ES2938225T3 - Compuestos de sondas basadas en la actividad, composiciones y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan compuestos de sonda basados en la actividad para usar en el marcaje de una cisteína proteasa. Los compuestos se dirigen a la proteasa a través de un elemento de direccionamiento específico. Los compuestos incluyen además un elemento detectable, como un marcador fluorescente, un radiomarcador o un quelante. En algunos casos, los compuestos incluyen además un elemento inhibidor que se libera al reaccionar con la proteasa. También se proporcionan composiciones que comprenden los compuestos y métodos para usar los compuestos, por ejemplo, para marcar una proteasa en un animal y para visualizar un tumor en un animal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos de sondas basadas en la actividad, composiciones y métodos de uso
Referencia cruzada a solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 61/794.296, presentada el 15 de marzo de 2013.
Declaración de ayuda gubernamental
La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud del proyecto número 5R01EB005011, otorgada por los National Institutes of Health. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Antecedentes de la invención
Actualmente se están desarrollando diversas técnicas para su uso en las áreas de formación de imágenes moleculares y seguimiento de las enfermedades. En particular, la formación de imágenes ópticas por fluorescencia es un enfoque que empieza a ser prometedor como herramienta clínica, dada su sensibilidad, especificidad y no invasividad. En algunos casos, la especificidad de las sondas ópticas fluorescentes puede venir dada por sus dianas biológicas. Por ejemplo, las sondas ópticas que son reconocidas por dianas enzimáticas en una muestra biológica suelen generar señales extremadamente específicas si la fluorescencia de la sonda solo se desencadena tras la reacción enzimática. Idealmente, la parte fluorescente de la sonda permanece asociada a su diana enzimática, incluso después de que la señal fluorescente haya sido activada por la reacción enzimática. Dichas sondas fluorescentes basadas en la actividad (ABP, por sus siglas en inglés) se han descrito para dianas de proteasas. Blum et al. (2009) PLoS One 4:e6374; doi:10.1371/journal.pone.0006374. Las ABP pueden distinguirse de los sustratos fluorogénicos simples por el enlace covalente permanente que resulta de la reacción de la ABP con el residuo catalítico del sitio activo de la enzima. Aunque los sustratos fluorescentes pueden parecer ventajosos debido a la amplificación de la señal resultante del recambio catalítico por su enzima diana, se ha observado que las APB presentan una mayor cinética de captación tisular y una retención prolongada de la sonda en el tejido diana debido a su modificación covalente de la enzima diana.
Entre las enzimas diana de interés para su uso con sondas ópticas basadas en fluorescencia se encuentran las proteasas y, en particular, las cisteína proteasas. Las cisteína catepsinas son una familia de proteasas que desempeñan funciones importantes en la salud y la enfermedad. Reiser et al. (2010) J. Clin. Invest. 120:3421-31. Aunque su función se ha descrito principalmente como confinada a la vía endosomal, cada vez hay más evidencia de que son uno de los principales reguladores de la degradación de la matriz, lo que sugiere que también funcionan en un contexto extracelular. Bromme & Wilson (2011) Role of Cysteine Cathepsins in Extracellular Proteolysis. Biology of Extracellular Matrix Volumen 223-51. De manera adicional, se ha demostrado que los miembros de la familia de las cisteína catepsinas desempeñan un papel importante en el desarrollo y la progresión de varios tipos de cáncer. Mohamed & Sloane (2006) Nat. Rev. Cancer (2006) 6:764-75; Palermo & Joyce (2008) Trends Pharmacol. Sci. 29:22-8. Es más, cambios en la expresión de los inhibidores endógenos de las catepsinas, las cistatinas, se han observado en el cáncer. Cox (2009) Cystatins and cancer. Front. Biosci. 14:463-74. Estas observaciones, en combinación con posibles cambios en el medio intra y extracelular, enfatizan la importancia de disponer de herramientas que permitan evaluar directamente la actividad de estas proteasas en el contexto de un microambiente tumoral nativo. Se han sintetizado varias ABP dirigidas a la familia de las cisteína catepsinas. Edgington et al. (2011) Curr. Opin. Chem. Biol.
15:798-805. En particular, las ABP inactivadas por fluorescencia (qABP, por sus siglas en inglés) han demostrado ser potentes herramientas para la formación de imágenes ópticas no invasivas del cáncer y la posterior caracterización de las catepsinas diana a nivel histológico, celular y proteico. Blum et al. (2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77; Verdoes et al. (2012) Chem. Biol. 19:619-28.
Se han descrito inhibidores basados en la actividad de la dipeptidil peptidasa I basados en un grupo reactivo 2,3,5,6-tetrafluorofenoxiarilmetilcetona (Deu et al. (2010) Chem Biol. 17:808-819), pero estos inhibidores no eran peptídicos y no incluían un grupo detectable.
También se han notificado inhibidores peptídicos basados en la actividad inactivada para su uso en la formación de imágenes fluorescentes de células que contienen proteasas activas tales como la catepsina. Véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2007/0036725. Estas sondas emplean un grupo reactivo aciloximetilcetona ligado a éster para unirse al sitio activo de la proteasa. En algunos casos, las sondas fluorescentes basadas en la actividad no son peptídicas. Véase, p. ej., la publicación internacional PCT N.° WO 2012/118715. En algunos casos, las sondas basadas en la actividad se utilizan para radiomarcar sus enzimas diana. Véase, p. ej., la publicación internacional PCT N.° WO 2009/124265.
Sigue existiendo la necesidad en el campo, sin embargo, de nuevas sondas fluorescentes basadas en la actividad de las cisteína proteasas que tengan una mayor captación celular, que se dirijan a un espectro más amplio de actividades de cisteína proteasas y que ofrezcan una mayor sensibilidad de detección.
Sumario de la invención
La presente invención aborda estos y otros problemas proporcionando compuestos, composiciones, y métodos de uso de los compuestos y composiciones para marcar una cisteína proteasa.
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se divulgan compuestos representados por la fórmula estructural (I):
en donde
L es un elemento saliente ligado a éter;
T es un elemento de direccionamiento; y
D es un elemento detectable.
En los compuestos de la invención, el grupo D es un marcador fluorescente.
El marcador fluorescente de la presente invención es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina, o un marcador de cianina. En realizaciones aún más específicas, el marcador fluorescente es un marcador de cianina, tal como Cy5.
En compuestos específicos divulgados, AA1 es una cadena lateral de fenilalanina.
En compuestos específicos divulgados, U es O.
Los ejemplos del grupo D, no de acuerdo con la invención, incluyen un radiomarcador o un quelante.
En la presente invención, el grupo D es un marcador fluorescente, en donde el marcador fluorescente es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina, o un marcador de cianina. En realizaciones más específicas de la invención, el marcador fluorescente es un marcador de cianina, tal como Cy5.
Se divulgan compuestos en donde el elemento del grupo saliente, el grupo L comprende un inactivador y, más específicamente, L es L2-L3-Q, en donde L2 es un grupo fenoxi, L3 es un enlazador, y Q es un inactivador.
En ejemplos específicos, L es
en donde cada Y es independientemente un grupo electroaceptor o hidrógeno.
En compuestos divulgados más específicos, cada Y es independientemente un halógeno o hidrógeno. De acuerdo con la presente invención, L es
y L3 es un enlazador de alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente
sustituido por un heteroátomo.
En compuestos divulgados incluso más específicos, L es
en donde R es un inactivador QSY, y n es un número entero de 1 a 16.
En realizaciones preferidas, el inactivador QSY es un inactivador QSY hidrófilo y, más específicamente, el inactivador QSY hidrófilo es un inactivador sulfo-QSY.
Se divulgan compuestos representados por la fórmula estructural (II):
en donde D es un marcador fluorescente, L3 es un enlazador, y Q es un inactivador.
En realizaciones divulgadas más particulares, se divulgan compuestos representados por la fórmula estructural (III):
en donde R es un inactivador QSY, D es un colorante de cianina, y m y n son independientemente números enteros de 1 a 16. El grupo R puede, en algunas de estas realizaciones, ser QSY21 o sulfo-QSY21, y el grupo D puede ser Cy5.
Las realizaciones de compuestos específicos de la invención incluyen lo siguiente:
en donde R = QSY21 y n = 6;
R = sulfo-QSY21 y n = 6;
R = QSY21 y n = 2; y
R = sulfo-QSY21 y n = 2.
De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona composiciones para su uso en el marcado de una proteasa en un animal que comprende un compuesto de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona además todavía composiciones para su uso en visualizar un tumor en un animal que comprende las etapas de: administrar una composición de la presente divulgación al animal, y medir una señal detectable generada en el animal a partir de una reacción de la composición con una catepsina cisteína proteasa, en donde la señal detectable está asociada a un tumor en el animal.
En la presente invención, la señal detectable es una señal fluorescente. En otras realizaciones específicas del método, la señal fluorescente se genera en un margen del tumor.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. a) Estructuras de las qABP GB 137 (1) y las sondas 2-8 sintetizadas en el presente trabajo. b) Perfil de marcado de las sondas 1-8 en células RAW vivas a 1 pM. c) Marcado dependiente de la concentración por las sondas 1 y 8 en células RAW vivas. d) Intensidad total de marcado por catepsina de las sondas 1-8 en células RAW vivas en relación con 5 pM de GB137 (1).
Figura 2. a) Marcado dependiente de la concentración del lisado de células RAW por la sonda 8 a pH 5,5. b) Curso temporal del marcado con 0,5 pM de sonda 8 en células RAW vivas, c) Inhibición del marcado de las sondas 1 y 8 en células RAW vivas mediante un pretratamiento con JPM-OEt (50 pM) y estabilidad del suero. d) Microscopía de fluorescencia de células de células RAW vivas expuestas a 1 pM de sonda 8 (fila superior de paneles) y colocalización con lysotracker (segunda fila de paneles, barra de escala de 10 pm).
Figura 3. a) Curso temporal de formación de imágenes ópticas no invasivas de ratones portadores de tumores inyectados con la sonda 8 y 1 (paneles derechos). Los paneles inferiores representan el contraste de fluorescencia óptimo en cada punto temporal. b) Fluorescencia específica del tumor dependiente del tiempo (tumor - fondo) para ratones tratados con la sonda 1 u 8 (n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). c) Fluorescencia tumoral ex vivo (panel superior) y proteínas marcadas por fluorescencia in vivo tras SDS-PAGE visualizadas mediante barrido de fluorescencia en gel (panel inferior). d) Intensidad de fluorescencia en el criterio de valoración de la formación de imágenes ópticas no invasivas (mostrado en a), formación de imágenes tumorales ex vivo y marcado de fluorescencia en gel (mostrado en c). Se representa la intensidad relativa a la sonda 1 (n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). e) Microscopía de fluorescencia de una sección de tejido tumoral tratada con la sonda 8 (panel izquierdo) con inmunotinción CD68 (panel central) y tinción nuclear (DAPI - panel derecho, barra de escala de 50 pm). f) Reconstrucción 3D de CLSM de una sección de tejido tumoral tratada con la sonda 8 (rojo) con inmunotinción CD68 (Verde) y tinción nuclear (DAPI - Azul).
Figura 4. a) Inmunoprecipitación de cisteína catepsinas marcadas con BMV109. b,c) Marcado dependiente de la concentración por las sondas 1-8 en células RAW vivas. Los paneles de b) y c) se realizaron en los mismos geles respectivamente.
