KR20150129004A - 활성 기반 프로브 화합물, 조성물, 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 시스테인 프로테아제의 표지화에 사용하기 위한 활성 기반 프로브 화합물이 제공된다. 화합물은 특이적인 표적화 요소를 통해 프로테아제에 표적화된다. 화합물은 검출가능 요소, 예를 들면, 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터를 추가로 포함한다. 일부 경우, 화합물은 프로테아제와의 반응에서 방출되는 ?칭 요소를 추가로 포함한다. 또한 화합물을 포함하는 조성물 및, 예를 들면, 동물에서의 프로테아제의 표지화 및 동물에서의 종양의 가시화에 화합물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

활성 기반 프로브 화합물, 조성물, 및 사용 방법{ACTIVITY-BASED PROBE COMPOUNDS, COMPOSITIONS, AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/794,296호의 이득을 청구하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
정부 지원 성명서
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된, 프로젝트 번호 5R01EB005011 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 특정한 권리를 갖는다.
현재 분자 영상 및 질환 모니터링의 영역에서 사용되기 위한 다양한 기술들이 개발되고 있다. 특히, 광학 형광 영상은 이의 감응성, 특이성, 및 비침습성을 고려할 때, 임상적 도구로서 유망해지기 시작한 접근법이다. 형광성 광 프로브의 특이성은 일부 경우에 이들의 생물학적 표적에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플에서 효소 표적에 의해 인식되는 광 프로브는 종종, 프로브의 형광이 효소 반응 상에서만 촉발되는 경우, 극도로 특이적인 신호를 발생시킨다. 이상적으로, 프로브의 형광 부분은 심지어 형광 신호가 효소 반응에 의해 활성화된 후에도 이의 효소 표적과 연관된 채로 남아 있다. 이러한 형광 활성 기반 프로브(ABP)는 프로테아제 표적에 대하여 기재되었다. 문헌 [Blum et al.(2009) PLoS One 4:e6374; doi: 10.1371/journal.pone.0006374]. ABP는 ABP와 효소의 활성 부위 촉매 모이어티(moiety)의 반응으로부터 야기된 영구적인 공유 결합에 의하여 단순한 형광원 기질과 구별될 수 있다. 형광 기질은 이들의 표적 효소에 의한 촉매 전환으로부터 야기된 신호 증폭으로 인하여 유리함을 나타낼 수 있음에도 불구하고, APB는 이들의 표적 효소의 공유 변형으로 인하여, 증가된 조직 흡수 역학 및 표적 조직에서 프로브의 연장된 체류를 나타내는 것으로 확인되었다.
형광계 광 프로브와 사용하기에 흥미있는 표적 효소는 그 중에서도 프로테아제, 및 특히 시스테인 프로테아제이다. 시스테인 카텝신은 건강 및 질환에서 중요한 역할을 하는 프로테아제 패밀리이다. 문헌 [Reiser et al.(2010) J. Clin. Invest. 120:3421-31]. 이들의 작용은 엔도솜 경로로 제한되는 것으로 기재되었지만, 이들이 매트릭스 분해의 주요 조절자라는 증거가 축적되고 있고, 이는 이들이 세포외 맥락에서 또한 작용하는 것을 제시한다. 문헌 [Bromme & Wilson(2011) Role of Cysteine Cathepsins in Extracellular Proteolysis. Biology of Extracellular Matrix Volume 2 23-51]. 추가로, 시스테인 카텝신 패밀리의 멤버는 여러 유형의 암 발달 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 문헌 [Mohamed & Sloane(2006) Nat. Rev. Cancer(2006) 6:764-75]; [Palermo & Joyce(2008) Trends Pharmacol. Sci. 29:22-8]. 게다가, 카텝신의 내인성 억제제인 시스타틴의 발현에서의 변화가 암에서 관찰되었다. 문헌 [Cox(2009) Cystatins and cancer. Front. Biosci. 14:463-74]. 이들 관찰은, 세포내 및 세포외 환경에서 잠재적인 변화와 결합하여, 고유한 종양 미세 환경의 맥락에서 이들 프로테아제의 활성의 직접적인 평가를 가능하게 하는 도구의 중요성을 강조한다. 시스테인 카텝신 패밀리를 표적화하는 몇몇 ABP가 합성되었다. 문헌 [Edgington et al.(2011) Curr. Opin. Chem. Biol. 15:798-805]. 특히, 형광적으로 ?칭(quenching)된 ABP(qABP)는 암의 비침습성 광학 영상 및 조직학, 세포 및 단백질 수준에서 후속적인 표적 카텝신의 특성화를 위한 강력한 도구임이 입증되었다. 문헌 [Blum et al.(2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77; Verdoes et al.(2012) Chem. Biol. 19:619-28].
2,3,5,6-테트라플루오로페녹시아릴메틸 케톤 반응성 기를 기반으로 한 디펩티딜 펩티다제 I의 활성 기반 억제제가 보고되었지만(Deu et al.(2010) Chem Biol. 17:808-819), 이들 억제제는 비-펩티드이고, 검출가능 기를 포함하지 않았다.
카텝신과 같은 활성 프로테아제를 함유하는 세포의 형광 영상에 사용하기 위한 ?칭된 활성 기반 펩티드 억제제가 보고되었다. 미국 특허 출원 공개 제2007/0036725호를 참조한다. 이들 프로브는 프로테아제 활성 부위에 결합되는 에스테르-결합된 아실옥시메틸 케톤 반응성 기를 사용한다. 일부 경우, 활성 기반 형광 프로브는 비-펩티드이다. 예를 들면, PCT 국제 공개 제WO 2012/118715호를 참조한다. 일부 경우, 활성 기반 프로브는 이들의 표적 효소를 방사성 표지화 하는데 사용된다. 예를 들면, PCT 국제 공개 제WO 2009/124265호를 참조한다.
그러나, 더 높은 세포 흡수를 갖고, 시스테인 프로테아제 활성의 더 넓은 스펙트럼을 표적화하며, 증가된 검출 감응성을 제공하는 시스테인 프로테아제의 신규한 활성 기반 형광 프로브에 대한 당해 분야의 요구가 남아 있다.
본 발명은 시스테인 프로테아제를 표지화하는 화합물, 조성물, 및 화합물 및 조성물의 사용 방법을 제공함으로써 이들 및 다른 문제를 해결한다.
특히, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 화학식 I로 표시된 바와 같은 화합물이 제공된다:
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
L은 에테르-결합된 이탈 요소이고;
T는 표적화 요소이고;
D는 검출가능 요소이다.
본 발명의 일부 양태에서, D 기는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터이다.
특정한 양태에서, D 기는 형광 표지이고, 심지어 보다 특히 플루오레세인, 오레곤 그린(Oregon green), 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지이다. 심지어 보다 특정한 양태에서, 형광 표지는 시아닌 표지, 예를 들면, Cy5이다.
본 발명의 일부 양태에서, T 기는 화합물을 시스테인 프로테아제에 표적화한다. 특정한 양태에서 T 기는 비-펩티드 표적화 요소, 예를 들면, 트리아졸 구조를 포함하는 다양한 특이적 화합물을 포함하는, 트리아졸 구조를 포함하는 요소이다. 특정한 기타 양태에서, T 기는 펩티드 표적화 요소이다.
일부 화합물 양태에서, D-T-기는
Figure pct00002
이고,
여기서, L1은 연결기이고;
AA1은 아미노산 측쇄이고;
U는 O, N, 또는 S이고;
R1은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환되고;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알크아미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알크아미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
특정한 화합물 양태에서, L1은 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 여기서 각각의 탄소 원자가 헤테로원자로 임의로 치환된다.
다른 특정한 화합물 양태에서, AA1은 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이다.
다른 특정한 화합물 양태에서, U는 O이다.
특정한 양태에서, D 기는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터이다.
특정 양태에서, D 기는 형광 표지이고, 심지어 보다 특정하게는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지이다. 심지어 보다 특정한 양태에서, 형광 표지는 시아닌 표지, 예를 들면, Cy5이다.
일부 화합물 양태에서, L 기는 ?처(quencher)를 포함하고, 보다 특정한 양태에서, L은 L2-L3-Q이고, 여기서 L2는 페녹시 기이고, L3은 연결기이고, Q는 ?처이다.
특정한 양태에서, L은
Figure pct00003
이고; 여기서 각각의 Y는 독립적으로 전자 끄는 기 또는 수소이다.
보다 특정한 양태에서, 각각의 Y는 독립적으로 할로겐 또는 수소이고, 심지어 보다 특정한 양태에서, L은
Figure pct00004
이고, L3은 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 여기서 각각의 탄소 원자가 헤테로원자로 임의로 치환된다.
심지어 보다 특정한 양태에서, L은
Figure pct00005
이고, 여기서 R은 QSY ?처이고, n은 1 내지 16의 정수이다.
바람직한 양태에서, QSY ?처는 친수성 QSY ?처이고, 보다 특정하게, 친수성 QSY ?처는 설포-QSY ?처이다.
본 발명의 일부 양태에서, 화학식 II로 표시된 바와 같은 화합물이 제공된다:
Figure pct00006
상기 화학식 II에서, D는 형광 표지이고, L3은 연결기이고, Q는 ?처이다.
보다 특정한 양태에서, 화학식 III으로 표시된 바와 같은 화합물이 제공된다:
Figure pct00007
상기 화학식 III에서, R은 QSY ?처이고, D는 시아닌 염료이고, m 및 n은 독립적으로 1 내지 16의 정수이다. R 기는, 이들 일부 양태에서, QSY21 또는 설포-QSY21일 수 있고, D 기는 Cy5일 수 있다.
본 발명의 특정한 화합물 양태는 하기를 포함한다:
Figure pct00008
여기서,
R = QSY21 및 n = 6;
R = 설포-QSY21 및 n = 6;
R = QSY21 및 n = 2; 및
R = 설포-QSY21 및 n = 2.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물에서 프로테아제 표지화에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 프로테아제를 표지화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계, 및 조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제의 반응으로부터 동물에서 발생된 검출가능 신호를 측정하는 단계로서, 검출가능 신호가 동물의 종양과 연관되는 것인 단계를 포함하는, 동물에서 종양을 가시화하는 방법을 제공한다.
특정한 방법 양태에서, 검출가능 신호는 형광 신호이다. 기타 특정한 방법 양태에서, 형광 신호는 종양 가장자리에서 발생된다.
도 1. a) 당해 작업에서 합성된 qABP GB137(1) 및 프로브 2 - 8의 구조. b) 1μM에서 살아있는 RAW 세포에서 프로브 1 - 8의 표지화 프로파일. c) 살아있는 RAW 세포에서 프로브 1 및 8의 농도 의존적 표지화. d) 5μM GB137(1)에 대한 살아있는 RAW 세포에서 프로브 1 - 8의 총 카텝신 표지화 강도.
도 2. a) pH 5.5에서 프로브 8에 의한 RAW 세포 용해물의 농도 의존적 표지화. b) 살아있는 RAW 세포에서 0.5μM 프로브 8의 표지화 시간 경과. c) JPM-OEt(50μM) 전처리 및 혈청 안정성에 의한 살아있는 RAW 세포에서 프로브 1 및 8의 표지화 억제. d) 1μM 프로브 8(패널의 제1 열)에 노출된 RAW 세포의 생세포 형광 현미경관찰 및 라이소트래커(lysotracker)(패널의 제2 열, 기준자 10㎛)와의 공존.
도 3. a) 프로브 8 및 1(우측 패널)이 주사된 종양 보유 마우스의 비-침습성 광학 영상 시간-경과. 하부 패널은 각 시간점에서 최적 형광 콘트라스트를 나타낸다. b) 프로브 1 또는 8로 처리된 마우스에 대한 시간-의존적 종양-특이적 형광(종양 - 배경)(n = 3; 데이타는 평균값 ± 표준 오차를 나타낸다). c) 생체외 종양 형광(상부 패널) 및 겔 내 형광 주사에 의하여 가시화된 SDS-PAGE 후, 생체내 형광 표지화된 단백질(하부 패널). d) 비침습성 광학 영상(a에 도시됨), 생체외 종양 영상, 및 겔 내 형광 표지화(c에 도시됨)의 말단점에서의 형광 강도. 프로브 1에 대한 강도가 도시된다(n = 3; 데이타는 평균값 ± 표준 오차). e) CD68 면역-염색(중간 패널) 및 핵 염색(DAPI - 우측 패널, 기준자 50㎛)에 의한, 프로브 8(좌측 패널) 처리된 종양 조직 부분의 형광 현미경관찰. f) CD68 면역-염색(녹색) 및 핵 염색(DAPI - 청색)에 의한 프로브 8(적색) 처리된 종양 조직 부분의 CLSM의 3D 재구성.
