ES2855169T3 - Conjugados de polipéptido-anticuerpo derivados de aprotinina - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de proteína que comprende una fracción del anticuerpo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17- Glu18-Tyr19 (SEQ ID NO: 117), o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, y un enlazador entre la fracción del anticuerpo y el polipéptido, en el que la fracción del anticuerpo es trastuzumab, cetuximab o panitumumab, o una variante biológicamente activa de los mismos, en el que la fracción del anticuerpo está conjugada con el polipéptido en una o más de las siguientes posiciones en el polipéptido: residuo de aminoácido del terminal N; el residuo de aminoácido del terminal C; o un residuo de lisina entre el terminal N y el terminal C, y en el que el enlazador es un ciclooctino monofluorado (MFCO), biciclo[6.1.0]nonino (BCN) o dibenzociclooctina (DBCO).

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de polipéptido-anticuerpo derivados de aprotinina
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No.
61/725.365, que fue presentada el 12 de noviembre de 2012.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de proteínas en los que uno o más inhibidores de proteasa de tipo Kunitz (por ejemplo, aprotinina) o derivados de los mismos (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina) se conjugan con una fracción del anticuerpo de la manera descrita en este documento; métodos mediante los cuales se sintetizan los conjugados para uso farmacéutico o uso diagnóstico (por ejemplo, uso como agentes de formación de imágenes); composiciones fisiológicamente aceptables que las incluyen; y métodos de administración de conjugados a pacientes para el diagnóstico y tratamiento, por ejemplo, de cáncer y trastornos neurológicos.
Antecedentes de la invención
Si bien la barrera hematoencefálica (BHE) protege el sistema nervioso central (SNC) de sustancias nocivas (por ejemplo, toxinas ingeridas accidentalmente), también evita que las proteínas terapéuticas accedan al cerebro y la médula espinal y, por lo tanto, presenta un importante obstáculo en el tratamiento de trastornos del SNC. Como regla general, solo las moléculas lipofílicas menores de aproximadamente 500 Dalton atraviesan la BHE. Muchos fármacos que muestran resultados prometedores en estudios animales de enfermedad del SNC son considerablemente más grandes que eso, y las terapias proteicas generalmente se excluyen del SNC por completo debido a la permeabilidad insignificante de la pared endotelial capilar cerebral a fármacos de ese tamaño y complejidad.
Las estrategias que se están siguiendo actualmente para mejorar la administración de terapias proteicas al SNC se pueden dividir en tres categorías. La primera categoría incluye procedimientos invasivos como la administración intraventricular directa de fármacos y la infusión dentro de la carótida de soluciones hiperosmolares que interrumpen temporalmente la BHE. La segunda categoría incluye estrategias de base farmacológica que tienen como objetivo aumentar la solubilidad en lípidos de las proteínas a través de la BHE. En la tercera categoría se encuentran los regímenes de administración en los que el agente terapéutico se une a una proteína que actúa como vector o vehículo de administración dirigido al receptor con respecto a la BHE. Este enfoque es ventajoso porque es altamente específico y eficaz, da como resultado efectos adversos mínimos y es ampliamente aplicable. El documento WO2008144919 describe conjugados de anticuerpo-péptido, usando enlazadores diferentes a los de la presente solicitud. El documento WO2012000118 también describe varios enlazadores que se pueden usar para enlazar anticuerpos con otros agentes tales como péptidos.
Sumario de la invención
El alcance de la invención se define en las reivindicaciones. Cualquier discusión de realizaciones que no caigan dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para referencia.
En un primer aspecto, la presente invención presenta conjugados de proteínas que incluyen una fracción del anticuerpo y uno o más inhibidores de proteasa de tipo Kunitz (por ejemplo, aprotinina) o derivados de los mismos (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina). Tanto la fracción del anticuerpo como el polipéptido que transporta el conjugado a través de la BHE se describen en detalle a continuación. Los conjugados de proteínas se definen además mediante la inclusión de un enlazador; pueden definirse además por el número de polipéptidos conjugados con cada fracción del anticuerpo; y/o por las posiciones en las que se conjugan la fracción del anticuerpo y los polipéptidos. Además, dentro de un conjugado dado, en el que se incluye más de un polipéptido, cada polipéptido se une únicamente a la fracción del anticuerpo. En otras palabras, ningún polipéptido está unido, mediante un enlazador o de otro modo, a otro polipéptido dentro del conjugado.
En una realización, los conjugados de proteínas incluyen una fracción del anticuerpo y un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr-ig (SEQ ID NO: 117) o un análogo o fragmento biológicamente activo de la SEQ ID NO: 117. Como se indica por "Cys7/Ser7", el residuo de aminoácido en la posición 7 puede ser cisteína o serina. En conjugados de proteínas que incluyen este polipéptido (SEQ ID NO: 117) o cualquier otro polipéptido descrito en este documento, la fracción del anticuerpo puede conjugarse con el polipéptido en una o más de las siguientes posiciones en el polipéptido: el residuo de aminoácido del terminal N (por ejemplo, Thn en el que el polipéptido consiste en la SEQ ID NO: 117); el residuo de aminoácido del terminal C (por ejemplo, Tyrig en el que el polipéptido consiste en la SEQ ID NO: 117); o un residuo de lisina entre el terminal N y el terminal C (por ejemplo, Lys10 o Lys15 en la SEQ ID NO: 117).
Se utiliza el término "conjugado de proteína" para referirse a un compuesto basado en aminoácidos formado por partes acopladas molecularmente. En la presente invención, las partes incluyen una fracción del anticuerpo y el polipéptido o polipéptidos acoplados al mismo (por ejemplo, mediante un enlazador). Un "compuesto basado en aminoácidos" es uno que incluye principalmente, pero no necesariamente exclusivamente, residuos de aminoácidos (es decir, uno que incluye sólo residuos de aminoácidos (como en una proteína de fusión convencional) o uno que incluye residuos de aminoácidos y otros componentes). Como se señaló anteriormente, los conjugados de proteínas pueden incluir un enlazador, que puede ser un compuesto químico. Dichos conjugados incluirían principalmente, pero no exclusivamente, residuos de aminoácidos, ya que la fracción del anticuerpo y el polipéptido están hechos de aminoácidos y el enlazador es un compuesto químico. Los conjugados de proteínas también pueden incluir un agente de detección (por ejemplo, un fluoróforo, radioisótopo, colorante o similar). El agente detectable puede no incluir residuos de aminoácidos y, en ese caso, también puede hacerse referencia a un conjugado de proteína que contiene tales agentes detectables como un compuesto basado en aminoácidos. La invención abarca métodos de uso de conjugados detectables en métodos de diagnóstico, que incluyen la obtención de imágenes diagnósticas.
En aras de una mayor claridad, se observa que la fracción del anticuerpo y el polipéptido o polipéptidos son distintos entre sí (es decir, no son idénticos entre sí). Sin embargo, cualquier proteína conjugada puede incluir más de un polipéptido, y los dos, tres, cuatro o más polipéptidos pueden ser iguales (es decir, pueden tener una secuencia de aminoácidos idéntica) o pueden diferir entre sí (es decir, los polipéptidos conjugados a la fracción del anticuerpo pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos). Con respecto a las composiciones y métodos de la invención, se usa el término "incluye" para significar "que comprende". Por ejemplo, en la realización descrita anteriormente, los conjugados de proteínas comprenden una fracción del anticuerpo y un polipéptido que, a su vez, comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 117. En cualquier caso, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario, las composiciones de la invención, sus partes componentes (por ejemplo, la fracción del anticuerpo y el polipéptido) y los métodos de la invención pueden comprender o consistir en los elementos o etapas enumerados. Por ejemplo, un polipéptido dado puede comprender o consistir en la secuencia mencionada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 117).
Como se indicó anteriormente, los conjugados de proteínas de la presente invención pueden incluir un polipéptido como se describe en el presente documento o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo. Se usa el término "biológicamente activo" con respecto a la porción polipeptídica de los conjugados de proteína para significar que el análogo o fragmento de un polipéptido referenciado retiene suficiente actividad en un entorno fisiológico para ser útil. Dado que la porción polipeptídica de los conjugados de proteína es responsable de transportar el conjugado y/o la fracción del anticuerpo al que se unen los polipéptidos a través de la BHE, un análogo o fragmento de un polipéptido al que se hace referencia es biológicamente activo cuando tiene la capacidad de transportar el conjugado y/o la fracción del anticuerpo al que está unido a través de la BHE. Esta propiedad se puede probar en modelos in vivo o ex vivo, y los análogos y fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de referencia pueden ser más o menos eficaces en este transporte que el polipéptido de referencia. En particular, la eficacia de un fragmento o análogo puede ser menor que la del polipéptido de referencia siempre que permanezca lo suficientemente alto como para lograr un resultado deseado (por ejemplo, siempre que el conjugado en el que se incluye logre un resultado clínicamente beneficioso).
Un "fragmento" de un polipéptido referenciado es una porción continua o contigua del polipéptido referenciado (por ejemplo, un fragmento de un polipéptido que tiene diez aminoácidos de longitud puede ser cualesquiera 2-9 residuos contiguos dentro de ese polipéptido). Un "análogo" de un polipéptido referenciado es cualquier polipéptido que tenga una secuencia que sea similar, pero no idéntica, a la secuencia del polipéptido referenciado o una porción del mismo. Por tanto, un polipéptido que incluye una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos de un residuo de aminoácido (o cualquier combinación de los mismos) es un análogo de la secuencia referenciada. Los fragmentos y análogos de polipéptidos adecuados para su inclusión en los presentes conjugados de proteínas se describen adicionalmente a continuación.
Como se indica, cualquiera de los conjugados de proteína de la invención incluye un enlazador entre la fracción del anticuerpo y el polipéptido o polipéptidos del conjugado. Los conjugados pueden ensamblarse mediante métodos conocidos en la técnica como "química clic". Quizás el ejemplo más destacado de una reacción clic es la reacción de cicloadición azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC), y tales reacciones pueden emplearse para generar los conjugados de la presente invención. Estas reacciones son útiles in vivo porque ni los grupos funcionales azida ni los grupos funcionales alquinos terminales están generalmente presentes en los sistemas naturales. A pesar de las características atractivas de la química clic basada en CuAAC, el cobre puede dificultar la conjugación bioortogonal en células vivas u organismos completos, y los métodos actuales también se pueden llevar a cabo con química clic sin cobre (es decir, los conjugados presentes se pueden ensamblar con química clic libre de cobre).
En la presente invención, el enlazador es un compuesto químico que incluye un grupo reactivo con una amina primaria. Por tanto, el enlazador puede ser un ciclooctina monofluorada (MFCO), biciclo[6.1.0]nonino (BCN) o dibenzociclooctina (DBCO). Los enlazadores adecuados y los métodos para incorporarlos en los presentes conjugados se describen adicionalmente a continuación.
En el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 117, el residuo en la posición numerada como 7 puede ser un residuo de cisteína o un residuo de serina, y esta sustitución se puede realizar en cualquiera de los polipéptidos descritos en este documento. Por tanto, los polipéptidos útiles pueden incluir la secuencia de aminoácidos Thn-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g (SEQ ID NO: 67), la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu 17- Glu 18-Tyng (SEQ ID NO : 97), o un fragmento o análogo biológicamente activo del polipéptido representado por la SEQ ID NO: 67 o la SEQ ID NO: 97. Para facilitar la lectura, no se repetirá la frase "o un fragmento biológicamente activo o análogo del mismo" en cada ocasión posible. Debe entenderse que cuando un polipéptido referenciado es útil, también es útil un fragmento biológicamente activo o análogo del mismo.
Cuando el conjugado de proteína incluye un análogo de la SEQ ID NO: 117, el análogo puede comprender al menos 13 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 13-19 residuos de aminoácidos, inclusive) que son invariantes con respecto a la SEQ ID NO: 117. Como un análogo puede incluir residuos de aminoácidos adicionales, el análogo puede ser más largo que los 19 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117. Independientemente de la longitud o la naturaleza exacta de la o las diferencias, el grado de similitud puede expresarse como el "porcentaje de identidad" entre la secuencia del análogo y la secuencia del polipéptido referenciado (en el presente documento, la SEQ ID NO: 117). Los análogos caracterizados de esta manera se describen con más detalle a continuación. En cualquier caso en el que el polipéptido sea un análogo de la SEQ ID NO: 117, el residuo de lisina en la posición numerada como 10 y/o el residuo de lisina en la posición numerada como 15 pueden permanecer invariantes. Es decir, los análogos pueden incluir un residuo de lisina en la posición 10 y/o en la posición 15. Un experto en la técnica reconocería que la posición absoluta de un residuo dado puede variar en algunos casos. Por ejemplo, los residuos de lisina que se acaban de mencionar estarán presentes en posiciones equivalentes a las posiciones 10 y/o 15 si el análogo incluye más o menos que los primeros nueve residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117. Por ejemplo, en un análogo que incluye un residuo de aminoácido adicional en el terminal N, los residuos de lisina en las posiciones 10 y 15 de la secuencia de referencia aparecerían en las posiciones 11 y 16 del análogo.
