki托盘孔内，如此每次处理都重复执行。该盘在5％CO2 37℃下孵育器内孵育过夜， 直至单层大约汇合了60％。 
制备Biotin-CMG(2)-Ad-DOPE稀释液，加入12μl体积于含有洗涤细胞层的孔中，提供最终浓度为20、100或者500μg/mL。托盘37℃下，5％CO2孵育120min。 
然后洗涤细胞，加入12μl体积的0.1mg/mL Avidin Alexa 488溶液。托盘然后继续在室温下黑暗中孵育30分钟。 
单层最终用PBS洗涤三遍，托盘倒置，使用Olympus BX51荧光显微镜用200x放大拍照，曝光时间475ms(图12)。 
当构造物以20、200和500mg/mL插入无血清介质时，在细胞膜上观察到均匀强度的荧光信号，构造物浓度增加其强度加大(图12A、C和E)。当构造物插入含血清介质时，在同样的浓度下观察到弱化的荧光(图12B、D和F)。该结果显示将构造物结合到细胞膜的最优化需要无血清介质。 
当构造物以20、200和500mg/mL插入无血清介质时，在细胞膜上观察到均匀强度的荧光信号，构造物浓度增加其强度加大。荧光强度还随着插入时间的增加而加大(表28). 
该结果显示构造物浓度和/或增加插入时间增加后，发生的构造物到细胞膜的结合最优化。 
表28.构造物浓度和/或增加插入时间增加后，发生的构造物到细胞膜的结合最优化。 
‘na’代表“未评估” 
当Avidin Alexa 488加入到构造物修饰RL95-2细胞且在37℃下孵育4和24小时，荧光逐渐从细胞表面转移到细胞内部(图13)当细胞在4℃下孵育时，观察不到内化。 
当在无血清介质培育时，插入后24小时在构造物修饰RL95-2细胞内检测到荧光，虽然从T＝0荧光开始减少(表29)。然而，当细胞在含血清的介质培育时，最高浓度的构造物(500mg/mL)内检测到的荧光得分为1+，低浓度无。该结果显示在插入后24小时，细胞膜内构造物保持的最优化条件为在无血清介质培育，而不是含血清介质。 
表29.插入后24小时构造物的保留。插入后24小时在无血清介质内培育的细胞上检测到了构造物，但是仅在最高浓度的有血清介质检测到。‘na’表示“未评估”。 
抗原呈递的修饰
国际申请号PCT/NZ2005/000052(公布号WO 2005/090368)的说明书描述了的用于制造质量控制细胞的构造物量是制造成本的决定因素。 
预期从细胞最接近的环境有一定距离的抗原的呈递，可通过交叉反应抗体和随后的凝聚促进识别。估计功能性脂类构造物(F-S-L)的抗原(F)，距细胞表面的距离，当间隔臂(S)包括了本发明所述功能性基团的时候，为7.2nm(CMG(2))和11.5nm(CMG(4))。该距离可与构造物(F-S-L)抗原的1.9nm对比，其间隔臂为国际申请号PCT/NZ2005/000052(公布号WO 2005/090368)的说明书描述的一种间隔臂例如Atri-sp-Ad-DOPE(I)时。 
为检验假设，在CelpresolTM内制备50μM、10μM和5μM的四种不 同三糖(Atri)-脂类构造物溶液。然后通过使0.6mls(pcv)的洗涤RBCs接触0.6mls的相关溶液，制备修饰红血球。混合物在37℃下孵育2小时，然后洗涤3遍，提供修饰细胞悬浮液。 
修饰细胞悬浮液在适用于BioVue血清卡的Celpresol LISSTM内制备，浓度为0.8％。0.05mls体积的CSL单克隆抗体-A(026129801)和0.05mls的修饰细胞悬浮液相继加入每张卡上。在BioVue套盒离心机内离心后记录反应(表29)。 
比较反应记录的Atri-脂类构造物摩尔当量，说明需要更少CMG(2)或者CMG(4)构造物以提供相等的血清学结果。比较CMG(2)和CMG(4)，没有显著的增益。MCMG(2)有轻微的，但不是显著的改变。 
尽管本发明通过实施例来描述，但应理解，对权利要求所述的方法可以变形和修改，而不脱离本发明的范围。如所述，应认为对于一个非特异性反应，例如功能性脂类构造物的二酰基或者二烷基甘油脂部分与膜、天然脂类的结构和立体异构体之间的相互作用，在功能上等同。 
当已知替代物存在特有的性质，该替代物犹如特别引用，包括在本发明内。例如，假定二酰基甘油2-磷酸盐能被磷脂酸盐(二酰基甘油3-磷酸盐)替代，且磷脂酸盐的绝对构型可以为R或S的任一种。 
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Claims (34)

1.一种结构为F-S-L的功能性脂类构造物，其中F为功能性基团，所述的功能性基团F选自于由碳水化合物、肽、化学反应性基团、结合物或者荧光团组成的群组，L为二酰基或者二烷基脂类，S为共价键合F到L的隔离臂且包括亚结构：
其中g为整数1、2或3，M为单价阳离子或者取代基，*为非H。
2.如权利要求1所述的功能性脂类构造物，其中所述亚结构为：
其中h为整数1、2、3或4。
3.如权利要求2所述的功能性脂类构造物，其中g是整数2且h为整数1、2或4。
4.如权利要求3所述的功能性脂类构造物，其中M为H或CH3。
5.如权利要求4所述的功能性脂类构造物，其中L为二酰基甘油磷脂。
6.如权利要求5所述的功能性脂类构造物，其中L为磷脂酰乙醇胺。
7.如权利要求6所述的功能性脂类构造物，其中所述功能性脂类构造物的结构包括以下局部结构：
其中v为整数3、4或5，M’为单价阳离子，R1和R2独立地选自于由脂肪酸反-3-十六碳烯酸、顺-5-十六碳烯酸、顺-7-十六碳烯酸、顺-9-十六碳烯酸、顺-6-十八碳烯酸、顺-9-十八碳烯酸、反-9-十八碳烯酸、反-11-十八碳烯酸、顺-11-十八碳烯酸、顺-11-二十碳烯酸、顺-13-二十二碳烯酸的烷基或者烯烃基取代物构成的群组。
8.如权利要求7所述的功能性脂类构造物，其结构为：
其中F为碳水化合物，x为整数2、3或4，y为整数1、2或3，R3为该碳水化合物取代羟基的O。
9.如权利要求7所述的功能性脂类构造物，其结构为：
