KR102669535B1 - 생체 내 이미징을 위한 프로테아제 활성화 조영제 - Google Patents

생체 내 이미징을 위한 프로테아제 활성화 조영제 Download PDF

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Abstract

이미지 유도 수술에서 조영제로서 유용한 화합물이 제공된다. 상기 화합물은 치료된 조직 내에서, 특히 종양 및 다른 이병 조직 내에서 라이소좀 프로테아제에 의한 절단 시 검출 가능한 잠재 양이온 라이소좀자극성 단편을 포함한다. 또한, 상기 화합물을 포함하는 조성물 및 예를 들어 이미지 유도 종양 절제술 중 생체 내에서 프로테아제 활성을 동력학적으로 모니터링함에 있어서 상기 화합물을 이용하는 방법이 제공된다.

Description

생체 내 이미징을 위한 프로테아제 활성화 조영제
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 그의 전체적인 개시 내용이 본 출원에 참고로 인용된 2017년 3월 30일 출원된 미국 가출원 62/478,639를 우선권 주장의 기초로 한다.
정부 지원에 대한 언급
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 계약 EB005011 및 HL116307 하의 정부 지원에 따라 완성되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
수술적 개입(외과 수술)은 현재 실질적으로 모든 유형의 고형암을 치료하기 위한 가장 보편적인 치료법이다[Siegel et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62: 220-41; DeSantis et al. (2014) CA Cancer J. Clin. 64: 252-71]. 따라서, 성공적인 결과는 수술 중에 병에 걸린 원발 장기 및 잠재적인 전이 부위 둘 다로부터 모든 암세포의 완전한 제거에 좌우된다[Vahrmeijer et al. (2013) Nat. Rev. Clin. Oncol. 10: 507-18]. 암 내의 특이적인 바이오마커를 타겟팅하는 조영제는 치료 결과를 개선하기 위해 고형 종양의 수술적 절제를 유도하는 수술중 조영제로서 사용될 수 있다[Miwa et al. (2014) J. Orthop. Res. 32: 1596-601; Fujita (2012) J. Am. Coll. Surg. 215: 591]. 다양한 이미징 양식 중에서, 형광 조영제를 이용하는 광학 기반 기법이 큰 잠재성을 갖는다[Rudin 및 Weissleder (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2: 123-31; Bednar et al. (2007) Expert Opin. Drug Discov. 2: 65-85]. 인도시아닌 그린(ICG), 플루오레세인, 메틸렌블루, 및 5-아미노레불린산(5-ALA)은 모두 현재 다양한 종양의 시각화를 위해 주사 가능한 증강제로서 허가된 비-타겟팅된 조영제이다[Schaafsma et al. (2011) J. Surg. Oncol. 104: 323-32; Tanaka et al. (2006) Ann. Surg. Oncol. 13: 1671-81]. 또한, 몇몇 타겟팅된 조영제는 여러 가지 단계의 임상시험 중이다[Kovar et al. (2007) Anal. Biochem. 367: 1-12]. 특히, 폴레이트 수용체-α를 타겟팅하는 FITC 프로브는 난소암의 치료를 위한 수술중 플루오레세인 유도 수술(FGS)의 가치를 입증하기 위한 임상시험에 사용되었다[van Dam et al. (2011) Nat. Med. 17: 1315-9]. 추가적으로, 다른 종양 타겟팅 제제, 예를 들어 클로로톡신-Cy5.5는 여러 가지 마우스 암 모델을 이용하여 악성 암세포의 광학적 이미징을 위해 입증되어 왔다. 그러나, 이러한 제제에 대한 종양 선택성의 메커니즘은 잘 이해되지 않는다[Veiseh et al. (2007) Cancer Res. 67: 6882-8].
일반적인 종양 타겟팅된 조영제에 대한 대안적인 접근은, 종양 또는 주변 마진(surrounding margin)과 결합되는 효소 활성에 의해 작용하는 경우, 종양 조직 에서 신호를 단지 생성 또는 축적하는 소위 "스마트 프로브"를 이용하는 것이다. 스마트 프로브 디자인에서 한 가지 유용한 전략은 프로테아제에 의해 절단되는 경우 신호를 생성하는 프로브를 제작하는 것이다. 프로테아제는 종양 성장 및 전이뿐만 아니라 다양한 병리학, 예를 들어 섬유증, 염증, 골다공증, 및 관절염에서 중요한 역할을 수행하기 때문에, 프로테아제에 의해 활성화되는 조영제는 많은 질병의 검출 및 치료를 위해 가치가 있는 것으로 입증될 수 있다[Turk (2006) Nat. Rev. Drug Discov. 5: 785-99; Drag 및 Salvesen (2010) Nat. Rev. Drug Discov. 9: 690-701].
종양 이미징 적용을 위한 다수의 프로브는 매트릭스 메탈로 프로테아제(MMP)를 타겟팅하여 왔는데, 그 이유는 혈관신생 및 종양 성장에서 그들의 역할이 보고되었기 때문이다. 이는 절단 시의 신호뿐만 아니라 MMP에 의해 절단되는 경우 세포 내에 축적되는 마스킹된 세포 투과 펩티드를 생성하는, 소형 분자 및 대형 중합체 기반 프로브 둘 다를 포함한다. MMP에 대한 대안으로서, 시스테인 카텝신은 종양 형성의 다양한 국면의 중요한 조절자이다[Shree et al. (2011) Genes Dev. 25: 2465-79]. 또한, 이들 프로테아제는 내재성 염증 반응을 조절하는 많은 세포에서 고도로 발현되고 활성화된다[Mohamed 및 Sloane (2006) Nat. Rev. Cancer 6: 764-75]. 일반적으로, 시스테인 카텝신 활성은 면역 세포의 증가된 침윤에 기인하는 모든 고형 종양에서 실질적으로 상승된다[Mitchem et al. (2013) Cancer Res. 73: 1128-41; McIntyre 및 Matrisian (2003) J. Cell. Biochem. 90: 1087-97; Fonovic 및 Bogyo (2007) Curr. Pharm. Des. 13: 253-61; Gocheva et al. (2010) Genes Dev. 24: 241-55]. 따라서, 시스테인 카텝신은 종양 특이적인 조영 이미징제의 디자인에서 타겟팅되어 왔다. 그러한 제제는 전환 중에 카텝신을 공유적으로 변형시키는 형광 활성 기반 프로브[Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135: 14726-30; Lee 및 Bogyo (2010) ACS Chem. Biol. 5: 233-43; Blum et al. (2005) Nat. Chem. Biol. 1: 203-9; Blum et al. (2007) Nat. Chem. Bio. 3: 668-677; Verdoes et al. (2012) Chem. Biol. 19: 619-28], 일정 범위의 고 및 저 분자량 켄칭된 기질 프로브[Watzke et al. (2008) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47: 406-9; Hu et al. (2014) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53: 7669-73], 및 형광생성 턴온 기질 프로브[Kisin-Finfer et al. (2014) Bioorg. Med. Chem. Lett. 24: 2453-8; Chowdhury et al. (2014) J. Med. Chem. 57: 6092-104; Fujii et al. (2014) Bioconjug. Chem. 25: 1838-46]를 포함한다. 보고된 모든 프로테아제-유발된 스마트 프로브는 암의 마우스 모델에서 종양 마진의 이미징을 위해 유용한 것으로 확인되었음에도 불구하고[Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135: 14726-30; Hu et al. (2014) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53: 7669-73; Mito et al. (2012) Cancer 118: 5320-30], 모두는 종양 조영의 관점에서 한계가 있으며, 임상적으로 승인된 이미징 장비와 함께 사용되어 온 것은 없다. 더구나, 대부분은 단지 대형 종양이 피부 표면에서 또는 근처에서 이미징되는 암의 단순 이식 모델을 이용하여 확인되었다. 따라서, 다수의 종양 유형에 대한 증강된 조영을 갖고 기존의 수술 절차의 범위 내에서 종래의 임상 장비와 함께 사용될 수 있는 타겟팅된 조영제의 최적화는 다수의 수술 절차에 대한 변형이 될 것이다.
활성 프로테아제, 예를 들어 카텝신을 함유하는 세포의 이미징을 위한 방법 및 재료는 미국 특허 출원 공보 2007/0036725에 개시되어 있다. 카텝신을 포함하는 타겟 효소의 생체 내 방사선레이블링에 유용한 방사선레이블링된 활성 기반 프로브는 미국 특허 출원 공보 2009/0252677에 개시되어 있다. 각각의 경우에, 프로브는 프로테아제 활성 부위를 공유적으로 변형시키기 위해 에스테르-결합된 아실옥시메틸케톤(AOMK) 반응기를 이용한다. 비펩티드 활성 기반 형광 프로브는 PCT 국제 공보 WO 2012/118715에 개시되어 있다.
