ITFI20080124A1 - Peptidi e loro uso come carrier in cellule cancerose - Google Patents
Peptidi e loro uso come carrier in cellule canceroseInfo
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Description
“Peptidi e loro uso come carrier in cellule canceroseâ€
DESCRIZIONE
Campo dell'invenzione
L'invenzione si riferisce al campo dei prodotti utilizzabili a scopo diagnostico o terapeutico nell'analisi o il trattamento di cellule cancerose.
Stato dell'arte
Come à ̈ noto fin dal secolo scorso si sono rilevate anomalie cromosomiali nello sviluppo dei tumori.
Tuttavia solo negli ultimi due decenni, con gli sviluppi della citogenetica e della biologia molecolare si sono confermate con certezza le basi della genetiche neoplasia e le alterazioni cromosomiali sono state riconosciute come critiche per la patogenesi dei tumori nell'uomo.
In uno studio recente si à ̈ studiata una linea cellulare di liposarcoma che si à ̈ trovato produrre e secernere nel suo mezzo di cultura varie proteine fra le quali à ̈ stata in particolare identificata una Manganese superossido-dismutasi (detta LSA-type-MnSOD) che oltre all'attività enzimatica diretta alla trasformazione di radicali liberi in perossido d'idrogeno (comune a tutte le SOD) ha mostrato proprietà strutturali e funzionali tali che la rendono diversa dalla corrispondente MnSOD espressa dalla linea cellulare del leucemia mieloide U937.
Infatti la LSA-Type-MnSOD à ̈ secreta dalle cellule LSA mentre la MnSOD MnSOD nativa à ̈ localizzata nella matrice mitocondriale ed inoltre ha peso molecolare significativamente maggiore (30KDa) rispetto a quello della MnSOD nativa (24kDa).
Inoltre se iniettata in vivo o in vitro la LSA-type-MnSOD à ̈ capace di raggiungere e essere assorbita solo da cellule tumorali purché queste siano capaci di esprimere recettori di estrogeni e bassi livelli di catalasi mentre le cellule normali non sono interessate dalla proteina per cui si può dire che l'azione citotossica della LSA-type-MnSOD à ̈ specifica e selettiva per le cellule tumorali.
Anche una forma ricombinante di LSA-type-MnSOD (rMnSOD) prodotta da cloni cDNA specifici ha mostrato mantenere le proprietà strutturali e oncotossiche della proteina nativa, inoltre sia LSA-Type MnSOD estrattiva che rMnSOD portano un residuo peptidico di 24 in posizione N-terminale, corrispondente esattamente alla sequenza leader della MnSOD
Descrizione dettagliata dell'invenzione
E' stato ora sorprendentemente trovato che il peptide di sequenza:
MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1)
che rappresenta il peptide leader di rMnSOD e, vista l'uguaglianza di cui sopra, anche di LSA-type-MnSOD, à ̈ capace di penetrare nelle cellule cancerogene e può quindi fungere da carrier per il trasporto all'interno di dette cellule di molecole o radioisotopi utilizzabili a scopo terapeutico o diagnostico.
Secondo una sua ulteriore realizzazione l'invenzione si riferisce anche ad un peptide di sequenza:
MLSRAVC (SEQ 2)
Che à ̈ anch'esso capace di fungere da carrier analogamente al peptide di cui sopra (SEQ. 1)
Inoltre l'invenzione si riferisce anche ad un peptide ottenuto o inserendo una cisteina nel eptapeptide precedentemente descritto (legata alla metionina N-terminale) o sostituendo detta metionina con una cisteina e ciclizzando a formare un ponte disolfuro fra detta cistena inserita e la cisterna già presente; detti peptidi hanno quindi rispettivamente sequenza:
CMLSRAVC (SEQ 3)
CLSRAVC (SEQ 4)
In cui le due cisteine terminali sono unite fra loro da un ponte disolfuro.
L'invenzione si riferisce inoltre a coniugati del peptide leader come sopra descritto con gruppi chelanti capaci di legare radioisotopi (come ad esempio DOTA, DTPA, NOTA, HYNIC, ecc.), coloranti come ad esempio fluoresceina, rodamina ecc, molecole aventi proprietà citostatiche quali ad esempio il cis-platino, il taxolo, la farmorubicina ecc., oppure molecole aventi attività enzimatiche come per esempio gli inibitori delle chinasi capaci di impedire la trasduzione del segnale mitotico ed inoltre oligonucleotidi antisenso (o.n.)..
L'invenzione si riferisce inoltre a composizioni farmaceutiche per il trattamento di malattie tumorali e a mezzi diagnostici comprendenti almeno un coniugato come sopra descritto.
L'invenzione sarà più e meglio compresa alla luce degli esempi qui di seguito riportati
Esempio 1
Sintesi del peptide di sequenza MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1) Il peptide leader di 24 aminoacidi (SEQ. 1) à ̈ stato sintetizzato usando le tecniche di sintesi in-fase solida con metodologia Fmoc standard in un reattore manuale. La purificazione à ̈ stata effettuata con RP-HPLC semi preparativa utilizzando una colonna di silice legata a C!( (Vydac 218TP1010). Il peptide ha mostrato una purezza del 99%; la massa molecolare del peptide à ̈ stata confermata per spettrometria di massa ed analisi degli aminoacidi.
Esempio 2
Coniugazione del peptide di sequenza MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1) con il DOTA e marcatura del complesso marcatura con<68>Ga.
Il peptide leader sintetico ottenuto nell'esempio 1 à ̈ stato poi coniugato con 20 Î1⁄4g di DOTA e con<68>Ga radioattivo a 120°C per 15 minuti in buffer Hepes. Il peptide marcato à ̈ stato poi purificato mediante cromatografia in fase inversa su una colonnina C18, lavato con acqua ed essiccato con flusso d'aria.