도 4. a) BMV109 표지화된 시스테인 카텝신의 면역침강. b,c) 살아있는 RAW 세포에서 프로브 1 - 8에 의한 농도 의존적 표지화. b) 및 c)에서 패널은 각각 동일한 겔에서 수행되었다.
도 5. a) 프로브 1, 2, 6 또는 8 주사 후 8시간에 종양 보유 마우스의 비-침습성 광학 영상. 하부 패널은 각 시간점에서 최적 형광 콘트라스트를 나타낸다. b) 프로브 1, 2, 6 또는 8로 처리된 마우스에 대한 시간-의존적 종양-특이적 형광(종양 - 배경)(n = 3; 데이타는 평균값 ± 표준 오차를 나타낸다). c) 세포외 종양 형광(상부 패널) 및 겔 내 형광 주사에 의해 가시화된 SDS-PAGE 후, 생체내 형광 표지된 단백질(하부 패널). d) 비침습성 광학 영상(a에 도시됨), 생체외 종양 영상, 및 겔 내 형광 표지화(c에 도시됨)의 말단점에서 형광 강도. 프로브 1에 대한 강도가 도시된다(n = 3; 데이타는 평균값 ± 표준 오차). e) CD68 면역-염색(두번째, 세번째, 및 네번째 컬럼) 및 핵 염색(DAPI - 세번째 및 네번째 컬럼, 기준자 50㎛)에 의한, 프로브 8(제1, 제3, 및 제4 컬럼) 처리된 종양 조직 부분의 형광 현미경관찰. 프로브가 없는 대조군(중간 열 패널) 및 면역-염색에 대한 동종형 대조군(하부 열 패널)이 도시된다. f) 프로브 8(Cy5) 및 CD68(FITC)에 대한 공존 다이어그램.
시스테인 카텝신은 정상 세포 생리학 뿐만 아니라 많은 인간 질환의 병리학 둘 다에 중요한 역할을 하는 프로테아제의 패밀리이다. 따라서, 다수의 기질 및 활성 기반 프로브(ABP) 부류가 이들 효소의 기능을 연구하기 위하여 개발되었다. 일부 양태에서, 페녹시메틸 케톤(PMK) 친전자체를 함유하는 ?칭된 형광 활성 기반 프로브의 부류가 본원에서 제공된다. 이들 시약은 이전에 보고된 ABP와 비교하여 극적으로 개선된 시험관내 및 생체내 표지화 특성을 야기하는 시스테인 카텝신에 대한 개선된, 넓은 반응성을 나타낸다. 프로브는 전례 없는 신호 강도 및 콘트라스트로 마우스에서 종양을 강조하는 것으로 본원에서 추가로 입증되었다. 이들 신규한 시약은 인간 질환의 다양한 모델에서 유기체, 조직, 세포 및 단백질 수준으로 시스테인 카텝신 연구를 가능하게 한다.
화합물
따라서, 일부 양태에서, 본 발명의 기재는 프로테아제 효소, 특히 카텝신을 표지화하는데 사용하기 위한 신규한 화합물을 제공한다. 본 발명의 화합물은 화학식 I의 화합물일 수 있다:
Figure pct00009
상기 화학식 I에서,
L은 에테르-결합된 이탈 요소이고;
T는 표적화 요소이고;
D는 검출가능 요소이다.
본 발명의 화합물의 표적화 요소, T는 펩티드 또는 비-펩티드 구조일 수 있고, 이는 바람직하게는 화합물을 시스테인 프로테아제에 표적화한다.
이러한 목적을 위하여 본 발명의 화합물 내로 유용하게 도입되는 비-펩티드 구조 요소의 비제한적인 예는 PCT 국제 공개 제WO2012/118715호에 기재되고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 바람직한 양태에서, 비-펩티드 표적화 요소는 트리아졸 구조를 포함한다.
비-펩티드 표적화 요소를 갖는 본 발명의 화합물의 특정한 예는
Figure pct00010
,
Figure pct00011
, 및
Figure pct00012
이다.
화합물을 시스테인 프로테아제, 및 특히, 시스테인 카텝신에 표적화하기 위하여 본 발명의 화합물 내로 유용하게 도입될 수 있는 펩티드 구조 요소의 비제한적인 예는 PCT 국제 공개 제WO2009/124265호에 기재되고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 화합물의 일부 양태에서, D-T-는
Figure pct00013
이고,
여기서, L1은 연결기이고;
AA1은 아미노산 측쇄이고;
U는 O, N, 또는 S이고;
R1은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환되고; 각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알크아미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알크아미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 직쇄 알킬 기, 측쇄 알킬 기, 사이클로알킬(지환족) 기, 알킬-치환된 사이클로알킬 기, 및 사이클로알킬-치환된 알킬 기를 포함하는 포화 지방족 기의 라디칼을 의미한다. 일부 양태에서, 직쇄 또는 측쇄 알킬은 이의 골격에 30개 이하의 탄소 원자를 갖고(예를 들면, 직쇄에 있어서 C1-C30, 측쇄에 있어서 C3-C30), 보다 특정하게 20개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 이와 같이, 일부 사이클로알킬은 이들의 고리 구조에 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖고, 보다 특정하게 고리 구조에 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다.
게다가, 명세서, 실시예, 및 청구범위 전체에서 사용되는 용어 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "치환되지 않은 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 다를 포함하는 것을 의도하고, 후자는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 치환하는 치환체를 갖는 알킬 모이어티를 의미한다. 이러한 치환체는, 예를 들면, 할로, 하이드록실, 카르보닐(예를 들면, 케토, 카르복시, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐(예를 들면, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 티오, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 적절한 경우, 탄화수소 쇄 상에서 치환된 모이어티는 그 자체가 치환될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 예를 들면, 치환된 알킬의 치환체는 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함), 및 실릴 기, 뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카르보닐(케톤, 알데히드, 카르복실레이트, 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등의 치환된 형태 및 치환되지 않은 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 하기 기재된다. 사이클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알콕시"는 이에 부착된 산소를 갖는 알킬 기, 특정한 양태에서, 저급 알킬 기를 의미한다. 대표적인 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, t-부톡시 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 지방족 기를 의미하고, "치환되지 않은 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 둘 다를 포함하는 것을 의도하고, 후자는 알케닐 그룹의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 치환하는 치환체를 갖는 알케닐 모이어티를 의미한다. 이러한 치환체는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에서 발생할 수 있다. 게다가, 이러한 치환체는 안정성이 제한되는 것을 제외하고, 상기 논의된 바와 같이, 알킬 기에 대하여 고려된 모든 것들을 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴 기에 의한 알케닐 기의 치환이 고려된다.
아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 같은 화학적 모이어티와 연결되어 사용되는 경우, 용어 "Cx-y"는 쇄에서 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어 "Cx-y-알킬"은 트리플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등과 같은 할로알킬 기를 포함하는, 쇄에서 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 직쇄 알킬 및 측쇄 알킬 기를 포함하는 치환되거나 치환되지 않은 포화 탄화수소 기를 의미한다. "C0-알킬"은 기가 말단 위치에 있는 경우, 수소를 나타내고, 내부인 경우, 결합을 나타낸다. 용어 "C2-y-알케닐" 및 "C2-y-알키닐"은 상기 기재된 알킬의 길이 및 가능한 치환체와 동일하지만, 각각 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유하는, 치환되거나 치환되지 않은 불포화 지방족 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬아미노"는 하나 이상의 알킬 기로 치환된 아미노 기를 이미한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬티오"는 알킬 기로 치환된 티올 기를 의미하고, 화학식 알킬-S-로 표시될 수 있다.
본원에서 사용되는 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 지방족 기를 의미하고, "치환되지 않은 알키닐" 및 "치환된 알키닐" 둘 다를 포함함을 의도하고, 후자는 알키닐 기의 하나 이상의 탄소 상에서 수소를 치환하는 치환체를 갖는 알키닐 모이어티를 의미한다. 이러한 치환체는 하나 이상의 삼중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에서 발생할 수 있다. 게다가, 이러한 치환체는 안정성이 매우 높다는 것을 제외하고, 상기 논의된 바와 같이, 알킬 기에 대하여 고려된 모든 것들을 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴 기에 의한 알키닐 기의 치환이 고려된다.
본원에서 사용되는 용어 "아미드"는 기
Figure pct00014
를 의미하고, 여기서 Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 기를 나타내거나, Rx 및 Ry는 이들에 결합된 N 원자와 함께 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
용어 "아민" 및 "아미노"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 치환되지 않은 아민 및 치환된 아민 둘 다 및 이의 염, 예를 들면,
Figure pct00015
또는
Figure pct00016
로 표시될 수 있는 모이어티를 의미하고, 여기서 Rx, Ry, 및 Rz는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 기를 나타내거나, Rx 및 Ry는 이들에 결합된 N 원자와 함게 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노알킬"은 아미노 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "아르알킬"은 아릴 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 치환되거나 치환되지 않은 단일-고리 방향족 기를 포함하고, 고리의 각각의 원자는 탄소이다. 특정한 양태에서, 고리는 5 내지 7원 고리이고, 보다 특정한 양태에서, 6원 고리이다. 용어 "아릴"은 또한 2개 이상의 탄소가 두 인접한 고리에 공통적이고, 하나 이상의 고리는 방향족이고, 예를 들면, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있는, 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함한다. 아릴 기는 벤젠, 나프탈렌, 프난트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다.
용어 "카르바메이트"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 기
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
를 나타내고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌 기를 나타내거나, Rx 및 Ry는 이들에 결합된 원자와 함께 고리 구조에 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본원에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 고리의 각각의 원자가 탄소인 비-방향족 포화 또는 불포화 고리를 나타낸다. 특정한 양태에서, 사이클로알킬 고리는 3 내지 10개의 원자, 보다 특정한 양태에서, 5 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "카르보네이트"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 기 -OCO2-Rx를 나타내고, 여기서 Rx는 하이드로카빌 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "카르복시"는 화학식 -CO2H로 표시된 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "에스테르"는 기 -C(O)ORx를 나타내고, 여기서 Rx는 하이드로카빌 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "에테르"는 산소를 통해 또 다른 하이드로카빌 기에 결합된 하이드로카빌 기를 의미한다. 따라서, 하이드로카빌 기의 에테르 치환체는 하이드로카빌-O-일 수 있다. 에테르는 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 에테르의 예는 헤테로사이클-O-헤테로사이클 및 아릴-O-헤테로사이클을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 에테르는 화학식 알킬-O-알킬로 표시될 수 있는 "알콕시알킬" 기를 포함한다.
용어 "구아니디닐"은 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 화학식
Figure pct00019
로 표시될 수 있고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "할로" 및 "할로겐"은 할로겐을 의미하고, 클로로, 플루오로, 브로모, 및 요오도를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤타르알킬" 및 "헤테로아르알킬"은 헤타릴 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 치환되거나 치환되지 않은 방향족 단일 고리 구조, 특정한 양태에서 5 내지 7원 고리, 보다 특정하게 5 내지 6원 고리를 포함하고, 이의 고리 구조는 1개 이상의 헤테로원자, 일부 양태에서 1 내지 4개의 헤테로원자, 보다 특정한 양태에서 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통적인 둘 이상의 사이클릭 고리를 갖고, 하나 이상의 고리는 헤테로방향족이고, 예를 들면, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함한다. 헤테로아릴 기는, 예를 들면, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 및 피리미딘 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 요소의 원자를 의미한다. 전형적인 헤테로원자는 질소, 산소, 및 황이다.