Figura 5. a) Formación de imágenes ópticas no invasivas de ratones portadores de tumores 8 horas después de la inyección de la sonda 1, 2 , 6 u 8. Los paneles inferiores representan el contraste de fluorescencia óptimo en cada punto temporal. b) Fluorescencia específica del tumor dependiente del tiempo (tumor - fondo) en ratones tratados con la sonda 1, 2 , 6 u 8 (n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). c) Fluorescencia tumoral ex vivo (panel superior) y proteínas marcadas por fluorescencia in vivo tras SDS-PAGE visualizadas mediante barrido de fluorescencia en gel (panel inferior). d) Intensidad de fluorescencia del criterio de valoración de la formación de imágenes ópticas no invasivas (mostrado en a), formación de imágenes tumorales ex vivo y marcado de fluorescencia en gel (mostrado en c). Se representa la intensidad relativa a la sonda 1 (n = 3; los datos representan valores medios ± errores estándar). e) Microscopía de fluorescencia de la sección de tejido tumoral tratado con la sonda 8 (columnas primera, tercera y cuarta) con inmunotinción CD68 (columnas segunda, tercera y cuarta) y tinción nuclear (DAPI - columnas tercera y cuarta, barra de escala de 50 pm). Se representan el control sin sonda (paneles de fila central) y el control de isotipo para inmunotinción (paneles de fila inferior). f) Diagrama de colocalización para la sonda 8 (Cy5) y CD68 (FITC).
Descripción detallada de la invención
Las cisteína catepsinas son una familia de proteasas que desempeñan papeles importantes tanto en la fisiología celular normal como en la patología de muchas enfermedades humanas. Por lo tanto, se han desarrollado varias clases de sustratos y sondas basadas en la actividad (ABP) para estudiar la función de estas enzimas. En el presente documento se proporciona una clase de sondas fluorescentes basadas en la actividad inactivadas que contienen, en algunas realizaciones, un electrófilo de fenoximetilcetona (PMK). Estos reactivos muestran una amplia reactividad mejorada frente a las cisteína catepsinas, lo que da lugar a propiedades de marcado in vitro e in vivo notablemente mejoradas en comparación con las ABP reportadas anteriormente. En el presente documento se demuestra además que las sondas resaltan tumores en ratones con una intensidad y un contraste de señal sin precedentes. Estos nuevos reactivos permiten el estudio de las cisteína catepsinas en el nivel orgánico, tisular, celular y proteico en diversos modelos de enfermedades humanas.
Compuestos
Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona nuevos compuestos para su uso en el marcado de enzimas proteasas, en particular catepsinas. Los compuestos de la divulgación pueden ser compuestos
de la fórmula (I):
en donde
L es un elemento saliente ligado a éter;
T es un elemento de direccionamiento; y
D es un elemento detectable.
El elemento de direccionamiento, T, de los compuestos divulgados puede ser una estructura peptídica o no peptídica, y preferentemente dirige el compuesto a una cisteína proteasa.
En la publicación internacional PCT N.° WO2012/118715 se describen ejemplos no limitativos de elementos estructurales no peptídicos incorporados de forma útil en los compuestos divulgados para estos fines.
En realizaciones preferidas, el elemento de direccionamiento no peptídico comprende una estructura de triazol. Los ejemplos específicos de compuestos con elementos de direccionamiento no peptídicos son:
, y
Los ejemplos no limitantes de elementos estructurales peptídicos que pueden incorporarse de forma útil a los compuestos divulgados para dirigir los compuestos a cisteína proteasas y, en particular, cisteína catepsinas, se describen en la publicación internacional PCT N.° WO2009/124265.
En algunos aspectos de los compuestos divulgados, D-T- es
en donde Li es un enlazador;
AA1 es una cadena lateral de aminoácidos;
U es O, N o S;
Ri es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, o un grupo protector, y está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos A; y cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido, o azido.
Como se utiliza en el presente documento, el término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo alquil-sustituidos y grupos alquilo cicloalquil-sustituidos. En algunas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o cadena ramificada tiene 30 o menos átomos de carbono en su estructura principal (por ejemplo, Ci -C30 para cadenas lineales, C3.30 para cadenas ramificadas), y más específicamente 20 o menos. Igualmente, algunos cicloalquilos tienen de 3-10 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más específicamente tienen 5, 6 o 7 carbonos en la estructura de anillo.
Por otra parte, el término "alquilo" (o "alquilo inferior"), como se utiliza en toda la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones, tiene por objeto incluir tanto "alquilos sin sustituir" como "alquilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a restos alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un átomo de hidrógeno en uno o más átomos de carbono de la estructura principal de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halo, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un ceto, un carboxi, un alcoxicarbonilo, un formilo o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un tio, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo, o un resto aromático o heteroaromático. Los expertos en la materia comprenderán que los restos sustituidos en la cadena de hidrocarburo pueden a su vez estar sustituidos, si se considera apropiado. Por poner un ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de grupos amino, azido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, sulfamoílo y sulfonato) y sililo, así como éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehídos, carboxilatos y ésteres), -CF3, -CN. Se describen alquilos sustituidos ilustrativos más adelante. Los cicloalquilos pueden sustituirse además con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos sustituidos con carbonilo, -CF3, -CN.
Como se utiliza en el presente documento, el término "alcoxi" se refiere a un grupo alquilo, en determinadas realizaciones específicas, un grupo alquilo inferior, que tiene un oxígeno unido al mismo. Los grupos alcoxi representativos incluyen metoxi, etoxi, propoxi, f-butoxi.
El término "alquenilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alifático que contiene al menos un doble enlace, y pretende incluir tanto "alquenilos no sustituidos" como "alquenilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a restos alquenilo que tienen sustituyentes que reemplazan un átomo de hidrógeno en uno o más átomos de carbono del grupo alquenilo. Dichos sustituyentes pueden darse en uno o más átomos de carbono que estén incluidos o no incluidos en uno o más dobles enlaces. Por otra parte, dichos sustituyentes incluyen todos los contemplados para los grupos alquilo, como se ha analizado anteriormente, excepto cuando la estabilidad es prohibitiva. Por ejemplo, se contempla la sustitución de grupos alquenilo por uno o más grupos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo.
El término "Cx-y" cuando se utiliza en combinación con un resto químico, tal como acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi, pretende incluir grupos que contienen de x a y carbonos en la cadena. Por ejemplo, la expresión"alquilo Cx-y" se refiere a grupos de hidrocarburos saturados sustituidos o no sustituidos, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal y grupos alquilo de cadena ramificada que contienen de x a y carbonos en la cadena, incluyendo grupos haloalquilo tales como trifluorometilo y 2,2,2-trifluoroetilo, etc. "Alquilo C0" indica un hidrógeno cuando el grupo está en una posición terminal, es un enlace si es interno. Las expresiones "alquenilo C2V' y "alquinilo C2V' se refieren a grupos alifáticos insaturados sustituidos o no sustituidos análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble o triple, respectivamente.
El término "alquilamino", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo amino sustituido con al menos un grupo alquilo.
El término "alquiltio", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo tiol sustituido con un grupo alquilo y puede estar representado por la fórmula general alquil-S-.
El término "alquinilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alifático que contiene al menos un triple enlace, y pretende incluir tanto "alquinilos no sustituidos" como "alquinilos sustituidos", los últimos de los
cuales se refieren a restos alquinilo que tienen sustituyentes que reemplazan un átomo de hidrógeno en uno o más átomos de carbono del grupo alquinilo. Dichos sustituyentes pueden darse en uno o más átomos de carbono que estén incluidos o no incluidos en uno o más triples enlaces. Por otra parte, dichos sustituyentes incluyen todos los contemplados para los grupos alquilo, como se ha analizado anteriormente, excepto cuando la estabilidad es prohibitiva. Por ejemplo, se contempla la sustitución de grupos alquinilo por uno o más grupos alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo o heteroarilo.
El término "amida", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo
en donde cada uno de Rx y Ry representa independientemente un hidrógeno o grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura de anillo.
Los términos "amina" y "amino" están reconocidos en la materia y se refieren tanto a aminas no sustituidas como sustituidas y a sales de las mismas, p. ej., un resto puede estar representado por
en donde cada uno de Rx, Ry, y Rz representa independientemente un hidrógeno o grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura de anillo.
El término "aminoalquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo amino.
El término "aralquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo.
El término "arilo", como se utiliza en el presente documento, incluye grupos aromáticos de un solo anillo, sustituidos o no sustituidos, en los que cada átomo del anillo es carbono. En determinadas realizaciones, el anillo es un anillo de 5 a 7 miembros, y en realizaciones más específicas es un anillo de 6 miembros. El término "arilo" también incluye sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es aromático, p. ej., los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos arilo incluyen benceno, naftaleno, fenantreno, fenol, anilina.
El término "carbamato" está reconocido en la materia y se refiere a un grupo
en donde cada uno de Rx y Rz representa independientemente un hidrógeno o grupo hidrocarbilo, o Rx y Ry tomados junto con los átomos al que están unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura de anillo.
El término "cicloalquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anillo saturado o insaturado, no aromático, en el que cada átomo del anillo es carbono. En determinadas realizaciones, un anillo de cicloalquilo contiene de 3 a 10 átomos, y en realizaciones más específicas de 5 a 7 átomos.
El término "carbonato" está reconocido en la materia y se refiere a un grupo -OCO2-Rx, en donde Rx representa un grupo hidrocarbilo.
El término "carboxi", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -CO2H.
El término "éster", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo -C(O)ORx en donde Rx representa un grupo hidrocarbilo.
El término "éter", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbilo unido a través de un oxígeno a otro grupo hidrocarbilo. Por consiguiente, un sustituyente éter de un grupo hidrocarbilo puede ser hidrocarbil-O-. Los éteres pueden ser simétricos no simétricos. Los ejemplos de éteres incluyen, pero no se limitan a, heterociclo-O-heterociclo y aril-O-heterociclo. Los éteres incluyen grupos "alcoxialquilo", que pueden estar representados por la fórmula general alquil-O-alquilo.
El término "guanidinilo" está reconocido en la materia y puede representarse por la fórmula general
en donde Rx y Ry representan independientemente hidrógeno o un hidrocarbilo.
Los términos "halo" y "halógeno", como se utilizan en el presente documento, significan halógeno, e incluyen cloro, flúor, bromo y yodo.
Los términos "hetaralquilo" y "heteroaralquilo", como se utiliza en el presente documento, se refieren a un grupo alquilo sustituido con un grupo hetarilo.
Los términos "heteroarilo" y "hetarilo" incluyen estructuras de un solo anillo aromático sustituido o sin sustituir, en ciertas realizaciones específicas, anillos de 5 a 7 miembros, más específicamente anillos de 5 a 6 miembros, cuyas estructuras anulares incluyen al menos un heteroátomo, en algunas realizaciones uno a cuatro heteroátomos, y en realizaciones más específicas uno o dos heteroátomos. Los términos "heteroarilo" y "hetarilo" también incluyen sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es heteroaromático, p. ej., los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos heteroarilo incluyen, por ejemplo, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina, y pirimidina.
El término "heteroátomo" como se utiliza en el presente documento significa un átomo de cualquier elemento distinto de carbono o hidrógeno. Son heteroátomos típicos nitrógeno, oxígeno y azufre.