PCT 국제 공보 WO 2014/145257은 에테르 결합된 2,3,5,6-테트라플루오로-치환된 페녹시메틸케톤(PMK) 이탈 요소를 포함하는 켄칭된 ABP를 개시한다. 개시된 ABP의 검출 가능한 성분은 효소적 전환 후에 그들의 타겟 프로테아제에 공유적으로 부착된 상태를 유지한다.
미국 특허 출원 공보 2014/0301950은 다크 켄처, 아미노산 백본, 형광단, 6-아미노헥사노산, 아미노에톡시에톡시아세틸 스페이서, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 사슬을 포함하는 이미징제를 개시한다. 상기 제제는 알려진 대로라면 카텝신에 의해 절단되어 형광 신호를 생성하고, 따라서 이병 세포(diseased cell)를 이미징한다. 상기 기술은 조직의 표면에서 또는 근처에서 이병 세포를 확인하는 것에 관한 것이다.
카스파아제 및 다른 시스테인 프로타아제의 다른 활성 기반 억제제는 PCT 국제 공보 WO 2012/021800; 미국 특허 출원 공보 2002/0052323; 미국 특허 출원 공보 2002/0028774; PCT 국제 공보 WO 96/41638; 및 유럽 특허 출원 공보 EP 0272671에 보고되어 있다.
이들 개시에도 불구하고, 높은 세포 흡수를 갖고, 광범위한 동물 프로테아제를 타겟팅하고, 및 다양한 파장, 특히 이병 조직을 투과할 수 있는 파장에서 증가된 검출 감도를 제공하는 신규한 활성 기반 조영제에 대한 요구가 당해 기술분야에 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 동물 프로테아제를 타겟팅하는 화합물, 조성물, 및 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법을 제공함으로써 이들 요구 및 다른 요구를 해결한다. 특히, 본 발명의 한 관점에 따라, 하기 화학식 (I)에 의해 나타내는 바와 같은 화합물이 제공된다:
상기 식에서,
D는 벤조인돌 염료를 포함하는 검출 가능한 요소이고;
Q는 켄처이며;
L0 및 L1은 링커이며;
AA2는 아미노산 측쇄이며;
U는 O, NH, 또는 S이며;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환되며;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클로알콕시, 시클로알카노일, 시클로알크아미노, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴아미노, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알콕시, 헤테로시클릴알카노일, 헤테로시클릴알크아미노, 히드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
화학식 (I)의 몇몇 화합물 실시양태에서, 벤조인돌 염료는 하기 구조를 갖는다:
상기 식에서,
o는 1 내지 4의 정수이고;
R1은 설포네이트 또는 카르보네이트로 임의 치환된 C2-C8 알킬기이며;
각각의 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬기이며;
L2는 임의 치환된 알킬 링커이며, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다.
더 구체적으로, 벤조인돌 염료는 하기 구조를 가질 수 있다:
.
몇몇 실시양태에서, AA2는 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이고, 몇몇 실시양태에서, U는 O이다. 몇몇 실시양태에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 임의 치환된 알킬 링커이고, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다. 구체적인 실시양태에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 C2-8 알킬 링커이다. 더욱 더 구체적으로, L1은 C4 알킬 링커이다.
몇몇 실시양태에서, Q는 QSY 켄처이고, 더 구체적으로 친수성 QSY 켄처이며, 더욱 더 구체적으로 친수성 QSY 켄처는 설포-QSY 켄처이다. 다른 특정 실시양태에서, Q는 QC-1이다.
몇몇 실시양태에 따라, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (II)를 갖는다:
상기 식에서,
n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
R1은 QSY 켄처 또는 QC-1이며;
R2는 벤조인돌 염료이다.
더 구체적으로, n'는 2, 4, 또는 6일 수 있거나, 또는 n"는 4일 수 있다. 더욱 더 구체적으로, n'는 2, 4, 또는 6이고, n"는 4이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 구조를 갖는다:
본 발명의 다른 관점에서, 하기 화학식 (III)에 의해 나타내는 바와 같은 화합물이 제공된다:
상기 식에서,
D는 벤조인돌 염료를 포함하는 검출 가능한 요소이고;
L0는 링커이며;
T는 경우에 따라 켄처를 포함하는 프로테아제 타겟팅 요소이며,
단 L0는 에톡시에톡시 스페이서를 포함하지 않는다.
화학식 (III)의 구조를 갖는 몇몇 화합물 실시양태에 따라, T는 켄처를 포함한다.
화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, L0는 임의 치환된 알킬 링커이고, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다. 구체적으로, L0는 C2-8 알킬 링커일 수 있다.
T가 켄처를 포함하는 몇몇 화합물 실시양태에서, 켄처는 QSY 켄처일 수 있다. 구체적으로, QSY 켄처는 친수성 QSY 켄처일 수 있고, 더 구체적으로 친수성 QSY 켄처는 설포-QSY 켄처일 수 있다. T가 켄처를 포함하는 몇몇 실시양태에서, 켄처는 QC-1이다.
화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, T는 펩티드성 타겟팅 요소이다. 구체적인 실시양태에서, T는 4개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, T는 경우에 따라 켄처를 포함하는 카텝신 타겟팅 요소이다. 더 구체적으로, T는 카텝신 L 및 카텝신 V에 대해 특이적일 수 있다.
화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, T는 이고;
AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄이며;
U는 O, NH, 또는 S이며;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환되며;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클로알콕시, 시클로알카노일, 시클로알크아미노, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴아미노, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알콕시, 헤테로시클릴알카노일, 헤테로시클릴알크아미노, 히드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
구체적인 실시양태에서, AA1은 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된다. 다른 구체적인 실시양태에서, U는 O이다. 여전히 다른 구체적인 실시양태에서, T는 켄처를 포함한다.
T가 인 화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, D는 방사성 물질을 포함한다.
T가 인 화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, AA1은 켄처를 포함한다. 더 구체적으로, AA1은 -L1-Q일 수 있고, 이때 L1은 링커이고, Q는 켄처이다. 이들 실시양태에서, L1은 더 구체적으로 임의 치환된 알킬 링커일 수 있고, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다. 더욱 더 구체적으로, L1은 C2-8 알킬 링커, 예를 들어 C4 알킬 링커일 수 있다.
몇몇 화학식 (III)의 상기 화합물에서, AA2는 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 몇몇 이들 화합물에서, U는 O이다. 몇몇 상기 화합물에서, Q는 QSY 켄처, 예를 들어 친수성 QSY 켄처, 또는 심지어 설포-QSY 켄처이다.
다른 관점에서, 본 발명은 동물에서 조직 레이블링에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 상기 화합물 중 임의의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
아직 다른 관점에서, 본 발명은 동물에서 조직을 레이블링하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 상기 조성물 중 임의의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
여전히 아직 다른 관점에서, 본 발명은 동물에서 종양을 시각화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은
상기 조성물 중 임의의 조성물을 동물에게 투여하는 단계; 및
상기 조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출 가능한 신호를 측정하는 단계로서, 이때 검출 가능한 신호는 동물에서 이병 조직과 관련되는 것인 단계
를 포함한다.
실시양태에서, 검출 가능한 신호는 형광 신호이다. 더 구체적으로, 형광 신호는 근적외선 신호이다.
다른 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 종양 마진(tumor margin)에서 생성된다.
여전히 다른 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 이미지 유도 수술 장치를 이용하여 측정된다.
도 1a-1b. 카텝신-선택적 프로테아제 기질 프로브의 디자인. 도 1a: 프로테아제-절단 가능한 아마이드 결합을 갖는 6개의 기질 유사체의 화학 구조. "nCQ"(화합물 2-4)로 지정된 구조에서, "n" 값은 스페이서 길이(n=2, 4, 및 6)에 상응하고, 발색단(C)은 라이신 측쇄(R1)에 부착되는 반면, "nQC"(화합물 5-7)로 지정된 구조에서 "n"의 값도 스페이서 길이에 상응하지만, 발색단은 절단 가능한 아마이드 결합의 C-말단 측 상의 아민기(R2)에 부착된다. 도 1b: 프로브 절단의 절단된 형광 생성물의 체류를 개선하기 위해 프로브 디자인 내에 도입된 잠재 라이소좀자극성 효과(Latent Lysosomotropic Effect, LLE)의 모식도.