용어 "헤테로사이클릴", "헤테로사이클", 및 "헤테로사이클릭"은 이의 고리 구조가 1개 이상의 헤테로원자, 일부 양태에서 1 내지 4개의 헤테로원자, 보다 특정한 양태에서 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는, 치환되거나 치환되지 않은 비-방향족 고리 구조, 특정한 양태에서 3 내지 10원 고리, 보다 특정하게 3 내지 7원 고리를 의미한다. 용어 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통적인 둘 이상의 사이클릭 고리를 갖고, 하나 이상의 고리는 헤테로사이클릭이고, 예를 들면, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있는, 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함한다. 헤테로사이클릴 기는, 예를 들면, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 모르폴린, 락톤, 락탐 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 "하이드로카빌"은 =O 또는 =S 치환체를 갖지 않고, 전형적으로 하나 이상의 탄소-수소 결합 및 1차 탄소 골격을 갖지만, 임의로 헤테로원자를 포함할 수 있는, 탄소 원자를 통해 결합된 기를 의미한다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜, 및 트리플루오로메틸과 같은 기는 본원에서 목적을 위하여 하이드로카빌로서 간주되지만, 아세틸(이는 결합 탄소 상에 =O 치환체를 갖는다) 및 에톡시(이는 탄소가 아닌 산소를 통해 결합된다)와 같은 치환체는 아니다. 하이드로카빌 기는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드록시알킬"은 하이드록시 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 같은 화학적 모이어티와 연결되어 사용되는 경우, 용어 "저급"은 치환체에서 10개 이하, 특정한 양태에서, 6개 이하의 비-수소 원자가 존재하는 기를 포함하는 것을 의미한다. "저급 알킬"은, 예를 들면, 10개 이하의 탄소 원자, 특정한 양태에서 6개 이하의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기를 의미한다. 특정한 양태에서, 하이드록시알킬 및 아르알킬(이의 경우, 예를 들면, 알킬 치환체에서 탄소 원자를 세는 경우, 아릴 그룹 내의 원자는 세지 않는다)의 설명에서와 같이, 이들이 단독으로 또는 다른 치환체와 배합물로서 나타나는지 여부와 상관없이, 본원에서 정의된 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 알콕시 치환체는 각각 저급 아실, 저급 아실옥시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 및 저급 알콕시이다.
용어 "폴리사이클릴", "폴리사이클", 및 "폴리사이클릭"은 둘 이상의 원자가 2개의 인접한 고리에서 공통적이고, 예를 들면, 고리는 "융합된 고리"인, 둘 이상의 고리(예를 들면, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴)를 의미한다. 폴리사이클의 각각의 고리는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 특정한 양태에서, 폴리사이클의 각각의 고리는 고리에 3 내지 10개, 보다 특정하게 5 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "치환된"은 골격의 하나 이상의 탄소 상에 수소를 치환하는 치환체를 갖는 모이어티를 의미한다. "치환" 또는 "치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가에 따르고, 치환이 안정한 화합물, 예를 들면, 화합물이 사용되는 조건하에 재배열, 환형화, 제거 등과 같은 변형을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 야기하는 것을 조건을 전제로 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용되는 치환체를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용되는 치환체는 유기 화합물의 비환식 및 환식, 분지형 및 비분지형, 카르보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비-방향족 치환체를 포함한다. 허용되는 치환체는 하나 이상의 동일하거나 상이한 적절한 유기 화합물일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환체 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용되는 치환체일 수 있다. 치환체는 본원에 기재된 임의의 치환체, 예를 들면, 할로겐, 하이드록실, 카르보닐(예를 들면, 케토, 카르복시, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐(예를 들면, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 적절한 경우, 탄화수소 쇄 상의 치환된 모이어티가 그 자체로 치환될 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다.
"치환되지 않은"이라고 달리 특정하게 기재되지 않는 한, 본원에서 화학적 모이어티에 대한 언급은 치환된 변이를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, "아릴" 기 또는 모이어티에 대한 언급은 암시적으로 치환된 및 치환되지 않은 변이를 둘 다 포함한다.
용어 "설페이트"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 기 -OSO3H, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 의미한다.
용어 "설폰아미드"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 화학식
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
로 표시된 기를 의미하고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌을 나타낸다.
용어 "설폭사이드"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, -S(O)-Rx 기를 의미하고, 여기서 Rx는 하이드로카빌을 나타낸다.
용어 "설포" 또는 "설포네이트"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, -SO3H 기, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 의미한다.
용어 "설폰"은 당해 분야에서 인식된 바와 같고, -S(O)2-Rx 기를 의미하고, 여기서 Rx는 하이드로카빌을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "티오알킬"은 티올 기로 치환된 알킬 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 "티오에스테르"는 -C(O)SRx 또는 -SC(O)Rx 기를 의미하고, 여기서 Rx는 하이드로카빌을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "티오에테르"는 산소가 황으로 치환된 에테르와 동일하다.
용어 "우레아"는 당해 분야에서 인식된 바와 같고, 화학식
Figure pct00022
로 표시될 수 있고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카빌을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 표준 합성 화학 기술을 사용하여, 예를 들면, 하기 실시예 부분에 기재된 방법을 사용하여 합성된다. 기타 유용한 합성 기술이, 예를 들면, 문헌 [March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Ed.,(Wiley, 2013)]; [Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4th Ed, Vols. A and B(Plenum 2000, 2001)]; [Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27(Wiley, 2013)]; [Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals(Elsevier Science Publishers, 1989)]; [Organic Reactions, Volumes 1-81(Wiley, 2013)]; 및 [Larock's Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc., 1989)](이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다)에 기재된다. 화합물은 상업적인 공급원으로부터 일반적으로 입수가능하고 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 제조되는 출발 물질을 사용하여 일반적으로 합성된다. 예를 들면, 문헌 [Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27(Wiley, 2013)], 또는 문헌 [Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin]을 보충판을 포함하여 참조한다.
본 발명의 화합물의 구성분을 언급하는 경우, 용어 "로부터 유도된 잔기"는 공유 결합을 형성하는 제1 구성분 상의 제1 반응성 작용기 및 제2 구성분 상의 제2 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된 잔기를 기재하는데 사용될 수 있다. 예시적인 양태에서, 제1 구성분 상의 아민 기는 제2 구성분 상의 활성화된 카르복실 기와 반응하여 하나 이상의 아미드 모이어티를 포함하는 잔기를 형성할 수 있다. 제1 및 제2 반응성 작용기의 기타 순열은 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 아지드-치환된 제1 구성분과 알킨-치환된 제2 구성분의 구리-촉매된 또는 구리-무함유 반응은 잘 알려진 "클릭(click)" 반응을 통해 트리아졸-함유 잔기를 야기하고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 잘 이해될 것이다. 문헌 [Kolb et al.(2001) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40:2004; Evans(2007) Aus. J. Chem. 60:384]를 참조한다. "클릭" 반응을 사용하는 비-펩티드 형광 영상 프로브의 예시적인 발생 방법은 PCT 국제 공개 제WO 2012/118715호에 제공된다. 본 발명의 청구범위의 화합물의 이러한 발생 또는 개질 방법의 적응은 당해 분야의 기술에 속한다.
당해 분야의 숙련가는 보호기를 분자의 목적하는 위치에 가역적으로 부착하여 그 위치에서 다른 제제의 반응을 제어할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 보호기는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4th edition, by P.G.M. Wuts and T.W. Greene(Wiley-Interscience, 2006)]; 및 [Protective Groups, by P. Kocienski(Thieme, 2005)]을 참조한다.
본 발명의 화합물의 L1 기는 검출가능 요소, D를 표적화 요소에 연결하는 연결기이다. 당해 기는 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같은 임의의 적합한 연결기일 수 있다. L1 기는 바람직하게는 알킬 연결기이고, 여기서 알킬 연결기는 임의로 치환되고, 추가로 연결기 내의 탄소는 수득된 구조가 화학적으로 안정한 정도로 헤테로원자로 임의로 치환된다. 이러한 치환 및 교체는 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 에스테르, 아미드, 카르보네이트, 카르바메이트 등과 같은 연결기 내에 개입된 기를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직한 연결기는 5 내지 40개의 결합 길이 범위이고, 분지형, 직쇄이거나 고리를 함유할 수 있다. 연결기는 일부 경우에 이중 결합을 포함할 수 있다. 이들은 특정 요건에 따라 바람직한 바와 같이 소수성 또는 친수성일 수 있다.
L1 기 및 검출가능 요소, D 사이의 연결은 임의의 적합한 화학적 연결일 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 하고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 일부 경우에 특정한 화학적 기, 예를 들면, 아미노 기, 티올 기 등과 반응성인 전구체 모이어티를 검출가능 요소 내에 포함함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 이러한 상황에서 검출가능 요소는 표적화 요소 상의 당해 기의 반응을 통해 표적화 요소에 용이하게 부착될 수 있다. 이들 부착 유형은 따라서, 심지어 연결의 구조적 세부사항이 명백하게 보이지 않는 경우에도, 기재된 화합물의 범위 내에 속하는 것으로 이해된다.
본 발명의 화합물의 AA1 기는 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄일 수 있고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다. 바람직한 양태에서, AA1 기는 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 심지어 보다 바람직한 양태에서, AA1 기는 페닐알라닌 측쇄이다.
바람직한 화합물에서, U 기는 O이다.
본 발명의 화합물의 검출가능 요소는 특정한 양태에서 형광 표지, 방사성 표지, 킬레이터 등이다. 이들 화합물에서 사용하기에 적합한 방사성 표지 및 킬레이터의 예는 PCT 국제 특허 제2009/124265호에 기재된다.
본 발명의 화합물의 바람직한 양태에서, 검출가능 요소는 형광 표지이다. 당해 분야의 숙련가에게 알려진 바와 같이, 형광 표지는 입사 전자기 방사선의 흡수에 의해 촉진되는 경우에 전자기 방사선, 바람직하게는 가시광을 방출한다. 예를 들면, 아미노 기, 티올 기 등과 같은 반응성 기에 표지를 커플링하는데 유용한 반응성 모이어티를 갖는 표지를 포함하는 많은 다양한 형광 표지가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들면, 문헌 [The Molecular Probes ® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies]을 참조한다.
형광 표지의 예는 플루오레세인이고, 이는 면역형광 표지화에 광범위하게 사용된다. 플루오레세인은 495 나노미터에서 최대 흡수를 갖는 크산텐 염료이다. 관련 형광단은 플루오레세인의 플루오르화된 유도체인 오레곤 그린이다.
본 발명의 화합물의 화합물의 검출가능 요소에서 사용되는 형광 표지는 일부 경우에 pH-의존적 형광단일 수 있다. 예를 들면, 하기 나타낸 화합물 표지된 "LES12" 및 "LES13"에서 사용되는 바와 같은 이러한 형광 표지는 표지의 환경의 pH에 의존적인 형광 스펙트럼을 나타내고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것인 바와 같고, 따라서 반응 후 표지의 환경에 대한 정보, 예를 들면, 반응성 화합물에 의해 표지된 프로테아제의 위치 또는 유형에 대한 정보를 보고하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 검출가능 요소에 유용하게 포함된 다양한 표지의 pH-의존적 형광은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [The Molecular Probes ® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies]을 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 화합물에 사용되기에 적합한 다른 예시적인 형광 표지는 보라-디아자-인데센, 로다민, 및 시아닌 염료이다. 특히, 보라-디아자-인데센 염료는 BODIPY® 염료로 알려진 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센이 대표적이다. 이들 염료의 다양한 유도체는 공지되어 있고 본 발명의 화합물에서 검출가능 요소로서 사용되기에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들면, 문헌 [Chen et al.(2000) J. Org. Chem. 65:2900-2906]을 참조한다.
본 발명의 화합물에서 유용하게 사용되는 형광 표지의 또 다른 부류는 Li-Cor(www.licor.com)로부터 입수가능한 IRDye 적외선 염료이다. 이들 염료의 비제한적인 예는 IRDye 800CW, IRDye 680RD, IRDye 680LT, IRDye 750, IRDye 700DX, IRDye 800RS, 및 IRDye 650이다.
로다민 염료는 로다민 고리 구조를 기반으로 한 염료 부류이다. 로다민은, 그 중에서도, 단백질 컨쥬게이트, 특히 항체 및 아비딘 컨쥬게이트의 제조를 위한 매우 흔한 형광단인 테트라메틸로다민(TMR), 및 올리고뉴클레오티드 표지화 및 자동 핵산 서열분석에 일반적으로 사용되는 염료인 카르복시 테트라메틸-로다민(TAMRA)을 포함한다. 로다민은 플루오레세인계 형광단에 대한 천연 보충제로서 확립되어 있고, 이는 더 긴 파장 방출 최대를 제공하고 따라서 다색성 표지화 또는 염색에 기회를 제공한다.