En otros análogos de la SEQ ID NO: 117, Asn12 se puede sustituir con Gln, Asn13 se puede sustituir con Gln y/o Phe14 se puede sustituir con Tyr o Trp. En otros análogos útiles de la SEQ ID NO: 117, se añade un residuo de cisteína al terminal amino y/o carboxilo del polipéptido. Se puede añadir un residuo de cisteína en una posición terminal si esa posición es el residuo de treonina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 117, el residuo de tirosina en la posición 19 de la SEQ ID NO: 117, o un residuo interno a cualquiera de los que se generaron por una eliminación de uno o más residuos del extremo terminal amino y/o carboxilo del polipéptido. En otras palabras, puede añadirse un residuo de cisteína del terminal N y/o C a un polipéptido de longitud completa o a un fragmento o análogo del mismo. Los análogos útiles pueden incluir la secuencia: Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu^-Glu^-Tyr^-Cys (SEQ ID NO: 118); Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-G lu^-Ty^-C ys (s Eq ID NO: 119); Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys (SEQ iD NO: 120); Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys (SEQ ID NO: 121); o Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr19-Cys (SEQ ID NO: 122). Se han numerado los residuos de aminoácidos de tal manera que sea más evidente cómo se relaciona el análogo con la SEQ ID NO: 117. Por ejemplo, Phe3 es el tercer residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 117 pero, obviamente, el primer residuo de aminoácido en el análogo de la SEQ ID NO: 117 que está representado por la SEQ ID NO: 118.
Cuando el conjugado de proteína incluye un fragmento de la SEQ ID NO: 117, el fragmento puede incluir al menos seis (por ejemplo, 6-18, inclusive) residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 117. Por ejemplo, el fragmento puede incluir o consistir en la secuencia Lys10-Argn -Asn12-Asn13-Phe14-Lys15 (SEQ ID NO: 123).
En cualquier realización, el polipéptido puede incluir residuos de aminoácidos en la forma D, la forma L o ambas formas. Por ejemplo, uno o más (y hasta todos los residuos) pueden estar en la forma L o la forma D.
Con respecto a la configuración de los conjugados de proteínas, los conjugados pueden incluir una fracción del anticuerpo y, unido al mismo, un número variable de polipéptidos. El número de polipéptidos estará gobernado por el número de puntos de unión adecuados en la fracción del anticuerpo. Como los enlazadores descritos en el presente documento pueden reaccionar con un grupo amina primaria, los enlazadores pueden unir polipéptidos a la fracción del anticuerpo en uno o más de los residuos de lisina dentro de la fracción del anticuerpo. Alternativamente, el enlazador también puede reaccionar con (y por lo tanto unirse a) un grupo tiol o un grupo carbohidrato en la fracción del anticuerpo. Los enlazadores pueden residir en tan solo 1-10 residuos de lisina (es decir, se pueden conjugar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos en distintos residuos de lisina dentro de la fracción del anticuerpo). En realizaciones particulares, se pueden ocupar aproximadamente 15 (por ejemplo, 14-16), aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80 o aproximadamente 90 residuos de lisina. El número de polipéptidos dentro de un conjugado también se puede expresar como un porcentaje del número de residuos dentro de la fracción del anticuerpo disponible para la conjugación. Más específicamente, alrededor del 10% hasta el 100% de los residuos de lisina pueden conjugarse con un polipéptido.
Los anticuerpos particulares que caen dentro del alcance de esta invención se definen en las reivindicaciones. En cualquier realización, la fracción del anticuerpo puede ser de la clase IgG. En cualquier realización, la fracción del anticuerpo puede ser un anticuerpo tetramérico, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento de un anticuerpo tetramérico (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2) o una variante biológicamente activa de cualquier de estas fracciones de anticuerpos. Se usa el término "biológicamente activo" con respecto a la porción de anticuerpo de los conjugados de proteína para significar que la variante del anticuerpo retiene suficiente actividad en un entorno fisiológico para ser útil. Dado que la fracción del anticuerpo del conjugado de proteína se une selectivamente a un objetivo biológico, una variante de una fracción del anticuerpo referenciada es biológicamente activa cuando tiene la capacidad de unirse selectivamente a ese objetivo en un grado útil. Una variante biológicamente activa de una fracción del anticuerpo puede tener, por ejemplo, una afinidad diferente por el objetivo biológica (por ejemplo, un receptor celular) que la fracción del anticuerpo referenciada. La afinidad puede ser menor que la de la fracción del anticuerpo al que se hace referencia siempre que permanezca lo suficientemente alta para lograr un resultado deseado (por ejemplo, siempre que el conjugado en el que se incluye logre un resultado clínicamente beneficioso).
La fracción del anticuerpo puede ser una fracción del anticuerpo humano, quimérico o humanizado o una variante biológicamente activa del mismo. Para facilitar la lectura, no se repetirá la frase "o una variante biológicamente activa de la misma" en cada ocasión. Debe entenderse que cuando una fracción del anticuerpo es útil en el contexto de la presente invención, una variante biológicamente activa del mismo es también útil. La fracción del anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario construido a partir de anticuerpos monoclonales o policlonales, o un fragmento (por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab')2) de un anticuerpo monoclonal o policlonal.
Con respecto a los objetivos, la fracción del anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo tetramérico, una variante biológicamente activa del mismo, un scFv, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, o variantes biológicamente activas del mismo, independientemente de la clase (es decir, ya sea de la clase IgG o de otra clase) y ya sea humano, humanizado, quimérico, monoclonal o que tenga cualquier otro atributo o característica descrito en este documento) puede unirse específicamente a un receptor de factor de crecimiento o un receptor de citocina (por ejemplo, un receptor de interleucina). El receptor del factor de crecimiento puede ser un receptor unido por un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Ejemplos de receptores para proteínas en la familia EGF incluyen un receptor EGF (EGFR), un receptor del factor de crecimiento similar al EGF que se une a la heparina (HB-EGFR), un receptor de anfirregulina (AR), un receptor de epirregulina (EPR), un receptor de epígeno, un receptor de betacelulina y un receptor para una neurregulina (por ejemplo, un receptor para neurregulina-1, neurregulina-2, neurregulina-3 o neurregulina-4). En particular, la fracción del anticuerpo puede ser trastuzumab, cetuximab o panitumumab, un scFv que comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de trastuzumab, cetuximab o panitumumab, o una variante biológicamente activa de estos anticuerpos tetraméricos o monocatenarios. Por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab')2 de trastuzumab, cetuximab o panitumumab. Hemos realizado estudios con anticuerpos que tienen una secuencia que es aproximadamente un 99% homóloga a trastuzumab. Con respecto a la función, la fracción del anticuerpo puede ser un agente quimioterapéutico o un agente antiinflamatorio.
En un segundo aspecto, la invención presenta composiciones farmacéuticas que incluyen un conjugado de proteína como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones relacionadas, que también están dentro del alcance de la presente invención, incluyen precursores de estas composiciones farmacéuticas, tales como soluciones madre concentradas, preparaciones liofilizadas, composiciones conservadas en forma congelada (por ejemplo, con agentes crioprotectores) u otras composiciones que requieren cierta manipulación (por ejemplo, dilución, resuspensión, purificación y/o esterilización) antes de la administración a un paciente. Estas composiciones y los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden incluir se describen con más detalle a continuación. Las composiciones se pueden formular de diversas formas, incluida la administración oral o parenteral (por ejemplo, intravenosa o transmucosa).
En un tercer aspecto, la invención presenta conjugados para su uso en métodos de tratamiento de un paciente que padece un cáncer del sistema nervioso central o un trastorno neurológico con afectación del SNC (por ejemplo, un trastorno asociado con inflamación). Los métodos pueden incluir la etapa de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un conjugado de proteína como se describe en el presente documento. En cualquiera de los métodos, también se puede realizar la etapa de identificar a un paciente que necesita tratamiento antes de administrar la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede identificar a un paciente que padece un cáncer del SNC realizando una o más pruebas de diagnóstico, tales como diagnóstico mediante obtención de imágenes. Del mismo modo, se puede realizar un examen adecuado para diagnosticar un trastorno neurológico. Aunque la invención no está tan limitada, se contemplan claramente los conjugados para su uso en el tratamiento de pacientes humanos. El uso veterinario (por ejemplo, para tratar mamíferos no humanos, como mascotas domesticadas) es ciertamente posible, aunque es probable que el costo siga siendo prohibitivamente alto al menos en un futuro próximo. Si bien se tiende a usar el término "paciente", también puede hacerse referencia sin diferencia significativa a un "individuo" o un "sujeto", ya sea en el contexto de uso humano o veterinario. Se usa el término "trastorno" de manera amplia para referirse a cualquier condición clínicamente indeseable que afecte a un paciente. Por ejemplo, aunque algunas afecciones se denominan específicamente enfermedades (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer), estas afecciones son clínicamente indeseables y son "trastornos" como se usa ese término en este documento. Por tanto, un trastorno neurológico con implicación del SNC puede ser cualquiera de tales afecciones a las que normalmente se hace referencia como trastorno, enfermedad, afección, síndrome o similar. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición farmacéutica es una cantidad suficiente para producir un resultado clínico positivo, ya sea que ese resultado sea o no la erradicación del trastorno. Por tanto, "tratar" a un paciente se logra mejorando un signo o síntoma del trastorno en cuestión o inhibiendo o ralentizando la progresión del trastorno a un estado más severo. La cantidad de conjugado de proteína administrada puede ser una "dosis equivalente", en cuyo caso la cantidad de la fracción del anticuerpo que se administra dentro del conjugado de proteína es la misma o aproximadamente la misma (por ejemplo, ± 10-20%) que la cantidad de la fracción del anticuerpo que se habría administrado para tratar eficazmente un tejido que no está protegido por la BHE. Cuando el trastorno es un cáncer que afecta al SNC, el cáncer puede ser uno que surja dentro del SNC o uno que haya hecho metástasis en el SNC.
En un cuarto aspecto, la presente invención presenta métodos para preparar los conjugados de proteínas descritos en el presente documento. Los métodos se llevan a cabo conjugando una fracción del anticuerpo con un polipéptido mediante un enlazador. En una realización, el método conjuga una fracción del anticuerpo con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Glya-Cys7/Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr-ig (SEQ ID NO: 117), o un análogo biológicamente activo o un fragmento del mismo. En otras realizaciones, se puede incorporar cualquiera de los otros polipéptidos descritos en este documento. Los métodos pueden incluir las etapas de: (a) proporcionar una fracción del anticuerpo unido al enlazador; (b) proporcionar el polipéptido en forma modificada; y (c) exponer la fracción del anticuerpo unido al enlazador al polipéptido en forma modificada en condiciones que produzcan un conjugado de proteína que comprende la fracción del anticuerpo, el enlazador y el polipéptido. El polipéptido está en una forma modificada cuando incluye una entidad química reactiva con el enlazador (por ejemplo, una amina primaria (por ejemplo, N3)). La fracción del anticuerpo unida al enlazador puede formarse llevando a cabo las etapas: (a) proporcionar la fracción del anticuerpo; y (b) exponer la fracción del anticuerpo a un enlazador en condiciones que produzcan una fracción del anticuerpo unido al enlazador. El polipéptido modificado se puede formar llevando acabo las etapas: (a) proporcionar el polipéptido; y (b) exponer el polipéptido a una entidad química reactiva con el enlazador en condiciones que produzcan un polipéptido modificado.
En otro esquema de conjugación, el enlazador se une primero al polipéptido, y ese compuesto intermedio modificado (un polipéptido unido al enlazador) se conjuga luego con la fracción del anticuerpo. En los casos en que la conjugación está mediada por una reacción de cicloadición azida-alquino, el alquino dentro de un enlazador dado reacciona con una azida en el compañero de conjugación. Por ejemplo, cuando el polipéptido se une a un enlazador que incluye un alquino, la fracción del anticuerpo se puede modificar para incluir una azida (estando el polipéptido unido al enlazador y el anticuerpo que porta la azida compañeros de conjugación). Los grupos alquilo y azida reaccionan para producir un triazol estable. Por ejemplo, un polipéptido modificado mediante la unión a un dibenzociclooctilo que contiene alquilo (enlazador DBCO) puede reaccionar con una fracción del anticuerpo que contiene azida para producir un triazol estable, que también puede denominarse libre de Cu (I) o reacción clic promovida por tensión. Véase Baskin et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (43): 16793-16797, 2007; Ning et al., Anweg. Chem. Int. Ed. 47: 2253-5; y Jewett et al., J. Am. Chem. Soc., 132 (11): 3688-3690, 2010.