도 2. 다수의 카텝신에 의한 기질 절단의 반응속도(키네틱) 분석(kinetic analysis). 재조합 시스테인 카텝신을 이용하는 켄칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질의 효소적 전환. 각각의 패널에서 상부 기록(top trace)은 카텝신 L(Cat L)을 이용하는 활성에 상응한다. 각각의 패널에서 다음 하부 기록은 카텝신 V(Cat V)를 이용하는 활성에 상응한다.
도 3a-3b. 시험관 내에서 LLE 및 비-LLE 기질의 비교. 도 3a: 재조합 카텝신 L에 의한 켄칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질의 절단 효율(K cat/K M)에 대한 가변 스페이서 길이의 효과. 도 3b: 1 μM의 켄칭된 형광 기질(6CQ 및 6QC)과 함께 항온처리한 RAW 264.7 세포의 대표적인 생 세포 형광 현미경 관찰. 적색(상부 2개 패널 내의 반점이 있는 세포질 염색)은 프로브의 Cy5 형광이고, 녹색(중간 2개 패널 내의 반점이 있는 세포질 염색)은 라이소트랙커(라이소좀-선택적 염색)이고, 청색(상부 2개 및 중간 2개 패널 내의 핵 염색)은 Hoechst 33342이다. 스케일 바는 10 ㎛를 나타낸다. 통합된 형광(하부 2개 패널)은 Cy5 염색 및 라이소트랙커 염색의 중첩을 나타낸다.
도 4a-4c. 4T1 유방암 모델에서 형광 기질의 확인. 도 4a: 켄칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질(n=2, 6)이 주사된 마우스에서 종양 관련 시스테인 카텝신의 비침습성 경시적 형광 이미징 및 프로브의 정맥 내 주사 후 0.5, 1, 4, 8 및 24 시간에서 대표적인 시점 이미지. 하부 패널은 특정 시점에서 각각의 프로브에 대한 최적 형광 조영을 나타낸다. 도 4b: 24시간의 기간에 걸쳐 비-라이소자임자극성 기질, nCQ 및 라이소자임자극성 기질, nQC의 종양 레이블링 키네틱스 및 약물동력학적 특성의 비교. 에러 바는 N≥3 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다. 프로브가 없는 대조군 마우스는 자가-형광을 보정하기 위해 사용되었다. 도 4c: 2가지 유형의 기질의 주사 후 4 시간 및 24 시간에서 생체 외 종양 이미징. 에러 바는 N≥3 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 5a-5b. 생체 내에서 조직에의 LLE 기질의 특이적인 축적의 확인. 도 5a: 24 시간 종말점에서 기질 nCQ 및 nQC를 주사한 마우스로부터 절제된 종양의 냉동 절편에 대한 조직학. Cy5 형광은 상부 패널(적색 염색; 2QC-처리된 동물 및 6QC-처리된 동물에서만 관찰됨)에서 나타나고, 마크로파지에 대한 CD68 면역염색은 중간 패널(녹색 염색; 모든 동물에서 관찰됨)에서 나타나고, DAPI(핵 염색)는 상부 및 중간 패널(청색 염색)에서 나타난다. 패널의 하부 열은 통합된 형광을 나타낸다. 도 5b: 정맥 내 투여 후 4 시간 및 24 시간에서 다양한 기관에서 프로브의 생분포. 에러 바는 각각의 시점에 대해 N≥3 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 6a-6e. 최적화된 NIR 프로브의 생체 내 특성의 평가. 도 6a: 근적외선 켄칭된 비-라이소좀자극성 기질 6CQNIR(8) 및 라이소좀자극성 유사체 6QCNIR(9)의 화학 구조. 도 6b: NIR 프로브를 이용하는 유방암 마우스 모델에서 종양 연관 시스테인 카텝신의 경시적인 비침습성 형광 이미징. 이미지는 1, 2, 3, 4, 6, 12, 및 24 시간 시점에 대해 나타낸다. 하부 패널은 특정 시점에서 각각의 프로브에 대한 최적 형광 조영을 나타낸다. 도 6c: 24 시간의 시간 경과에 걸친 6CQNIR 및 6QCNIR의 종양 레이블링 키네틱스의 정량화. 에러 바는 각각의 프로브에 대해 N≥3 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다. 도 6d: 2가지 유형의 기질이 수용된 마우스로부터 분리된 종양을 포함하는 생체 외 이미지. 분리는 4 시간 및 24 시간 시점에서 수행하였다. 도 6e: 주사 후 24 시간에 여러 가지 장기 및 종양에서 프로브의 생분포.
도 7a-7d. 디자인된 카텝신 프로브와 함께 임상적 다빈치 수술 장비를 이용하는, 결장직장, 유방 및 폐 아데노암종의 수술 중 형광 이미지 유도 검출 및 절제. 도 7a: NIR 카메라가 장착된 다빈치 수술 로봇 시스템의 그래픽 예시. 도 7b: LLE 프로테아제 타겟팅된 조영제, 6QCNIR(9)의 정맥 내 투여 6 시간 후 결장직장암 APCmin+ 마우스 모델의 결장 내에서 폴립의 검출. 이미지는 스플레이드 결장의 실시간 수술 중 이미징의 스크린샷으로부터 얻었다. 패널은 절제된 종양의 백색광(좌측), 형광(중앙) 및 H&E 염색(우측)에 의해 조명된 동일한 마우스의 결장에서 검출된 폴립의 대표적인 이미지를 나타낸다. 도 7c: 임상적 기구 및 조영제 6QCNIR을 이용하는 마우스 유방 종양(4T1)의 검출 및 형광 이미지 유도 수술적 제거. 이미지는 종양 및 종양 베드의 백색광 조명(좌측), 형광(중앙), 및 H&E(우측)에 의한 종양의 악성의 확인을 비교한다. 도 7d: 마우스 폐 암의 검출 및 절제에서 프로브의 적용 및 조직학과 암의 상관관계.
도 8a-8c. 카텝신을 이미징하기 위한 PET 기질 프로브의 디자인 및 확인. 도 8a: 기질 프로브 LO263의 구조. 도 8b: 이미징의 2 시간 및 24 시간에서 7일째에 염수 또는 블레오마이신으로 처리된 마우스의 비침습성 PET/CT 스캔. 두정(중앙), 경축(우측) 및 시상(좌측) 이미지는 나타낸 시점에서 염수 또는 블레오마이신 처리된 군 유래의 대표적인 마우스에 대해 나타낸다. 도 8c: 상이한 처리 군에서 7일째에 모든 마우스의 폐 유래의 PET/CT 강도의 정량화. 에러 바는 평균±SEM을 나타낸다. 7일째(염수 n=4; 블레오마이신 n=4. t-테스트에 의한 *p<0.05).
도 9a-9b. DyLight 780-레이블링된 프로브(도 9a) 또는 인도시아닌 그린(ICG)-레이블링된 프로브(도 9b)를 이용하여 마우스에서 종양을 레이블링하는 비교 시간 경과. 또한, 우측 패널에는 종양-레이블링 반응의 더 상세한 키네틱스가 도시되어 있다.
도 10a-10b. DyLight 780-레이블링된 프로브(도 10a) 또는 인도시아닌 그린(ICG)-레이블링된 프로브(도 10b)를 이용하는 마우스에서 종양 레이블링의 비교 농도 의존성.
도 11a-11d. DyLight 780-레이블링된 프로브(도 11a 및 11c) 또는 인도시아닌 그린(ICG)-레이블링된 프로브(도 11b 및 11d)를 이용하여 레이블링된 동물의 비교 생체 외 연구.
발명의 상세한 설명
본 명세서는 특히 비침습성 이미징 적용에 사용하기 위한 켄칭된 형광 기질 프로브의 디자인 및 최적화를 개시한다. 구체적으로, 켄처 및 형광단 쌍 또는 방사성 동위원소 라벨을 함유하는 변형된 펩티드가 제공된다. 상기 화합물은 프로테아제 절단 시 리포터(켄칭되지 않은 형광단 또는 방사성 동위원소) 및 양성자 아민(protonable amine) 함유하는 단편을 방출하고, 따라서 방출된 단편의 증강된 라이소좀 체류를 초래한다.
본 발명의 화합물은 염증과 연루된 임의의 질환에서 조영 이미징을 위해 유용하다. 상기 화합물은 여러 가지 고형 종양(유방, 결장, 폐 등)의 이미지 유도 수술에서 특정 용도가 확인되지만, 아테롬성경화증, 섬유증, 감염성 질병(예를 들어, 결핵 감염), 및 카텝신 또는 다른 프로테아제가 염증 반응에서 분비되는 임의의 질환의 진단 및 모니터링에도 유용하다.