또한 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료로 공지된 형광단의 설포네이트화된 로다민 시리즈가 로다민 염료 군에 포함된다. 현대 형광단 기술의 극적인 발전은 알렉사 플루오르 염료에 의해 예시화되고, 이는 분자 프로브(Molecular Probe)에 의해 도입되었다. 이들 설포네이트화된 로다민 유도체는 스펙트럼 유사 프로브 보다 더 강한 형광 방출에 대하여 더 높은 양자 수율을 나타내고, 개선된 광안정성, 일반 레이저선에 맞는 흡수 스펙트럼, pH 무감응성, 및 높은 정도의 수용성을 포함하는 추가의 몇몇 개선된 특징을 갖는다.
시아닌 염료는 관련 염료의 패밀리, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 및 이들의 유도체에 상응하고, 이는 다양한 탄소 수의 폴리알켄 브릿지를 통해 연결되는 2개의 방향족 단위를 갖는 부분적 포화 인돌 질소 헤테로사이클릭 핵을 기반으로 한다. 이들 프로브는 많은 전통적인 염료, 예를 들면, 플루오레세인 및 테트라메틸로다민과 유사한 형광 여기 및 방출 프로파일을 나타내지만, 개선된 수용성, 광안정성, 및 더 높은 양자 수율을 나타낸다. 대부분의 시아닌 염료는 pH 및 유기 봉입제에 덜 민감한 이들의 형광 방출 강도를 제공하는, 전통적인 카운터파트 보다 더 환경적으로 안정하다. 알렉사 플루오르와 유사한 방식으로, 합성 염료의 Cy 시리즈의 여기 파장은 특히 일반 레이저 및 아크-방전 공급원과 사용을 위해 조정되고, 형광 방출은 전통적인 필터 조합에 의해 검출될 수 있다. 시아닌 염료는 반응성 염료 또는 형광단으로서 용이하게 입수가능하다. 시아닌 염료는 일반적으로 알렉사 플루오르 패밀리의 멤버 보다 넓은 흡수 스펙트럼을 갖고, 이는 공초점 현미경관찰을 위한 레이저 여기 공급원의 선택에 있어서 이들을 어느 정도 더 다용도로 만든다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물의 검출가능 요소는 시아닌 염료, Cy5이다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물의 검출가능 요소 내에서, 다중 형광 표지, 방사성 표지, 킬레이터 등을 포함하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면, 하기 예시적인 화합물 표지된 "LES12" 및 "LES13"은 단일 검출가능 요소 내에서 2개의 상이한 형광 표지를 포함한다. 이러한 다중 표지화는 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 것인 일반적인 커플링 화학을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, "LES12" 및 "LES13" 화합물 중의 형광 표지는 "클릭" 화학을 사용하여 커플링되었다. "클릭" 화학에 의해 검출가능 요소 내로 다중 표지를 함유하는 화합물의 합성에서 유용한 중간체 화합물의 예는 하기 나타낸다("WL938"). 당해 화합물은 아지도 기를 함유하고, 따라서 "클릭" 반응에서 적합한 알킬-함유 시약과 용이하게 반응할 수 있다. 목적하는 경우, 알킨 및 아지도 기의 위치는 또한 반대일 수 있고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것이다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I의 화합물이고, 여기서 T는 펩티드 표적화 요소이고, 화합물은 추가로 하기 번호 문장에서 설명된다:
1. D-T-가 짧은 검출가능 펩티드 기이고; L이 에테르-결합된 이탈 요소인, 화학식 I의 화합물.
2. 1번 문장에 있어서, 검출가능 펩티드 기가 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 함유하는 것인 화합물.
3. 2번 문장에 있어서,
D-T가
Figure pct00023
,
Figure pct00024
, 또는
Figure pct00025
이고;
각각의 AA1, AA2, AA3, 및 AA4가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 독립적으로 수소 또는 R1이고;
RB가 수소, R1, -C(O)R1, -C(O)OR1, -C(O)SR1, 또는 -C(O)N(R1)(RA)이고;
R1이 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 보호기, 또는 -L1-D이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환되고;
각각의 A가 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알크아미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알크아미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이고;
L1이 연결기인 화합물.
4. 3번 문장에 있어서,
각각의 RA가 수소이고;
RB가 -C(O)OR1인 화합물.
5. 3번 문장에 있어서,
D-T-가
Figure pct00026
이고;
각각의 AA1 및 AA2가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
6. 3번 문장에 있어서,
D-T-가
Figure pct00027
이고;
각각의 AA1, AA2, 및 AA3이 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
7. 3번 문장에 있어서,
D-T가
Figure pct00028
이고;
각각의 AA1, AA2, AA3, 및 AA4가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
8. 3번 문장에 있어서, L1이 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 각각의 탄소 원자가 헤테로원자로 임의로 치환되는 것인 화합물.
9. 3번 문장에 있어서, RB가 -C(O)OR1인 화합물.
10. 3번 문장에 있어서, D는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터인 화합물.
11. 10번 문장에 있어서, D는 형광 표지인 화합물.
12. 11번 문장에 있어서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지인 화합물.
13. 12번 문장에 있어서, 형광 표지는 시아닌 표지인 화합물.
14. 13번 문장에 있어서, 시아닌 표지는 Cy5인 화합물.
본 발명의 화합물의 이들 양태에서 AA1, AA2, AA3, 및 AA4 기는 독립적으로 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것인 임의의 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄, 또는 "-L1-D" 기일 수 있다. 바람직한 양태에서, 기는 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 심지어 보다 바람직한 양태에서, 기는 페닐알라닌으로부터의 측쇄이다. 다른 바람직한 양태에서, 기는, 임의의 조합으로, 산성 아미노산 잔기로부터의 측쇄, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로부터의 측쇄, 또는 알킬 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 또는 기타 이러한 아미노산 잔기로부터의 측쇄이다. 기타 아미노산 잔기, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴 등으로부터의 측쇄가 본 발명의 화합물에서 또한 바람직하다.
AA1, AA2, AA3, 또는 AA4 기가 "-L1-D" 기인 화합물의 양태에서, L1 연결기 구성분은 아미노산 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 리신 잔기는 적합하게 활성화된 검출가능 요소와의 반응을 위한 아미노-알킬 기를 편리하게 제공한다.
"짧은" 검출가능 펩티드 기는 본원에서 10개 이하의 아미노산 잔기를 갖는 검출가능 펩티드 기로서 정의된다.
본 발명의 에테르-결합된 이탈 요소, L은 이들의 표적 효소 활성 부위와 화합물의 반응성에 영향을 주고, 또한 특정 효소에 대한 표적화 특이성에 영향을 미칠 수 있다. 이들 화합물에서 이탈 요소의 에테르 결합은 아실옥시메틸 케톤(AOMK)과 같은 기타 활성 기반 프로브의 에스테르 결합과 대조를 이룬다. 에테르-결합된 이탈 요소, 예를 들면, 페놀 에테르-결합된 이탈 요소는 에스테르-결합된 또는 기타 유형의 프로브 보다 개선된 생체내 안정성을 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물의 에테르-결합된 이탈 요소는 ?처를 포함한다. 용어 "?처"는 형광단의 방출을 조절하는 화학 물질을 의미한다. 일부 양태에서, ?처는 그 자체로 이의 형광이 이로 인해 ?칭되는 표지와 구별되는 특유의 파장에서 형광을 방출하는 형광 분자일 수 있다. 따라서, 형광단은 또 다른 염료와 적절하게 커플링되는 경우, ?처로서 작용할 수 있고, 그 반대로 가능하다. 이러한 상황에서, 공여체 표지의 것과 상이한 파장의 수용체 분자로부터의 형광 증가는 이의 환경, 예를 들면, 표적 효소의 활성 부위와 표지된 화합물의 상호작용을 개별적으로 보고할 수 있다. 일부 경우, ?처는 그 자체로 형광성이 아니다(즉, ?처는 "다크 수용체"이다). 이러한 ?처는, 예를 들면, 다브실, 메틸 레드, QSY 디아릴로다민 염료 등을 포함한다. 특히, 다브실(4-디메틸아미노-페닐아조)벤조산)은 많은 분석에서, 예를 들면, DNA 검출을 위하여 "분자 비콘"에서 사용되는 통상적인 다크 ?처이다. 미국 특허 제5,989,823호. "블랙 홀 ?처(Black Hole Quencher)"로서 언급되는 BHQ 시리즈의 디아조 염료는 많은 형광단의 방출과 잘 겹치는 넓은 흡수 범위를 제공한다. PCT 국제 공개 제WO 01/86001호. 분자 프로브로부터의 QSY 시리즈 염료는 많은 생물검정에서 ?칭 시약으로 광범위하게 사용된 다크 ?처 염료의 또 다른 예이다. 미국 특허 제6,399,392호.
QSY 7은 특히 비형광성 디아릴로다민 유도체이다. 미국 특허 출원 공개 제2005/0014160호. QSY21은 가시 스펙트럼에서 강한 흡수를 갖는 비형광성 디아릴로다민 발색단이고, 효과적인 형광 ?처이다. 형광단/?처 쌍은 미국 특허 출원 공개 제2004/0241679호에 추가로 설명된다.
IRDye QC-1(Li-Cor로부터 입수가능)은 본 발명의 화합물에서 ?처로서 사용되기에 적합한 비형광성 염료의 또 다른 예이다. 이는 효과적으로 가시 영역부터 근적외선까지의 파장 범위를 포함하는 광범위한 형광단으로부터 형광을 ?칭한다.
본 발명의 화합물의 일부 양태에서, 이탈기 요소, L은 L2-L3-Q이고, 여기서 L2는 페녹시 기이고, L3은 연결기이고, Q는 ?처이다. 이탈기 요소는, 예를 들면,
Figure pct00029
일 수 있고, 여기서 각각의 Y는 독립적으로 전자 끄는 기 또는 수소이다. 이러한 화합물에서, 각각의 Y는 독립적으로 할로겐 또는 수소일 수 있다. 특정한 화합물에서, L 기는, 예를 들면,
Figure pct00030
이다.
상기 기재된 이탈 요소의 L3 연결기는 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 바와 같은 임의의 적합한 연결기이다. 특히, L 연결기는, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 L1 기일 수 있다.
다른 특정한 화합물에서, L 기는, 예를 들면,
Figure pct00031
이고, 여기서 R은 QSY ?처이고, n은 1 내지 8의 정수이다. 특정한 양태에서, QSY ?처는 친수성 ?처, 예를 들면, 설포-QSY ?처이다.
일부 특정한 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 II의 구조를 갖는다:
Figure pct00032
일부 특정한 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 III의 구조를 갖는다:
Figure pct00033
이들 양태에서, m 및 n은 독립적으로 1 내지 16의 정수이다.
일부 양태에서, R은 QSY21 또는 설포-QSY21이고, D는 Cy5이다.
본 발명의 특정한 비제한적인 화합물 양태는 하기를 포함한다:
Figure pct00034
여기서,
R = QSY21 및 n = 6;
R = 설포-QSY21 및 n = 6;
R = QSY21 및 n = 2; 및
R = 설포-QSY21 및 n = 2.
일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 화학식 IV의 구조를 갖는 화합물이다:
Figure pct00035
상기 화학식 IV에서, T은 펩티드 표적화 요소이고, 화합물은 하기 번호 문장에서 추가로 설명된다:
1. D-T-가 짧은 검출가능 펩티드 기이고;
L3이 연결기이고;
Q가 ?처인, 화학식 IV의 화합물.
2. 1번 문장에 있어서, 검출가능 펩티드 기가 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 함유하는 것인 화합물.
3. 2번 문장에 있어서,
D-T가
Figure pct00036
,
Figure pct00037
, 또는
Figure pct00038
이고;
각각의 AA1, AA2, AA3, 및 AA4가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 독립적으로 수소 또는 R1이고;
RB가 수소, R1, -C(O)R1, -C(O)OR1, -C(O)SR1, 또는 -C(O)N(R1)(RA)이고;
R1이 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 보호기, 또는 -L1-D이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환되고;
각각의 A가 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알크아미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알크아미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이고;
L1이 연결기인 화합물.
4. 3번 문장에 있어서,
각각의 RA가 수소이고;
RB가 -C(O)OR1인 화합물.