Si un experto en la materia desea obtener información adicional sobre los métodos y la mecánica de conjugación, se puede consultar a Jewett y Bertozzi ("Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology", Chemical Society Reviews 39: 1272-1279, 2010), documento WO 2012/134925, y las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2005-0222427 y 2009-004753.
En los métodos que implican un enlazador, el enlazador puede incluir una octina cíclica o ciclooctina tensada. La entidad química del polipéptido que reacciona con el enlazador puede incluir un grupo azida. Para efectuar la conjugación, el grupo azida en el polipéptido modificado reacciona con el octino en el enlazador como se muestra en la Figura 1. En la Figura 1, el enlazador ejemplificado es el éster de MFCO-N-hidroxisuccinimida. Más generalmente, el enlazador empleado puede ser una ciclooctina monofluorada (MFCO), biciclo[6.1.0]nonino (BCN) o dibenzociclooctina (DBCO). Si bien las condiciones para preparar un conjugado de proteína se describen con más detalle a continuación, observamos aquí que la fracción del anticuerpo unido al enlazador puede exponerse a un polipéptido modificado en un entorno con restricción de luz durante aproximadamente 8-24 horas a temperatura ambiente. La conjugación puede controlarse controlando el consumo del polipéptido modificado mediante, por ejemplo, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Después de la conjugación, los conjugados de proteínas pueden purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna. Por ejemplo, se puede pasar el conjugado sobre una columna de Proteína A y eluirlo con un tampón de ácido cítrico de aproximadamente pH 3,0.
Las fracciones de anticuerpos unidas al enlazador y los polipéptidos modificados, que también pueden estar enlazados al enlazador, descritos en el presente documento también son composiciones de la invención y pueden incluirse en los kits de la invención. Por tanto, en un quinto aspecto, la invención presenta kits. En una realización, el kit incluye una composición farmacéutica o un precursor de la misma que se empaca junto con las instrucciones de uso y, opcionalmente, cualquier dispositivo útil para manipular las composiciones en preparación para la administración y/o para administrar las composiciones. Por ejemplo, los kits de la invención pueden incluir uno o más de: diluyentes, guantes, viales u otros recipientes, pipetas, agujas, jeringas, tubos, soportes, espátulas, paños o cubiertas estériles, controles positivos y/o negativos, y similares. En otra realización, los kits de la invención incluyen composiciones y reactivos útiles para preparar un conjugado de proteína. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más de: una fracción del anticuerpo, un enlazador, una fracción del anticuerpo unida al enlazador, un polipéptido, una entidad química reactiva con el enlazador y/o un polipéptido modificado. Por ejemplo, en una realización, un kit puede incluir una fracción del anticuerpo, un enlazador, una entidad química reactiva con el enlazador y un polipéptido. En otra realización, el kit puede incluir una fracción del anticuerpo unida al enlazador y un polipéptido modificado. Al igual que con los kits útiles para administrar las composiciones, los kits útiles para preparar las composiciones pueden incluir uno o más de: diluyentes, guantes, viales u otros recipientes, pipetas, agujas, jeringas, tubos, soportes, espátulas, paños o cubiertas estériles, controles positivos y/o negativos, y similares. También se puede incluir cualquier reactivo útil para unir un enlazador a una fracción del anticuerpo, modificar un polipéptido, conjugar una fracción del anticuerpo unido al enlazador a un polipéptido modificado o purificar y probar un conjugado de proteína. Como se señaló, las fracciones de anticuerpo unidas al enlazador y los polipéptidos modificados son composiciones destacadas de la invención.
También se describen en el presente documento métodos para obtener imágenes de un tejido biológico, tal como un tejido dentro del sistema nervioso central. Los métodos se llevan a cabo proporcionando un conjugado como se describe en el presente documento que ha sido diseñado para incluir un agente de formación de imágenes detectable. Este agente puede variar y seleccionarse de cualquiera de los marcadores disponibles actualmente y las etiquetas utilizadas en la creación de imágenes. Por ejemplo, el agente de formación de imágenes puede ser, o puede incluir, un tinte fluorescente o radioisótopo. El agente de formación de imágenes se incorpora a los presentes conjugados (por ejemplo, mediante reacciones químicas convencionales), que luego se administran a un sujeto. Por ejemplo, un conjugado que comprende un marcador o etiqueta detectable se puede administrar por vía intravenosa, y luego se puede examinar al sujeto con un dispositivo configurado para detectar el agente de formación de imágenes particular que se ha incorporado al conjugado.
Además de la permeabilidad de la BHE, los conjugados de proteínas de la invención pueden tener una o más de las siguientes ventajas: poca o ninguna precipitación a las concentraciones de dosificación; estabilidad de congelacióndescongelación; y solubilidad (produciendo poco o ningún agregado en solución). La fracción del anticuerpo también puede conservar una alta afinidad por su objetivo (en relación con la afinidad en una forma no conjugada). Por ejemplo, la fracción del anticuerpo puede tener una afinidad por su objetivo que esté dentro de aproximadamente 3 veces la afinidad de la fracción cuando no está conjugado. En estudios con la proteína conjugada H43, se observó una afinidad de 2,2 nM cuando la afinidad de la fracción del anticuerpo no conjugado era 1,3 nM. Otras características y ventajas de las presentes composiciones y métodos se ilustran en la descripción siguiente, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1a y 1b son esquemas que ilustran métodos para unir una fracción del anticuerpo a un polipéptido usando una técnica de "química clic" sin cobre. El panel a) muestra un esquema de reacción general y el panel b) muestra un proceso de conjugación más específico.
La Figura 2 es una tabla que enumera las secuencias de polipéptidos descritas y referenciadas en el presente documento.
La Figura 3 es una tabla que resume ciertos parámetros que pueden examinarse y caracterizarse con respecto a los conjugados de proteínas de la invención (por ejemplo, permeabilidad de la BHE y afinidad de unión), experimentos que pueden realizarse para probar estos parámetros y los resultados obtenidos con un ejemplo de conjugado de proteína (H43, que comprende un polipéptido angiopep-2 y trastuzumab).
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un estudio de perfusión con los conjugados de proteínas designados H1, H2 y H3. Se muestra Vd (ml/100 g/2 min) para cada conjugado y para trastuzumab (anti-HER2) en el cerebro, los capilares y el parénquima.
La Figura 5 es un par de gráficos de líneas que muestran los resultados de los estudios de unión con los conjugados de proteínas designados H40 y H41 (gráfico de la izquierda) y H42, H43 y H44 (gráfico de la derecha) en relación con trastuzumab no conjugado (aHer-2).
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un estudio de perfusión con los conjugados de proteínas designados H40, H41, H42, H43 y H44. Se muestra Vd (ml/100 g/2 min) para cada conjugado y para trastuzumab (anti-HER2) en el cerebro, los capilares y el parénquima.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la cantidad de trastuzumab y un conjugado de proteína de la invención que incluye trastuzumab y An2 (proporción de cerebro a sangre (%)) en el tejido cerebral de ratones en varios momentos después de la inyección intravenosa.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un estudio in vivo en el que se inyectaron ratones con células tumorales BT-474 y luego se trataron con una solución de vehículo/control, con trastuzumab o con un conjugado de proteína de la invención (H43).
La Figura 9 es una serie de gráficos de barras que muestran los resultados de un estudio in vivo de la distribución en los tejidos. La distribución de un anticuerpo anti-HER2 no conjugado y del constructo conjugado H43 se expresa como % [Cerebro]/[Plasma] (gráfico de la izquierda) y como % de dosis inyectada/g de tejido (gráfico central). Los niveles en plasma se muestran en el gráfico de la derecha. En cada gráfico, los datos obtenidos con el anticuerpo anti-HER2 no conjugado están representados por la barra más oscura, barra más a la izquierda de cada par, y los datos obtenidos con h 43 están representados por las barras más claras, más a la derecha.
La Figura 10 es una alineación de una aprotinina humana y AngioPep-2.
La Figura describe las SEQ ID NOS 128 y 129, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 11 es una serie de cuatro Tablas que incluyen ejemplos de enlazadores para su uso en los presentes conjugados y su inclusión en los kits de la invención. La primera Tabla enumera enlazadores de amina con amina, incluidos ésteres de NHS, imidoésteres y otros; la segunda Tabla enumera enlazadores de sulfhidrilo con sulfhidrilo, tales como maleimidas y piridilditioles; la tercera Tabla enumera enlazadores de amina con sulfhidrilo, que incluyen compuestos de éster/maleimida de NHS. Los enlazadores que entran dentro del alcance de la invención se definen en las reivindicaciones. En la tabla siguiente se proporcionan ejemplos de estos compuestos.
Descripción detallada de la invención
La mayoría de los fármacos que son potencialmente útiles en el tratamiento del SNC no atraviesan la BHE, y es sorprendente que se hayan centrado tan pocos esfuerzos en este problema de larga data. Se estima que más del 99% del desarrollo de fármacos para el SNC en todo el mundo se dedica al descubrimiento de fármacos per se, con menos del 1% del esfuerzo dirigido a mejorar la administración. No existen tratamientos fiables y eficaces para muchos trastornos graves, costosos y debilitantes del SNC, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los cánceres cerebrales. Por tanto, existe una necesidad sustancial e insatisfecha no sólo de descubrir agentes eficaces, sino también de administrar con éxito esos agentes al cerebro y la médula espinal.
Los anticuerpos terapéuticos se encuentran entre los nuevos tratamientos más prometedores para muchos tipos de trastornos, incluidos los trastornos que afectan al SNC. Debido a su tamaño, los anticuerpos terapéuticos también se encuentran entre los agentes más difíciles de administrar al SNC. En el contexto de la presente invención, una fracción del anticuerpo, cuando se conjuga con un polipéptido como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina), cruza la barrera hematoencefálica en mayor medida de lo que la misma fracción del anticuerpo habría cruzado la barrera hematoencefálica sola (es decir, cuando no está conjugada). También se pueden observar diferencias en el transporte en modelos ex vivo de la BHE. Por tanto, los polipéptidos en los presentes conjugados son útiles para transportar la fracción del anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica de un individuo, y el acceso mejorado resultante al SNC permite que la fracción del anticuerpo se use en el tratamiento y diagnóstico de cánceres y trastornos neurológicos de formas que antes no eran posibles.
La presente invención se basa, en parte, en el trabajo de los inventores con estrategias fisiológicas para la administración de fármacos en las que un agente terapéutico (en la presente invención, una fracción del anticuerpo) se conjuga de una manera particular con un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina) que sirve como vector o vehículo de administración dirigido al receptor con respecto a la BHE.
Los transportadores y receptores presentes en la BHE son importantes para mantener la integridad de la BHE y la homeostasis. Una familia de receptores, las proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP), que incluyen LRP1 y LRP2 (también conocidas como megalina), median el transporte de ligandos a través de las células endoteliales de la BHE (Shibata et al., 2000; Ito et al., 2006; Bell et al., 2007). Más específicamente, LRP2 actúa como un receptor de unión de múltiples ligandos en la membrana plasmática de las células epiteliales y media la endocitosis de ligandos que conducen a la transcitosis. Por ejemplo, tanto LRP1 como LRP2 median la endocitosis de la proteína precursora de amiloide secretada (APP) (Kounnas et al., 1995; Cam y Bu, Mol. Neurodegen. 1: 8, 2006). Curiosamente, APP carece del dominio inhibidor de proteasa de Kunitz (KPI) y es un sustrato/ligando deficiente para una LRP. Esto sugiere que este dominio es importante para el reconocimiento, internalización y eliminación de APP por LRP (Kounnas et al., 1995).
La aprotinina es un inhibidor de proteasa del tipo Kunitz (es decir, contiene un dominio KPI) y es un ligando para LRP1 y LRP2. Es un polipéptido monomérico biológicamente activo derivado del tejido pulmonar de bovino y se utiliza para reducir el sangrado durante cirugías complejas. La aprotinina consta de 58 residuos de aminoácidos, con diez residuos de lisina y arginina cargados positivamente y sólo cuatro residuos de aspartato y glutamato cargados negativamente. La aprotinina es estable debido a la inclusión de tres enlaces disulfuro que unen seis residuos de cisteína dentro de la proteína. También contiene una horquilla p retorcida y una hélice a en el terminal C. Los estudios in vitro han demostrado que la aprotinina atraviesa una capa celular que imita a la BHE de los mamíferos y, por tanto, actúa como un vector para transportar agentes a través de la BHE de un individuo necesitado.