시스테인 프로테아제를 타겟팅하는 것으로 알려진 활성 기반 프로브(ABP)의 이전의 예들은 시스테인 프로테아제의 파파인 패밀리를 공유적으로 타겟팅하는 일련의 켄칭된 근적외선 형광 활성 기반 프로브(qNIRF-ABP)[Blum et al. (2007) Nat. Chem. Bio. 3: 668-677] 및 에테르-결합된 이탈기를 갖는 일련의 강력한 시스테인 프로테아제 특이적인 ABP 화합물[Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135: 14726-30; PCT 국제 공보 WO 2014/145257]을 포함한다. 이전의 ABP는 효소 전환 중에 반응성 프로브에 의해 프로테아제 활성 부위의 공유결합 변형을 초래한다. 형광 라벨은 프로테아제에 공유적으로 부착된 상태로 유지되고, 그의 잠재 형광은 효소 전환 중 켄처를 함유하는 프로브의 일부분의 방출에 의해 차폐되지 않는다.
현재의 프로브는 본 발명자들의 기존 ABP[Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135: 14726-30; PCT 국제 공보 WO 2014/145257]의 신규한 변형인데, PMK 탄두가 프로테아제에 의해 절단 가능한 천연 아마이드 결합에 의해 대체된다(도 1a). 기질과 절단 기 사이의 알킬 스페이서의 길이는 새로운 기질에서 가변적이고, 리포터 형광단 및 켄처를 기질 상의 상이한 위치에 위치시키는 효과가 평가되어 왔다. 이론에 의해 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 라이소좀(pH ~4-5) 내에서 절단된 기질 단편의 유리 아미노기의 양성자화는 라이소좀 막을 가로지르는 양이온성 중간체의 확산 속도를 감소시키고[Soulet et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 49355-66], 따라서 라이소좀 내에서 절단된 단편의 체류를 증강시킴으로써 신호의 강도를 증가시키며, 절단된 단편 상에 형광단을 함유하는 기질에 대한 종양에서의 지속기간을 연장시킨다[Kazmi et al. (2013) 41: 897-905도 참조].
시험관내 효소 반응속도 분석은, 디자인된 기질이 여러 가지 시스테인 카텝신에 의해, 특히 카텝신 L에 의해 효율적으로 절단된다(켄칭되지 않는다)는 것을 나타냈다. 전환수 및 기질에 대한 친화도는 시스테인 카텝신에 대한 시판되는 기질에 필적한다. 유방암의 공통유전자 동소 마우스 모델을 이용하는 비침습적 이미징 연구에서, 디자인된 기질 프로브는 이상적인 약리학적 특성, 예를 들어 신속한 레이블링 키네틱스, 종양 내 및 종양 주변 부위에의 유의미한 축적을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 결과는, 프로브 디자인 내로 잠재 양이온성 굴성(tropism)의 도입에 의해 신호 강도 및 전체적인 조영을 증가시킬 수 있음을 확인시켜 준다. 그러한 시약의 예는 본 출원에 그 전체적인 개시 내용이 참고로 인용된 PCR 국제 공보 WO 2016/118910 A1 및 문헌[참조: Ofori et al. (2015) ACS Chemical Biology 10: 1977-1988]에 기재되어 있다.
화합물
따라서, 한 관점에서, 본 개시 내용은 동물 조직에서 프로테아제 활성, 특히 카텝신의 활성의 검출 및 이미징에서 이미징제로서 사용하기 위한 신규 화합물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물은 하기 화학식 (I)을 갖는다:
상기 식에서,
D는 벤조인돌 염료를 포함하는 검출 가능한 요소이고;
Q는 켄처이며;
L0 및 L1은 링커이며;
AA2는 아미노산 측쇄이며;
U는 O, NH, 또는 S이며;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 또는 보호기이고, 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환되며;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클로알콕시, 시클로알카노일, 시클로알크아미노, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴아미노, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알콕시, 헤테로시클릴알카노일, 헤테로시클릴알크아미노, 히드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 시클로알킬(지환식) 기, 알킬-치환된 시클로알킬기, 및 시클로알킬-치환된 알킬기를 포함하는 포화 지방족기의 라디칼을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그의 백본 내에 30개 이하의 탄소 원자(예를 들어, 직쇄의 경우 C1-C30, 분지쇄의 경우 C3-C30), 더 구체적으로 20개 이하를 갖는다. 유사하게, 몇몇 시클로알킬은 그들의 고리 구조 내에 3-10개의 탄소 원자를 갖고, 더 구체적으로 고리 구조 내에 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다.
아울러, 발명의 상세한 설명, 실시예 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이 용어 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 다를 포함하는 것으로 의도되고, 치환된 알킬은 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상에수소를 대체하는 치환체를 갖는 알킬 모이어티를 의미한다. 그러한 치환체는 예를 들어, 할로, 히드록실, 카르보닐(예를 들어, 케토, 카르복시, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐(예를 들어, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕시, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 티오, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티는 적합하다면 스스로 치환될 수 있다는 것은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환체는 치환된 및 비치환된 형태의 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트를 포함함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트를 포함함), 및 실릴기 뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카르보닐(케톤, 알데히드, 카르복실레이트, 및 에스테르를 포함함), -CF3, -CN 등을 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 후술한다. 시클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등에 의해 추가로 치환될 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "알콕시"는 부착된 산소를 갖는 알킬기, 특정의 구체적인 실시양태에서, 저급 알킬기를 의미한다. 대표적인 알콕시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, t-부톡시 등을 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 지방족기를 의미하고, "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 둘 다를 포함하는 것으로 의도되며, "치환된 알케닐"은 알케닐기의 하나 이상의 탄소 상에 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알케닐 모이어티를 의미한다. 그러한 치환체는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에서 발생할 수 있다. 더구나, 그러한 치환체는 안정성이 금지적인 경우를 제외하고 상기한 바와 같이 알킬기에 대해 고려된 모든 것들을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴기에 의한 알케닐기의 치환이 고려된다.
화학적 모이어티, 예를 들어 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 함께 사용되는 경우 용어 "Cx-y"는 사슬 내에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "Cx-y 알킬"은 치환된 또는 비치환된 포화 탄화수소기를 의미하는데, 할로알킬기, 예를 들어 트리플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등을 포함하는 사슬 내에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 직쇄 알킬기 및 분지쇄 알킬기를 포함한다. "C0 알킬"은 상기 기가 말단 위치에 존재하는 경우 수소를 나타내고, 내부에 존재하는 경우 결합이다. 용어 "C2-y-알케닐" 및 "C2-y-알키닐"은 길이 및 상기한 알킬에 대해 가능한 치환이 유사하지만 각각 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유하는 치환된 또는 비치환된 불포화 지방족기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬아미노"는 적어도 하나의 알킬기로 치환된 아미노기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬티오"는 일반식 알킬-S-에 의해 나타낼 수 있는 알킬기로 치환된 티올기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 함유하는 지방족기를 의미하고, "비치환된 알키닐" 및 "치환된 알키닐" 둘 다를 포함하는 것으로 의도되는데, "치환된 알키닐"은 알키닐기의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 갖는 알키닐 모이어티를 의미한다. 그러한 치환체는 하나 이상의 삼중 결합에 포함되거나 또는 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에서 발생할 수 있다. 더구나, 그러한 치환체는 안정성이 금지적인 경우를 제외하고 상기한 바와 같이 알킬기에 대해 고려된 모든 것들을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴기에 의한 알케닐기의 치환이 고려된다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "아마이드"는 기를 의미하는데, 이때 Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 히드로카르빌기를 나타내거나, 또는 Rx 및 Ry는 그들이 부착되는 N 원자와 함께 고리 구조 내에서 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
용어 "아민" 및 "아미노"는 당해 기술분야에서 인식되고, 비치환된 및 치환된 아민 둘 다 및 이의 염, 예를 들어 또는 으로 나타낼 수 있는 모이어티를 의미하는데, 이때 Rx, Ry 및 Rz는 각각 독립적으로 수소 또는 히드로카르빌기를 나타내거나, 또는 Rx 및 Ry는 그들이 부착되는 N 원자와 함께 고리 구조 내에서 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노알킬"은 아미노기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "아르알킬"은 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 고리의 각각의 원자가 탄소인 치환된 또는 비치환된 단일 고리 방향족 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 고리는 5원 내지 7원 고리이고, 더 구체적인 실시양태에서는 6원 고리이다. 또한, 용어 "아릴"은 2개 이상의 탄소가, 고리의 적어도 하나가 방향족이고 예를 들어 다른 시클릭 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로시클릴일 수 있는, 2개의 인접하는 고리에 공통되는 2개 이상의 시클릭 고리를 갖는 폴리시클릭 고리 시스템을 포함한다. 아릴기는 벤젠, 나프탈렌, 페난트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다.