5. 3번 문장에 있어서,
D-T-가
Figure pct00039
이고;
각각의 AA1 및 AA2가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
6. 3번 문장에 있어서,
D-T-가
Figure pct00040
이고;
각각의 AA1, AA2, 및 AA3이 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
7. 3번 문장에 있어서,
D-T가
Figure pct00041
이고;
각각의 AA1, AA2, AA3, 및 AA4가 독립적으로 아미노산 측쇄 또는 -L1-D이고;
각각의 RA가 수소인 화합물.
8. 3번 문장에 있어서, L1이 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 각각의 탄소 원자가 헤테로원자로 임의로 치환되는 것인 화합물.
9. 3번 문장에 있어서, RB가 -C(O)OR1인 화합물.
10. 3번 문장에 있어서, D는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터인 화합물.
11. 10번 문장에 있어서, D는 형광 표지인 화합물.
12. 11번 문장에 있어서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지인 화합물.
13. 12번 문장에 있어서, 형광 표지는 시아닌 표지인 화합물.
14. 13번 문장에 있어서, 시아닌 표지는 Cy5인 화합물.
본 발명의 화합물의 이러한 양태에서 AA1, AA2, AA3, 및 AA4 기는 당해 분야의 숙련가에게 이해될 바와 같은 독립적으로 임의의 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄, 또는 "-L1-D" 기일 수 있다. 바람직한 양태에서, 기는 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 심지어 보다 바람직한 양태에서, 기는 페닐알라닌으로부터의 측쇄이다. 다른 바람직한 양태에서, 기는, 임의의 조합으로, 산성 아미노산 잔기로부터의 측쇄, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기로부터의 측쇄, 또는 알킬 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 또는 기타 이러한 아미노산 잔기로부터의 측쇄이다. 기타 아미노산 잔기, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴 등으로부터의 측쇄가 또한 본 발명의 화합물에서 바람직하다.
AA1, AA2, AA3, 또는 AA4 기가 "-L1-D" 기인 화합물 양태에서, L1 연결기 구성분은 아미노산 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 리신 잔기는 적합하게 활성화된 검출가능 요소와의 반응을 위한 아미노-알킬 기를 편리하게 제공한다.
"짧은" 검출가능 펩티드 기는 본원에서 10개 이하의 아미노산 잔기를 갖는 검출가능 펩티드 기로서 정의된다.
본 발명의 다른 특정한 비제한적인 화합물 양태는 하기를 포함한다:
Figure pct00042
Figure pct00043
약제학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 동물에서 조직 영상에 유용하고, 동물에서 효소, 예를 들면, 프로테아제 효소의 활성을 평가하는데 추가로 유용하다. 특히, 카텝신을 표지화하는 본 발명의 화합물에 있어서, 약제학적 조성물은 암 세포의 비-침습성 광학 영상을 위한 도구로서 유용하게 제공된다.
약제학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 수용액, 예를 들면, 물 또는 생리학적 완충 식염수 또는 기타 용매 또는 비히클, 예를 들면, 글리콜, 글리세롤, 오일, 예를 들면, 올리브유 또는 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 특정한 양태에서, 이러한 약제학적 조성물이 인간 투여용인 경우, 수용액은 발열원 무함유, 또는 실질적으로 발열원 무함유이다. 부형제는, 예를 들면, 제제의 지연된 방출에 영향을 주거나, 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기를 선택적으로 표적화하기 위하여 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 투여 단위 형, 예를 들면, 정제, 캡슐, 스프링클 캡슐, 과립, 분말, 시럽, 좌제, 주사 등일 수 있다. 조성물은 또한 경피 전달 시스템, 예를 들면, 피부 패치로 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들면, 본 발명의 화합물의 흡수를 안정화시키고 증가시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용되는 제제를 함유할 수 있다. 이러한 생리학적으로 허용되는 제제는, 예를 들면, 탄수화물, 예를 들면, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란, 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트화제, 저분자량 단백질 또는 기타 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 생리학적으로 허용되는 제제를 포함하여 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은, 예를 들면, 조성물의 투여 경로에 따라 좌우된다. 약제학적 조성물은 또한, 예를 들면, 그 안에 본 발명의 화합물을 도입할 수 있는 리포좀 또는 다른 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 리포좀, 예를 들면, 인지질 또는 기타 지질로 이루어진 리포좀은 비교적 제조 및 투여가 단순한 비독성, 생리학적으로 허용되는 대사가능 담체이다.
본원에서 사용되는 구 "약제학적으로 허용되는"는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 문제점 없이, 합리적인 이득/위험 비율에 상응하고, 현명한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하에 사용하기에 적합한 이러한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여형을 의미한다.
본원에서 사용되는 구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 장기, 또는 신체의 일부로부터 다른 장기, 또는 신체의 일부로 옮기거나 수송하는데 포함되는, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클, 예를 들면, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 다른 제형화 성분과 혼화성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로서 제공되는 물질의 일부 예는 (1) 당, 예를 들면, 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예를 들면, 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 겔라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들면, 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예를 들면, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들면, 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들면, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예를 들면, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원-무함유 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약제학적 제형에서 사용되는 기타 비독성 혼화성 성분을 포함한다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed.(Alfonso R. Gennaro ed.), 2000]을 참조한다.
본 발명의 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 임의의 많은 투여 경로에 의해, 예를 들면, 경구적으로(예를 들면, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액과 같은 드렌치(drench), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트); 설하로; 항문, 직장, 또는 질로(예를 들면, 페서리, 크림, 또는 폼으로서); 비경구적으로(예를 들면, 무균 용액 또는 현탁액으로서 근육내, 정맥내, 피하 또는 척수강내를 포함하여); 코로; 복강내로; 피하로; 경피로(예를 들면, 피부에 적용되는 패치로서); 또는 국소적으로(예를 들면, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이로서) 대상에게 투여될 수 있다. 화합물은 또한 흡입용으로 제형화될 수 있다. 특정한 양태에서, 본 발명의 화합물은 단순하게 살균수에 용해되거나 현탁될 수 있다. 동일한 것에 적합한 적절한 투여 경로 및 조성물의 세부 사항은, 예를 들면, 미국 특허 제6,110,973호; 제5,763,493호; 제5,731,000호; 제5,541,231호; 제5,427,798호; 제5,358,970호; 및 제4,172,896호, 뿐만 아니라 그 안에 기재된 특허에서 찾을 수 있다.
표지화 및 가시화 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 종양을 가시화하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계, 및 조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제의 반응으로부터 동물에서 발생된 검출가능 신호를 측정하는 단계로서, 검출가능 신호가 동물의 종양과 연관되는 것인 단계를 포함하는, 동물에서 종양의 가시화 방법을 제공한다.
방법의 일부 양태에서, 검출가능 신호는 형광 신호이다. 일부 양태에서, 형광 신호는 종양 가장자리에서 발생된다.
동물에게 펩티드 조영제의 투여는 당해 분야의 숙련가에게 잘 이해된다. 임의의 적합한 투여 수단이 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주됨에도 불구하고, 바람직한 양태에서, 제제는 주사로 투여된다.
본 발명의 방법은 동물에서의 프로테아제, 특히 시스테인 프로테아제의 표지화 및 가시화에 관한 것이다. 적합한 동물은 특히 종양 세포에서 시스테인 프로테아제를 발현하는 동물을 포함한다. 바람직한 양태에서, 동물은 포유동물이다. 매우 바람직한 양태에서, 동물은 인간이다. 다른 바람직한 양태에서, 동물은 가축동물 또는 애완동물이다.
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 동물에서 발생한 검출가능 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 검출가능 신호를 측정하는 방법은 영상 방법, 예를 들면 형광 영상 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, 형광 영상 시스템은, 예를 들면, 제노겐(Xenogen) IVIS 100 시스템이지만, 임의의 적합한 영상 시스템이 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 개작이 본 발명의 범위 또는 이의 임의의 양태를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 본 발명의 상세한 설명은 이제 본 발명의 제한을 의도하지 않고 설명만을 목적으로 본원에 포함되는 하기 실시예를 참조하여 더 명백하게 이해될 것이다.
[ 실시예 ]
신규한 페녹시메틸 케톤(PMK) 친전자체를 함유하는 ?칭된 형광 시스테인 카텝신 영상 프로브의 합성 및 특성화
당해 작업의 목표는 암의 비침습성 광학 영상에 사용될 수 있는 기존의 qABP와 비교하여 전체적으로 개선된 생체내 특성을 갖는 qABP를 개발하는 것이었다. 따라서 프로브의 주요 세 요소인 ?처, 연결기 및 친전자성 "탄두"를 최적화하기로 결정하였다. 데이타에 보고된 시스테인 카텝신 qABP의 가장 큰 단점 중 하나는 비교적 불량한 수성 용해도이다. 따라서 설포네이트 기는 수용성 및 이에 따라 프로브의 생-분포를 개선시키기 위하여 QSY21 ?처로 도입되었다(Xing et al.(2005) J. Am. Chem. Soc. 127:4158-9). 또한 qABP의 친유성을 감소시키기 위하여 친전자체와 ?처를 묶는 스페이서의 길이를 다양하게 하였다. 최종적으로, 가능한 카텝신 표적의 범위를 증가시키기 위하여 신규한 친전자체를 탐구하였다. 시스테인 카텝신 패밀리의 몇몇 멤버는 다양한 암에서 조절되기 때문에(Mohamed & Sloane(2006) Nat. Rev. Cancer(2006) 6:764-75), 프로브가 시스테인 카텝신 활성의 넓은 스펙트럼을 표적화하는 경우, 종양에서 더 밝은 형광 신호가 예상될 것이다. 더 큰 pan-반응성의 프로브를 수득하기 위하여, 친전자체의 크기를 감소시키고, 반응성을 증가시켰다. 2,3,5,6-테트라플루오로 치환된 페녹시메틸 케톤(PMK) 친전자체는 2,6-디메틸벤조산 유도된 아실옥시메틸 케톤(AOMK)과 비교하여 시스테인 디펩티딜 아미노펩티다제에 대한 더 큰 반응성을 갖는 것으로 이전에 나타났다. 문헌 [Deu et al.(2010) Chem Biol. 17:808-819]. 시스테인 카텝신의 일부 결합 홈이 입체 장애를 갖기 때문에, 더 작은 크기의 PMK는 또한 pan-반응성을 증가시킬 수 있다. 문헌 [Blum et al.(2005) Nat. Chem. Biol. 1:203-9]; [Blum et al.(2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77]; [Paulick & Bogyo(2011) ACS Chem. Biol. 6:563-72]. 추가로, 페놀 에테르는 에스테라제에 의해 분해될 수 있는 에스테르 결합을 함유하는 AOMK 친전자체와 비교하여 더 큰 생체내 안정성을 갖는 것으로 예상된다.
당해 연구를 위하여 출발점으로서 qABP GB137(1)의 7 동족체(2 - 8)를 합성하였다. 문헌 [Blum et al.(2007) Nat. Chem. Biol. 3:668-77](도 1a). 이들 화합물은 2종의 친전자체, 2종의 ?처 및 2종의 연결기 길이의 모든 조합을 나타낸다. 모든 프로브는 하기 반응식 1과 연관된 설명에 기재된 바와 같은 과정을 기반으로 한, 최적화된 용액 화학을 사용하여 합성하였다. 온전한 RAW 264.7 세포(마우스 백혈병 단핵구 대식 세포주)를 표지화함으로써 프로브의 특이성 및 효능을 초기에 시험하였다(도 1b). 몇가지 경향이 프로브의 특성에서 관찰되었다. 모든 설포-QSY21 작용화된 qABP(2, 4, 6 및 8)는 더 소수성인 QSY21 함유 프로브(1, 3, 5 및 7)와 비교하여 더 강한 전체 카텝신 표지화를 나타냈다. 흥미롭게도, 헥실부터 에틸 연결기까지의 스페이서 길이의 변화는 표지화 프로파일에 극적인 영향을 미치지 않는다. 아마 대부분의 현저한 관찰은 PMK 친전자체를 갖는 qABP가 이들의 AOMK 카운터파트와 비교하여 더 넓은 시스테인 카텝신 표지화 프로파일을 나타냈다는 것이었다. 프로브 5 - 8은 강력한 카텝신 X 표지화를 나타냈고, 설포-QSY21 작용화된 프로브 6 및 8은 카텝신 L의 고분자량 프로-폼(pro-form)을 표지화할 수 있었다. 형광 표지된 카텝신의 확인은 면역침강에 의해 결정되었다(도 4a). 살아있는 RAW 세포에서 적정 표지화 실험을 수행한 바, 몇몇 다른 흥미로운 경향이 관찰되었다(도 1c,d. 도 4b,c). 가장 소수성인 qABP(1 및 5)는 0.5μM에서 감소된 최대 표지화 강도에 도달하고, 이는 이들의 감소된 수용성이 더 높은 농도에서 프로브의 침강을 야기함을 제안한다. 모든 프로브는 이들의 헥실 함유 카운터파트와 비교하여 더 밝은 표지화를 제공하는 에틸 스페이서를 갖고, 더 짧은 스페이서 길이가 유리한 것으로 보인다. AOMK를 PMK와 비교하는 경우, 감응성에서 분명한 차이가 관찰된다. AOMK qABP는 우선적으로 카텝신 S 및 L를 표지화하고, 오직 더 높은 농도에서만 카텝신 B를 표지화한다. 심지어 선행 연구가 몇몇 다른 관련 AOMK는 당해 표적을 표지화할 수 없다고 나타냈음에도 불구하고(Paulick & Bogyo(2011) ACS Chem. Biol. 6:563-72), 놀랍게도 AOMK qABP 2 - 4는 카텝신 X를 표지화한다. PMK qABP는 또한 모든 표적 시스테인 카텝신을 동일한 강도로, 심지어 더 낮은 프로브 농도에서도, 표지화하였다. 함께, 이들 실험은 증가된 친수성이 표지화 강도를 개선시키고 신규한 PMK qABP가 더 넓고, 더 많은 pan-시스테인 카텝신 표지화 프로파일을 갖는 것을 입증한다.