Por consiguiente, los polipéptidos útiles en los presentes conjugados pueden tener una o más de las características de un polipéptido de aprotinina u otro polipéptido de dominio de KPI. Es decir, un polipéptido incorporado en los presentes conjugados puede incluir o consistir en aproximadamente 58 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 56-60 residuos de aminoácidos, inclusive) que exhiben un grado de homología o identidad con una secuencia de aprotinina (por ejemplo, 70-100 % de homología o identidad); puede incluir aproximadamente diez residuos de lisina y/o arginina; puede contener no más de aproximadamente cuatro residuos cargados negativamente (por ejemplo, no más de aproximadamente cuatro residuos de aspartato o glutamato); puede incluir aproximadamente tres (por ejemplo, 2-4, inclusive) enlaces intramoleculares (por ejemplo, disulfuro); y/o puede incluir una horquilla p retorcida y/o una hélice a en el terminal C. Los inventores han identificado una familia de polipéptidos que se diferencian de un polipéptido de aprotinina, pero conservan cierto grado de similitud con él. Estos polipéptidos derivados de aprotinina se describen en el presente documento en el contexto de conjugados de proteínas de nueva configuración, de los que pueden formar parte. Por consiguiente, los presentes conjugados pueden incluir una secuencia de aprotinina descrita en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia que consta de la SEQ ID NO: 98 o la SEQ ID NO: 126 (véase también Siekmann et al., Biol. Chem. 369 (3): 157 -163, 1988). Aunque el mecanismo molecular exacto de la transcitosis no está claro, y aunque la invención no se limita a conjugados de proteínas que funcionan mediante un mecanismo molecular particular, se cree que los polipéptidos descritos en este documento, incluidos la aprotinina y los polipéptidos derivados de aprotinina, interactúan con un receptor de la familia de LRP.
Polipéptidos: Los polipéptidos útiles en el contexto de los presentes conjugados incluyen aquellos que tienen un dominio de Kunitz, que se entiende en la técnica que inhibe las enzimas que degradan proteínas. Los polipéptidos incorporados en los presentes conjugados pueden o no conservar esa función. Como los dominios tienen típicamente aproximadamente 50-60 residuos de aminoácidos de longitud y típicamente tienen un peso molecular de aproximadamente 6 kDa, la porción polipeptídica de los presentes conjugados puede tener estas mismas características. Más específicamente, el polipéptido puede ser aprotinina, proteína precursora del amiloide de Alzheimer (APP) o inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI). Dado que estas proteínas pueden ser inmunogénicas, la invención abarca fragmentos menos inmunogénicos de estas proteínas que acompañan a una fracción del anticuerpo conjugado a través de la barrera hematoencefálica. Puede usarse APP o un fragmento biológicamente activo de la misma en los presentes conjugados a pesar de la falta de un dominio KPI.
En una realización, el polipéptido o polipéptidos incorporados en los conjugados de proteínas de la invención son: una aprotinina (por ejemplo, la SEQ ID NO: 98); un fragmento o análogo biológicamente activo de aprotinina (este fragmento puede incluir una o más de las características de un dominio de Kunitz, como se discutió anteriormente). En una realización, el polipéptido está representado por la SEQ ID NO: 117 o es un fragmento biológicamente activo o análogo de la SEQ ID NO: 117 (por ejemplo, un fragmento o análogo mostrado en la Tabla de la Figura 2).
Los residuos de aminoácidos dentro de los polipéptidos pueden ser de la forma estándar de a-aminoácidos y pueden estar en forma D, forma L o una mezcla de estas dos formas enantioméricas. Como se conoce en la técnica, todos los a-aminoácidos excepto la glicina pueden existir en cualquiera de dos formas enantioméricas, y una o ambas formas pueden incorporarse en los presentes polipéptidos así como en las fracciones de anticuerpos de los conjugados de proteína. Como también se conoce en la técnica, la convención de referirse a los residuos de aminoácidos por tener una forma D o L no es una referencia a la actividad óptica del propio residuo de aminoácido, sino a la actividad óptica del isómero de gliceraldehído a partir del cual ese aminoácido puede, en teoría, sintetizarse (el D-gliceraldehído es dextrógiro y el L-gliceraldehído es levógiro). La sustitución de un residuo de aminoácido en forma D en lugar de un residuo de aminoácido en forma L puede generar un polipéptido más estable. Por ejemplo, el empleo de D-lisina en lugar de L-lisina en la posición 10 y/o la posición 15 (o posiciones comparables en un análogo de un polipéptido derivado de aprotinina) puede aumentar la estabilidad de un polipéptido derivado de aprotinina. De manera similar, el empleo de un aminoácido en forma D en el terminal N y/o el terminal C de dicho polipéptido debería aumentar la estabilidad in vivo porque las peptidasas no pueden utilizar un D-aminoácido como sustrato (Powell et al., Pharm. Res.
10: 1268-1273, 1993). Los polipéptidos también pueden configurarse como polipéptidos D inversos, que contienen residuos de aminoácidos en forma D dispuestos en una secuencia inversa con respecto a un polipéptido que contiene L-aminoácidos; el residuo del terminal C de un polipéptido con L-aminoácidos se convierte en el terminal N para el polipéptido con D-aminoácidos, y viceversa. Los polipéptidos D inversos retienen la misma conformación terciaria y, por lo tanto, la misma actividad que el polipéptido con L-aminoácidos correspondiente, pero su mayor estabilidad puede conducir a una mayor eficacia terapéutica (Brady y Dodson, Nature 368: 692-693, 1994 y Jameson et al., Nature 368: 744-746, 1994). Los polipéptidos también pueden ser "restringidos", por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína que forman puentes disulfuro (véase Rizo et al., Ann. Rev. Biochem. 61: 387-418, 1992). En cualquier realización, el polipéptido puede ser un polipéptido cíclico (por ejemplo, ciclado mediante la inclusión de residuos de cisteína terminales que forman enlaces disulfuro).
Con respecto a su preparación, los polipéptidos útiles en los conjugados de proteínas pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos de síntesis y técnicas recombinantes utilizadas de forma rutinaria para producir proteínas a partir de ácidos nucleicos. Los polipéptidos resultantes pueden almacenarse en una forma no purificada o aislada o sustancialmente purificada hasta su uso posterior. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden almacenar hasta que se usen en los métodos descritos a continuación para generar un conjugado de proteína de la invención. La síntesis química se puede lograr, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida, y las técnicas recombinantes pueden incluir la expresión de constructos de vector en una célula biológica (por ejemplo, una célula procariota o eucariota). Los codones que codifican residuos de aminoácidos específicos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Biochemistry", 3a Ed., 1988, Lubert Stryer, Universidad de Stanford, WH Freeman and Company, Nueva York), al igual que los métodos para la optimización de codones. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica un análogo de aprotinina se ilustra en la SEQ ID NO: 106 y se puede encontrar en el GenBank con el número de acceso X04666. Esta secuencia codifica un análogo de aprotinina que tiene una lisina en la posición 16 (con referencia a la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 106) en lugar de una valina como se encuentra en la SEQ ID NO: 98. Se puede introducir una mutación en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 106 mediante métodos conocidos en la técnica para producir el péptido de la SEQ ID NO: 98 que tiene una valina en la posición 16.
Los polipéptidos descritos en el presente documento para su inclusión en un conjugado de proteína pueden modificarse postraduccionalmente, ya sea dentro de una célula en la que se expresa el polipéptido o ex vivo mediante modificación química. Por ejemplo, un polipéptido como se describe en este documento puede pegilarse, acetilarse, acilarse, amidarse, oxidarse, ciclarse y/o sulfonarse.
Como se describe en detalle, los polipéptidos dentro de los conjugados pueden tener una secuencia como se establece específicamente en este documento (por ejemplo, la secuencia representada por la SEQ ID NO: 67 o 97 o cualquier otro polipéptido derivado de aprotinina mostrado en la Tabla de la Figura 2) o pueden ser fragmentos biológicamente activos o análogos de cualquiera de estas secuencias de referencia. Un fragmento se diferencia de una secuencia de referencia en virtud de que tiene menos residuos de aminoácidos contiguos (uno o más aminoácidos del terminal N o C se eliminan) mientras que un análogo se diferencia de la secuencia de referencia porque incluye al menos un residuo de aminoácido adicional o al menos una sustitución de aminoácido. El o los residuos de aminoácidos adicionales se pueden agregar al terminal N, al terminal C, a una posición entre los terminales N y C de un polipéptido de referencia (por ejemplo, la SEQ ID NO: 117), o en cualquier combinación de estas posiciones. Un análogo puede ser más corto que una secuencia de referencia (es decir, puede incluir una eliminación de uno o más residuos de aminoácidos), sin embargo, se usa el término "análogo" para referirse a una variante que difiere de alguna manera de la secuencia de referencia de manera que no sea solo una simple eliminación de un residuo o residuos de aminoácidos del terminal N y/o C. Cuando el análogo incluye una sustitución de un residuo de aminoácido, la sustitución puede considerarse conservadora o no conservadora. Las sustituciones conservadoras son aquellas dentro de los siguientes grupos: Ser, Thr y Cys; Leu, Ile y Val; Glu y Asp; Lys y Arg; Phe, Tyr y Trp; y Gln, Asn, Glu, Asp y His. Por ejemplo, reemplazar un residuo de serina con treonina o cisteína se consideraría una sustitución conservadora de aminoácidos; la sustitución de leucina por isoleucina o valina se consideraría una sustitución conservadora de aminoácidos; etc. Las sustituciones conservadoras también pueden definirse mediante el algoritmo BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local), la matriz de sustitución BLOSUM (por ejemplo, la matriz BLOSUM 62) o la sustitución PAM: matriz p (por ejemplo, la matriz PAM 250).
Cuando una secuencia de referencia tiene 19 residuos de aminoácidos, un fragmento biológicamente activo de la misma puede tener de 6 a 18 residuos contiguos (inclusive). Cuando la secuencia de referencia tiene 19 residuos de aminoácidos, un análogo biológicamente activo de la misma puede tener 1 a 13 sustituciones de aminoácidos; una o más adiciones de aminoácidos (por ejemplo, la adición de residuos en el terminal N y/o terminal C que aumentan la longitud del polipéptido de referencia hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácidos); o una combinación de tales sustituciones y adiciones. Como se señaló, en el caso de un análogo (en oposición a un fragmento), en el que hay al menos una sustitución y/o al menos una adición, también puede haber al menos una eliminación.
El grado de similitud entre un fragmento o análogo biológicamente activo de un polipéptido derivado de aprotinina y el polipéptido de referencia también puede expresarse como el porcentaje de residuos que son idénticos en posiciones comparables. Un fragmento o análogo biológicamente activo de un polipéptido derivado de aprotinina puede ser al menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% idéntico a un polipéptido de referencia (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina al que se le asigna un identificador de secuencia en el presente documento).
Así como la forma enantiomérica de los residuos de aminoácidos incorporados puede alterar la estabilidad de un polipéptido, se puede modificar la longitud y el contenido del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina) para optimizar una característica tal como la carga o la polaridad, hidrofilicidad o hidrofobicidad, biodisponibilidad y propiedades de conjugación. Por ejemplo, se puede promover una carga positiva eliminando uno o más aminoácidos (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 3 residuos de aminoácidos) que no están básica/positivamente cargados o que tienen una carga menos positiva (por ejemplo, según lo determinado mediante pKa). Alternativamente, o además, la carga positiva se puede promover agregando uno o más aminoácidos (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 3 residuos de aminoácidos) que están básica/positivamente cargados o cargados más positivamente (por ejemplo, según lo determinado por pKa) que los residuos que reemplazan. Un experto en la materia reconocería que los residuos de origen natural tienen propiedades reconocidas y compartidas, atribuidas en gran parte a las propiedades de sus cadenas laterales. La siguiente información puede usarse según se desee para modificar las propiedades de los polipéptidos derivados de aprotinina. Para aumentar la hidrofobicidad, se puede incorporar norleucina, metionina (Met), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), histidina (His), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y fenilalanina (Phe); para aumentar la neutralidad o hidrofilicidad, se pueden incorporar cisteína (Cys), serina (Ser) y treonina (Thr); para aumentar la acidez o carga negativa, se puede incorporar ácido aspártico (Asp) o ácido glutámico (Glu); para promover la basicidad, se pueden incorporar asparagina (Asn), glutamina (Gln), histidina (His), lisina (Lys) y arginina (Arg). Los residuos que influyen en la orientación de la cadena incluyen glicina (Gly) y prolina (Pro). Los residuos con cadenas laterales aromáticas incluyen triptófano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe) e histidina (His).