용어 "카르바메이트"는 당해 기술분야에서 인식되고, 또는 기를 의미하는데, 이때 Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 히드로카르빌기를 나타내거나, 또는 Rx 및 Ry는 그들이 부착되는 N 원자와 함께 고리 구조 내에서 4 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "시클로알킬"은 고리의 각각의 원자가 탄소인 비방향족 포화 또는 불포화 고리를 의미한다. 특정 실시양태에서, 시클로알킬 고리는 3개 내지 10개의 원자를 함유하고, 더 구체적인 실시양태에서 5개 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "카르보네이트"는 당해 기술분야에서 인식되고, -0CO2-Rx- 기를 의미하는데, 이때 Rx는 히드로카르빌기를 나타낸다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "카르복시"는 식 -CO2H로 나타내는 기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "에스테르"는 -C(O)ORx 기를 나타내는데, 이때 Rx는 히드로카르빌기를 나타낸다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "에테르"는 다른 히드로카르빌기에 산소를 통해 연결된 히드로카르빌기를 의미한다. 따라서, 히드로카르빌기의 에테르 치환체는 히드로카르빌-O-일 수 있다. 에테르는 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 에테르의 예는 헤테로사이클-O-헤테로사이클 및 아릴-O-헤테로사이클을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 에테르는 "알콕시알킬" 기를 포함하는데, 이는 일반식 알킬-O-알킬에 의해 나타낼 수 있다.
용어 "구아니디닐"은 당해 기술분야에서 인식되고, 일반식 에 의해 나타낼 수 있는데, 이때 Rx 및 Ry는 독립적으로 히드로카르빌기를 나타낸다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "할로" 및 "할로겐"은 할로겐을 의미하고, 클로로, 플루오로, 브로모, 및 요오도를 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤트아르알킬" 및 "헤테로아르알킬"은 헤트아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다.
용어 "헤테로아릴" 및 "헤트아릴"은 치환된 또는 비치환된 방향족 단일 고리 구조를 포함하는데, 특정의 구체적인 실시양태에서 5원 내지 7원 고리, 더 구체적으로 5원 내지 6원 고리를 포함하고, 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 몇몇 실시양태에서 1개 내지 4개의 헤테로원자, 및 더 구체적인 실시양태에서 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 또한, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤트아릴"은 2개 이상의 탄소가, 고리의 적어도 하나가 방향족이고 예를 들어 다른 시클릭 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로시클릴일 수 있는, 2개의 인접하는 고리에 공통되는 2개 이상의 시클릭 고리를 갖는 폴리시클릭 고리 시스템을 포함한다. 헤테로아릴기는 예를 들어 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 및 피리미딘 등을 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 의미한다. 전형적인 헤테로원자는 질소, 산소, 및 황이다.
용어 "헤테로시클릴", "헤테로사이클", 및 "헤테로시클릭"은 치환된 또는 비치환된 비방향족 고리 구조를 포함하는데, 특정의 구체적인 실시양태에서 3원 내지 10원 고리, 더 구체적으로 3원 내지 7원 고리를 포함하고, 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 몇몇 실시양태에서 1개 내지 4개의 헤테로원자, 및 더 구체적인 실시양태에서 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 또한, 용어 "헤테로시클릴" 및 "헤테로시클릭"은 2개 이상의 탄소가, 고리의 적어도 하나가 방향족이고 예를 들어 다른 시클릭 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로시클릴일 수 있는, 2개의 인접하는 고리에 공통되는 2개 이상의 시클릭 고리를 갖는 폴리시클릭 고리 시스템을 포함한다. 헤테로시클릴기는 예를 들어 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 모르폴린, 락톤, 락탐 등을 포함한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로시클릴알킬"은 헤테로사이클기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "히드로카르빌"은 =O 또는 =S 치환체를 갖지 않는 탄소 원자를 통해 결합된 기를 의미하는데, 전형적으로 적어도 하나의 탄소-수소 결합 및 주로 탄소 백본을 갖지만, 경우에 따라 헤테로원자를 포함할 수 있다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜, 및 트리플루오로메틸과 같은 기는 본 출원의 목적을 위해 히드로카르빌로 간주되지만, 치환체, 예를 들어 아세틸(연결 탄소 상에 =O 치환체를 가짐) 및 에톡시(탄소가 아니라 산소를 통해 연결됨)는 아니다. 히드로카르빌기는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 이의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "히드록시알킬"은 히드록시기로 치환된 알킬기를 의미한다.
화학적 모이어티, 예를 들어 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 함께 사용되는 경우 용어 "저급"은 치환체 내에 10개 이하의 비-수소 원자가 존재하는 기를 의미하는데, 특정 실시양태에서는 6개 이하이다. "저급 알킬"은 예를 들어 10개 이하의 탄소 원자, 구체적인 실시양태에서는 6개 이하의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 출원에서 정의된 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 알콕시 치환체는 각각 저급 아실, 저급 아실옥시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 및 저급 알콕시인데, 그들은 단독으로 또는 예를 들어 설명에서 히드록시알킬 및 아르알킬에서와 같이 다른 치환체와 함께 나타난다(이 경우, 예를 들어 아릴기 내의 원자는, 알킬 치환체 내의 탄소 원자를 계수하는 경우, 계수되지 않는다).
용어 "폴리시클릴", "폴리사이클", 및 "폴리시클릭"은, 2개 이상의 원자가 2개의 인접하는 고리에 공통되는 2개 이상의 고리(예를 들어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로시클릴)를 의미하는데, 예를 들어 상기 고리는 "융합 고리"이다. 폴리사이클의 각각의 고리는 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리사이클의 각각의 고리는 고리 내에 3 내지 10개의 원자, 더 구체적으로 5개 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "치환된"은 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환체를 갖는 모이어티를 의미한다. "치환" 또는 "∼으로 치환된"은 그러한 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가에 부합되고, 상기 치환이 안정한 화합물, 예를 들어 화합물이 사용되는 조건 하에서 예를 들어 재배열, 고리화, 제거 등에 의한 변환이 자연적으로 일어나지 않는 안정한 화합물을 초래한다는 암묵적인 단서를 포함한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환체를 포함하는 것으로 고려된다. 광의의 관점에서, 허용 가능한 치환체는 유기 화합물의 비환식 및 환식, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환체를 포함한다. 허용 가능한 치환체는 적합한 유기 화합물에 대해 동일하거나 상이할 수 있고, 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환체 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족하는 본 출원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용 가능한 치환체를 가질 수 있다. 치환체는 본 출원에 기재된 임의의 치환체, 예를 들어 할로겐, 히드록실, 카르보닐(예를 들어, 케토, 카르복시, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐(예를 들어, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프히드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티는 필요한 경우 자신이 치환될 수 있다는 것은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
"비치환된"이라고 구체적으로 기재하지 않으면, 본 출원의 화학적 모이어티에 대한 언급은 치환된 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "아릴" 기 또는 모이어티에 대한 언급은 치환된 및 비치환된 변이체 둘 다를 암묵적으로 포함한다.
용어 "설페이트"는 당해 기술분야에서 인식되고, -OSO3H 기 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.
용어 "설폰아미드"는 당해 기술분야에서 인식되고, 일반식 또는 에 의해 나타내는 기를 의미하는데, 이때 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 히드로카르빌을 나타낸다.
용어 "설폭사이드"는 당해 기술분야에서 인식되고, -S(O)-Rx 기를 의미하는데, 이때 Rx는 히드로카르빌을 나타낸다.
용어 "설포" 또는 "설포네이트"는 당해 기술분야에서 인식되고, -SO3H 기 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.
용어 "설폰"은 당해 기술분야에서 인식되고, -S(O)2-Rx 기를 의미하는데, 이때 Rx는 히드로카르빌을 나타낸다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오알킬"은 티올기로 치환된 알킬기를 의미한다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오에스테르"는 -C(O)SRx 또는 -SC(O)Rx를 의미하는데, 이때 Rx는 히드로카르빌을 나타낸다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오에테르"는 에테르와 균등한데, 이때 산소는 황으로 대체된다.