PMK qABP 8이 전체적인 표지화 강도 및 넓은 카텝신 반응성 면에서 가장 최적이었기 때문에, 추가의 생체내 프로파일에 있어서 당해 프로브로 진행하기로 결정하였다. 추가로 표적 선택성을 정의하기 위하여, pH 5.5에서 qABP 8의 농도 증가하에 RAW 세포 용해물을 표지화하였다. 이들 결과는 5nM 만큼 낮은 농도에서 관찰된 표지화의 카텝신 B 및 X를 향하여 프로브가 가장 강력함을 입증한다. 그러나, 모든 카텝신(B, S, L, X)의 표지화는 프로브 500nM에 의해 포화되었다(도 2a). 프로브를 500nM의 세트 농도에서 살아있는 RAW 세포의 시간경과 표지화를 위하여 사용하는 경우, 카텝신 X의 신속한 포화 후, 카텝신 S, L 및 B의 더 느린 표지화 및 심지어 120분에서 카텝신 B 표지화 신호 증가가 관찰되었다(도 2b). 아마도 세포 내 또는 세포 표면 상의 이의 위치로 인하여, 이들 데이타는 카텝신 X의 풀(pool)을 가장 신속하게 접근할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 또한 카텝신 B 및 X가 상이한 정도로 프로프에 의해 접근될 수 있는 세포에서 대안적인 위치에 존재할 수 있음을 지시한다. 신규한 PMK 프로브의 안정성을 시험하기 위하여, RAW 세포에서 표지화에 대한 혈청 노출 효과를 시험하였다(도 1c). 본래의 AOMK 프로브 1에 대한 혈청 전-노출 4시간은 표적 표지화의 거의 70% 손실을 야기하지만, 표지화의 80% 이상은 PMK qABP 8에 있어서 유지되었다. 시스테인 카텝신 억제제 JPM-OEt에 의한 세포의 전처리는 또한 당해 표지화의 90% 이상을 차단하였다. PMK 프로브의 안정성 및 개선된 표지화 특성을 고려해볼 때, 살아있는 세포 형광 현미경관찰 연구를 다음으로 수행하였다. 이들 결과는 프로브가 밝고 특이적인 표지화 신호를 생성하고, 대부분의 프로브가 리소좀에서 카텝신 잔기를 표지화하였음을 확인하였다(도 2d).
신규한 PMK 친전자체의 양성 살아있는 세포 표지화 특성을 고려해 볼 때, 가장 우수한 PMK qABP 2, 6 및 8을 유방암의 동소 마우스 모델에서 시험하였다. 문헌 [Tao et al.(2008) BMC Cancer 8:228]. 추가로 이들 PMK 프로브를 본래의 AOMK 프로브 1과 비교하였다(도 3 및 도 5). 4T1 세포를 Balb/c 마우스의 2번 및 7번 유선 지방체에 이식하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 확립되면, 꼬리 혈관을 통해 동몰량의 qABP(20nmol)를 마우스에 주사하고, Cy5 형광은 시간에 따라 비침습성으로 영상화되었다(도 3a,b). 다시, 이들 결과는 qABP 8가 우수한 것으로 증명되었음을 확인하였다. 형광의 강력한 종양-특이적 활성화는 높은 전체 콘트라스트로 종양 영역에 특이적으로 프로브 8에 대해 관찰될 수 있었다. 이러한 신호는 시간이 지남에 따라 시간 경과의 끝까지 계속 증가하였다. 궁극적으로 프로브 8은 프로브 1과 비교하여 20배 이상 개선된 종양 특이적 형광 신호를 달성하였다. 둘 다 여전이 프로브 1 보다 10배 이상 뛰어났음에도 불구하고, 우수한 종양 특이적 콘트라스트가 또한 프로브 6에 대하여 관찰되고 프로브 2에 대해서는 더 적은 정도로 관찰되었다(도 5a,b). 시간 경과 완료 후, 종양을 절단하고 종양 형광을 생체외 측정한 다음, SDS-PAGE에 의해 형광 표지된 단백질의 균질화 및 분석을 수행하였다(도 3c 및 도 5c). 생체외 형광의 정량 및 총 시스테인 카텝신 표지화는 비침습성 광학 영상 연구에서 보인 바와 유사한 경향을 나타냈다(도 3d 및 도 5d). 프로브 형광의 세포 공급원을 측정하기 위하여, 프로브 표지된 마우스로부터의 종양 조직 부분의 면역-형광 염색을 대식세포 마커 CD68을 사용하여 염색하였다(도 3e 및 도 5e). 그러나, 모든 CD68 양성 세포가 아닌 CD68 양성 세포에 국지화된 Cy5 형광은 또한 프로브 8 양성이었고, 이는 종양-연관된 대식세포의 상이한 활성 상태를 나타낸다. 공초점 레지어 주사 현미경관찰(CLSM)에 의한 보다 상세한 분석은 프로브 8에 양성인 모든 세포가 CD68 양성이지만, 프로브 표지된 카텝신 및 CD68 신호는 동일한 비히클에 대해 공존하지 않는다는 것을 확인해 주었다(도 3f 및 도 5f). 이와 함께, 이들 데이타는 ?처의 친수성 증가, 스페이서의 단축화 및 더 큰 반응성의 도입 및 입체적으로 덜 장애를 갖는 친핵성 트랩이 넓은 시스테인 카텝신 반응성 및 전체적인 개선된 생체내 특성을 갖는 qABP를 야기하는 것을 확인해 주었다.
매우 분명한 기능들이 시스테인 카텝신 패밀리 멤버의 일부에 대해 기재되었음에도 불구하고(Conus & Simon(2010) Swiss Med. Wkly. 140:wl3042), 다른 역할은 불필요하고 카텝신의 활성에서 변경은 다른 것들의 활성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 카텝신 B의 손실은 카텝신 X의 증가된 활성에 의해 보상되고(Sevenich et al.(2010) Proc. Natl Acad. Sci. USA 107:2497-502), 카텝신 B의 상향조절은 카텝신 L의 하향조절을 야기한다(Gopinathan et al.(2012) Gut 61:877-84). 따라서 넓은 스펙트럼 프로브는 하나의 실험에서 다중 시스테인 카텝신의 판독을 촉진하고 서로에 대하여 개별적인 카텝신의 활성 비교를 가능하게 하기 때문에 가치가 높다. 이러한 pan-반응성 ABP의 유용성은 pan-세린 가수분해효소 플루오로포스포네이트 프로브(Liu et al.(1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 14694-9) 및 pan-반응성 프로테아좀 프로브 MV151(Verdoes et al.(2006) Chem. Biol. 13: 1217-26)에 의해 입증되었다. 추가로, PMK계 qABP가 카텝신 X에 대한 반응성이 높기 때문에, 이들 스캐폴드는 여전히 불량하게 이해되는 시스테인 카텝신에 대항하는 선택적인 qABP를 발생시키는데 사용될 수 있다(Paulick & Bogyo(2011) ACS Chem. Biol. 6:563-72).
결과적으로, 이전에 보고된 AOMK계 프로브와 비교하여 더 큰 반응성 및 더 넓은 선택성을 갖는 PMK 친전자체를 보유하는 ?칭된 형광 활성 기반 프로브의 신규한 부류가 합성되었다. qABP의 친수성은 추가로 설포네이트화된 ?처의 도입 및 친전자체와 ?처를 묶는 스페이서의 단축화에 의해 증가되었고, 이는 암의 비침습성 광학 영상에서 개선된 콘트라스트를 야기하는 더 큰 수성 용해도 및 개선된 생체내 특성을 야기한다.
방법
일반
모든 수지 및 시약은 상업적 공급자로부터 구입하였고 추가의 정제없이 사용하였다. 사용된 모든 용매는 HPLC 등급이었다. 모든 수-민감성 반응은 아르곤 정압하에 무수 용매 중에 수행하였다. API 150EX 단일-사중극자 질량 분석계(Applied Biosystems)를 사용하는 LC-MS에 의해 반응을 분석하였다. C18 컬럼을 사용하는 AKTA 익스플로러 100(Amersham Pharmacia Biotech)으로 역상 HPLC를 수행하였다. NMR 스펙트럼은 펄스 필드 경사 부속물이 장착된 Varian 400 MHz(400/100), 베리안(Varian) 500 MHz(500/125) 또는 베리안 이노바(Varian Inova) 600 MHz(600/150 MHz) 상에 기록하였다. 화학적 시프트는 내부 표준으로서 테트라메틸실란에 대하여 ppm(δ)으로 제공된다. 결합 상수는 Hz로 제공된다. 형광 겔은 타이푼(Typhoon) 9400 플랫베드 레이저 스캐너(GE Healthcare)를 사용하여 스캐닝하였다. 겔 내 표지화 강도는 이미지(Image) J 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 통계 분석은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행하였고, n의 제곱근으로 s.d.를 나눔으로써 s.e.m.을 계산하였다. 형광 현미경관찰 영상은 1O×, 40× 및 63× 대물렌즈(Carl Zeiss)가 장착된 자이스(Zeiss) 공초점 LSM 710 및 자이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 200M 도립 현미경 상에서 수득하였다. 데이타 분석을 위하여 슬라이드북(Slidebook) 소프트웨어를 사용하여 현미경과 카메라를 조절하였다(Intelligent Imaging Innovations).
qABP 합성
하기 화합물의 합성을 위한 합성 반응식을 하기 반응식 1에 도시한다.
2,6-디메틸-4-((6-(트리틸아미노)헥실)카르바모일)벤조산(11a). 모노-트리틸 1,6-디아미노헥산 아세트산 염(9a)(117.2mg, 0.28mmol)을 DCM 중에 넣고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 아민을 DMF 중에 용해시키고, HOBt 모노하이드레이트(43mg, 0.28mmol, 1당량), EDC(54mg, 0.28mmol, 1당량) 및 2,6-디메틸테레프탈산(10)(54.4mg, 0.28mmol, 1당량)을 가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(DCM → DCM 중의 5% MeOH)로 정제하고, 후속적으로 DCM 중에 넣고 물로 세척하고 MgS04 상에서 건조시켜 70mg(0.13mmol, 47% 분리 수율)을 수득하였다.
2,6-디메틸-4-((2-(트리틸아미노)에틸)카르바모일)벤조산(11b). 모노-트리틸 에틸렌디아민 아세트산 염(9b)(97.9mg, 0.27mmol)을 DCM 중에 넣고, 포화 수성 NaHCO3로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 아민을 DMF 중에 용해시키고, HOBt 모노하이드레이트(43mg, 0.28mmol, 1.04당량), EDC(61mg, 0.32mmol, 1.2당량) 및 2,6-디메틸테레프탈산(10)(52mg, 0.27mmol, 1당량)을 가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(DCM → DCM 중의 5% MeOH)로 정제하고, 후속적으로 DCM 중에 넣고 물로 세척하고 MgS04 상에 건조시켜 28mg(0.06mmol, 22% 분리 수율)을 수득하였다.