En las secuencias de referencia proporcionadas en este documento, los residuos de aminoácidos son de origen natural. Sin embargo, los análogos biológicamente activos de estas secuencias pueden incluir uno o más residuos de origen no natural. Por ejemplo, pueden incluir selenocisteína (por ejemplo, seleno-L-cisteína) en cualquier posición, incluso en el lugar de la cisteína en la posición 7. Se conocen en la técnica muchos otros sustitutos de aminoácidos "no naturales" y están disponibles a partir de fuentes comerciales tales como como la empresa química Sigma Aldrich. Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen D-aminoácidos en la mayoría de los casos, residuos de aminoácidos que tienen un grupo acetilaminometilo unido a un átomo de azufre de una cisteína, un aminoácido pegilado y aminoácidos omega de fórmula NH2(CH2)nCOOH en la que n es 2-6 aminoácidos no polares neutros, tales como sarcosina, t-butilalanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina y norleucina. La fenilglicina puede sustituir a Trp, Tyr o Phe; la citrulina y el sulfóxido de metionina son neutros no polares, el ácido cisteico es ácido y la ornitina es básica. La prolina puede sustituirse con hidroxiprolina y conservar la conformación que confiere las propiedades de la prolina. Los conjugados de proteínas de la invención abarcan polipéptidos y fracciones de anticuerpos que incluyen dichos residuos. Debe entenderse que cuando nos referimos a una modificación o característica tal como la inclusión de varios enantiómeros, una modificación postraduccional o la inclusión de un residuo "no natural", esa modificación o característica puede estar presente en la parte del conjugado descrito en el presente documento como polipéptido derivado de aprotinina, en la parte del conjugado descrito en este documento como la fracción del anticuerpo, o en cualquier otra parte del conjugado que contenga aminoácidos (por ejemplo, en un marcador detectable).
Independientemente de la secuencia o características precisas de un fragmento o análogo biológicamente activo de un polipéptido de referencia, esa variante puede tener una capacidad reducida o una capacidad mejorada para transportar una fracción del anticuerpo a través de la BHE en relación con la capacidad de una secuencia de referencia. Por supuesto, una secuencia referenciada y un fragmento biológicamente activo o análogo de la misma también pueden tener aproximadamente las mismas capacidades con respecto al transporte a través de la BHE. Por ejemplo, cuando el polipéptido es una variante biológicamente activa de un polipéptido de referencia (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 67, 97 o 117), la capacidad de la variante para transportar una fracción del anticuerpo conjugado puede reducirse, en relación con el polipéptido referenciado, en al menos o aproximadamente un 5% (por ejemplo, en al menos o aproximadamente un 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, o 95%). Cuando el polipéptido es una variante biológicamente activa de un polipéptido referenciado (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 67, 97 o 117), la capacidad de la variante para transportar una fracción del anticuerpo conjugado puede mejorarse, en relación con el polipéptido referenciado, en al menos o aproximadamente el 5% (por ejemplo, al menos o aproximadamente el 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500% o 1000%). Como se señaló anteriormente, aunque la actividad puede variar, un fragmento o análogo biológicamente activo de un polipéptido de referencia es uno que es lo suficientemente activo para lograr un resultado beneficioso (por ejemplo, un resultado clínicamente beneficioso en un paciente o, en promedio, un grupo de pacientes a quienes se administra). El resultado beneficioso puede ser un procedimiento de diagnóstico o tratamiento beneficioso.
En realizaciones particulares, el polipéptido puede tener la secuencia: Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g (SEQ ID NO: 67) o Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19 (SEQ ID NO: 97). Como se indicó anteriormente, el polipéptido puede ser un fragmento o un análogo de la SEQ ID NO: 117 en el que al menos 13 de los 19 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 117 permanecen invariantes. En particular, el análogo de la SEQ ID NO: 117 puede incluir una secuencia en la que K10 y/o K15 permanecen invariables. En algunas realizaciones, Asn12 está sustituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, Gln); Asn13 está sustituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, Gln); y/o Phe14 está sustituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, Tyr o Trp). El polipéptido puede incluir la secuencia: Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr19-Cys (SEQ ID NO: 118); Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Gly9-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr^-Cys (SEQ ID NO: 119); Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g-Cys (SEQ ID NO: 120); Glyg-Lys10-Arg11-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g-Cys (SEQ ID NO: 121); o Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr19-Cys (SEQ ID NO: 122).
Cuando el polipéptido es un fragmento de la SEQ ID NO: 117, o cuando el polipéptido es un análogo de la SEQ ID NO: 117 que incluye un fragmento de la SEQ ID NO: 117, el fragmento puede tener una longitud de al menos 6 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 residuos de aminoácidos) que son idénticos a 6-18 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 117. De acuerdo con la presente invención, el fragmento puede ser Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15 (SEQ ID NO: 123). Los análogos biológicamente activos de la SEQ ID NO: 17 pueden tener (consistir en), o pueden incluir (comprender) una secuencia en la que los residuos de lisina en las posiciones 10 y 15 son invariantes, o una secuencia en la que los residuos de lisina en las posiciones 10 y 15 así como el residuo de arginina en la posición 16 es invariante. En el último caso, el análogo biológicamente activo tendría, o incluiría, una secuencia conforme a la fórmula Lys-Arg-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys (Fórmula I; SEQ ID NO: 106). Xaa3 puede ser Asn o Gln; Xaa4 puede ser Asn o Gln; y Xaa5 puede ser Phe, Tyr o Trp. La secuencia indicada anteriormente, Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15 (SEQ ID NO: 123) se ajusta a la Fórmula I. En la que se seleccionan Xaa3 , Xaa4 y Xaa5 , pueden ser sustituciones conservadoras (es decir, los residuos de Asn contiguos se puede reemplazar, independientemente con Gln, Glu, Asp o His, y Phe se puede reemplazar con Tyr o Trp). Xaa3, Xaa4 y Xaa5 también pueden variar en forma enantiomérica, pueden ser residuos de aminoácidos de origen no natural o pueden seleccionarse en base a otra rasgo o característica como se describe en el presente documento.
En realizaciones particulares, el polipéptido derivado de aprotinina tiene (consta de) o incluye (comprende) una secuencia mostrada en la Tabla de la Figura 2, designada como SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 123.
Polipéptidos modificados: cualquiera de los polipéptidos incorporados en los conjugados de proteínas de la invención puede modificarse para interactuar químicamente con un enlazador (por ejemplo, un enlazador unido a una fracción del anticuerpo) como se describe más adelante. Estos polipéptidos modificados están dentro del alcance de la presente invención y pueden empacarse como un componente de un kit con instrucciones para completar el proceso de conjugación con una fracción del anticuerpo unida al enlazador. Por ejemplo, un polipéptido se puede modificar para incluir un grupo azida N3 , que reaccionará con un alquino en un enlazador unido a una fracción del anticuerpo (y viceversa; el polipéptido se puede unir al enlazador incluyendo un alquino, que reaccionará con un grupo azida que se extiende desde una fracción del anticuerpo).
Fracciones de anticuerpo: además de un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido derivado de aprotinina), los conjugados de proteínas de la presente invención incluyen una única fracción de anticuerpo o una variante biológicamente activa del mismo. Como se señaló anteriormente, la fracción del anticuerpo puede ser un anticuerpo expresado de forma natural (por ejemplo, un anticuerpo tetramérico) o una variante biológicamente activa del mismo. La fracción del anticuerpo también puede ser un anticuerpo de origen no natural (por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla) o una variante biológicamente activa del mismo. Las variantes incluyen, sin limitación, un fragmento de un anticuerpo natural (por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, por ejemplo, de un anticuerpo tetramérico), un fragmento de un scFv o una variante de un anticuerpo tetramérico, un scFv, o fragmentos del mismo que se diferencian en virtud de la adición y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos.
Como es bien conocido en la técnica, se pueden generar ciertos tipos de fragmentos de anticuerpos mediante el tratamiento enzimático de un anticuerpo de "longitud completa". La digestión con la enzima papaína produce dos fragmentos Fab idénticos, cada uno con un único sitio de unión al antígeno y un fragmento Fc residual. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el dominio Ch1 de la cadena pesada. Por el contrario, la digestión con la enzima pepsina produce el fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con el antígeno. Las fracciones del anticuerpo incorporados en los presentes conjugados se pueden generar mediante digestión con estas enzimas o se pueden producir mediante otros métodos.
Los fragmentos Fab', que también pueden incorporarse, difieren de los fragmentos Fab en que incluyen residuos adicionales en el terminal C del dominio Ch1, incluyendo uno o más residuos de cisteína de la región bisagra del anticuerpo. Los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre, que puede participar en las reacciones de conjugación descritas en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 son pares de fragmentos Fab' unidos por residuos de cisteína en la región bisagra. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
La región Fv es un fragmento mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo que consta de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera. Las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno con el anticuerpo. Como se conocería en la técnica, un anticuerpo de "cadena sencilla" o fragmento "scFv" es una variante de Fv de cadena sencilla formada cuando los dominios Vh y Vl de un anticuerpo se incluyen en una cadena polipeptídica sencilla que reconoce y se une a un antígeno. Normalmente, los anticuerpos monocatenarios incluyen un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme una estructura tridimensional deseada para la unión del antígeno (véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, 113: 269-315, 1994).
En otras realizaciones, la fracción del anticuerpo puede ser un diacuerpo. Los diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpos que tienen dos sitios de unión al antígeno. Cada fragmento contiene un dominio VH concatenado a un dominio Vl. Sin embargo, dado que el enlazador entre los dominios es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre ellos en la misma cadena, los dominios Vh-Vl enlazados se ven obligados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993.
En otra realización, la fracción del anticuerpo puede ser un anticuerpo lineal. En este caso, la fracción del anticuerpo se forma a partir de un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos como se describe, por ejemplo, en Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8 (10): 1057 - 1062, 1995.
Con respecto a los objetivos, la fracción del anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo tetramérico, una variante biológicamente activa del mismo, un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2 , o variantes biológicamente activas del mismo, independientemente de la clase (es decir, ya sea de la clase IgG u otra clase) y ya sea humano, humanizado, quimérico, policlonal, monoclonal o que tenga cualquier otro atributo o característica descrita en este documento) puede unirse específicamente a un receptor del factor de crecimiento o un receptor de citocina (por ejemplo, un receptor de interleucina). El receptor del factor de crecimiento puede ser un receptor unido por un miembro de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Ejemplos de receptores para proteínas de la familia EGF incluyen un receptor de EGF (EGFR), un receptor del factor de crecimiento similar al EGF que se une a heparina (HB-EGFR), un receptor de anfirregulina (AR), un receptor de epirregulina (EPR), un receptor de epígeno, un receptor de betacelulina y un receptor para una neurregulina (por ejemplo, un receptor para neurregulina-1, neurregulina-2, neurregulina-3 o neurregulina-4). En la presente invención, la fracción del anticuerpo puede ser trastuzumab, cetuximab o panitumumab, un scFv que comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de trastuzumab, cetuximab o panitumumab, o una variante biológicamente activa de estos anticuerpos tetraméricos o monocatenarios. Por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab')2 de trastuzumab, cetuximab o panitumumab.
Con respecto a la función, la fracción del anticuerpo puede ser un agente quimioterapéutico o un agente antiinflamatorio.
Varios de nuestros estudios hasta la fecha, incluidos algunos de los descritos en los ejemplos a continuación, se han realizado con trastuzumab (HERCEPTIN®), que es un anticuerpo monoclonal humanizado de ratón que se une con alta afinidad al receptor del factor 2 de crecimiento epidérmico humano (HER2)/neu. Trastuzumab está aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer de mama. Se cree que el receptor de HER2/neu es un receptor huérfano sin ligando conocido. Sin embargo, se expresa en la superficie de las células tumorales y regula procesos celulares críticos como la progresión del ciclo celular, la supervivencia celular, la proliferación celular y la motilidad celular. Trastuzumab o cualquier fracción del anticuerpo que se una de forma selectiva a HER2 puede ser un biomarcador clínicamente relevante para ciertos tipos de tumores. Terapéuticamente, cuando trastuzumab se une al receptor HER, no solo inhibe la capacidad de la célula para crecer y dividirse, sino que también marca la célula para que la destruya el sistema inmunológico del huésped.
Enlazadores: se puede usar una variedad de enlazadores para generar los presentes conjugados. Por ejemplo, una fracción del anticuerpo o una variante biológicamente activa del mismo puede unirse a un enlazador que reacciona con aminas libres modificadas, que están presentes en los residuos de lisina dentro del polipéptido y en el terminal amino del polipéptido. Por tanto, los enlazadores útiles en los presentes conjugados pueden comprender un grupo que es reactivo con una amina primaria en el polipéptido o polipéptido modificado con el que se conjuga la fracción del anticuerpo. Más específicamente, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en ciclooctina monofluorada (MFCO), biciclo[6.1.0]nonino (BCN) y éster de dibenzociclooctina (un éster de DBCO).