Los términos "heterociclilo", "heterociclo" y "heterocíclico" se refieren a estructuras de anillos no aromáticos, sustituidos o sin sustituir, en ciertas realizaciones específicas, anillos de 3 a 10 miembros, más específicamente anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras anulares incluyen al menos un heteroátomo, en algunas realizaciones uno a cuatro heteroátomos, y en realizaciones más específicas uno o dos heteroátomos. Los términos "heterociclilo" y "heterocíclico" también incluyen sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más átomos de carbono son comunes a dos anillos adyacentes en los que al menos uno de los anillos es heterocíclico, p. ej., los otros anillos cíclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, piperidina, piperazina, pirrolidina, morfolina, lactonas, lactamas.
El término "heterociclilalquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo heterociclo.
El término "hidrocarbilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo que está unido a través de un átomo de carbono que no tiene un sustituyente =O o =S, y normalmente tiene al menos un enlace carbonohidrógeno y una estructura principalmente de carbonos, pero puede incluir opcionalmente heteroátomos. Así, grupos como metilo, etoxietilo, 2-piridilo y trifluorometilo se considera que son hidrocarbilo para los fines del presente documento, pero sustituyentes tales como acetilo (que tiene un sustituyente =O en el carbono de unión) y etoxi (que está unido a través de oxígeno, no carbono), no. Los grupos hidrocarbilo incluyen, pero sin limitación, arilo, heteroarilo, carbociclo, heterociclo, alquilo, alquenilo, alquinilo y combinaciones de los mismos.
El término "hidroxialquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo hidroxi.
El término "inferior" cuando se utiliza en combinación con un resto químico, tal como acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi, se entiende que incluye grupos en los que hay diez o menos átomos en el sustituyente, y en ciertas realizaciones, seis o menos. Un "alquilo inferior", por ejemplo, se refiere a un grupo alquilo que contiene diez o menos átomos de carbono y, en ciertas realizaciones, seis o menos átomos de carbono. En determinadas realizaciones, los
sustituyentes acilo, aciloxi, alquilo, alquenilo, alquinilo o alcoxi definidos en el presente documento son respectivamente acilo inferior, aciloxi inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior y alcoxi inferior, ya sea que aparezcan solos o en combinación con otros sustituyentes, tal como en las citas hidroxialquilo y aralquilo (en cuyo caso, por ejemplo, los átomos del grupo arilo no se cuentan cuando se cuentan los átomos de carbono del sustituyente alquilo).
Los términos "policiclilo", "policiclo" y "policíclico" se refieren a dos o más anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos, heteroarilos y/o heterociclilos) en los que dos o más átomos son comunes a dos anillos adyacentes, p. ej., los anillos son "anillos condensados". Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido o sin sustituir. En determinadas realizaciones, cada anillo del policiclo contiene de 3 a 10 átomos en el anillo, más específicamente de 5 a 7.
El término "sustituido" se refiere a restos que tienen sustituyentes que reemplazan un átomo de hidrógeno en uno o más átomos de carbono de la cadena principal. Se entenderá que el término "sustitución" o la expresión "sustituido con" incluyen la condición implícita de que cada sustitución está conforme con la valencia permitida del átomo sustituido y del sustituyente, y de que la sustitución da como resultado un compuesto estable, p. ej., un compuesto que no sufre espontáneamente la transformación como por redistribución, ciclación, eliminación, etc., en condiciones en las que se utilizará el compuesto. Como se utiliza en el presente documento, el término "sustituido" se contempla que incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes de compuestos orgánicos acíclicos y cíclicos, ramificados o no ramificados, carbociclos y heterociclos, aromáticos y no aromáticos. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más y el mismo o diferente para los compuestos orgánicos adecuados. Para los fines de esta invención, los heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descritos en el presente documento que reúnan las valencias de los heteroátomos. Los sustituyentes pueden incluir cualquiera de los sustituyentes descritos en el presente documento, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un ceto, un carboxi, un alcoxicarbonilo, un formilo o un acilo), un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato o un tioformiato), un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo, o un resto aromático o heteroaromático. Los expertos en la materia comprenderán que los restos sustituidos en la cadena de hidrocarburo pueden a su vez estar sustituidos, si se considera apropiado.
A menos que se describan específicamente como "sin sustituir", se entiende que las referencias a los restos químicos incluyen variantes sustituidas. Por ejemplo, la referencia a un grupo o resto "arilo" incluye implícitamente variantes tanto sustituidas como no sustituidas.
El término "sulfato" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -OSO3H, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "sulfonamida" está reconocido en la materia y se refiere al grupo representado por las fórmulas generales
en donde Rx y Ry representan independientemente hidrógeno o hidrocarbilo.
El término "sulfóxido" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -S(O)-Rx, en donde Rx representa un hidrocarbilo.
El término "sulfo" o "sulfonato" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -SO3H, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El término "sulfona" está reconocido en la materia y se refiere al grupo -S(O)2-Rx, en donde Rx representa un hidrocarbilo.
El término "tioalquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo tiol.
El término "tioéster", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo -C(O)SRx o - SC(O)Rx en donde Rx representa un hidrocarbilo.
El término "tioéter", como se utiliza en el presente documento, es equivalente a un éter, en donde el oxígeno está reemplazado por un azufre.
El término "urea" está reconocido en la materia y puede representarse por la fórmula general
en donde Rx y Ry representan independientemente hidrógeno o un hidrocarbilo.
Los compuestos de la presente invención se sintetizan generalmente utilizando técnicas químicas de síntesis estándar, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la sección Ejemplo a continuación. Se describen otras técnicas de síntesis útiles, por ejemplo, en March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7a Ed, (Wiley, 2013); Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4a Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001); Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volúmenes 1-27 (Wiley, 2013); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volúmenes 1-5 y suplementos (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volúmenes 1-81 (Wiley, 2013); y Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989).
Los compuestos se sintetizan normalmente utilizando materiales de partida que están generalmente disponibles en fuentes comerciales o se preparan fácilmente utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, p. ej., Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volúmenes 1-27 (Wiley, 2013), o Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlín, incluyendo los suplementos.
Al referirse a componentes de los compuestos de la invención, la expresión "residuo derivado de" puede utilizarse para describir un residuo formado por la reacción de un primer grupo funcional reactivo en un primer componente y un segundo grupo funcional reactivo en un segundo componente para formar un enlace covalente. En realizaciones ilustrativas, un grupo amina en un primer componente puede reaccionar con un grupo carboxilo activado en un segundo componente para formar un residuo que incluye uno o más restos amida. La invención abarca otras permutaciones de los grupos funcionales reactivos primero y segundo. Por ejemplo, la reacción catalizada por cobre o libre cobre de un primer componente sustituido con azida con un segundo componente sustituido con alquino da como resultado un residuo que contiene triazol a través de la conocida reacción de "clic", como entenderían los expertos en la materia. Véanse Kolb et al. (2001) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40:2004; Evans (2007) Aus. J. Chem.
60:384. En la publicación internacional PCT N.° WO 2012/118715 se proporcionan métodos ilustrativos de generación de sondas de formación de imágenes fluorescentes no peptídicas mediante reacciones de "clic". La adaptación de estos métodos para generar o modificar compuestos de las presentes reivindicaciones está dentro de la habilidad en la materia.
Un experto en la materia entendería que un grupo protector se une reversiblemente a una posición deseada de la molécula para controlar la reacción de otros agentes en esa posición. Los grupos protectores útiles en la práctica de la presente invención son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4a edición, de P.G.M. Wuts y T.W. Greene (Wiley-Interscience, 2006); y Protecting Groups, de P. Kocienski (Thieme, 2005).
El grupo L1 de los compuestos divulgados es un grupo enlazador que conecta el elemento detectable, D, al elemento de direccionamiento. Este grupo puede ser cualquier enlazador adecuado, como entendería el experto en la materia. El grupo L1 es preferentemente un grupo enlazador alquilo, en donde el enlazador alquilo está opcionalmente sustituido, y adicionalmente, en donde los carbonos en el enlazador se sustituyen opcionalmente por heteroátomos en la medida en que la estructura resultante sea químicamente estable. Debe entenderse que dichas sustituciones y reemplazos incluyen grupos intervinientes dentro del enlazador, tales como éteres, tioéteres, disulfuros, ésteres, amidas, carbonatos, carbamatos, etc. Los enlazadores preferidos tienen una longitud de 5 a 40 enlaces y pueden ser ramificados, de cadena lineal o contener anillos. En algunos casos, los enlazadores pueden incluir dobles enlaces. Pueden ser hidrófobos o hidrófilos según se desee de acuerdo con los requisitos particulares.
Debe entenderse además que la conexión entre el grupo L1 y el elemento detectable, D, puede ser cualquier conexión química adecuada, como entenderá el experto en la materia. Por ejemplo, los compuestos divulgados pueden en algunos casos ser convenientemente preparados al incluir en el precursor de elemento detectable un resto que es reactivo con un grupo químico particular, tal como, por ejemplo, un grupo amino, un grupo tiol. En tal situación, el elemento detectable puede unirse fácilmente al elemento de direccionamiento mediante la reacción de este grupo en el elemento de direccionamiento. Por lo tanto, se entiende que estos tipos de uniones están dentro del alcance de los compuestos divulgados, incluso si los detalles estructurales de la conexión no se muestran explícitamente.
El grupo AA1 de los compuestos divulgados puede ser cualquier cadena lateral de aminoácido natural o no natural, tal como entendería un experto en la materia. En ejemplos preferidos, el grupo AA1 es una cadena lateral de aminoácido aralquilo que es opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos A. En los compuestos de la presente invención, el grupo AA1 es una cadena lateral de fenilalanina.
En los compuestos de la presente invención, el grupo U es O.
El elemento detectable de los compuestos divulgados es un marcador fluorescente, un radiomarcador, un quelante. En la publicación internacional PCT N.° 2009/124265 se describen ejemplos de radiomarcadores y quelantes adecuados para su uso en estos compuestos.
En la presente invención, el elemento detectable es un marcador fluorescente, en donde el marcador fluorescente es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina, o un marcador de cianina.
Como es sabido por los expertos en la materia, los marcadores fluorescentes emiten radiación electromagnética, preferentemente luz visible, cuando son estimulados por la absorción de radiación electromagnética incidente. Una gran variedad de marcadores fluorescentes, incluyendo marcadores que tienen elementos restos reactivos útiles para acoplar el marcado a grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos amino, grupos tiol,
se encuentran comercialmente disponibles. Véase, p. ej., The Molecular Probes® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies.
Un ejemplo de marcador fluorescente de acuerdo con la presente invención es fluoresceína, que se utiliza ampliamente en el marcado por inmunofluorescencia. La fluoresceína es un colorante xanteno con un máximo de absorción a 495 nanómetros. Un fluoróforo relacionado es Verde de Oregón, un derivado fluorado de la fluoresceína.
El marcador fluorescente utilizado en el elemento detectable de los compuestos de la presente divulgación puede ser un fluoróforo dependiente del pH. Tales marcadores fluorescentes, por ejemplo, como los utilizados en los compuestos marcados "LES12" y "LES13", mostrado a continuación, muestran un espectro de fluorescencia que depende del pH del entorno del marcador, como entendería el experto en la materia, y, por lo tanto, puede ser útil para proporcionar información sobre el entorno del marcado tras la reacción, por ejemplo, información sobre la localización o el tipo de proteasa marcada por el compuesto reactivo. Es bien conocida la fluorescencia dependiente del pH de varios marcadores incluidos de forma útil en el elemento detectable de los presentes compuestos. Véase, p. ej., The Molecular Probes® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies.