2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-N-(6-(트리틸아미노)헥실)벤즈아미드(13a). 모노-트리틸 1,6-디아미노헥산 아세트산 염(9a)(117.2mg, 0.28mmol)을 DCM 중에 넣고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하고, 진공하에 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 아민을 DMF 중에 용해시키고, HOBt 모노하이드레이트(43mg, 0.28mmol, 1당량), EDC(54mg, 0.28mmol, 1당량) 및 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시벤조산(12)(59mg, 0.28mmol, 1당량)을 가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(헥산 중의 15% → 30% 에틸 아세테이트)로 정제하여 90mg(0.16mmol, 58% 분리 수율)을 수득하였다.
2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시-N-(2-(트리틸아미노)에틸)벤즈아미드(13b). 모노-트리틸 에틸렌디아민 아세트산 염(9b)(100mg, 0.28mmol)을 DCM 중에 넣고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 아민을 DMF 중에 용해시키고, HOBt 모노하이드레이트(43mg, 0.28mmol, 1당량), EDC(54mg, 0.28mmol, 1당량) 및 2,3,5,6-테트라플루오로-4-하이드록시벤조산(12)(59mg, 0.28mmol, 1당량)을 가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(헥산 중의 20% → 35% 에틸 아세테이트)로 정제하여 90mg(0.18mmol, 65% 분리 수율)을 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, DMSO) δ = 8.77(t, J=6.0, 1H), 7.39(d, J=7.8, 6H), 7.27(t, J=7.7, 6H), 7.17(t, J=7.2, 3H), 3.40 - 3.35(m, 2H), 2.86 - 2.77(m, 1H), 2.14 - 2.04(m, 2H).
Figure pct00044
반응식 1. 시약 및 조건: i. EDC, HOBt, DMF. ii. a) KF, DMF. b) 1% TFA, DCM. iii. a) QSY21-NHS 또는 설포-QSY21-NHS, DiPEA, DMSO. b) TFA/DCM = ℓ/ℓ. c) Cy5-NHS, DiPEA, DMSO. iv. a) KF, DMF, 80℃. b) 1% TFA, DCM.
중간체 15. 플루오르화칼륨(3mg, 52μmol, 3당량)을 5분 동안 초음파처리하여 DMF 중에 현탁시킨 다음, 카르복실산 11a(10mg, 19μmol, 1.1당량)을 가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 클로로메틸 케톤 14(9.7mg, 17.3μmol, 1당량)를 가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고, 조물질을 DCM 중의 1% TFA 중에 넣고, 30분 동안 교반한 다음, 용액이 무색이 될 때까지 트리이소프로필실란의 첨가로 ?칭시켰다. 톨루엔(3x)과의 공증발(coevaporation) 후, 표제 화합물을 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 15:85에서 55:45로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 15를 백색 분말(3.12mg, 3.46μmol, 2 단계 동안 20%)로서 수득하였다.
중간체 16. 플루오르화칼륨(3mg, 52μmol, 3당량)을 5분 동안 초음파처리하여 DMF 중에 현탁시킨 다음, 카르복실산 11b(9.5mg, 20μmol, 1.1당량)을 가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 클로로메틸 케톤 14(10mg, 17.9μmol, 1당량)을 가하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고, 조물질을 DCM 중의 1% TFA 중에 넣고, 30분 동안 교반한 다음, 용액이 무색으로 변할 때까지 트리이소프로필실란 첨가로 ?칭하였다. 톨루엔(3x)과의 공증발 후, 중간체 16을 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 15:85에서 55:45로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 백색 분말(3.99mg, 4.57μmol, 2 단계 동안 26%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CD3OD) δ 7.80(s, 1H), 7.42(s, 1H), 7.35 -7.18(m, 10H), 5.06(s, 2H), 4.85 - 4.78(m, 2H), 4.42(dd, J = 13.1, 6.2 Hz, 1H), 4.37(dd, J = 10.1, 4.0 Hz, 1H), 3.64(t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.18(t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.12(dd, J = 13.7, 7.0 Hz, 1H), 3.01(t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.94(dd, J = 13.6, 8.9 Hz, 1H), 2.41(s, 3H), 2.34(s, 3H), 1.92 - 1.82(m, 1H), 1.67 - 1.57(m, 1H), 1.49 -1.26(m, 4H), 1.42(s, 9H).
중간체 17. 플루오르화칼륨(6.3mg, 108μmol, 3당량)을 5분 동안 초음파처리하여 DMF 중에 현탁시킨 다음, 페놀 13a(21.5mg, 39μmol, 1.1당량)를 가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 클로로메틸 케톤 14(20mg, 36μmol, 1당량)을 가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 5시간 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 DCM 중의 1% TFA 중에 넣고, 30분 동안 교반한 다음, 용액이 무색으로 변할 때까지 트리이소프로필실란 첨가로 ?칭시켰다. 톨루엔(3x)과의 공증발 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 25:75에서 70:30로; 5㎖/분) 정제 후, 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 분말(16.6mg, 17.5μmol, 2 단계 동안 49%)로서 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, CD3OD) δ 7.29(m, 10H), 5.07(s, 2H), 4.86(m, 2H), 4.44(m, 2H), 3.41(t, J = 6.8, 2H), 3.10(dd, J = 13.5, 7.0, 1H), 3.02(t, J = 6.8, 2H), 2.97 - 2.91(m, 3H), 1.93 - 1.81(m, 1H), 1.73 - 1.62(m, 4H), 1.62 - 1.53(m, 1H), 1.51 - 1.46(m, 4H), 1.43(s, 9H), 1.45 - 1.25(m, 4H).
중간체 18. 플루오르화칼륨(6.3mg, 108μmol, 3당량)을 5분 동안 초음파처리하여 DMF 중에 현탁시킨 다음, 페놀 13b(19.4mg, 39μmol, 1.1당량)을 가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반한 다음, 클로로메틸 케톤 14(20mg, 36μmol, 1당량)를 가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 진공하에 농축시켰다. 조물질을 DCM 중의 1% TFA 중에 넣고, 30분 동안 교반한 다음, 용액이 무색으로 변할 때까지 트리이소프로필실란 첨가로 ?칭시켰다. 톨루엔(3x)과의 공증발 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 20:80에서 60:40로; 5㎖/분) 정제 후, 동결건조시켜 표제 화합물을 백색 분말(15.4mg, 17.3μmol, 2 단계 동안 48%)로서 수득하였다. 1H NMR(400 MHz, CD3OD) δ = 7.36 - 7.12(m, 10H), 5.05(s, 2H), 4.86 - 4.81(m, 2H), 4.42 - 4.37(m, 2H), 3.64(t, J=6.5, 2H), 3.14(t, J=6.5, 2H), 3.08(dd, J=13.9, 7.2, 1H), 2.99(t, J=6.5, 2H), 2.91(dd, J=13.9, 8.4, 1H), 1.90 - 1.78(m, 1H), 1.62 - 1.48(m, 1H), 1.41(s, 9H), 1.46 - 1.20(m, 4H).
프로브 1(GB137). 중간체 15(1.5mg, 1.7μmol)를 DMSO(50㎕) 중에 넣고, QSY21-NHS(1.39mg, 1.7μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.5㎕, 8.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 80:20로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 넣고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 2.42mg(1.6μmol, 2 단계 동안 95%)을 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(1.3mg, 1.76μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(1.4㎕, 8μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 75:25로; 5㎖/분) 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 1을 짙은 청색 분말(2.0mg, 0.99μmol, 62%)로서 수득하였다.
프로브 2(BMV122). 중간체 15(1.5mg, 1.7μmol)을 DMSO(50㎕) 중에 넣고, 설포-QSY21-NHS(1.66mg, 1.7μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.5㎕, 8.5μmol, 5당량)을 가하였다. 1시간 후, 설포-QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 30:70에서 70:30로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 짙은 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 흡수시키고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 2.29mg(1.39μmol, 2 단계 동안 81%)을 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(1.1mg, 1.5μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(1.2㎕, 7μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 15:85에서 50:50로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 2를 짙은 청색 분말(1.83mg, 0.84μmol, 61%)로서 수득하였다.
프로브 3(BMV145). 중간체 16(1.5mg, 1.7μmol)을 DMSO(50㎕) 중에 넣고, QSY21-NHS(1.39mg, 1.7μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.5㎕, 8.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 80:20로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 짙은 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 넣고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 0.86mg(0.6μmol, 2 단계 동안 35% 분리 수율)을 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(0.5mg, 0.66μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(0.57㎕, 3.3μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 75:25로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 3을 짙은 청색 분말(0.67mg, 0.34μmol, 57%)로서 수득하였다.
프로브 4(BMV146). 중간체 16(1.0mg, 1.2μmol)를 DMSO(50㎕) 중에 넣고, 설포-QSY21-NHS(1.25mg, 1.2μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.05㎕, 6μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, 설포-QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 20:80에서 80:20로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 짙은 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 넣고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 1.06mg(0.66μmol, 2 단계 동안 55%)을 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(0.55mg, 0.73μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(0.64㎕, 3.65μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 15:85에서 50:50로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 4를 짙은 청색 분말(0.63mg, 0.3μmol, 45%)로서 수득하였다.
프로브 5(BMV118). 중간체 17(1.2mg, 1.3μmol)을 DMSO(50㎕) 중에 넣고, QSY21-NHS(1.0mg, 1.3μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.13㎕, 6.5μmol, 5당량)를 가하였다. 2시간 후, QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 80:20로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 짙은 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 넣고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 2.0mg(1.3μmol, 2 단계 동안 정량)을 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(1.0mg, 1.3μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.1㎕, 6.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 40:60에서 85:15로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 5를 짙은 청색 분말(1.91mg, 0.94μmol, 72%)로서 수득하였다.
프로브 6(BMV119). 중간체 17(1.2mg, 1.3μmol)을 DMSO(50㎕) 중에 넣고, 설포-QSY21-NHS(1.35mg, 1.3μmol, 1당량) 및 DiPEA(1.13㎕, 6.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, 설포-QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 30:70에서 90:10로; 5㎖/분)로 정제한 후, 동결건조시켰다. Boc 보호기를 제거하기 위하여, 수득된 짙은 청색 분말을 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에 넣고, 30분 동안 반응시킨 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켜 상응하는 TFA 염 1.98mg(0.9μmol, 2 단계 동안 70%)를 수득하였다. 아민을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(0.7mg, 0.9μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(0.8㎕, 4.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 15:85에서 50:50로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 6을 짙은 청색 분말(1.63mg, 0.74μmol, 82%)로서 수득하였다.
프로브 7(BMV108). 중간체 18(1.2mg, 1.3μmol)을 DMSO(50㎕) 중에 넣고, QSY21-NHS(1.2mg, 1.4μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(1.13㎕, 6.5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 30:70에서 70:30로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 짙은 청색 분말(1.43mg, 0.99μmol, 76%)을 수득하였다. Boc 보호기를 후속적으로 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에서 30분 동안 제거한 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켰다. TFA 염을 DMSO(50㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(0.83mg, 1.1μmol, 1.1당량) 및 DiPEA(0.88㎕, 5μmol, 5당량)를 가하였다. 1시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 30:70에서 70:30로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 7을 짙은 청색 분말(0.95mg, 0.48μmol, 2 단계 동안 49%)로서 수득하였다.