Los entrelazadores homobifuncionales y heterobifuncionales (agentes de conjugación) están disponibles en muchas fuentes comerciales. Aunque es conocido en la técnica, notamos brevemente que los grupos reactivos en los entrelazadores homobifuncionales son idénticos y están colocados en extremos opuestos del brazo espaciador del entrelazador. Es conveniente trabajar con ellos, ya que la reacción se puede completar con un entrelazador químico en una sola etapa y se pueden ensamblar cuando se desee para formar dímeros y polímeros. Entre los entrelazadores homobifuncionales disponibles comercialmente se encuentran: BSOCOES (bis(2-[succinimidooxicarboniloxi]etil) sulfona; DPDPB (1,4-di(3'-[2-piridilditio]-propionamido)butano; DSS (suberato de disuccinimidilo); DST (tartrato de disuccinimidilo); Sulfo DST (tartrato de sulfodisuccinimidilo); DSP (ditiobis(propionato de succinimidilo); DTSSP (3,3'-ditiobis(propionato de sulfosuccinimidilo); EGS (bis(succinimidil succinato) de etilenglicol); y BASED (Bis(p-[4-azidosalicilamido]-etil)disulfuro que puede ser yodado).
Las regiones disponibles para el entrecruzamiento con un entrelazador homo o heterobifuncional pueden encontrarse en los polipéptidos de la presente invención. El entrelazador (o enlazador, como ese término se usa más comúnmente en este documento) puede comprender un brazo flexible, como por ejemplo, un brazo corto (cadena de < 2 carbonos), un brazo de tamaño mediano (cadena de 2 a 5 carbonos), o un brazo largo (cadena de 3-6 carbonos). Entre los entrelazadores útiles se incluyen BS3 ([bis(sulfosuccinimidil)suberato], que es un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional que se dirige a aminas primarias accesibles. Otro enlazador útil es NHS/EDC (N-hidroxisuccinimida y N-etil-(dimetilaminopropil)carbodiimida, que permite la conjugación de grupos amina primaria con grupos carboxilo). Otro enlazador útil es sulfoEMCS ([ácido N-e-maleimido-caproico]hidrazida, que incluye grupos reactivos heterobifuncionales (una maleimida y un éster de NHS) que son reactivos hacia los grupos sulfhidrilo y amino. Otro enlazador útil es la hidrazida. La mayoría de las proteínas contienen carbohidratos expuestos y la hidrazida es un reactivo útil para enlazar grupos carboxilo a aminas primarias. Otro enlazador útil es SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato). SATA es reactivo frente a aminas y agrega grupos sulfhidrilo protegidos. Con respecto al método utilizado, el proceso de conjugar una fracción del anticuerpo al polipéptido preferiblemente no altera ni cambia las características clave de la fracción del anticuerpo, tal como su inmunoespecificidad o inmunorreactividad. Los entrelazadores homobifuncionales específicos de amina pueden depender de grupos reactivos de éster de NHS e imidoéster para la conjugación selectiva de aminas primarias y pueden ser escindibles. Los entrelazadores heterobifuncionales tienen dos grupos distintos, lo que permite que la conjugación progrese como una reacción de dos etapas. Estos enlazadores también están disponibles comercialmente en diferentes longitudes con diferentes tipos de brazos espaciadores. La conjugación puede tener lugar entre grupos amina primaria (por ejemplo, en un residuo de lisina) y grupos sulfhidrilo (por ejemplo, en un residuo de cisteína). Los enlazadores útiles se enumeran en las tablas de la Figura 11.
Conjugados de proteínas y métodos para su elaboración: La fracción del anticuerpo, enlazador y polipéptido dentro de un conjugado dado se pueden seleccionar de forma independiente. Es decir, cualquiera de los enlazadores descritos en el presente documento puede usarse para conjugar cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento con cualquiera de las fracciones de anticuerpos descritos en el presente documento. Los anticuerpos, polipéptidos y enlazadores de la invención se definen en las reivindicaciones. Los conjugados pueden usarse luego para administrar cualquiera de las fracciones de anticuerpos descritos en este documento al SNC por razones terapéuticas. Con la inclusión de un marcador detectable, los presentes conjugados también se pueden usar como agentes de formación de imágenes, proporcionando los medios para mapear la distribución de antígenos a los que se unen las fracciones de anticuerpos dentro del SNC.
Los conjugados de proteínas de la invención pueden formarse uniendo (es decir, conjugando), sin limitación, una o más fracciones polipeptídicas a una fracción del anticuerpo.
También se describen técnicas que incluyen el entrelazador SATA y la aplicación de la química del clic. SATA es un entrelazador heterobifuncional que facilita la formación de un enlace covalente para unir dos moléculas (es decir, la fracción del anticuerpo a la fracción del polipéptido). El éster succinimidílico reacciona con una amina primaria para introducir un grupo tiol en la molécula, seguido de la eliminación del grupo acetilo, generando así un sulfhidrilo. El grupo tiol proporciona el objetivo para unir las dos fracciones mediante un enlace disulfuro. Una de las ventajas de aplicar la reacción SATA es que la molécula modificada se puede almacenar durante largos períodos de tiempo para reacciones de conjugación posteriores porque los grupos sulfhidrilo se pueden agregar en forma protegida.
Como se señaló, se pueden usar técnicas de química clic sin cobre para producir los conjugados descritos en este documento. La química clic se entiende generalmente como una reacción modular que es ampliamente aplicable, estereoespecífica y capaz de producir altos rendimientos de productos en condiciones suaves (por ejemplo, condiciones fisiológicas). Se ha descrito que la química clic abarca cuatro clases de transformaciones químicas. Las primeras son reacciones químicas de carbonilo de tipo no aldólico, como las que forman ureas, tioureas, éteres de oxima, hidrazona, amidas y heterociclos aromáticos. Las segundas transformaciones son reacciones de sustitución nucleofílica en las que se abre un anillo dentro de un electrófilo heterocíclico deformado (por ejemplo, epóxidos, aziridinas y iones aziridinio). En la tercera, se producen reacciones de adición a enlaces múltiples C-C, tal como la adición de Michael, epoxidación, aziridación y dihidroxilación, y en la cuarta, reacciones de cicloadición, tales como cicloadición 1,3-dipolar y reacciones de Diels-Alder. La cicloadición 1,3-dipolar (reacción 1,3-Huisgen) de un alquino y una azida para formar triazol de cinco miembros es un ejemplo particular de una reacción clic. Véase, Guddehalli Parameswarappy, Sharavathi, "Bifunctional cyclooctynes in copper-free click chemistry for applications in radionuclide chemistry nd 4-Alkylpyridine derivatives in intramolecular dearomatization and heterocycle synethsis", Dissertation, University of Iowa, 2011. http://ir.uiowa.edu/etd/2710. Los métodos de química clic pueden utilizar el catalizador de cobre altamente tóxico en métodos de producción que producen altos rendimientos. Las reacciones de conjugación preliminares mostraron, sin embargo, que la incorporación total de un polipéptido en un conjugado de la invención fue muy baja (6%). El conjugado también era inestable y se observó una precipitación del producto. Por lo tanto, las etapas de conjugación que utilizan química clic se optimizaron para eliminar el uso de cobre. Brevemente, la etapa uno implica la activación de grupos para la conjugación, así como la purificación y diálisis del compuesto intermedio. Para esta etapa, un primer componente (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo) reacciona con un enlazador que genera un primer compuesto intermedio enlazador del componente (por ejemplo, un compuesto intermedio enlazador de anticuerpo o fragmento de anticuerpo). A continuación, el enlazador que tiene un grupo activado para la conjugación (es decir, alquino) y un segundo componente (por ejemplo, un polipéptido que tiene una azida) reaccionan formando el conjugado deseado que puede purificarse adicionalmente. Esta segunda etapa es eficaz porque la reacción entre los grupos relevantes (fracciones alquino y azida) tiene lugar dentro de las 24 horas a temperatura ambiente y sin desnaturalizar la proteína. Ninguna de las etapas de este procedimiento interfiere con la actividad biológica de las moléculas generadas.
Alternativamente, la fracción polipeptídica se puede unir o conjugar a una fracción de carbohidrato de la molécula de anticuerpo mediante un proceso de oxidación. El método de oxidación de carbohidratos puede ser químico o enzimático. La fracción de carbohidrato se puede ubicar en la región Fc del anticuerpo, fragmentos Fab o Fab'. La oxidación de la región Fc de la fracción del anticuerpo se puede llevar a cabo usando métodos conocidos para producir un aldehído. Los agentes oxidantes se pueden seleccionar del grupo que consiste en ácido peryódico, ácido paraperyódico, metaperyodato de sodio y metaperyodato de potasio. A esta etapa le sigue una reacción con un grupo amina seleccionado del grupo que consiste en derivados de amoníaco tales como amina primaria, amina secundaria, hidroxilamina, hidracina, hidrazida, fenilhidracina, semicarbazida o tiosemicarbazida). El método enzimático implica hacer reaccionar la fracción de carbohidrato de la molécula de anticuerpo con una enzima tal como el oxidato de galactosa en presencia de oxígeno para formar un aldehído.
Los conjugados de proteínas de la presente invención pueden evaluarse de diversas formas. Por ejemplo, se puede evaluar la permeabilidad de la BHE en un conjugado de proteína (mediante perfusión cerebral in situ o ensayando en un modelo ex vivo de la BHE tal como el modelo descrito en la patente de los Estados Unidos No. 7.557.182); por la afinidad de la fracción del anticuerpo por su objetivo; por la citotoxicidad (por ejemplo, por incorporación de bT-474 [3H]-timidina); por la solubilidad y/o estabilidad in vitro; por la pureza (por ejemplo, se pueden confirmar niveles bajos de fracciones de anticuerpos no conjugados y niveles bajos de agregados de proteínas mediante separación en gel y transferencia Western); y por la estabilidad y distribución in vivo en el tejido (por ejemplo, midiendo los niveles en plasma a lo largo del tiempo y la distribución en el tejido mediante ensayos de formación de imágenes).
Composiciones farmacéuticas: la presente invención también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de proteína de la invención. Las composiciones se pueden formular para la administración mediante cualquiera de una variedad de vías de administración y pueden incluir uno o más excipientes fisiológicamente aceptables, que pueden variar dependiendo de la vía de administración. Se usa el término "excipiente" en sentido amplio para significar cualquier compuesto o sustancia, incluidos aquellos que también pueden denominarse "vehículos" o "diluyentes". La preparación de composiciones farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables se considera generalmente una rutina en la técnica, y un experto en la técnica puede consultar a numerosas autoridades para obtener orientación. Por ejemplo, se puede consultar Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 17a ed., 1985. Para una breve revisión de los métodos para la administración de fármacos, véase, por ejemplo, Langer (Science 249: 1527-1533, 1990).
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar para administración oral o parenteral, aunque esperamos que se favorezca la administración parenteral (no por conveniencia sino para optimizar la administración del agente de diagnóstico o farmacéutico activo (en el presente documento, la fracción del anticuerpo). Las composiciones farmacéuticas preparadas para administración parenteral incluyen aquellas preparadas para administración intravenosa (o intraarterial), intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, transmucosa (por ejemplo, intranasal, intravaginal o rectal) o transdérmica (por ejemplo, tópica). Estas vías se pueden utilizar para tratamiento diagnóstico o terapéutico. También se contempla la inhalación de aerosoles. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que incluyen conjugados de proteínas disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso, tal como agua, agua tamponada, solución salina, solución salina tamponada (por ejemplo, PBS) y similares. Uno o más de los excipientes incluidos pueden ayudar a aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes ajustadores de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Cuando las composiciones incluyen un componente sólido (como puede ser para la administración oral), uno o más de los excipientes pueden actuar como aglutinantes o rellenos (por ejemplo, para la formulación de un comprimido, una cápsula y similares). Cuando las composiciones se formulan para su aplicación en la piel o en una superficie mucosa, uno o más de los excipientes pueden ser un disolvente o emulsionante para la formulación de una crema, un ungüento y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser estériles; pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales o pueden esterilizarse por filtración. Las soluciones acuosas pueden envasarse para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada, que está abarcada por la invención, con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. El pH de las composiciones farmacéuticas estará típicamente entre 3 y 11 (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 9) o entre 6 y 8 (por ejemplo, entre aproximadamente 7 y 8). En algunas realizaciones, el pH de las composiciones farmacéuticas está entre aproximadamente 7,0 y 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida se pueden empacar en múltiples unidades de dosis única, cada una de las cuales contiene una cantidad fija del agente o agentes mencionados anteriormente, tal como en un empaque sellado de comprimidos o cápsulas. La composición en forma sólida también se puede empacar en un recipiente para una cantidad flexible, tal como en un tubo comprimible diseñado para una crema o ungüento de aplicación tópica.