Otros marcadores fluorescentes ilustrativos adecuados para su uso en los presentes compuestos son colorantes de bora-diaza-indeceno, rodamina y cianina. En particular, los colorantes de bora-diaza-indeceno están representados por 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diazas-indaceno, conocidos como colorantes BODIPY®. Se conocen varios derivados de estos colorantes y se consideran adecuados para su uso como elemento detectable en los compuestos de la presente divulgación. Véase, p. ej., Chen et al. (2000) J. Org. Chem. 65:2900-2906.
Otra clase de marcador fluorescente útilmente empleada en los compuestos de la presente divulgación son los colorantes infrarrojos IRDye disponibles en Li-Cor (www.licor.com). Los ejemplos no limitantes de estos colorantes son IRDye 800CW, IRDye 680RD, IRDye 680LT, IRDye 750, IRDye 700DX, IRDye 800RS, e IRDye 650.
Los colorantes de rodamina son una clase de colorantes basados en la estructura anular de la rodamina. Las rodaminas incluyen, entre otros, tetrametilrodamina (TMR), un fluoróforo muy común para preparar conjugados de proteínas, especialmente conjugados de anticuerpos y avidina, y carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA), un colorante comúnmente utilizado para el marcado de oligonucleótidos y la secuenciación automatizada de ácidos nucleicos. Las rodaminas se han establecido como complementos naturales de los fluoróforos a base de fluoresceína, que ofrecen máximos de emisión de longitud de onda más larga y, por tanto, crean oportunidades para el marcado o la tinción multicolor.
Dentro del grupo de los colorantes de rodamina también se incluye la serie de fluoróforos de rodamina sulfonada conocidos como colorantes Alexa Fluor. Los espectaculares avances de la moderna tecnología de fluoróforos se ejemplifican con los colorantes Alexa Fluor, introducidos por Molecular Probes. Estos derivados de rodamina sulfonada presentan mayores rendimientos cuánticos para una emisión de fluorescencia más intensa que las sondas espectralmente similares, y tienen varias características adicionales mejoradas, incluyendo una mayor fotoestabilidad, espectros de absorción adaptados a las líneas láser habituales, insensibilidad al pH y un alto grado de solubilidad en agua.
Los colorantes de cianina corresponden a una familia de colorantes relacionados, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 y sus derivados, que se basan en el núcleo heterocíclico parcialmente saturado de nitrógeno indólico con dos unidades aromáticas conectadas mediante un puente polialqueno con número variable de carbonos. Estas sondas presentan perfiles de excitación y emisión de fluorescencia similares a los de muchos de los colorantes tradicionales, como fluoresceína y tetrametilrodamina, pero con mayor solubilidad en agua, fotoestabilidad y mayores rendimientos cuánticos. La mayoría de los colorantes de cianina son más estables desde el punto de vista medioambiental que sus homólogos tradicionales, por lo que su intensidad de emisión de fluorescencia es menos sensible al pH y a los medios de montaje orgánicos. De forma similar a Alexa Fluor, las longitudes de onda de excitación de la serie Cy de colorantes sintéticos se ajustan específicamente para su uso con fuentes láser y de descarga de arco comunes, y la emisión de fluorescencia puede detectarse con combinaciones de filtros tradicionales. Los colorantes de cianina están disponibles
como colorantes reactivos o fluoróforos. Los colorantes de cianina tienen generalmente espectros de absorción más amplios que los miembros de la familia Alexa Fluor, lo que los hace algo más versátiles en la elección de fuentes de excitación láser para microscopía confocal.
En realizaciones preferidas, el elemento detectable de los presentes compuestos es el colorante de cianina, Cy5.
Se divulga que puede ser beneficioso incluir múltiples marcadores fluorescentes, radiomarcadores, quelantes, dentro del elemento detectable de los compuestos de la divulgación. Por ejemplo, los compuestos ilustrativos marcados "LES12" y "LES13" a continuación incluyen dos marcadores fluorescentes diferentes dentro de un único elemento detectable. Dicho marcado múltiple puede lograrse utilizando química de acoplamiento habitual, como entendería un experto en la materia. Por ejemplo, los marcadores fluorescentes de los compuestos "LES12" y "LES13" se acoplaron mediante química de "clic". A continuación se muestra un ejemplo de un compuesto intermedio útil en la síntesis de compuestos que contienen múltiples marcadores dentro del elemento detectable mediante química de "clic" ("WL938"). Este compuesto contiene un grupo azido y, por tanto, puede reaccionar fácilmente con un reactivo adecuado que contenga alquino en una reacción de "clic". Las posiciones de los grupos alquino y azido también podrían invertirse, si se desea, como entenderían los expertos en la materia.
Se divulga un compuesto de fórmula (I), en donde T es un elemento de direccionamiento peptídico, y el compuesto se describe además en las siguientes frases numeradas:
1. Un compuesto de fórmula (I), en donde D-T- es un grupo peptídico corto detectable; y
L es un elemento saliente ligado a éter.
2. El compuesto de la frase 1, en donde el grupo peptídico detectable contiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos.
3. El compuesto de la frase 2, en donde D-T es:
o
en donde
cada AA1, AA2, AA3, y AA4 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D;
cada Ra es independientemente hidrógeno o R1;
Rb es hidrógeno, R1, -C(O)R1, -C(O)OR1, -C(O)SR1, o -C(O)N(R1)(Ra);
R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, un grupo protector, o -L1-D, y está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos A;
cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido, o azido; y
L1 es un enlazador.
4. El compuesto de la frase 3, en donde
cada Ra es hidrógeno; y
Rb es -C(O)OR1.
5. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1 y AA2 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y cada Ra es hidrógeno.
6. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1, AA2, y AA3 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y
cada Ra es hidrógeno.
7. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1, AA2, AA3, y AA4 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y cada Ra es hidrógeno.
8. El compuesto de la frase 3, en donde L1 es un enlazador de alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente sustituido por un heteroátomo.
9. El compuesto de la frase 3, en donde Rb es -C(O)OR1.
10. El compuesto de la frase 3, en donde D es un marcador fluorescente, un radiomarcador o un quelante.
11. El compuesto de la frase 10, en donde D es un marcador fluorescente.
12. El compuesto de la frase 11, en donde el marcador fluorescente es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina, o un marcador de cianina.
13. El compuesto de la frase 12, en donde el marcador fluorescente es un marcador de cianina.
14. El compuesto de la frase 13, en donde el marcador de cianina es Cy5.
Los grupos AA1, AA2, AA3, y AA4 en estos compuestos divulgados pueden ser independientemente cualquier cadena lateral de aminoácido natural o no natural, como entendería un experto en la materia, o el grupo "-L1-D". En ejemplos preferidos, el grupo es una cadena lateral de aminoácido aralquilo que está opcionalmente sustituida con 1 a 3 grupos A. En ejemplos incluso más preferidos, el grupo es una cadena lateral de fenilalanina. En otros ejemplos preferidos, el grupo es una cadena lateral de un residuo de aminoácido ácido, tal como una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico, o una cadena lateral de un residuo de aminoácido alquilo, tal como una alanina, leucina, isoleucina, valina u otro residuo de aminoácido de este tipo, en cualquier combinación. Cadenas laterales de otros residuos de aminoácidos, tales como lisina, arginina, tirosina, glutamina, asparagina, también se prefieren en los compuestos divulgados.
En los ejemplos de compuestos donde el grupo AA1, AA2, AA3, o AA4 es un grupo "-L1-D", el componente enlazador L1 puede ser proporcionado por una cadena lateral de aminoácido. En la presente invención, un residuo de lisina proporciona convenientemente un grupo aminoalquilo para la reacción con un elemento detectable convenientemente activado.
Un grupo peptídico detectable "corto" se define en el presente documento como un grupo peptídico detectable que tiene hasta 10 residuos de aminoácidos.
El elemento saliente ligado a éter, L, de los presentes compuestos influye en la reactividad de los compuestos con su sitio activo de enzima diana y también puede afectar a la especificidad del direccionamiento a una enzima particular. El enlace éter del elemento saliente en estos compuestos contrasta con el enlace éster de otras sondas basadas en la actividad, tales como las aciloximetilcetonas (AOMK). Un elemento saliente ligado a éter, tal como, por ejemplo, un elemento saliente ligado a éter fenólico, puede proporcionar una mejor estabilidad in vivo que las sondas ligadas a éster u otros tipos de sondas.
En algunas realizaciones, el elemento saliente ligado a éter de los presentes compuestos comprende un inactivador. El término "inactivador" es una entidad química que modula la emisión de un fluoróforo. En algunos casos, un inactivador puede en sí ser una molécula fluorescente que emite fluorescencia en una longitud de onda característica distinta del marcador cuya fluorescencia se está inactivando. Así, un fluoróforo puede actuar como inactivador cuando se acopla apropiadamente a otro colorante, y viceversa. En estas situaciones, el aumento en la fluorescencia de la molécula aceptora, que está en una longitud de onda diferente a la del marcador donante, puede informar por separado de las interacciones del compuesto marcado con su entorno, tal como, por ejemplo, el sitio activo de una enzima diana. En algunos casos, el inactivador no es fluorescente por sí mismo (es decir, el inactivador es un "aceptor oscuro"). Dichos inactivadores incluyen, por ejemplo, los colorantes dabcyl, rojo de metilo, QSY diarilrodamina. En particular, dabcyl ácido (4-dimetilamino-fenilazo)benzoico es un inactivador oscuro habitual ampliamente utilizado en muchos
ensayos, tales como "balizas moleculares" para la detección de ADN. Patente de Estados Unidos N.° 5.989.823. Los colorantes diazo de la serie BHQ, que se denominan "Inactivadores de agujero negro", proporcionan un amplio intervalo de absorción que se solapa bien con la emisión de muchos fluoróforos. Publicación internacional PCT N.° WO01/86001. Los colorantes de la serie QSY de Molecular Probes son otro ejemplo de colorantes inactivadores oscuros que se ha utilizado ampliamente como reactivos de inactivación en muchos bioensayos. Patente de Estados Unidos N.° 6.399.392.
QSY 7 en particular es un derivado de diarilrodamina no fluorescente. Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0014160. El QSY21 es un cromóforo no fluorescente de diarilrodamina con una fuerte absorción en el espectro visible, y es un eficaz inactivador de la fluorescencia. Los pares fluoróforo/inactivador se ilustran con más detalle en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2004/0241679.
IRDye QC-1 (disponible en Li-Cor) es otro ejemplo de colorante no fluorescente adecuado para su uso como inactivador en los presentes compuestos. Inactiva eficazmente la fluorescencia de un amplio intervalo de fluoróforos, incluyendo los que van en longitud de onda desde la región en el visible hasta el infrarrojo cercano.
Se divulgan compuestos, en donde el elemento de grupo saliente, L, es L2-L3-Q, en donde L2 es un grupo fenoxi, L3 es un enlazador, y Q es un inactivador. El elemento de grupo saliente puede ser, por ejemplo,
en donde cada Y es independientemente un grupo electroaceptor o hidrógeno. En dichos compuestos, cada Y puede ser independientemente un halógeno o hidrógeno. En compuestos específicos de acuerdo con la presente invención, el grupo L es,
El grupo enlazador L3 del elemento saliente descrito anteriormente puede ser cualquier enlazador adecuado, como entendería el experto en la materia. En particular, el grupo enlazador L3 puede ser, por ejemplo, un grupo L1 , como se ha descrito anteriormente.