용어 "우레아"는 당해 기술분야에서 인식되고, 일반식 에 의해 나타낼 수 있는데, 이때 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 히드로카르빌을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 표준 합성 화학 기법, 예를 들어 하기 실시예 부분에 기재된 방법을 이용하여 합성된다. 다른 유용한 합성 기법은 예를 들어 문헌[참조: March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Ed., (Wiley, 2013); Carey 및 Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4 th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001); Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27 (Wiley, 2013); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-81 (Wiley, 2013); 및 Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989), 이들 모든 문헌은 그 전체 내용이 참고로 인용된 것이다]에 기재되어 있다. 상기 화합물은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법을 이용하여 용이하게 제조되거나, 또는 일반적으로 시판되는 출발 물질을 이용하여 통상적으로 합성된다[참조: 예를 들어, Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27 (Wiley, 2013), 또는 Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, 부록 포함].
본 발명의 화합물의 성분을 언급하는 경우, 용어 "∼로부터 유도된 잔기"는 공유결합을 형성하기 위해 제1 성분 상의 제1 반응성 작용기와 제2 성분 상의 제2 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된 잔기를 기재하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제1 성분 상의 아민기는 제2 성분 상의 활성화된 카르복실기와 반응하여 하나 이상의 아마이드 모이어티를 포함하는 잔기를 형성할 수 있다. 제1 및 제2 반응성 작용기의 다른 치환은 본 발명에 의해 포함된다. 예를 들어, 아지드-치환된 제1 성분과 알킬-치환된 제2 성분의 구리-촉매된 또는 구리를 함유하지 않는 반응은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 널리 공지된 "클릭(click)" 반응을 통해 트리아졸 함유 잔기를 형성한다[참조: Kolb et al. (2001) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40: 2004; Evans (2007) Aus. J. Chem. 60: 384]. "클릭" 반응을 이용하여 비펩티드 형광 이미징 프로브를 생성하는 예시적인 방법은 PCT 국제 공보 WO 2012/118715에 제공된다. 본 발명의 화합물, 특히 본 발명의 화합물의 프로테아제 타겟팅 요소를 생성하거나 또는 변형하기 위한 이들 방법의 적용은 당해 기술분야의 기술 범위 내에 있다.
당해 기술분야의 통상의 기술자는, 보호기가 원하는 위치에서 다른 제제의 반응을 조절하는 분자의 그 위치에 가역적으로 부착된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 화합물의 합성에 유용한 보호기는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다[참조: Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4 th edition, by P. G. M. Wuts 및 T. W. Greene (Wiley-Interscience, 2006); 및 Protecting Groups, by P. Kocienski (Thieme, 2005)].
본 발명의 화합물의 L0 및 L1 기는 대상 화합물에 각각 검출 가능한 요소 D 및 켄처 Q를 연결하는 링커 기이다. 각각의 링커 기는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 독립적으로 임의의 적합한 화학적 링커일 수 있다. L0 및 L1 기는 바람직하게는 알킬 링커 기인데, 이때 상기 알킬 링커는 임의 치환되고, 또한 이때 링커 내의 탄소는 생성된 구조가 화학적으로 안정한 정도까지 헤테로원자에 의해 임의 치환된다. 그러한 치환 및 대체는 링커 내에 개재하는 기, 예를 들어 에테르, 티오에테르, 다이설파이드, 에스테르, 아마이드, 카르보네이트, 카르바메이트 등을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직한 링커는 길이가 5 내지 40 결합 범위이고, 분지쇄, 직쇄일 수 있거나, 또는 고리를 함유할 수 있다. 링커는 몇몇 경우에 이중 결합을 포함할 수 있다. 이들은 필요하다면 링커를 함유하는 화합물의 특정 필요조건에 따라 소수성 또는 친수성일 수 있다.
구체적인 실시양태에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 임의 치환된 알킬 링커일 수 있는데, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다. 더 구체적인 실시양태에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 C2-8 알킬 링커이다. 더욱 더 구체적인 실시양태에서, L1은 C4 알킬 링커이다.
또한, L0 기와 검출 가능한 요소 D, 및 L1 기와 켄처 Q 사이의 연결은 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 적합한 화학적 연결일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 몇몇 경우에 예를 들어 아미노기, 티올기 등과 같은 특정 화학 기와 반응하는 모이어티를 검출 가능한 요소 또는 켄처 전구체 내에 포함시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 반응성의 검출 가능한 요소 또는 켄처는 그러한 상황에서 상기 화합물 상의 아미노기, 티올기 등과 반응성 기와의 반응을 통해 화합물에 용이하게 부착될 수 있다. 따라서, 이러한 유형의 화학적 연결은, 연결의 구조적인 상세한 내용이 명시적으로 밝혀지지 않음에도 불구하고, 개시된 화합물의 범위 내에 있는 것으로 이해된다.
몇몇 실시양태에 따라, 화학식 (I)의 화합물에서 L1 기는 생체 내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 실시양태에서, 따라서 L1 기는 폴리에틸렌글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함하여 변형된 화합물을 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 화합물의 AA1 및 AA2 기는 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 독립적으로 임의의 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄일 수 있거나, 또는 "-L1-Q" 기일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, AA1 기는 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2 기는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된다. 구체적인 실시양태에서, AA1 기는 라이신 측쇄이고, AA2 기는 페닐알라닌 측쇄이다. 몇몇 실시양태에서, AA1 기는 -L1-Q이고, AA2 기는 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 다른 실시양태에서, AA1 기는 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2 기는 -L1-Q이다. 여전히 다른 실시양태에서, AA1 및 AA2 기는 독립적으로 산성 아미노산 잔기 유래의 측쇄, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기 유래의 측쇄, 또는 알킬 아미노산 잔기, 예를 들어 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 또는 임의 조합의 다른 그러한 아미노산 잔기 유래의 측쇄이다. 또한, 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 타이로신, 글루타민, 아스파라진 등 유래의 측쇄는 본 발명의 화합물 내의 AA1 또는 AA2 기로서 적합하다.
AA1 또는 AA2 기가 "-L1-Q"인 화합물 실시양태에서, L1 링커 성분은 아미노산 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 라이신 잔기는 적절히 활성화된 켄처와의 반응을 위한 아미노-알킬기를 용이하게 제공한다.
몇몇 화합물 실시양태에서, U 기는 O이다.
몇몇 화합물 실시양태에서, R 기는 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환되는 알킬기이다. 더 구체적으로, R 기는 자신이 임의 치환되는 아릴로 치환되는 알킬기일 수 있다. 더욱 더 구체적으로, R 기는 예를 들어 벤질기와 같은 임의 치환된 아르알킬기일 수 있다.
본 발명의 화합물의 검출 가능한 요소 D는 비제한적으로 광학적, 전기적, 또는 화학적 검출 방법을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 화학기이다. 구체적인 실시양태에서, 검출 가능한 요소는 형광 라벨, 발광종, 인광종, 포지트론 방출 물질을 포함하는 방사성 물질, 나노입자, SERS 나노입자, 퀀텀 닷 또는 다른 형광 결정성 나노입자, 회절 입자, 라만 입자, 킬레이트된 금속을 포함하는 금속 입자, 자기 입자, 마이크로스피어, RFID 태그, 마이크로바코드 입자, 또는 이들 라벨의 조합이다. 더 구체적인 실시양태에서, 검출 가능한 요소는 형광 라벨, 킬레이트된 금속 등을 포함하는 방사성라벨이다. 이들 화합물 내에 사용하기 위해 적합한 방사선라벨 및 킬레이트된 금속은 그 전체 내용이 본 출원에 참고로 인용된 PCT 국제 공보 WO 2009/124265에 기재되어 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 실시양태에서, 검출 가능한 요소는 형광 라벨이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 형광 라벨은. 입사 전자기 조사의 흡수에 의해 자극되는 경우, 전자기 방사, 바람직하게는 가시광 또는 근적외광을 방출한다. 예를 들어 아미노기, 티올기 등과 같은 반응성 기에 라벨을 커플링하기 위해 유용한 반응성 모이어티를 갖는 라벨을 포함하는 다양한 종류의 형광 라벨은 시판되고 있다[참조: 예를 들어, 그 전체 내용의 본 출원에 참고로 인용되는 The Molecular Probes ® Handbook―A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific]. 다양한 근적외선(NIR) 형광 라벨을 포함하는 다른 유용한 형광 시약은 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products로부터 구입할 수 있다.
전형적으로 700-900 nm 영역에서 흡수하는 근적외선 형광단은 조직 이미징을 위해 특히 적합한데, 그 이유는 이들 파장의 광은 짧은 광, 예를 들어 가시광 파장 보다 더 깊이 조직을 투과할 수 있기 때문이다. 본 발명의 화합물에 유용하게 사용되는 예시적인 근적외선 형광 라벨은 미국 네브라스카주에 소재하는 LI-COR Biosciences에서 시판되는 IRDye 적외선 염료이다. 이들 염료의 비제한적인 예는 IRDye 800CW, IRDye 680RD, IRDye 680LT, IRDye 750, IRDye 700DX, IRDye 800RS, 및 IRDye 650이다.