Métodos de tratamiento y uso: Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente se pueden formular para incluir una cantidad útil para el diagnóstico o terapéuticamente eficaz de un conjugado de proteína. La administración terapéutica abarca aplicaciones profilácticas, y cualquiera de los métodos terapéuticos descritos en este documento se puede expresar en términos del "uso" del conjugado de proteína (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer o en la preparación de un medicamento útil para tratar el cáncer). Con base en pruebas genéticas y otros métodos de pronóstico, un médico en consulta con su paciente puede elegir una administración profiláctica en la que el paciente tiene una predisposición clínicamente determinada o una mayor susceptibilidad (en algunos casos, una susceptibilidad mucho mayor) a un cáncer del SNC o un trastorno neurológico con afectación del SNC. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar al sujeto (por ejemplo, un paciente humano) en una cantidad suficiente para retrasar, reducir o preferiblemente prevenir la aparición de la enfermedad clínica. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) que ya padece un cáncer del SNC o un trastorno neurológico con afectación del SNC en una cantidad suficiente para mejorar al menos parcialmente un signo o síntoma o para inhibir la progresión de (y preferiblemente detener) los síntomas de la afección, sus complicaciones y consecuencias. Una cantidad adecuada para lograr este propósito se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz". Por ejemplo, en el tratamiento de un trastorno neurológico (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Huntington), un agente o compuesto que disminuya, prevenga, retrase, suprima o detenga cualquier síntoma del trastorno sería terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica puede ser una cantidad que logra una cura, pero ese resultado es solo uno entre varios que se pueden lograr. Como se ha indicado, una cantidad de efecto terapéutico incluye cantidades que proporcionan un tratamiento en el que el inicio o la progresión del trastorno se retrasa, dificulta o previene, o mejora el trastorno o un síntoma del trastorno. Uno o más de los síntomas pueden ser menos graves. La recuperación puede acelerarse en un individuo que ha sido tratado.
Las cantidades eficaces para este uso pueden depender de la gravedad del cáncer del SNC o del trastorno neurológico y del peso y estado general del sujeto, pero generalmente oscilan entre aproximadamente 0,05 |jg y aproximadamente 1000 jg (por ejemplo, 0,5-100 jg ) de una cantidad equivalente del conjugado de proteína por dosis por sujeto. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las administraciones de refuerzo se caracterizan por una administración inicial seguida de dosis repetidas en uno o más intervalos de una hora, diarios, semanales o mensuales mediante una administración posterior. Por ejemplo, un sujeto puede recibir un conjugado de proteína en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 1000 jg de dosis equivalente en comparación con una fracción del anticuerpo no conjugado por dosis una o más veces por semana (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o más veces por semana). Por ejemplo, un sujeto puede recibir una dosis de 0,1 a 2500 jg (por ejemplo, 2000, 1500, 1000, 500, 100, 10, 1, 0,5 o 0,1 jg ) por semana. Un sujeto también puede recibir un conjugado de la invención en el intervalo de 0,1 a 3000 jg por dosis una vez cada dos o tres semanas. Un sujeto también puede recibir 2 mg/kg cada semana (con el peso calculado con base en el peso del conjugado o de la fracción del anticuerpo).
La cantidad efectiva total de un conjugado de proteína en las composiciones farmacéuticas de la invención puede administrarse a un mamífero como una dosis única, ya sea como un bolo o por infusión durante un período de tiempo relativamente corto, o puede administrarse usando un protocolo de tratamiento fraccionado en el que se administran múltiples dosis durante un período de tiempo más prolongado (por ejemplo, una dosis cada 4-6, 8-12, 14-16 o 18-24 horas, o cada 2-4 días, 1-2 semanas o una vez al mes). Alternativamente, se contemplan infusiones intravenosas continuas suficientes para mantener concentraciones terapéuticamente eficaces en la sangre.
La cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes presentes en las composiciones de la invención y que se utilizan en los métodos de esta invención aplicados a mamíferos (por ejemplo, seres humanos) puede ser determinada por un experto en la técnica teniendo en cuenta los factores individuales, diferencias de edad, peso y otras condiciones generales (como se mencionó anteriormente). Debido a que los conjugados de proteína de la invención exhiben una capacidad mejorada para cruzar la BHE, la dosis de la fracción del anticuerpo puede ser menor que una dosis eficaz de la fracción del anticuerpo cuando no está conjugado. Por ejemplo, la dosis de la fracción del anticuerpo puede ser menor o aproximadamente 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% de la dosis requerida para un efecto terapéutico con el mismo agente no conjugado o uno comparable.
Las cantidades terapéuticamente eficaces también pueden ser determinadas empíricamente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones farmacéuticas de la invención con niveles de dosificación y el momento o patrón de administración seleccionados por el médico tratante. La dosis y el programa de administración se pueden determinar y ajustar en función de la gravedad de la enfermedad o afección en el sujeto, que se puede controlar a lo largo del curso del tratamiento de acuerdo con los métodos comúnmente practicados por médicos u otros profesionales de la salud capacitados.
Kits: Los kits de la invención pueden incluir cualquier combinación de las composiciones descritas anteriormente e instrucciones adecuadas (ya sean escritas y/o proporcionadas como material de audio, visual o audiovisual). En una realización, el kit incluye una composición farmacéutica o un precursor de la misma que se empaca junto con las instrucciones de uso y, opcionalmente, cualquier dispositivo útil para manipular las composiciones en preparación para la administración y/o para administrar las composiciones. Por ejemplo, los kits de la invención pueden incluir uno o más de: diluyentes, guantes, viales u otros recipientes, pipetas, agujas, jeringas, tubos, soportes, espátulas, paños o cubiertas estériles, controles positivos y/o negativos, y similares. En otra realización, los kits de la invención incluyen composiciones y reactivos útiles para preparar un conjugado de proteína. Por ejemplo, los kits pueden incluir uno o más de: una fracción del anticuerpo, un enlazador, una fracción del anticuerpo unido al enlazador, un polipéptido, una entidad química reactiva con el enlazador y/o un polipéptido modificado. Por ejemplo, en una realización, un kit puede incluir una fracción del anticuerpo, un enlazador, una entidad química reactiva con el enlazador y un polipéptido. En otra realización, el kit puede incluir una fracción del anticuerpo unido al enlazador y un polipéptido modificado. Al igual que con los kits útiles para administrar las composiciones, los kits útiles para preparar las composiciones pueden incluir uno o más de: diluyentes, guantes, viales u otros recipientes, pipetas, agujas, jeringas, tubos, soportes, espátulas, paños o cubiertas estériles, controles positivos y/o negativos, y similares. Cualquier reactivo útil para unir un enlazador a una fracción del anticuerpo o polipéptido, modificar un polipéptido, conjugar una fracción del anticuerpo unida al enlazador con un polipéptido modificado (o viceversa; conjugar una fracción del anticuerpo con un polipéptido unido al enlazador), o purificación y prueba de un conjugado de proteína también se pueden incluir. Como se señaló, las fracciones de anticuerpo unidas al enlazador y los polipéptidos modificados son composiciones destacadas de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Estudio preliminar con diversas estrategias de conjugación (H1, H2 y H3)
En una serie de experimentos dirigidos a optimizar las condiciones para preparar un conjugado de proteína, se hizo reaccionar trastuzumab (como la fracción del anticuerpo) con el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 97 (Angiopep-2 (An2)). Se usaron dos químicas de conjugación diferentes, una de las cuales empleaba el enlazador SATA. En esta conjugación, el éster succinimidílico dentro del enlazador SATA reacciona químicamente con una amina primaria en el polipéptido. Generalmente, con la química clic sin cobre, se pueden utilizar dos enfoques. En uno, la fracción del anticuerpo se modifica con grupos azido en las aminas primarias mientras que el polipéptido se modifica con alquino. En el segundo, la fracción del anticuerpo se modifica con un alquino (por ejemplo, MFCo o BCN) mientras que el polipéptido se modifica con grupos azido en las aminas primarias. También se vario la proporción de la fracción del anticuerpo con respecto al polipéptido, de 1:8 a 1:32. Las reacciones se llevaron a cabo a una escala teórica de 5 mg.
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continuación
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Debido a que se incorporó menos de 1 equivalente de Angiopep-2, hubo un gran exceso de trastuzumab, y se uso una columna de afinidad anti-Angiopep-2 para una mayor purificación y eliminación de trastuzumab. Esto dio lugar a rendimientos deficientes (entre un 5 y un 10%). También hubo un problema con la química clic tradicional que usa un catalizador de cobre, que permanece presente en cantidades traza y podría contribuir a la inestabilidad de los conjugados.
Se probaron H1, H2 y H3 in situ en un estudio diseñado para probar la perfusión cerebral. Los resultados mostraron niveles más altos de H1 y H3 en el cerebro que trastuzumab (aHER2) solo (Figura 4).
Ejemplo 2: Producción y prueba de una segunda serie de conjugados utilizando química clic optimizada sin cobre
Se utilizó la técnica química clic sin cobre porque es una técnica rápida, simple y reproducible que no requiere un catalizador altamente tóxico. Normalmente, tiene lugar la reacción entre las fracciones alquino y azida dentro de las 24 horas a temperatura ambiente y, como se indica, no requiere el catalizador Cu (I). Las condiciones de reacción son suaves y, por lo tanto, no causan degeneración de proteínas y las fracciones reactivas no interactúan con los grupos funcionales de las biomoléculas. Además, se puede controlar la ubicación del sitio de conjugación en la fracción polipeptídica y los conjugados resultantes son estables y biológicamente activos.
En estos métodos de producción, se ha designado la "etapa 1" como "activación, purificación y diálisis". Esta etapa produce una fracción del anticuerpo unida al enlazador. En un experimento, para llevar a cabo la etapa 1, se agregan 200 |jl de una solución madre de éster de MFCO-N-hidroxisuccinimida a 51 mg de un anticuerpo monoclonal anti-HER2. En la solución madre del enlazador, se disolvieron 7,6 mg de éster de MFCO-N-hidroxisuccinimida en 1000 j l de DMSO anhidro. La reacción se dejó a temperatura ambiente durante cinco horas con agitación ocasional. La fracción de anticuerpo unida al enlazador se purificó del exceso de reactivo mediante filtración en gel con una columna de desalación. Se recogieron 35 ml de la columna, estando presente la fracción del anticuerpo unida al enlazador a una concentración de 1,3 mg/ml. La fracción de anticuerpo unida al ligando se dializó contra a tampón fosfato/citrato (pH ~ 5) durante la noche a 4 °C. Se recuperaron 45 mg (rendimiento 88%) del octino activado, que se utilizó para la etapa 2 con azido An2. La formación de la fracción del anticuerpo unida al enlazador (una fracción del anticuerpooctino) se confirmó mediante análisis MALDI-TOF.
En la etapa 2, a la fracción del anticuerpo unida al enlazador, se le añadió un polipéptido no modificado (An2) y un polipéptido modificado (An2 unido a una entidad química que comprende N3). Se usaron 42,8 mg de la fracción del anticuerpo unida al enlazador, 2156 j l de una solución madre del polipéptido sin modificar (8 equivalentes; se disolvieron 13 mg de An2 en 4060 j l de H2O) y 901 j l de una solución madre del polipéptido modificado (se disolvieron 10 mg de An2N3 en 1.230 j l de DMSO anhidro). La mezcla se agitó mediante agitación tipo vórtice, se envolvió en papel de aluminio y se dejó durante la noche a temperatura ambiente. La conjugación se controló mediante el consumo de An2 N3 (el polipéptido modificado) por LC-MS. Como la concentración de An2 no cambia con el tiempo, ese polipéptido sirvió como patrón interno. El conjugado de proteína resultante se purificó con una columna de Proteína A usando un tampón de fosfato/citrato a pH 5,0 como tampón de unión y un tampón de ácido cítrico a pH 3,0 como tampón de elución. El conjugado de proteína se aisló y se neutralizó adicionalmente con tampón de fosfato dibásico a pH 5,0. La solución se centrifugó y se decantó para obtener un conjugado de proteína pura. La incorporación de An2 se confirmó mediante análisis MALDI-TOF.
Se generaron cinco conjugados de proteína, denominados H40-H44 que incluyen trastuzumab como la fracción del anticuerpo y el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 97 (Angiopep-2 o An2). Los conjugados se generaron a una escala de 5 mg, y se varió la relación entre la fracción del anticuerpo y el polipéptido y las longitudes de los enlazadores.