En otros compuestos específicos, el grupo L es, por ejemplo,
en donde R es un inactivador QSY y n es un número entero de 1 a 8. En realizaciones específicas, el inactivador QSY es un inactivador QSY, tal como, por ejemplo, un inactivador sulfo-QSY.
Se divulgan compuestos que
tienen la estructura de fórmula (II):
En algunos ejemplos más específicos, los compuestos de la presente divulgación tienen la estructura de fórmula (III):
En estas realizaciones, m y n son independientemente números enteros de 1 a 16.
En algunas realizaciones, R es QSY21 o sulfo-QSY21, y D es Cy5.
Las realizaciones de compuestos específicos de la invención incluyen:
R = sulfo-QSY21 y n = 6;
R = QSY21 y n = 2; y
R = sulfo-QSY21 y n = 2.
Se divulga un compuesto que tiene la estructura de fórmula (IV):
en donde T es un elemento de direccionamiento peptídico, y el compuesto se describe además en las siguientes frases numeradas:
1. Un compuesto de fórmula (IV), en donde D-T- es un grupo peptídico corto detectable;
L3 es un enlazador; y
Q es un inactivador.
2. El compuesto de la frase 1, en donde el grupo peptídico detectable contiene de 1 a 4 residuos de aminoácidos.
3. El compuesto de la frase 2, en donde D-T es:
en donde
cada AA1 , AA2 , AA3, y AA4 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D;
cada Ra es independientemente hidrógeno o R1 ;
Rb es hidrógeno, R1 , -C(O)R1 , -C(O)OR1 , -C(O)SR1 , o -C(O)N(R1)(Ra);
R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, un grupo protector, o -L1-D, y está opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos A;
cada A es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, alcanoílo, alquilamino, arilo, ariloxi, arilamino, aralquilo, aralcoxi, aralcanoílo, aralcamino, heteroarilo, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroaralquilo, heteroaralcoxi, heteroaralcanoílo, heteroaralcamino, cicloalquilo, cicloalquenilo, cicloalquilalquilo, cicloalcoxi, cicloalcanoílo, cicloalcamino, heterociclilo, heterocicliloxi, heterociclilamino, heterociclilalquilo, heterociclilalcoxi, heterociclilalcanoílo, heterociclilalcamino, hidroxilo, tio, amino, alcanoilamino, aroilamino, aralcanoilamino, alquilcarboxi, carbonato, carbamato, guanidinilo, urea, halo, trihalometilo, ciano, nitro, fosforilo, sulfonilo, sulfonamido, o azido; y
L1 es un enlazador.
4. El compuesto de la frase 3, en donde
cada Ra es hidrógeno; y
RB es -C(O)OR1.
5. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1 y AA2 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y
cada Ra es hidrógeno.
6. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1 , AA2 , y AA3 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y cada
Ra es hidrógeno.
7. El compuesto de la frase 3, en donde D-T es
cada AA1, AA2, AA3, y AA4 es independientemente una cadena lateral de aminoácidos o -L1-D; y cada Ra es hidrógeno.
8. El compuesto de la frase 3, en donde L1 es un enlazador de alquilo opcionalmente sustituido, en donde cada átomo de carbono está opcionalmente sustituido por un heteroátomo.
9. El compuesto de la frase 3, en donde Rb es -C(O)OR1.
10. El compuesto de la frase 3, en donde D es un marcador fluorescente, un radiomarcador o un quelante.
11. El compuesto de la frase 10, en donde D es un marcador fluorescente.
12. El compuesto de la frase 11, en donde el marcador fluorescente es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina, o un marcador de cianina.
13. El compuesto de la frase 12, en donde el marcador fluorescente es un marcador de cianina.
14. El compuesto de la frase 13, en donde el marcador de cianina es Cy5.
Los grupos AA1 , AA2, AA3, y AA4 en estos compuestos divulgados pueden ser independientemente cualquier cadena lateral de aminoácido natural o no natural, como entendería un experto en la materia, o el grupo "-L1-D". En ejemplos preferidos, el grupo es una cadena lateral de aminoácido aralquilo que está opcionalmente sustituida con 1 a 3 grupos A. En ejemplos incluso más preferidos, el grupo es una cadena lateral de fenilalanina. En otros ejemplos preferidos, el grupo es una cadena lateral de un residuo de aminoácido ácido, tal como una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico o ácido glutámico, o una cadena lateral de un residuo de aminoácido alquilo, tal como una alanina, leucina, isoleucina, valina u otro residuo de aminoácido de este tipo, en cualquier combinación. Cadenas laterales de otros residuos de aminoácidos, tales como lisina, arginina, tirosina, glutamina, asparagina, también se prefieren en los compuestos divulgados.
En los compuestos divulgados, donde el grupo AA1 , AA2 , AA3, o AA4 es un grupo "-L1-D", el componente enlazador L1 puede ser proporcionado por una cadena lateral de aminoácido. En la presente invención, un residuo de lisina proporciona convenientemente un grupo aminoalquilo para la reacción con un elemento detectable convenientemente activado.
Un grupo peptídico detectable "corto" se define en el presente documento como un grupo peptídico detectable que tiene hasta 10 residuos de aminoácidos.
Otras realizaciones de compuestos específicos de la invención excepto BMV157 incluyen:
y
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son útiles, por ejemplo, en la formación de imágenes de tejidos en un animal y son además útiles para evaluar la actividad de enzimas en el animal, por ejemplo, enzimas proteasas. En particular, para los compuestos de la invención que marcan catepsinas, las composiciones farmacéuticas pueden ser útiles como herramientas para la formación de imágenes ópticas no invasivas de células cancerosas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas tales como agua o solución salina fisiológicamente tamponada, u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites tales como aceite de oliva o ésteres orgánicos inyectables. En una realización específica, cuando tales composiciones farmacéuticas son para la administración a seres humanos, la solución acuosa es apirógena, o sustancialmente apirógena. Se pueden elegir los excipientes, por ejemplo, para efectuar una liberación retardada de un agente o para direccionarse de manera selectiva a una o más células, tejidos u órganos. La composición farmacéutica puede estar en una forma de dosificación unitaria, tal como un comprimido, cápsula, cápsula dispersable, gránulo, polvo, jarabe, supositorio, inyección.
La composición también puede estar presente en un sistema de administración transdérmico, p. ej., un parche dérmico.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener agentes fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción de un compuesto de la presente invención. Tales agentes fisiológicamente aceptables incluyen, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo un agente fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición. La composición farmacéutica también puede comprender un liposoma u otra matriz polimérica, que puede tener incorporada en la misma, por ejemplo, un compuesto de la invención. Los liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos, son vehículos no tóxicos fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de preparar y de administrar.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin producir demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en el presente documento se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en portar o transportar los compuestos objetos de un órgano o parte del organismo, a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales
como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua apirógena; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. Véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed. (Alfonso R. Gennaro ed.), 2000.
Una composición farmacéutica que contiene un compuesto de la presente invención se puede administrar a un sujeto mediante cualquiera de una serie de vías de administración que incluyen, por ejemplo, por vía oral (por ejemplo, medicamentos para ingesta forzosa en animales por inyección disueltos en soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, comprimidos, inyección en embolada, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua); por vía sublingual; por vía anal, por vía rectal o por vía vaginal (por ejemplo, en forma de un óvulo vaginal, crema o espuma); por vía parenteral (entre las que se incluyen por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea o intratecal como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril); por vía nasal; por vía intraperitoneal; por vía subcutánea; por vía transdérmica (por ejemplo, como un parche aplicado a la piel); o por vía tópica (por ejemplo, como una crema, pomada o pulverizador aplicado a la piel). El compuesto también se puede formular para inhalación. En determinadas realizaciones, un compuesto de la presente invención se puede disolver o suspender de manera sencilla en agua estéril. Los detalles de las vías de administración apropiadas y las composiciones adecuadas para la misma se pueden encontrar en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 6.110.973; 5.763.493; 5.731.000; 5.541.231; 5.427.798; 5.358.970; y 4.172.896, así como en las patentes citadas en esos documentos.
Métodos de marcado y visualización
Se divulgan métodos de visualización de un tumor en un animal, que comprenden la etapa de administrar una composición de la invención al animal.
En otro aspecto más, la invención proporciona compuestos para su uso en visualizar un tumor en un animal, que comprende las etapas que consisten en administrar una composición de la invención al animal, y medir una señal detectable generada en el animal a partir de una reacción de la composición con una catepsina cisteína proteasa, en donde la señal detectable está asociada a un tumor en el animal.
En algunas realizaciones, la señal detectable es una señal fluorescente. En algunas realizaciones, la señal fluorescente se genera en un margen del tumor.
La administración de agentes de formación de imágenes peptídicos a un animal es bien conocida por los expertos en la materia. En realizaciones preferidas, el agente se administra mediante inyección, aunque cualquier otro medio adecuado de administración se considera dentro del alcance de la invención.
La presente invención hace referencia al marcado y visualización de una proteasa, en particular una cisteína proteasa, en un animal. Los animales adecuados incluyen animales que expresan cisteína proteasas, particularmente en células tumorales. En realizaciones preferidas, el animal es un mamífero. En realizaciones muy preferidas, el animal es un ser humano. En otras realizaciones preferidas, el animal es un animal de ganadería o un animal de compañía.
En algunas realizaciones, la presente invención comprende la etapa de medir una señal detectable generada en el animal. Los métodos para medir la señal detectable incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de formación de imágenes, por ejemplo, métodos de formación de imágenes fluorescentes. En algunas realizaciones, el sistema de formación de imágenes fluorescentes es, por ejemplo, un sistema Xenogen IVIS 100, pero puede utilizarse cualquier sistema de formación de imágenes adecuado.
Será fácilmente evidente para un experto en la materia que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y solicitudes descritas en el presente documento pueden realizarse sin apartarse del alcance de la invención o de cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, esta se entenderá más completamente con referencia a los siguientes Ejemplos, que se incluye en la presente con fines ilustrativos únicamente y no pretende ser limitante de la invención.