其中F为肽，w为整数1或2，R3为肽Cys残基的取代巯基的S。
10.如权利要求7所述的功能性脂类构造物，其结构为：
其中F为化学反应性基团马来酰亚胺，w为整数1或2。
11.如权利要求7所述的功能性脂类构造物，其结构为：
其中F为生物素结合物，k为整数2、3或4。
12.如权利要求7～11任一项所述的功能性脂类构造物，其中所述的亚结构为：
命名为MCMG(1)；
命名为MCMG(2)；
命名为CMG(1)；或
命名为CMG(2)。
13.一种水溶性的结构为F-S-L的肽-脂类构造物，其中F是肽，L是二酰基或二烷基脂，以及S为通过硫化物键链接到F的隔离臂，并且包括亚结构：
其中g为整数1、2或3，M是单价阳离子或者取代基，*为非H。
14.如权利要求13所述的肽-脂类构造物，其中所述亚结构为：
其中h为整数1、2、3或4。
15.如权利要求14所述的肽-脂类构造物，其中g和h为整数2。
16.如权利要求14所述的肽-脂类构造物，其中M为H或者CH3。
17.如权利要求14所述的肽-脂类构造物，其中L为二酰基甘油磷脂。
18.如权利要求14所述的肽-脂类构造物，其中L为磷脂酰乙醇胺。
19.如权利要求14所述的肽-脂类构造物，其中所述肽-脂类构造物的结构包括以下局部结构：
其中v为整数3、4或5，M’为单价阳离子，R1和R2独立地选自于由脂肪酸反-3-十六碳烯酸、顺-5-十六碳烯酸、顺-7-十六碳烯酸、顺-9-十六碳烯酸、顺-6-十八碳烯酸、顺-9-十八碳烯酸、反-9-十八碳烯酸、反-11-十八碳烯酸、顺-11-十八碳烯酸、顺-11-二十碳烯酸、顺-13-二十二碳烯酸的烷基或者烯烃基取代物构成的群组。
20.如权利要求19所述的肽-脂类构造物，其中所述肽-脂类构造物结构为：
其中w为整数1或2，R3为肽Cys残基(Cys)的取代巯基中的S。
21.如权利要求20所述的肽-脂类构造物，其中所述肽-脂类构造物结构为：
其中x与y之和大于5。
22.如权利要求21所述的肽-脂类构造物，其中F为一种肽，其包括一种挑选的促进肽的溶解度的近末端序列(PTS)。
23.如权利要求22所述的肽-脂类构造物，其中所述肽的PTS选自于下述群组：
SerLysLysLysLysGly，
AlaAlaAlaAla，和
GlySerGlySerGly。
24.如权利要求20所述的肽-脂类构造物，其中所述的Cys残基为肽的末端Cys残基(Cys)。
25.如权利要求24所述的肽-脂类构造物，其中所述肽的末端序列选自于下述群组：
GlyLysLysLysLysSerCys，
AlaAlaAlaAlaCys，
GlySerGlySerGlyCys，
CysSerLysLysLysLysGly，
CysAlaAlaAlaAla，和
CysGlySerGlySerGly。
26.如权利要求25所述的肽-脂类构造物，其中所述Cys残基为肽羧基-末端的肽末端Cys残基。
27.如权利要求13所述的肽-脂类构造物，其中F为一种肽，其包括一种选自于MNS血型系统的抗原表位。
28.一种如权利要求27所述的肽-脂类构造物，其中F为一种选自下列群组的肽：
CysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGlu，
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys，
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCy，
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys，
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCys，
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys，
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluCys，
ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys，和
SerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys。
29.如权利要求13所述的肽-脂类构造物，其中L为一种甘油磷脂，其选自于由1,2-O-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1,2-O-二-硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)组成的群组。
30.制备如权利要求13～29任一项所述肽-脂类构造物的方法，包括以下步骤：
●含有Cys残基的肽与如权利要求11所述的功能性脂类构造物反应。
31.如权利要求1～12任一项所述的功能性脂类构造物在制备用于使表达于细胞表面的功能基团产生质变和量变方法的试剂中的用途，所述方法包括细胞与所述功能性脂类构造物的溶液经一定的时间在一定的温度下接触，足以允许构造物结合细胞。
32.如权利要求11所述的功能性脂类构造物在制备用于固定一个或者多个细胞的方法的试剂中的用途，所述包括以下步骤：
●细胞与所述构造物的溶液经一定的时间在一定的温度下接触，足以允许有效量的构造物结合细胞，以提供修饰细胞；和
●修饰细胞与能可逆地固定到表面的亲和素-包被底物接触。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述亲和素-包被底物选自于由亲和素-包被磁珠构成的群组。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述可逆地固定到表面是通过磁场的应用。
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