생체 내 이미징 적용을 위해 특히 적합한 적외선 염료의 다른 예는 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products에서 구입할 수 있는 벤조피릴륨의 DyLight 시리즈이다. 이들 염료의 비제한적인 예는 DyLight 675-B1, DyLight 675-B2, DyLight 675-B3, DyLight 675-B4, DyLight 679-C5, DyLight 690-B1, DyLight 690-B2, DyLight 700-B1, DyLight 700-B2, DyLight 730-B1, DyLight 730-B2, DyLight 730-B3, DyLight 730-B4, DyLight 747-B1, DyLight 747-B2, DyLight 747-B3, DyLight 747-B4, DyLight 775-B2, DyLight 775-B3, DyLight 775-B4, DyLight 780-B1, DyLight 780-B2, DyLight 780-B3, DyLight 800, 및 DyLight 830-B2이다. 바람직한 근 IR 형광단은 하기 구조를 갖는 DyLight 780B 및 DyLight 800이다:
및 .
또한, 상기 임의의 염료의 약학적으로 허용 가능한 염은 이들 적용을 위해 적합한 것으로 간주된다.
가시광 파장을 갖는 유용한 형광 라벨의 예는 면역형광 레이블링에 폭넓게 사용되는 플루오레세인이다. 플루오레세인은 최대 흡수 파장이 495 nm인 크산텐 염료이다. 관련된 형광단은 플루오레세인의 플루오르화 유도체인 오레곤 그린이다.
본 발명의 화합물에 사용하기에 적합한 다른 예시적인 형광 라벨은 보라-디아자-인데센, 로다민, 및 시아닌 염료이다. 특히, 보라-디아자-인데센 염료는 BODIPY® 염료로 공지된 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센으로 나타낸다. 이들 염료의 여러 가지 유도체는 공지되어 있고, 본 개시 내용의 화합물에서 검출 가능한 요소로서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다[참조: 예를 들어, Chen et al. (2000) J. Org. Chem. 65: 2900-2906].
로다민 염료는 로다민 고리 구조에 기초한 염료의 부류이다. 로다민은 특히 단백질 컨쥬게이트, 특히 항체 및 아비딘 컨쥬게이트를 제조하기 위한 매우 흔한 형광단인 테트라메틸로다민(TMR) 및 올리고뉴클레오티드 레이블링 및 자동화된 핵산 서열결정을 위해 통상적으로 사용되는 염료인 카르복시 테트라메틸-로다민(TAMRA)을 포함한다. 로다민은 플루오레세인계 형광단에 대한 천연 보충물로서 확립되었는데, 이는 더 긴 최대 파장 방출 및 이에 따른 다색 레이블링 또는 염색을 위한 폭넓은 기회를 제공한다.
또한, Alexa Fluor 염료로 공지된 설폰화된 로다민 시리즈의 형광단도 로다민 염료 그룹 내에 포함된다. 현대 형광단 기술의 획기적인 진보는 Molecular Probes에 의해 도입된 Alexa Fluor에 의해 예시된다. 이들 설폰화된 로다민 유도체는 스펙트럼적으로 유사한 프로브보다 더 강한 형광 방출을 위한 더 높은 양자 효율을 나타내고, 증강된 광안정성, 통상적인 레이저 라인에 매칭된 흡수 스펙트럼, pH 둔감, 및 높은 정도의 수용해도를 포함하는 몇 가지 추가적인 개선된 특징을 갖는다.
시아닌 염료는 관련된 염료 Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 및 그들의 유도체의 패밀리에 상응하는데, 이들은 가변 탄소수의 폴리알켄 브리지에 의해 연결되는 2개의 방향족 유닛을 가진 부분적으로 포화된 인돌 질소 헤테로시클릭 핵에 기초한다. 이들 프로브는 플루오레세인 및 테트라메틸로다민과 같은 전통적인 다수의 염료와 유사한 플루오레세인 여기 및 방출 프로필을 나타내지만, 증강된 수용해도, 광안정성, 및 더 높은 양자 효율을 갖는다. 대부분의 시아닌 염료는 그들의 전통적인 상대보다 환경적으로 더 안정하며, 이는 그들의 플루오레세인 방출 강도를 pH 및 유기 마운팅 매질에 덜 민감하도록 한다. Alexa Fluor와 유사한 방식으로, 합성 염료인 Cy 시리즈의 여기 파장은 통상적인 레이저 및 아크 방출 소스와 함께 이용하기 위해 구체적으로 조정되고, 형광 방출은 전통적인 필터 조합을 이용하여 검출될 수 있다. 시아닌 염료는 반응성 염료 또는 형광단으로서 용이하게 이용할 수 있다. 시아닌 염료는 일반적으로 Alexa Fluor 패밀리의 멤버보다 더 넓은 흡수 스펙트럼을 가지며, 이는 공초점 현미경을 위한 레이저 여기 소스의 선택에 있어서 이들을 다소 더 다재다능하게 만든다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 검출 가능한 요소는 시아닌 염료 Cy5이다.
몇몇 실시양태에서, 검출 가능한 요소는 벤조인돌 염료, 예를 들어 인도시아닌 그린("ICG") 또는 인도시아닌 그린의 잔기를 포함한다:
인도시아닌 그린은 다양한 의학적 진단 용도, 예를 들어 심장 질환, 간 질환, 안 질환 및 순환 질환을 모니터링하고 이미징하는데 사용된다. 이롭게도, 인도시아닌 그린 및 관련 화합물은 근적외선 영역 내에서 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸다. 예를 들어, ICG는 주로 600 nm 및 900 nm 사이를 흡수하고, 주로 750 nm 및 950 nm 사이를 방출한다. 그러한 파장은 생물학적 조직을 투과할 수 있는데, 따라서 ICG 및 관련 화합물을 이용하는 이들 조직의 이미징을 가능하게 한다. 더구나, 의학 진단 연구에서 장기적이고 광범위한 ICG의 이용은 이들 화합물의 생체적합성을 입증한다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 검출 가능한 요소는 하기 구조를 갖는 벤조인돌 염료를 포함한다:
상기 식에서, o는 1 내지 4의 정수이고;
R1은 설포네이트 또는 카르보네이트로 임의 치환된 C2-C8 알킬기이고;
각각의 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬기이며;
L2는 임의 치환된 알킬 링커인데, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다.
더 구체적으로, 벤조인돌 염료는 하기 구조를 가질 수 있다:
.
벤조인돌 함유 염료는 예를 들어 문헌[참조: Zhang et al. (2005) Chem. Commun. 2005: 5887 (DOI: 10.1039/b512315a)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다[참조: 미국 특허 출원 공보 2009/0214436 A1].
몇몇 실시양태에서, L2는 임의 치환된 저급 알킬 링커인데, 이때 각각의 탄소 원자는 헤테로원자로 임의 치환된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 검출 가능한 요소에 사용된 형광 라벨은 pH 의존성 형광단일 수 있다. 그러한 형광 라벨은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 라벨의 환경의 pH에 의존하는 형광 스펙트럼을 나타내고, 따라서 반응 후 라벨의 환경에 관한 정보, 예를 들어 반응성 화합물에 의해 레이블링된 프로테아제의 유형 또는 위치에 관한 정보를 보고하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 검출 가능한 요소에 포함된 여러 가지 라벨의 pH 의존성 형광은 널리 알려져 있다[참조: 예를 들어, The Molecular Probes ® Handbook―A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies].
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 검출 가능한 요소 내에 다수의 검출 가능한 기, 예를 들어 형광 라벨, 방사성라벨, 킬레이트된 금속 등을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 다수의 레이블링은 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 일상적인 커플링 화학을 이용하여 달성될 수 있다.