Ejemplo
Síntesis y caracterización de sondas de formación de imágenes de cisteína catepsina fluorescentes inactivadas que contienen un nuevo electrófilo de fenoximetilcetona (PMK)
El objetivo de este trabajo era desarrollar una qABP con propiedades in vivo en general mejoradas en comparación con las qABP existentes que pudiera utilizarse para la formación de imágenes ópticas no invasivas del cáncer. Por lo tanto, se decidió optimizar tres elementos principales de la sonda, el inactivador, el enlazador y la "ojiva" electrofílica. Uno de los mayores inconvenientes de las qABP de cisteína catepsina indicados hasta la fecha es su solubilidad acuosa relativamente escasa. Por lo ello, se introdujeron grupos sulfonato en el inactivador QSY21 (Xing et al. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127:4158-9) con el fin de mejorar la solubilidad en agua y, de este modo, la biodistribución de la sonda. También se varió la longitud del espaciador que une el electrófilo y el inactivador para disminuir la lipofilicidad de la qABP. Por último, se exploró un nuevo electrófilo con el fin de aumentar el intervalo de posibles dianas de la
catepsina. Dado que varios miembros de la familia de las cisteína catepsinas están regulados al alza en diversos tipos de cáncer (Mohamed & Sloane (2006) Nat. Rev. Cancer (2006) 6:764-75), se esperaría una señal de fluorescencia más brillante en los tumores si la sonda se dirige a un amplio espectro de actividades de cisteína catepsina. Para obtener una sonda más panreactiva, se redujo el tamaño del electrófilo y se aumentó la reactividad. Anteriormente se había demostrado que el electrófilo 2,3,5,6-tetrafluoro fenoximetilcetona (PMK) sustituido tiene una mayor reactividad para las cisteína dipeptidil aminopeptidasas en comparación con la aciloximetilcetona (AOMK) derivada del ácido 2,6-dimetilbenzoico. Deu et al. (2010) Chem Biol. 17:808-819. El menor tamaño de la PMK también podría aumentar la panreactividad, ya que las ranuras de unión de algunas de las cisteína catepsinas, están estéricamente restringidas. Blum et al. (2005) Nat. Chem. Biol. 1:203-9; Blum et al. (2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77; Paulick & Bogyo (2011) ACS Chem. Biol. 6:563-72. Es más, se espera que el éter fenólico sea más estable in vivo en comparación con el electrófilo AOMK que contiene un enlace éster que puede ser degradado por las estereasas.
Como punto de partida para este estudio se sintetizaron 7 análogos (2-8) de qABP GB137 (1). Blum et al. (2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77. (Figura 1a) Estos compuestos representan todas las combinaciones de los dos electrófilos, dos inactivadores y dos longitudes del enlazador. Todas las sondas se sintetizaron utilizando un procedimiento optimizado basado en química de solución, como se describe en el Esquema 1 a continuación. La especificidad y potencia de la sonda se comprobaron inicialmente marcando células RAW 264.7 intactas (línea celular de macrófagos monocitos leucémicos de ratón) (Figura 1b). Se observaron varias tendencias en las propiedades de las sondas. Todas las qABP funcionalizadas con sulfo-QSY21 (2, 4 , 6 y 8) mostraron un marcado más fuerte de la catepsina en general en comparación con las sondas más hidrófobas que contenían QSY21 (1, 3, 5 y 7). Curiosamente, el cambio en la longitud del espaciador de un enlazador hexil a etil no tuvo una influencia dramática en el perfil de marcado. Quizás la observación más sorprendente fue que las qABP con el electrófilo PMK mostraron un perfil de marcado de cisteína catepsina más amplio en comparación con sus homólogo AOMK. Las sondas 5-8 mostraron un marcado robusto de la catepsina X y las sondas funcionalizadas con Sulfo-QSY21 6 y 8 fueron capaces de marcar una proforma de mayor peso molecular de la catepsina L. Las identidades de las catepsinas marcadas por fluorescencia se determinaron mediante inmunoprecipitación (Figura 4a). Al realizar experimentos de marcado por titulación en células RAW vivas, se observaron otras tendencias interesantes (Figura 1c,d. Figure 4b,c). Las qABP más hidrófobas (1 y 5) alcanzan un máximo reducido de intensidad de marcado a 0,5 pM, lo que sugiere que su menor solubilidad en agua provoca la precipitación de las sondas a concentraciones más altas. La menor longitud del espaciador parece ser beneficiosa, con todas las sondas que portan el espaciador etílico presentando un marcado más brillante que sus homólogas que contienen hexilo. Al comparar las AOMk con las PMK, se observa una clara diferencia en la selectividad. Las qABP AOMK marcan preferentemente las catepsinas S y L y solo a concentraciones más altas marcan la catepsina B. Sorprendentemente, las qABP AOMK 2-4 marcan la catepsina X, a pesar de que estudios previos habían demostrado que varias otras AOMK relacionadas son incapaces de marcar esta diana (Paulick & Bogyo (2011) ACS Chem. Biol.
6:563-72). Las qABP PMK también marcaron todas las cisteína catepsinas diana con la misma intensidad, incluso a las concentraciones de sonda más bajas. En conjunto, estos experimentos demuestran que el aumento de la hidrofilicidad mejora la intensidad del marcado y que las nuevas qABP PMK tienen un perfil de marcado más amplio y más pancisteína catepsina.
Dado que la qABP PMK 8 fue la más óptima en términos de intensidad de marcado general y amplia reactividad a la catepsina, se decidió proceder con esta sonda para estudios in vivo posteriores. Para definir mejor la selectividad de la diana, Se marcaron lisados de células RAW con concentraciones crecientes de qABP 8 a pH 5,5. Estos resultados demostraron que la sonda es más potente hacia las catepsinas B y X, observándose el marcado a concentraciones tan bajas como 5 nM. Sin embargo, el marcado de todas las catepsinas (B,S, L, X) se saturó con 500 nM de la sonda (Figura 2a). Cuando se utilizó la sonda para un marcado de curso temporal de células RAW vivas a la concentración establecida de 500 nM, se observó una rápida saturación de la catepsina X y, a continuación, un marcado más lento de la catepsina S, L y B, aumentando la señal de marcado de la catepsina B incluso a los 120 min (Figura 2b). Estos datos indican que es probable que la sonda pueda acceder a los agrupamientos de catepsina X más rápidamente, quizás debido a su localización dentro o en la superficie de las células. También indican que las catepsinas B y X pueden estar en localizaciones alternativas de las células a las que la sonda puede acceder en distinta medida. Con el fin de comprobar la estabilidad de la nueva sonda PMK, se examinaron los efectos de la exposición al suero sobre el marcado en células RAW (Figura 1c). Mientras que la exposición previa al suero durante 4 horas a la sonda AOMK 1 original provocó una pérdida de casi el 70 % del marcado diana, en el caso de la qABP PMK 8 se conservó más del 80 % del marcado. El pretratamiento de las células con el inhibidor de la cisteína catepsina JPM-OEt también bloqueó más del 90 % de este marcado. Dada la estabilidad y las mejores propiedades de marcado de la sonda PMK, a continuación se realizaron estudios de microscopía de fluorescencia de células vivas. Estos resultados confirmaron que la sonda producía señales de marcado brillantes y específicas y que la mayoría de las catepsinas marcadas con la sonda residían en lisosomas (Figura 2d).
Dada la propiedad positiva de marcado de células vivas del nuevo electrófilo de PMK, las qABP PMK 2 , 6 y 8 con mejores resultados se probaron en un modelo ortotópico de ratón de cáncer de mama. Tao et al. (2008) BMC Cancer 8:228. Adicionalmente, estas sondas PMK se compararon con la sonda original AOMK 1 (Figura 3 y Figura 5). Se implantaron células 4T1 en las almohadillas adiposas mamarias número 2 y 7 de ratones Balb/c, y se controló el crecimiento tumoral. Cuando se establecieron los tumores, se inyectó a los ratones cantidades equimolares de qABPs (20 nmol) a través de la vena de la cola, y se obtuvo una imagen no invasiva de la fluorescencia Cy5 a lo largo del tiempo (Figura 3a,b). De nuevo, estos resultados confirmaron que la qABP 8 demostró ser superior. Se pudo observar
una activación robusta de la fluorescencia específica del tumor para la sonda 8 específicamente en la región tumoral con un alto contraste general. Esta señal continuó aumentando con el tiempo hasta el final del curso temporal. Finalmente, la sonda 8 alcanzó una señal de fluorescencia específica del tumor más de veinte veces superior a la de la sonda 1. También se observó un buen contraste específico del tumor con la sonda 6 y, en menor medida, con la sonda 2, aunque ambas superaron a la sonda 1 en más de diez veces (Figura 5a,b). Una vez finalizado el curso temporal, se extirparon los tumores y se midió la fluorescencia tumoral ex vivo, seguido de homogeneización y análisis de las proteínas marcadas con fluorescencia mediante SDS-PAGE (Figura 3c y Figura 5c). La cuantificación de la fluorescencia ex vivo y del marcado total de cisteína catepsina mostró una tendencia similar a la observada en los estudios de formación de imágenes ópticas no invasivas (Figura 3d y Figura 5d). Para determinar la fuente celular de la fluorescencia de la sonda, se realizaron tinciones de inmunofluorescencia de secciones de tejido tumoral de ratones marcados con la sonda utilizando el marcador de macrófagos CD68 (Figura 3e y Figura 5e). La fluorescencia Cy5 se localizó en las células CD68 positivas, sin embargo, no todas las células CD68 positivas eran también positivas para la sonda 8, lo que indica diferentes estados de activación de los macrófagos asociados al tumor. Un análisis más detallado con microscopía confocal de barrido láser (CLSM, por sus siglas en inglés) confirmó que todas las células positivas para la sonda 8 lo eran también para CD68, pero que las catepsinas marcadas con la sonda y las señales CD68 no se colocalizan en las mismas vesículas (Figura 3f y Figura 5f). Tomados en conjunto, estos datos confirman que el aumento de la hidrofilicidad del inactivador, el acortamiento del espaciador y la introducción de una trampa nucleofílica más reactiva y estéricamente menos restringida dieron como resultado una qABP con una amplia reactividad a la cisteína catepsina y unas propiedades in vivo mejoradas en general.
Aunque se han descrito funciones muy distintas para algunos de los miembros de la familia de las cisteína catepsinas, (Conus & Simon (2010) Swiss Med. Wkly. 140:w13042) otras funciones son redundantes y las alteraciones en la actividad de una catepsina pueden influir en la actividad de otras. Por ejemplo, la pérdida de catepsina B se compensa con una mayor actividad de la catepsina X (Sevenich et al. (2010) Proc. Natl Acad. Sci. USA 107:2497-502) y la regulación al alza de la catepsina B provoca la regulación a la baja de la catepsina L (Gopinathan et al. (2012) Gut 61:877-84). Por lo tanto, una sonda de amplio espectro es muy valiosa, ya que facilita la lectura de múltiples cisteína catepsinas en un experimento y permite la comparación de las actividades de las catepsinas individuales con respecto a las otras. La utilidad de estas ABP panreactivas ha quedado demostrada por las sondas de fluorofosfonato panserina hidrolasa (Liu et al. (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:14694-9) y la sonda panreactiva del proteasoma MV151 (Verdoes et al. (2006) Chem. Biol. 13:1217-26). Es más, dado que las qABP basadas en PMK son altamente reactivas frente a la catepsina X, estos andamiajes pueden utilizarse para generar qABP selectivas frente a esta cisteína catepsina aún poco conocida. (Paulick & Bogyo (2011) ACS Chem. Biol. 6:563-72).
En conclusión, se ha sintetizado una nueva clase de sondas basadas en la actividad fluorescentes atenuada con un electrófilo PMK sintetizado con mayor reactividad y selectividad en comparación con las sondas basadas en AOMK indicadas anteriormente. Es más, se ha aumentado la hidrofilicidad de la qABP introduciendo un inactivador sulfonado y acortando el espaciador que une el electrófilo y el inactivador, el resultado es una mayor solubilidad acuosa y una mejora de las propiedades in vivo, lo que se traduce en un mayor contraste en la formación de imágenes ópticas no invasivas del cáncer.