프로브 8(BMV109). 중간체 18(5.8mg, 6.5μmol)을 DMSO(100㎕) 중에 용해시켰다. 설포-QSY21-NHS(9.75mg, 10.39μmol, 1.6당량) 및 DiPEA(8.4㎕, 50.5μmol, 7.8당량)를 가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 설포-QSY21 아미드를 HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 25:75에서 55:45로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 짙은 청색 분말을 수득하였다. Boc 보호기를 후속적으로 TFA/DCM(ℓ/ℓ) 중에서 30분 동안 제거한 다음, 톨루엔(3x)과 공증발시켰다. 잔여물을 DMSO(250㎕) 중에 용해시키고, Cy5-NHS(10.5mg, 13.9μmol, 2.1당량) 및 DiPEA(12㎕, 72μmol, 11당량)를 가하였다. 4시간 후, HPLC(제조용 역상 C18 컬럼, CH3CN/H2O 0.1% TFA, 20분 동안 25:75에서 45:55로; 5㎖/분)로 정제한 다음, 동결건조시켜 프로브 8을 짙은 청색 분말(7.74mg, 4.61μmol, 3 단계 동안 71%)로서 수득하였다. 1H NMR(600 MHz, CD3CN) δ 8.12 - 8.08(m, 1H), 8.01 - 7.93(m, 2H), 7.89 - 7.85(m, 2H), 7.75(dd, J = 12.0, 1.5 Hz, 2H), 7.72(dd, J = 8.4, 1.7 Hz, 1H), 7.69(dd, J = 8.3, 1.2 Hz, 1H), 7.66(s, 2H), 7.62 - 7.57(m, 2H), 7.51(dd, J = 8.4, 5.1 Hz, 2H), 7.46(d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.41 - 7.35(m, 3H), 7.24(s, 1H), 7.22(s, 1H), 7.21 - 7.14(m, 6H), 7.13 - 7.09(m, 6H), 7.05(dd, J = 8.8, 4.6 Hz, 1H), 6.39(t, J = 12.8 Hz, 1H), 6.11(t, J = 12.6 Hz, 1H), 4.87(q, J = 12.7 Hz, 2H), 4.83(dd, J = 39.7, 14.1 Hz, 2H), 4.23 - 4.12(m, 4H), 3.93(q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.86(t, J = 1.4 Hz, 2H), 3.34(dd, J = 6.7, 4.1 Hz, 2H), 3.28 - 3.15(m, 9H), 3.04 - 2.92(m, 3H), 2.80 - 2.74(m, 1H), 2.45(t, J = 11.9 Hz, 2H), 2.15 -2.09(m, 1H), 2.09 - 2.03(m, 2H), 1.74 - 1.58(m, 7H), 1.57(s, 6H), 1.55(s, 6H), 1.49(dd, J = 15.1, 7.4 Hz, 4H), 1.35 - 1.22(m, 7H), 1.20(t, J = 7.3 Hz, 3H), 1.16 - 1.12(m, 4H).
세포 배양 및 살아있는 세포 및 세포 용해물의 표지화
RAW 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS; GIBCO), 100단위/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충된 DMEM(GIBCO) 중에서 배양하였다. 4T1 세포(ATCC)를 10% 소 태아 혈청(FBS; GIBCO), 100단위/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(GIBCO)으로 보충된 RPMI(GIBCO) 중에서 배양시켰다. 모든 세포를 37℃에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 배양하였다. 온전한 세포 표지화를 위하여, 달리 기재되지 않는 한, 세포를 배양 배지에서 프로브(DMSO 중의 500x)에 노출시키고, 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 지시된 바와 같이, 세포에 첨가 전에 세포를 1시간 동안 억제제 JPM-OEt(DMSO 중의 500x)와 함께 전배양하거나 마우스 혈청(혈청 9㎕에 첨가된 DMSO 중의 프로브 스톡 용액 1㎕)에 4시간 동안 노출시켰다. 표지화 후, 세포를 PBS로 세척하고, 저장성 용해 버퍼(50mM PIPES pH 7.4, 10mM KCl, 5mM MgCl2, 2mM EDTA, 4mM DTT, 및 1% NP-40) 중에 재현탁시키고, 15분 동안 얼음 위에 두고, 4″에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고, BCA 키트(pierce)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. SDS-PAGE(15%)에 의해 분해된, 4x SDS-샘플 버퍼의 첨가 및 100℃에서 3분 가열로 총 단백질 40㎍을 변성시키고, 타이푼 이미저(Typhoon imager)(GE Healthcare)로 겔을 스캐닝함으로써 표지된 프로테아제를 가시화하였다. J 소프트웨어를 사용하여 표지화 강도를 정량하였다. 세포 용해물에서 카텝신 표지화를 위하여, 세포를 수확하고, PBS로 세척하고, 시트레이트 버퍼(50mM 시트레이트 버퍼 pH 5.5, 5mM DDT, 0.5% CHAPS, 0.1% Triton X) 중에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 15분 및 4℃에서 30분 동안 원심 분리 후, 상청액을 수집하고, BCA 키트(pierce)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 총 단백질 40㎍을 지시된 프로브(DMSO 중의 200x)에 1시간 동안 37℃에서 노출시켰다. 4x SDS-샘플 버퍼를 가하고, 단백질을 3분 동안 100℃에서 변성시키고, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 살아있는 세포 현미경관찰을 위하여, RAW 세포를 35mm 유리 바닥 디쉬(시험관내 과학적)에서 1ㆍ105 세포의 밀도로 페놀 레드-무함유 완전 배지에 접종하고, 밤새 배양하였다. 세포를 DMSO 또는 1μM 프로브(DMSO 중의 500x)에 2시간 동안 노출시켰다. 마지막 시간 동안, 라이소트래커-그린(200nM 최종 농도, DMSO 중의 1OOOx)을 세포에 가하였다. 지시된 바와 같이, 억제제 JPM-OEt(DMSO 중의 500x)에 1시간 동안 전배양시켰다. 세포를 Cy5 및 FITC 채널 둘 다에서 자이스 악시오버트 200M 공초점 현미경을 사용하여 40x로 영상화하였다.
동물 모델
모든 동물 관리 및 실험은 국립보건원 및 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회 지침에 따라 수행하였다. 암컷 BALB/c 마우스(6-8주, The Jackson Laboratory)에 이소플루란 마취하에 PBS 중의 1ㆍ105 4T1 세포(ATCC)를 지방체 2번 및 7번으로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 영상화 24시간 전, '나이르(Nair) 로션'을 사용하여 흥미있는 영역의 털을 제거하였다. 10일에, 지시된 프로브(20nmol; 0.8nmol g-1)를 꼬리 혈관을 통해 100㎕의 용적(PBS 중의 20% DMSO)으로 투여하였다. 주사 후, 마우스를 IVIS 100 시스템(Xenogen)을 사용하여 지시된 시간점에서 비침습성으로 영상화하였다. 영상을 리빙 이미지(Living Image) 소프트웨어(PerkinElmer)로 분석하였다. 마지막 시간점 후, 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고, 경부 탈구로 사망시켰다. 생체외 형광 측정 및 생체내 프로브 표지화 프로파일의 평가를 위하여, 종양을 제거하고, FMT 2500(PerkinElmer)를 사용하여 영상화하고, 조직을 시트레이트 버퍼(50mM 시트레이트 버퍼 pH 5.5, 5mM DDT, 0.5% CHAPS, 0.1% Triton X) 중에서 초음파처리(얼음 상에서 1분)하였다. 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후, 상청액을 수집하고, BCA 키트(pierce)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 총 단백질 40 ㎍을 SDS-샘플 버퍼 중에서 3분 동안 100℃에서 변성시키고, 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 면역형광을 위하여, 절개된 종양을 PBS 중의 4% PFA 용액 중에서 6시간 동안 4℃에서 배양시킨 다음, 30% 수크로스 용액 중에서 밤새 배양하고, OCT 배지에서 조직을 냉동시켰다. 6-㎛ 부분을 아세톤 중에 고정시키고, PNB 블록킹 버퍼로 블록킹하고, 랫트 항-마우스 CD68(1:1000; Serotec)과 함께 밤새 배양하였다. 알렉사 플루오르-488(1:500; Invitrogen)과 컨쥬게이트된 고트-항 랫트를 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 부분을 DAPI(2㎍/㎖; Invitrogen)으로 5분 동안 염색한 다음, 프로롱 골드(ProLong Gold) 봉입제(Invitrogen)에 봉입하였다. 그 다음, 조직을 자이스 악시오버트 200M 현미경을 사용하여 가시화하였다.
모든 특허, 특허 공개, 및 기타 본원에 언급된 출판된 문헌은 각각이 개별적으로 및 특정하게 본원에 참조로서 인용되는 바와 같이 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
특정한 실시예가 제공되지만, 상기 기재는 설명적이고 제한이 아니다. 상기 기재된 양태의 임의의 하나 이상의 특징은 본 발명에서 임의의 다른 양태의 하나 이상의 특징과 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 추가로, 본 발명의 다양한 변이는 명세서를 참조하여 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 본 발명의 범위는, 따라서, 이들의 등가물의 전체 범위에 따라, 첨부된 청구범위를 참조하여 결정되어야 한다.

Claims (37)

  1. 프로테아제 표지화에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물:
    Figure pct00045

    상기 화학식 I에서,
    L은 에테르-결합된 이탈 요소이고;
    T는 표적화 요소이고;
    D는 검출가능 요소이다.
  2. 제1항에 있어서, D는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, D는 형광 표지인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린(Oregon green), 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 형광 표지는 시아닌 표지인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 시아닌 표지는 Cy5인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, T는 화합물을 시스테인 프로테아제에 표적화하는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, T는 비-펩티드 표적화 요소인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 비-펩티드 표적화 요소는 트리아졸 구조를 포함하는 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 하기 화합물 중 하나로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure pct00046
    ,
    Figure pct00047
    , 및
    Figure pct00048
    .
  11. 제1항에 있어서, T는 펩티드 표적화 요소인 화합물.
  12. 제11항에 있어서,
    D-T-는
    Figure pct00049
    이고;
    L1은 연결기이고;
    AA1은 아미노산 측쇄이고;
    U는 O, N, 또는 S이고;
    R1은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환되고;
    각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알크아미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알크아미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도인 화합물.
  13. 제12항에 있어서, L1은 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 각각의 탄소 원자가 헤테로원자로 임의로 치환되는 것인 화합물.
  14. 제12항에 있어서, AA1은 1 내지 3개의 A 기로 임의로 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄인 화합물.
  15. 제12항에 있어서, U는 O인 화합물.
  16. 제12항에 있어서, D는 형광 표지, 방사성 표지, 또는 킬레이터인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, D는 형광 표지인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지인 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 형광 표지는 시아닌 표지인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 시아닌 표지는 Cy5인 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, L은 ?처(quencher)를 포함하는 것인 화합물.
  22. 제21항에 있어서,
    L은 L2-L3-Q이고;
    L2는 페녹시 기이고;
    L3은 연결기이고;
    Q는 ?처인 화합물.
  23. 제22항에 있어서,
    L은
    Figure pct00050
    이고;
    각각의 Y는 독립적으로 전자 끄는 기 또는 수소인 화합물.
  24. 제23항에 있어서, 각각의 Y는 독립적으로 할로겐 또는 수소인 화합물.
  25. 제24항에 있어서,
    L은
    Figure pct00051
    이고;
    L3은 임의로 치환된 알킬 연결기이고, 각각의 탄소 원자가 헤테로원자에 의해 임의로 치환되는 것인 화합물.
  26. 제25항에 있어서,
    L은
    Figure pct00052
    이고;
    R은 QSY ?처이고;
    n은 1 내지 16의 정수인 화합물.
  27. 제26항에 있어서, QSY ?처는 친수성 QSY ?처인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 친수성 QSY ?처는 설포-QSY ?처인 화합물.
  29. 제12항에 있어서, 화학식 II를 갖는 화합물:
    Figure pct00053

    상기 화학식 II에서,
    D는 형광 표지이고;
    L3은 연결기이고;
    Q는 ?처이다.
  30. 제29항에 있어서, 화학식 III을 갖는 화합물:
    Figure pct00054

    상기 화학식 III에서,
    R은 QSY ?처이고;
    D는 시아닌 염료이고;
    m 및 n은 독립적으로 1 내지 16의 정수이다.
  31. 제30항에 있어서, R은 QSY21 또는 설포-QSY21이고, D는 Cy5인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 하기 화합물 중 하나로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure pct00055

    여기서,
    R = QSY21 및 n = 6;
    R = 설포-QSY21 및 n = 6;
    R = QSY21 및 n = 2; 및
    R = 설포-QSY21 및 n = 2.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동물에서 프로테아제 표지화에 사용하기 위한 조성물.
  34. 제33항의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 프로테아제를 표지화하는 방법.
  35. 제33항의 조성물을 동물에게 투여하는 단계; 및
    조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제의 반응으로부터 동물에서 발생된 검출가능 신호를 측정하는 단계로서, 검출가능 신호가 동물의 종양과 연관되는 것인 단계
    를 포함하는, 동물에서 종양을 가시화하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 검출가능 신호는 형광 신호인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 형광 신호는 종양 가장자리에서 발생되는 것인 방법.
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