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Como se muestra en la Figura 5, los conjugados de proteína H40, H41, H42, H43 y H44 mostraron todos parámetros de unión similares a trastuzumab. La unión de trastuzumab y conjugados de An2-trastuzumab a células BT-474 se llevó a cabo como sigue. Las células confluentes BT-474 se separaron primero de los matraces con tampón de disociación no enzimática de citrato de PBS. Las células en suspensión se lavaron en tampón de unión helado (BB: Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, CaCh 2,5 mM, pH: 7,3), se contaron y se separaron en diferentes tubos Eppendorf (106 células BT-474 por tubo). La unión de trastuzumab y conjugados de An2-trastuzumab se realizó con concentraciones crecientes de productos en BB helado durante 30 minutos a 4 °C. Después, las células se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario a-AlexaFluor488 humano en BB helado durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron extensamente con BB helado y se analizaron por citometría de flujo (10.000 eventos controlados por condición).
Los estudios de perfusión cerebral in situ, llevados a cabo como se describió anteriormente para H1, H2 y H3, mostraron que de los cinco conjugados de proteínas generados por química clic sin cobre, h 43 mostró la mayor penetración de parénquima cerebral (Figura 6). También se observo que H43 se absorbió linealmente a lo largo del tiempo entre el momento de la infusión (tiempo 0) y cuatro horas después.
En la tabla siguiente, se resumen varias características de los conjugados de proteínas (H43), comparando el primero y el segundo lote.
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El número de polipéptidos An2 consumidos se determinó mediante LC-MS (cromatografía líquida-espectrometría de masas). El número de polipéptidos An2 incorporados y la masa de los conjugados se determinó mediante MALDI-TOF. La masa de trastuzumab es -148.000.
Este trabajo con H43 hasta la fecha indica un aumento de la penetración del parénquima cerebral y que la fracción del anticuerpo conserva la capacidad de unirse a Her2 (la afinidad de unión por Her2 fue la misma después de un ciclo de congelación/descongelación). La composición producida se puede filtrar a través de un filtro de 0,2 pm sin reducir la concentración de conjugado. El conjugado de proteína también parece ser estable. Después del almacenamiento a 4 °C durante catorce días, no se observó precipitación, la concentración del conjugado permaneció prácticamente sin cambios después de la centrifugación y el polipéptido (An2) todavía pudo detectarse mediante transferencia Western después de 10 días.
Para probar la distribución en el tejido, se inyectaron ratones CD-1 por vía intravenosa con trastuzumab radiomarcado 125I-trastuzumab) o 125I-H43 a una dosis equivalente de 10 mg/kg. Se recolectaron muestras de sangre 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas después. A continuación, los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato frío durante ~ 8 minutos. Se recolectaron varios tejidos y se midió la radioactividad para evaluar la distribución en el tejido. Los resultados se muestran en la Figura 7. Se encontró que, después de 30 minutos, la distribución de H43 en el cerebro era 3,5 veces mayor que la de trastuzumab; después de 60 minutos, la distribución fue 2,5 veces mayor; y después de 72 horas, la distribución fue 2,3 veces mayor. En ausencia de tumores cerebrales que expresen Her2, podría producirse un eflujo potencial desde el cerebro a través del receptor Fc (FcRn) neonatal, que se ha informado que se expresa en el lado basolateral de la BHE y también se sabe que media la transcitosis inversa a través de la BHE. Si bien la distribución del conjugado de proteína fue mayor en el cerebro que la del anticuerpo no conjugado, la distribución tanto del conjugado de proteína como del anticuerpo no conjugado fue más baja en el cerebro que en cualquier otro tejido analizado (incluyendo músculo, corazón, hígado, riñón y pulmón).
En la Figura 9, se presentan datos adicionales recopilados de ratones tratados como se describió anteriormente. La distribución de un anticuerpo anti-HER2 no conjugado (125I-trastuzumab) y del constructo conjugado H43 (125I-H43) se expresa como % [Cerebro]/[Plasma] (véase el gráfico de la izquierda) y como % de dosis inyectada/g de tejido (véase el gráfico central). Los niveles en plasma se muestran en el gráfico de la derecha.
Ejemplo 3: un estudio de tumor cerebral ortotópico en ratones
Para probar la capacidad de un conjugado de proteína para inhibir un tumor cerebral, se inyectaron células BT-474 en el cerebro de 18 ratones (definiendo esa inyección el Día 0). Para probar la capacidad de un conjugado de proteína para inhibir un tumor cerebral, se inyectaron células BT-474 en los cerebros de 18 ratones (definiendo esa inyección el Día 1). El día 12, los ratones se trataron con una solución de control (una solución de solo vehículo proporcionada por inyección intravenosa), 14 mg/kg de trastuzumab o 15 mg/kg de H43. El día 33, se sacrificaron dos ratones tratados de acuerdo con cada régimen de tratamiento (dos controles; 2 trastuzumab; 2 conjugados de proteína). Se diseccionó tejido cerebral y se tiñó con azul de tripano. No se observaron tumores en este momento. El día 47, se sacrificaron dos ratones adicionales tratados de acuerdo con cada régimen de tratamiento. En ese momento, los ratones del grupo de control habían perdido peso y parecían tener mala salud. Tras el examen, fueron visibles grandes tumores cerebrales. En los cerebros de los ratones tratados con trastuzumab había tumores visiblemente más pequeños, y en los cerebros de los ratones tratados con el conjugado proteico se observaron tumores pequeños o no se observaron tumores. En los ratones restantes, el tratamiento continuó, seguido de la administración intravenosa de H43 Cyto720 a todos los ratones. Para estudios de imágenes in vivo del infrarrojo cercano (NiR), se marcaron ANG4043 (H43) y el anticuerpo anti-Her2 con un tinte reactivo de NiR Cyto750-éster de NHS (Cytodiagnostics, Burlington, ON) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se incubó cyto750-ester de NHS disuelto en DMSO con H43 o Herceptina a pH = 9 con una relación molar de colorante a proteína de 1:2. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las proteínas marcadas con Cyto750 se separaron del tinte no reactivo mediante filtración en gel (columna de desalación Pierce Dextrano), siendo la primera banda coloreada en aparecer las proteínas marcadas con Cyto750. A los ratones se les inyectó 5 mg/kg de anticuerpo cyto750-anti-Her2 o cyto750-H43. La obtención de imágenes de los animales se realizo 24 horas después de las inyecciones utilizando el sistema de obtención de imágenes in vivo Xtreme de Carestream.
Al día siguiente (día 48, se sacrificaron dos ratones adicionales tratados de acuerdo con cada régimen de tratamiento). Los resultados fueron similares a los informados el día 47. Se midió el peso del cerebro como una indicación de la carga tumoral, y los resultados se muestran en la Figura 8. Mientras que los cerebros de los ratones tratados con la solución de control y los cerebros de los ratones tratados con trastuzumab eran más pesados después de la inyección de células BT-474 que los cerebros de ratones sanos, los cerebros de los ratones tratados con el conjugado de proteína después de la inyección de células BT-474 no pesaban más que los cerebros de ratones sanos.
Ejemplo 4: Efecto del tratamiento con ANG4043 sobre la progresión del tumor intracerebral BT-474; un estudio de imágenes NiR
La sonda fluorescente lipofílica del infrarrojo cercano DiR se incorporó en las membranas de las células tumorales de mama BT-474. Esta sonda es adecuada para su inclusión en cualquiera de los presentes conjugados. A continuación, se implantaron las células tumorales BT-474-DiR en el cerebro de ratones desnudos. Doce días después de la implantación, los ratones se trataron con vehículo o ANG4043, que es el mismo conjugado mencionado anteriormente como H43 (15 mg/kg, IV, dos veces por semana), y se sometieron a imágenes de NiR in vivo. Se tomaron imágenes después de dos y cinco tratamientos para monitorear la progresión del tumor. Después de 5 tratamientos, la fluorescencia asociada al tumor disminuyó considerablemente en el grupo tratado con ANG4043 mientras que la fluorescencia asociada al tumor permaneció altamente detectable en el grupo de control. Estos resultados indican el efecto potencial del tratamiento con ANG4043 sobre el crecimiento tumoral.
En estudios relacionados, se encontró que la conjugación de un anticuerpo anti-HER2 a un polipéptido Angiopep (An2) no afecta la afinidad de unión del anticuerpo a las membranas de las células tumorales de mama BT-474. También se examino además la proliferación de células BT-474 tratadas con ANG4043 o el anticuerpo anti-HER2 no conjugado (tratamiento de 5 días seguido de una exposición de 4 horas a timidina tritiada). La incorporación fue comparable a concentraciones más bajas (0,0001-0,1 nM), pero las células tratadas con ANG4043 proliferaron menos a 100 nM. La IC50 (nM) fue 4,99 ± 0,76 para el anticuerpo anti-HER2 (n = 2) y 3,16 ± 0,97 para el conjugado de proteína (n = 3).
Los parámetros PK preliminares para ANG4043 (análisis no compartimental de WinNonLin) se muestran en la siguiente tabla:
Figure imgf000019_0001

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de proteína que comprende una fracción del anticuerpo, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu 18-Tyng (SEQ ID NO: 117), o un análogo biológicamente activo o fragmento del mismo, y un enlazador entre la fracción del anticuerpo y el polipéptido,
en el que la fracción del anticuerpo es trastuzumab, cetuximab o panitumumab, o una variante biológicamente activa de los mismos,
en el que la fracción del anticuerpo está conjugada con el polipéptido en una o más de las siguientes posiciones en el polipéptido: residuo de aminoácido del terminal N; el residuo de aminoácido del terminal C; o un residuo de lisina entre el terminal N y el terminal C, y en el que el enlazador es un ciclooctino monofluorado (MFCO), biciclo[6.1.0]nonino (BCN) o dibenzociclooctina (DBCO).
2. El conjugado de la reivindicación 1,
en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g (SEQ ID NO: 67), o
en el que polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Thr1-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g (SEQ ID NO: g7).
3. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el conjugado comprende un análogo de la SEQ ID NO: 117, preferiblemente
en el que el análogo de la SEQ ID NO: 117 comprende al menos 13 residuos de aminoácidos que son invariables con respecto a la SEQ ID NO: 117, o
en el que el análogo de la SEQ ID NO: 117 comprende una secuencia en la que Lys10 y/o Lys15 permanecen invariables, o
en el que, en el análogo de la SEQ ID NO: 117, Asn12 está sustituido con Gln, Asn13 está sustituido con Gln y/o Phe14 está sustituido con Tyr o Trp, o
en el que el análogo de la SEQ ID NO: 117 comprende la secuencia Phe3-Tyr4-Gly5-Gly6-Cys7/Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g-Cys (SEQ IDNO: 118); Gly5-Gly6-Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g-Cys (SEQ ID NO: 119); Ser7-Arg8-Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyr1g-Cys (s Eq ID NO: 120); Glyg-Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Thr16-Glu17-Glu18-Tyng-Cys (SEQ ID NO: 121); o Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15-Tyr1g-Cys (SEQ ID NO: 122).
4. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende un fragmento de la SEQ ID NO: 117.
5. El conjugado de la reivindicación 4, en el que el fragmento comprende al menos seis residuos de aminoácidos de la SEQ iD NO: 117, preferiblemente en el que el fragmento es Lys10-Argn-Asn12-Asn13-Phe14-Lys15 (SEQ ID NO: 123).
6. El conjugado de la reivindicación 4, en el que el fragmento comprende 6-18 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 117.
7. El conjugado de la reivindicación 1,
(a) en el que el polipéptido comprende residuos de aminoácidos en la forma D, la forma L o ambas formas, o (b) en el que el conjugado comprende 1-10 polipéptidos y una fracción del anticuerpo, preferiblemente en el que el conjugado comprende 2-6 polipéptidos y una fracción del anticuerpo, o
(c) en el que cada polipéptido está unido, a través de un enlazador, a una fracción del anticuerpo, y ningún polipéptido está enlazado, a través del enlazador o de otra forma, a otro polipéptido, o
(d) en el que la fracción del anticuerpo comprende un anticuerpo humano, quimérico o humanizado o una variante biológicamente activa del mismo, o
(e) en el que la fracción del anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, o
(f) en el que la fracción del anticuerpo es un agente quimioterapéutico, o
(g) en el que la fracción del anticuerpo es un agente antiinflamatorio.
8. El conjugado de la reivindicación 1,
(a) en el que la fracción del anticuerpo es un anticuerpo tetramérico o una variante biológicamente activa del mismo, o
(b) en el que la fracción del anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2.
9. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en el que la composición se formula para administración intravenosa.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece un cáncer del sistema nervioso central, en el que el método comprende:
identificar a un paciente que necesita tratamiento; y
administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica.
11. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 10, en la que el paciente es un paciente humano o en la que el cáncer es un tumor cerebral o una metástasis cerebral.
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