MÉTODOS
Generalidades
Todas las resinas y reactivos se compraron a proveedores comerciales y se utilizaron sin más purificación. Todos los disolventes utilizados fueron de calidad HPLC. Todas las reacciones sensibles al agua se realizaron en disolventes anhidros bajo presión positiva de argón. Las reacciones se analizaron por LC-MS utilizando un espectrómetro de masas de cuadrupolo único API 150EX (Applied Biosystems). La HPLC en fase inversa se realizó con un ÁKTA explorer 100 (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando columnas C18. Los espectros de RMN se registraron en un Varian 400 MHz (400/100), Varian 500 MHz (500/125) o un Varian Inova 600 Mhz (600/150 MHz) equipado con un accesorio de gradiente de campo pulsado. Los desplazamientos químicos se dan en ppm (8) con respecto al tetrametilsilano como patrón interno. Las constantes de acoplamiento se dan en Hz. Los geles fluorescentes se barrieron con un escáner láser plano Typhoon 9400 (GE Healthcare). Las intensidades de marcado en gel se cuantificaron con el software Image J. El análisis estadístico se realizó con Microsoft Excel y el eem se calculó dividiendo el eem por la raíz cuadrada de n. Las imágenes de microscopía fluorescente se adquirieron con un microscopio confocal Zeiss LSM 710 y un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200 M equipado con un objetivo de 10x, 40x y 63x (Carl Zeiss). Se utilizó el software Slidebook para controlar el microscopio y la cámara y para el análisis de datos (Intelligent Imaging Innovations).
Síntesis de qABP
El esquema de síntesis para la síntesis de los siguientes compuestos se representa a continuación en el Esquema 1.
Ácido 2,6-dimetil-4-((6-(tritilamino)hexil)carbamoil)benzoico (11a). La sal del ácido monotritil 1,6-diaminohexano acético (9a) (117,2 mg, 0,28 mmol) se tomó en DCM y se lavó con NaHCO3 sat. ac., se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y se añadió HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), EDC
(54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,6-dimetiltereftálico (10) (54,4 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarse al vacío. El crudo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (DCM ^ MeOH al 5 % en DCM) y posteriormente se tomó en DCM y se lavó con agua y se secó sobre MgSO4 para producir 70 mg (0,13 mmol, 47 % de rendimiento aislado).
Ácido 2,6-dimetil-4-((2-(tritilamino)etil)carbamoil)benzoico (11b). La sal del ácido mono-tritil-etilendiamino acético (9b) (97,9 mg, 0,27 mmol) se tomó en DCM y se lavó con NaHCO3 sat. ac., se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y se añadió HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1,04 equiv.), EDC (61 mg, 0,32 mmol, 1,2 equiv.) y ácido 2,6-dimetiltereftálico (10) (52 mg, 0,27 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarse al vacío. El crudo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (DCM ^ MeOH al 5 % en DCM) y posteriormente se tomó en DCM y se lavó con agua y se secó sobre MgSO4 para producir 28 mg (0,06 mmol, 22 % de rendimiento aislado).
2.3.5.6- tetrafluoro-4-hidroxi-N-(6-(tritilamino)hexil)benzamida (13a). La sal del ácido monotritil 1,6-diaminohexano acético (9a) (117,2 mg, 0,28 mmol) se tomó en DCM y se lavó con NaHCO3 sat. ac., se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y se añadió HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), EDC (54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,3,5,6-tetrafluoro-4-hidroxibenzoico (12) (59 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarse al vacío. El crudo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (15 % -> 30 % de acetato de etilo en hexano) para proporcionar 90 mg (0,16 mmol, 58 % de rendimiento aislado).
2.3.5.6- tetrafluoro-4-hidroxi-N-(2-(tritilamino)etil)benzamida (13b). La sal del ácido mono-tritil-etilendiamino acético (9b) (100 mg, 0,28 mmol) se tomó en DCM y se lavó con NaHCO3 sat. ac., se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío. La amina se disolvió en DMF y se añadió HOBt monohidrato (43 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.), EDC (54 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y ácido 2,3,5,6-tetrafluoro-4-hidroxibenzoico (12) (59 mg, 0,28 mmol, 1 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante una noche, antes de concentrarse al vacío. El crudo se purificó mediante cromatografía en columna instantánea (20 % -> 35 % de acetato de etilo en hexano) para proporcionar 90 mg (0,18 mmol, 65 % de rendimiento aislado). RMN 1H (400 MHz, DMSO) 8 = 8,77 (t, J = 6,0, 1H), 7,39 (d, J = 7,8, 6H), 7,27 (t, J = 7,7, 6H), 7,17 (t, J = 7,2, 3H), 3,40-3,35 (m, 2H), 2,86-2,77 (m, 1H), 2,14-2,04 (m, 2H).
Esquema 1. Reactivos y condiciones: i. EDC, HOBt, DMF. ii. a) KF, DMF. b) 1 % de TFA, DCM. iii. a) QSY21-NHS o sulfo-QSY21-NHS, DiPEA, DMSO. b) TFA/DCM = 1/1. c) Cy5-NHS, DiPEA, DMSO. iv. a) KF, DMF, 80 °C. b) 1 % de TFA, DCM.
Intermedio 15. El fluoruro potásico (3 mg, 52 |jmol, 3 equiv.) se suspendió en DMF por sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el ácido carboxílico 11a (10 mg, 19 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometilcetona 14 (9,7 mg, 17,3 jmol, 1 equiv.). Después de 2 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el crudo se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivarse mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución fuese incolora. Tras coevaporación con tolueno (3x), el compuesto del título se purificó por HPLC (columna C-is de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para obtener 15 como polvo blanco (3,12 mg, 3,46 jmol, 20 % en 2 etapas).
Intermedio 16. El fluoruro potásico (3 mg, 52 jmol, 3 equiv.) se suspendió en DMF por sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió el ácido carboxílico 11b (9,5 mg, 20 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometilcetona 14 (10 mg, 17,9 jmol, 1 equiv.). Después de 1,5 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío y el crudo se recogió en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivarse mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución se volvió incolora. Tras coevaporación con tolueno (3x), el intermedio 16 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para obtener un polvo blanco (3,99 mg, 4,57 jmol, 26 % en 2 etapas). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) 87,80 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,35-7,18 (m, 10H), 5,06 (s, 2H), 4,85-4,78 (m, 2H), 4,42 (dd, J = 13,1,6,2 Hz, 1H), 4,37 (dd, J = 10,1, 4,0 Hz, 1H), 3,64 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,18 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,12 (dd, J = 13,7, 7,0 Hz, 1H), 3,01 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,94 (dd, J = 13,6, 8,9 Hz, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,92-1,82 (m, 1H), 1,67-1,57 (m, 1H), 1,49-1,26 (m, 4H), 1,42 (s, 9H).
Intermedio 17. El fluoruro potásico (6,3 mg, 108 jmol, 3 equiv.) se suspendió en DMF por sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió fenol 13a (21,5 mg, 39 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometilcetona 14 (20 mg, 36 jmol, 1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 5 h, antes de concentrarse al vacío. El crudo se tomó en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivarse mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución se volvió incolora. Tras coevaporación con tolueno (3x), se realizó purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 25:75 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización se obtuvo el compuesto del título como polvo blanco (16,6 mg, 17,5 jmol, 49 % en 2 etapas). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) 87,29 (m, 10H), 5,07 (s, 2H), 4,86 (m, 2H), 4,44 (m, 2H), 3,41 (t, J = 6,8, 2H), 3,10 (dd, J = 13,5, 7,0, 1H), 3,02 (t, J = 6,8, 2H), 2,97-2,91 (m, 3H), 1,93-1,81 (m, 1H), 1,73-1,62 (m, 4H), 1,62-1,53 (m, 1H), 1,51-1,46 (m, 4H), 1,43 (s, 9H), 1,45-1,25 (m, 4H).
Intermedio 18. El fluoruro potásico (6,3 mg, 108 jmol, 3 equiv.) se suspendió en DMF por sonicación durante 5 min, tras lo cual se añadió fenol 13b (19,4 mg, 39 jmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min, antes de añadir la clorometilcetona 14 (20 mg, 36 jmol, 1 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 3 h, antes de concentrarse al vacío. El crudo se tomó en TFA al 1 % en DCM y se agitó durante 30 min, antes de inactivarse mediante la adición de triisopropilsilano hasta que la solución se volvió incolora. Tras coevaporación con tolueno (3x), se realizó purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 20:80 a 60:40 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización se obtuvo el compuesto del título como polvo blanco (15,4 mg, 17,3 jmol, 48 % en 2 etapas). RMN 1H (400 MHz, CD3OD) 8 = 7,36-7,12 (m, 10H), 5,05 (s, 2H), 4,86-4,81 (m, 2H), 4,42
4,37 (m, 2H), 3,64 (t, J = 6,5, 2H), 3,14 (t, J = 6,5, 2H), 3,08 (dd, J = 13,9, 7,2, 1H), 2,99 (t, J = 6,5, 2H), 2,91 (dd, J = 13,9, 8,4, 1H), 1,90-1,78 (m, 1H), 1,62-1,48 (m, 1H), 1,41 (s, 9H), 1,46-1,20 (m, 4H).
Sonda 1 (GB137). El intermedio 15 (1,5 mg, 1,7 |jmol) se tomó en DMSO (50 |jl) y se añadió QSY21-NHS (1,39 mg, 1.7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 jl, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,42 mg de la sal de TFA correspondiente (1,6 jmol, 95 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 j l ) y se añadió Cy5-NHS (1,3 mg, 1,76 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,4 j l, 8 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 75:25 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 1 como polvo azul oscuro (2,0 mg, 0,99 jmol, 62 %).
Sonda 2 (BMV122). El intermedio 15 (1,5 mg, 1,7 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l) y se añadió Sulfo-QSY21-NHS (1,66 mg, 1,7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 j l, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,29 mg de la sal de TFA correspondiente (1,39 jmol, 81 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 j l ) y se añadió Cy5-NHS (1,1 mg, 1,5 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,2 j l, 7 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 2 como polvo azul oscuro (1,83 mg, 0,84 jmol, 61 %).
Sonda 3 (BMV145). El intermedio 16 (1,5 mg, 1,7 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l) y se añadió QSY21-NHS (1,39 mg, 1.7 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,5 jl, 8,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 0,86 mg de la sal de TFA correspondiente (0,6 jmol, 35 % de rendimiento aislado en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 j l) y se añadió Cy5-NHS (0,5 mg, 0,66 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,57 jl, 3,3 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 40:60 a 75:25 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 3 como polvo azul oscuro (0,67 mg, 0,34 jmol, 57 %).
Sonda 4 (BMV146). El intermedio 16 (1,0 mg, 1,2 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l) y se añadió Sulfo-QSY21-NHS (1,25 mg, 1,2 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,05 jl, 6 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TfA al 0,1 %, 20:80 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 1,06 mg de la sal de TFA correspondiente (0,66 jmol, 55 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 j l ) y se añadió Cy5-NHS (0,55 mg, 0,73 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,64 jl, 3,65 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 4 como polvo azul oscuro (0,63 mg, 0,3 jmol, 45 %).
Sonda 5 (BMV118). El intermedio 17 (1,2 mg, 1,3 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l ) y se añadió QSY21-NHS (1,0 mg, 1.3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,13 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 2 h, la amida QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 80:20 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 2,0 mg de la sal de TFA correspondiente (1,3 jmol, cuantitativa en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSo (50 j l) y se añadió Cy5-NHS (1,0 mg, 1,3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,1 j l , 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 40:60 a 85:15 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 5 como polvo azul oscuro (1,91 mg, 0,94 jmol, 72 %).