Il peptide à ̈ stato poi ridisciolto con 400 Î1⁄4L di etanolo al 96%.
Lo stesso peptide à ̈ stato marcato con<90>Y,<177>Lu,<111>ln a 90° per 30 minuti in baffer Acido acetico/acetato di sodio o in baffer gentisico.
Esempio 3
Coniugazione del peptide di sequenza MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1) con fluoresceina.
La marcatura all'N-terminale del peptide parente MLSRAVCGTRQLAPALGYLLGSRQ e del suo analogo più corto MLSRAVC à ̈ stata eseguita in Fase Solida mediante l'utilizzo di un protocollo standard di accoppiamento utilizzando 5(6)-carbossifluoresceina (FAM).
Esempio 4
Sintesi del peptide di sequenza MLSRAVC (SEQ 2)
Il peptide formato dai primi 7 aminoacidi della sequenza del peptide ottenuto nell'esempio 1 , à ̈ stato sintetizzato usando le tecniche di sintesi in fase solida con metodologia Fmoc standard in un reattore manuale. La purificazione à ̈ stata effettuata con RP-HPLC semi preparativa utilizzando una colonna di silice legata a C 18( (Vydac 218TP1010). Il peptide ha mostrato una purezza del 99%; la massa molecolare del peptide à ̈ stata confermata per spettrometria di massa ed analisi degli aminoacidi.
Esempio 5
Ciclizzazione del peptide SEQ 2
Dalla sequenza del peptide MLSRAVC, due analoghi ciclici sono stati ottenuti con l'introduzione di un secondo residuo cisteinco:
Analogo 1 CMLSRAVC (SEQ. 3)
Analogo 2 CLSRAVC (SEQ 4)
Analogo 1 : deriva dal legame con una Cisteina aggiunta alla sequenza originale del peptide a livello della Metionina.
Analogo 2 : deriva dalla sostituzione della metionina N-terminale del peptide originale con un residuo cisteinico.
I ponti disolfuro sono stati ottenuti mediante il legame tra i 2 SH delle cisteine terminali.
La ciclizzazione à ̈ ottenuta per aggiunta di una soluzione 0.1 M di NH4HCO3in acqua alla catena peptidica (10 ml di soluzione per 10 mg di peptide) a cui segue semplice ossidazione all'aria a temperatura ambiente per circa 48h.
I due peptdi ciclici derivati sono stati legati a chelante e marcati con<90>Y,<177>Lu,<111>In a 90° per 30 minuti in baffer Acido acetico/acetato di sodio o in baffer gentisico.
Esempio 6
1 mCi del coniugato marcato ottenuto nell'esempio 2 Ã ̈ stato iniettato in una femmina di cane di 13 anni affetta da tumori mammari multipli.
La rilevazione à ̈ stata effettuata circa 30 minuti dopo l'iniezione utilizzando uno scanner ECAT 47 PET (Siemens) e le immagini sono state ricostruite secondo i piani transassiale, coronale e sagittale.
Esempio 7
Cellule MCF-7 sono state trattate separatamente per 1 h a temperatura ambiente con il coniugato ottenuto nell'esempio 3 e con un peptide “scrambled†, pure marcato, usato come controllo, avente la stessa composizione aminoacidica ma diversa sequenza.
Dopo il trattamento le cellule sono state esaminate per microscopia confocale. Una marcata fluorescenza citoplasmatica à ̈ rilevabile nelle celle incubate con il coniugato dell'esempio 3, mentre non à ̈ stata invece rilevata alcuna fluorescenza nei controlli trattati con il peptide scrambled; questo dimostra che il peptide marcato à ̈ stato capace di entrare nelle cellule mentre il peptide “scrambled†non ha mostrato detta capacità di penetrazione nelle cellule.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di un peptide contenente la sequenza MLSRAVC (SEQ 2) come carrier verso cellule cancerogene.
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1 in cui detto peptide ha sequenza MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1).
- 3. Uso di un peptide costituito dalla sequenza MLSRAVC (SEQ 2) come carrier verso cellule cancerogene.
- 4. Peptide avente la seguente sequenza MLSRAVC (SEQ 2)
- 5. Peptidi aventi sequenza: CMLSRAVC (SEQ 3) e CLSRAVC (SEQ 4) in cui le due cisteine terminali sono unite fra loro da un ponte disolfuro
- 6. Coniugati comprendenti un peptide di sequenza MLSRAVCGTSRQLAPALGYLGSRQ (SEQ 1), o un peptide secondo le rivendicazioni 4 e 5, e: una molecola con gruppi chelanti capaci di legare radioisotopi, un colorante, una molecola aventi proprietà citostatiche, una molecola aventi attività enzimatiche, oligonucleotidi antisenso (o.n.).
- 7. Coniugati secondo la rivendicazione 6 in cui detta molecola con gruppi chelanti à ̈: DOTA, DTPA, NOTA, HYNIC.
- 8. Coniugati secondo la rivendicazione 6 in cui detto colorante à ̈: fluoresceina o rodamìna.
- 9. Coniugati secondo al rivendicazione 6 in cui detta molecola avente proprietà citostatiche à ̈ scelta fra: cis-platino, taxolo, farmorubicina.
- 10. Coniugati secondo al rivendicazione 6 in cui detta molecola avente attività enzimatiche à ̈ un inibitore delle chinasi capace di impedire la trasduzione del segnale mitotico.
- 11. Uso dei coniugati secondo le rivendicazioni 6 - 8 come diagnostici.
- 12. Uso dei coniugati secondo le rivendicazioni 6 - 11 per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di malattie tumorali.
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