Sonda 6 (BMV119). El intermedio 17 (1,2 mg, 1,3 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l) y se añadió Sulfo-QSY21-NHS (1,35 mg, 1,3 jmol, 1 equiv.) y DiPEA (1,13 j l , 6,5 jm ol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 90:10 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización. Para eliminar el grupo protector Boc, el polvo azul oscuro resultante se tomó en TFA/DCM (1/1) y se hizo reaccionar durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x) para dar 1,98 mg de la sal de TFA correspondiente (0,9 jmol, 70 % en 2 etapas). La amina se disolvió en DMSO (50 j l ) y se añadió Cy5-NHS (0,7 mg, 0,9 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,8 jl, 4,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 15:85 a 50:50 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 6 como polvo azul oscuro (1,63 mg, 0,74 jmol, 82 %).
Sonda 7 (BMV108). El intermedio 18 (1,2 mg, 1,3 jm ol) se tomó en DMSO (50 j l ) y se añadió QSY21-NHS (1,2 mg, 1.4 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (1,13 jl, 6,5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, la amida QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido
de liofilización para obtener un polvo azul oscuro (1,43 mg, 0,99 |jmol, 76%). El grupo protector Boc se eliminó posteriormente en TFA/DCM (1/1) durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x). La sal de TFA se disolvió en DMSO (50 j l ) y se añadió Cy5-NHS (0,83 mg, 1,1 jmol, 1,1 equiv.) y DiPEA (0,88 jl, 5 jmol, 5 equiv.). Después de 1 h, purificación por HPLC (columna C-is de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 30:70 a 70:30 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 7 como polvo azul oscuro (0,95 mg, 0,48 jmol, 49 % en 2 etapas).
Sonda 8 (BMV109). El Intermedio 18 (5,8 mg, 6,5 jm ol) se disolvió en DMSO (100 jl). Se añadió Sulfo-QSY21-NHS (9,75 mg, 10,39 jmol, 1,6 equiv.) y DiPEA (8,4 j l, 50,5 jmol, 7,8 equiv.) y la mezcla se agitó durante la noche. La amida Sulfo-QSY21 se purificó por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 25:75 a 55:45 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización para obtener un polvo azul oscuro. El grupo protector Boc se eliminó posteriormente en TFA/DCM (1/1) durante 30 min, antes de la coevaporación con tolueno (3x). El residuo se disolvió en DMSO (250 j l) y se añadió Cy5-NHS (10,5 mg, 13,9 jmol, 2,1 equiv.) y DiPEA (12 jl, 72 jmol, 11 equiv.). Después de 4 h, purificación por HPLC (columna C18 de fase inversa preparatoria, CH3CN/H2O TFA al 0,1 %, 25:75 a 45:55 durante 20 min; 5 ml/min), seguido de liofilización, se obtuvo la sonda 8 como polvo azul oscuro (7,74 mg, 4,61 jmol, 71 % en 3 etapas). RMN 1 H (600 MHz, CD3CN) 88,12 - 8,08 (m, 1H), 8,01-7,93 (m, 2H), 7,89-7,85 (m, 2H), 7,75 (dd, J = 12,0, 1,5 Hz, 2H), 7,72 (dd, J = 8,4, 1,7 Hz, 1H), 7,69 (dd, J = 8,3, 1,2 Hz, 1H), 7,66 (s, 2H), 7,62 7,57 (m, 2H), 7,51 (dd, J = 8,4, 5,1 Hz, 2H), 7,46 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 7,41-7,35 (m, 3H), 7,24 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,21 7,14 (m, 6H), 7,13-7,09 (m, 6H), 7,05 (dd, J = 8,8, 4,6 Hz, 1H), 6,39 (t, J = 12,8 Hz, 1H), 6,11 (t, J = 12,6 Hz, 1H), 4,87 (c, J = 12,7 Hz, 2H), 4,83 (dd, J = 39,7, 14,1 Hz, 2H), 4,23-4,12 (m, 4H), 3,93 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 3,86 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 3,34 (dd, J = 6,7, 4,1 Hz, 2H), 3,28-3,15 (m, 9H), 3,04-2,92 (m, 3H), 2,80-2,74 (m, 1H), 2,45 (t, J = 11,9 Hz, 2H), 2,15-2,09 (m, 1H), 2,09-2,03 (m, 2H), 1,74-1,58 (m, 7H), 1,57 (s, 6H), 1,55 (s, 6H), 1,49 (dd, J = 15,1, 7,4 Hz, 4H), 1,35-1,22 (m, 7H), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,16-1,12 (m, 4H).
Cultivo celular y marcado de células vivas y lisados celulares
Las células RAW se cultivaron en DMEM (GIBCO) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés; GIBCO), 100 unidades/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina (GIBCO). Las células 4T1 (ATCC) se cultivaron en RPMI (GIBCO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; GIBCO), 100 unidades/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina (GIBCO). Todas las células se cultivaron en un incubador humidificado con un 5 % de CO2 a 37 °C. Para el marcado de células intactas, las células se expusieron a la sonda (500x en DMSO) en medios de cultivo y se incubaron durante 2 h a 37 °C, a menos que se indique lo contrario. Cuando se indicó, las células se preincubaron durante 1 h con el inhibidor JPM-OEt (500x en DMSO) o se expusieron a suero de ratón (1 j l de solución madre para sonda en DMSO que se añade a 9 j l de suero) durante 4 h antes de la adición a las células. Después del marcado, las células se lavaron con PBS y se volvieron a suspender en tampón de lisis hipotónica (PIPES 50 mM a pH 7,4, KCl 10 mM, MgCh 5 mM, EDTA 2 mM, DTT 4 mM, y 1 % de NP-40) y se pusieron en hielo durante 15 min, se centrifugó a 4 °C durante 30 min y se recogieron los sobrenadantes, determinándose la concentración de proteínas mediante un kit BCA (pierce). Se desnaturalizaron 40 jg de proteína total por adición de tampón de muestra SDS 4x y calentamiento durante 3 min a 100 °C, se reabsorbieron mediante s DS-PAGE (15%) y las proteasas marcadas se visualizaron barriendo el gel con un creador de imágenes Typhoon (GE Healthcare). Las intensidades de marcado se cuantificaron con el software Image J. Para el marcado de catepsinas en lisados celulares, se cosecharon las células, se lavaron con PBS y se volvieron a suspender en tampón citrato (tampón citrato 50 mM pH 5,5, DDT 5 mM, 0,5 % de CHAPS, 0,1 % de Tritón X). Tras 15 min en hielo y centrifugación a 4 °C durante 30 min, se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteínas mediante un kit BCA (pierce). Se expusieron 40 jg de proteína total a la sonda indicada (200x en DMSO) durante 1 h a 37 °C. Se añadió tampón de muestra SDS 4x y la proteína se desnaturalizó durante 3 min a 100 °C y se analizó como se ha descrito anteriormente. Para la microscopía de células vivas, se sembraron células RAW en medio completo sin rojo de fenol a una densidad de 1-105 células en una placa de fondo de cristal de 35 mm (in vitro scientific) y se cultivaron durante la noche. Las células se expusieron a DMSO o a una sonda de 1 jM (500x en DMSO) durante 2 horas. Durante la última hora, Lysotracker-green concentración final (200 nM, 1.000x en DMSO) se añadió a las células. En los casos indicados, las células se preincubaron durante 1 hora con el inhibidor JPM-OEt (500x en DMSO). Se tomaron imágenes de las células a 40x utilizando un microscopio confocal Zeiss Axiovert 200 M en los canales Cy5 y FITC.
Modelos animales
Todos los cuidados y experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices vigentes de los Institutos Nacionales de Salud y del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. A ratones hembra BALB/c (6-8 semanas de vida, The Jackson Laboratory) se les inyectó en la almohadilla adiposa número 2 y 7 1-105 células 4T1 (ATCC) en PBS bajo anestesia de isoflurano y se controló el crecimiento tumoral. 24 horas antes de la formación de imágenes, se eliminó el pelo de la región de interés con "loción Nair". El día 10, la sonda indicada (20 nmol; 0,8 nmol g_1) se administró a través de la vena de la cola en un volumen de 100 j l (20 % de DMSO en PBS). Después de la inyección, se tomaron imágenes no invasivas de los ratones en los puntos temporales indicados utilizando un sistema IVIS 100 (Xenogen). Las imágenes se analizaron con el software Living Image (PerkinElmer). Tras el último punto temporal, los ratones fueron anestesiados con isofluorano y sacrificados por dislocación cervical. Para las mediciones de fluorescencia ex vivo y la evaluación del perfil de marcado de la sonda in vivo se extirparon los tumores, se tomaron imágenes con un FMT 2500 (PerkinElmer) y se sonicó el tejido (1 min en
hielo) en tampón citrato (tampón citrato 50 mM, pH 5,5, DDT 5 mM, 0,5 % de CHAPS, 0,1 % de Tritón X). Tras la centrifugación a 4 °C durante 30 min, se recogieron los sobrenadantes y se determinó la concentración de proteínas mediante un kit BCA (pierce). Se desnaturalizaron 40 |jg de proteína total en tampón de muestra SDS durante 3 min a 100 °C y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Para la inmunofluorescencia, los tumores resecados se incubaron en una solución de PFA al 4 % en PBS durante 6 h a 4 °C, tras lo cual se incubaron durante la noche en una solución de sacarosa al 30 % y se congeló el tejido en medio OCT. Se fijaron secciones de 6 jm en acetona, se bloquearon con tampón de bloqueo PNB y se incubaron con CD68 anti-ratón de rata (1:1000; Serotec) durante toda la noche. Se incubó anti-rata de cabra conjugado con AlexaFluor-488 (1:500; Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las secciones se tiñeron con DAPI (2 jg/ml; Invitrogen) durante cinco minutos y, a continuación, se montaron en medio de montaje ProLong Gold (Invitrogen). A continuación, los tejidos se visualizaron con un microscopio Zeiss Axiovert 200M.
Claims (11)
1. Un compuesto para su uso en el marcado de una proteasa, que tiene la fórmula:
en la que D es un marcador fluorescente, en donde el marcador fluorescente es una fluoresceína, un verde Oregón, un bora-diaza-indeceno, una rodamina o un marcador de cianina;
L3 es un enlazador; y
Q es un inactivador, en donde el inactivador es una entidad química que modula la emisión de un fluoróforo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el marcador fluorescente es un marcador de cianina.
3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde el marcador de cianina es Cy5.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en donde R es QSY21 o sulfo-QSY21 y D es Cy5.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Q es QC-1.
8. Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en el marcado de una proteasa en un animal.
9. La composición de la reivindicación 8 para su uso en visualizar un tumor en un animal, comprendiendo el uso las etapas de:
administrar la composición al animal; y
medir una señal detectable generada en el animal a partir de una reacción de la composición con una catepsina cisteína proteasa; en donde la señal detectable está asociada a un tumor en el animal.
10. La composición para su uso de la reivindicación 9, en donde la señal detectable es una señal fluorescente.
11. La composición para su uso de la reivindicación 10, en donde la señal fluorescente se genera en un margen del tumor.
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