또한, 본 명세서의 화합물은 전형적으로 켄처 기 Q를 포함한다. 용어 "켄처"는 형광단의 방출을 조절하는 화학 물질(chemical entity)이다. 몇몇 경우에서, 켄처는 그 자신이, 형광이 켄칭되는 라벨과는 구별되는 특정 파장에서 형광을 방출하는 형광 분자일 수 있다. 따라서, 형광단은 다른 염료에 적절히 커플링되는 경우 켄처로서 작용할 수 있고, 반대의 경우도 동일하다. 이들 상황에서, 공여체 라벨의 형광에 대한 상이한 파장의 것인 수용체 분자 유래의 형광에서의 증가는 예를 들어 라이소좀의 내부 또는 다른 세포 구획과 같은 그의 환경과 레이블링된 화합물의 상호작용을 별도로 보고할 수 있다. 몇몇 경우에서, 켄처는 그 자체가 형광을 방출하지 않는다(즉, 켄처는 "다크 수용체"이다). 그러한 켄처는 예를 들어 dabcyl, 메틸 레드, QSY 디아릴로다민 염료 등을 포함한다. 특히, dabcyl(4-디메틸아미노-페닐아조)벤조산)은 DNA 검출을 위한 "분자 비콘(molecular beacons)"과 같은, 다수의 분석에서 광범위하게 사용되는 통상적인 다크 켄처이다(미국 특허 5,989,823). "블랙 홀 켄처"로서 언급되는 BHQ 시리즈의 디아조 염료는 다수의 형광단의 방출을 잘 중첩하는 넓은 흡수 범위를 제공한다(참조: PCT 국제 공보 WO 01/86001). Molecular Probes에서 시판되는 QSY 시리즈 염료는 다수의 바이오어세이에서 켄칭 시약으로서 광범위하게 사용되는 다크 켄처 염료의 다른 예이다.
특히 QSY7은 비형광 디아릴로다민 유도체이다(미국 특허 출원 공보 2005/0014160). QSY21은 가시광 스펙트럼에서 강한 흡수를 갖는 비형광 디아릴로다민 발색단이고, 효과적인 형광 켄처이다. 설포-QSY21은 QSY21의 설포네이트 버젼이다(도 1a 참조). 형광단/켄처 쌍은 추가로 미국 특허 출원 공보 2004/0241679에 예시된다.
IRDye QC-1(Li-Cor에서 시판됨)은 본 발명의 화합물에서 켄처로서 사용하기에 적합한 비형광 염료의 다른 예이다(도 6a 참조). 이는 가시광 영역으로부터 근적외선까지의 파장의 범위를 포함하는 넓은 범위의 형광단으로부터의 형광을 효율적으로 켄칭한다.
다른 관점에서, 본 명세서는 하기 화학식 (II)를 갖는 화합물을 제공한다:
상기 식에서,
n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
R1은 QSY 켄처 또는 QC-1이고;
R2는 벤조인돌 염료이다.
이들 화합물의 몇몇 실시양태에서, n"는 4이다.
이들 화합물의 몇몇 실시양태에서, n'는 2, 4, 또는 6이다.
구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 하기 구조식을 갖는다:
다른 관점에서, 본 개시 내용의 화합물은 하기 화학식 (III)을 갖는다:
상기 식에서,
D는 벤조인돌 염료를 포함하는 검출 가능한 요소이고;
L0는 링커이며;
T는 경우에 따라 켄처를 포함하는 프로테아제 타겟팅 요소이며,
단 L0는 에톡시에톡시 스페이서를 포함하지 않는다.
화학식 (III)의 화합물에서 프로테아제 타겟팅 요소 T는 프로테아제에 의해 인식될 수 있고, 라이소좀자극성 단편 D-L0-NH3 +를 방출하기 위해 상기 프로테아제에 의해 촉매적으로 가수분해되는 임의의 적합한 화학 구조이다. 펩티드 및 비펩티드 프로테아제 타겟팅 요소를 포함하는 그러한 구조의 비제한적인 예는 프로테아제 효소학 분야에서 널리 알려져 있다. 구체적인 실시양태에서, 프로테아제 타겟팅 요소는 4개 이하의 아미노산 잔기 또는 3개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 구조이다. 더 구체적인 실시양태에서, 프로테아제 타겟팅 요소는 2개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 구조이다. 예를 들어, 상기한 바와 같이 화학식 (I)의 화합물은 2개의 아미노산 잔기를 함유하는 프로테아제 타겟팅 요소를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 프로테아제 타겟팅 요소는 카텝신, 특히 카텝신 L 또는 카텝신 V에 의한 절단에 특이적인 구조이다.
몇몇 실시양태에서, 화학식 (III)의 화합물 내의 T 기는 생체 내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 실시양태에서, 따라서 T 기는 변형된 화합물을 안정화시키기 위해 폴리에틸렌글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, L0는 폴리에틸렌글리콜 기를 포함하지 않는다.
화학식 (III)의 몇몇 실시양태에서, 프로테아제 타겟팅 요소는 인데, 이때
AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄이며;
U는 O, NH, 또는 S이며;
R은 상기 화학식 (I)의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
구체적인 실시양태에서, AA1은 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된다. 다른 구체적인 실시양태에서, U는 O이다. 여전히 다른 구체적인 실시양태에서, R 기는 예를 들어 벤질기와 같은 아르알킬기이다.
상기 프로테아제 타겟팅 요소의 몇몇 실시양태에서, AA1은 켄처를 포함한다. 이들 실시양태에서, AA1은 구조 -L1-Q를 가질 수 있는데, 이때 L1은 상기 정의한 바와 같은 링커이고, Q는 켄처이다.
이들 실시양태 중 몇몇에서, L1 기는 생체 내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 이들 실시양태에서, 따라서 L1 기는 변형된 화합물을 안정화시키기 위해 폴리에틸렌글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 화학식 (III)의 화합물에서 카스파아제 타겟딩 요소 T는 켄처를 포함한다.
화학식 (III)의 화합물 내의 L0 링커 기는 앞에서 기재한 링커 중 임의의 것일 수 있다.
약학 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 그러한 화합물은, 예를 들어 동물에서 조직의 이미징에 유용하고, 또한 동물에서 효소, 예를 들어 프로테아제 효소의 활성을 평가하는데 유용하다. 특히, 프로테아제 기질 및 특히 카텝신 기질인 본 발명의 화합물의 경우, 약학 조성물은 암세포의 비침습적 광학적 이미징을 위한 제제로서 유용하게 기능할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 기술분야에 널리 알려져 있고, 예를 들어 수용액, 예를 들어 물 또는 생리적으로 완충처리된 염수 또는 다른 용매 또는 비히클, 예를 들어 글리콜, 글리세롤, 오일, 예를 들어 올리브유 또는 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 그러한 약학 조성물이 인간 투여를 위한 것인 경우, 수용액은 발열원이 없거나, 또는 실질적으로 발열원이 없다. 부형제는 예를 들어 제제의 지연 방출을 도모하거나, 또는 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기를 선택적으로 타겟팅하기 위해 선택될 수 있다. 약학 조성물은 단위 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐, 스프링클 캡슐, 과립, 분말, 시럽, 좌약, 주사제 등일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 경피 전달 시스템, 예를 들어 피부 패치로 존재할 수도 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어 본 발명의 화합물을 안정화시키거나 또는 이의 흡수를 증가시키기 위해 작용하는 생리적으로 허용 가능한 제제를 함유할 수 있다. 그러한 생리적으로 허용 가능한 제제는, 예를 들어 탄수화물, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스 또는 텍스트란, 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 글루타치온, 킬레이팅제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 생리적으로 허용 가능한 제제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체의 선택은 예를 들어 상기 조성물의 투여 경로에 따라 달라진다. 또한, 약학 조성물은 예를 들어 본 발명의 화합물이 내부에 통합될 수 있는 리포좀 또는 다른 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인지질 또는 다른 지질로 구성되는 리포좀은 비독성이고, 생리적으로 허용 가능하며, 대사 가능하며, 제조 및 투여가 상대적으로 단순한 담체이다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 합리적인 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없고, 이상적인 이익/위험 비율에 부합되면서 인간 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미하기 위해 본 출원에서 사용된다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 한 장기 또는 신체의 부분으로부터 다른 장기 또는 신체의 부분으로 대상 화합물을 운반하거나 수송하는데 연루된 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과의 상용성 및 환자에 대한 무해성의 관점에서 "허용 가능"하여야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 기능할 수 있는 물질의 몇 가지 예는 (1) 당, 예를 들어 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜; (12) 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예를 들어 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; (15) 알긴산; (16) 무발열원 물; (17) 등장성 염수; (18) 링커 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 포스페이트 완충 용액; 및 (21) 약학 제형에 사용된 다른 비독성의 상용성 물질을 포함한다[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed. (Alfonso R. Gennaro ed.), 2000].
본 발명의 화합물을 함유하는 약학적으로 허용 가능한 조성물은, 예를 들어 경구적으로(예를 들어, 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액 중에서와 같은 드렌치, 정제, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트); 설하로; 항문으로; 직장으로 또는 질로(예를 들어, 페사리, 크림, 또는 폼); 비경구적으로(예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액으로서 근육 내로, 정 맥내로, 피하로, 또는 척추강 내로를 포함); 코로; 복강 내로; 피하로; 경피로(예를 들어, 피부에 부착하는 패치로서); 또는 국소적으로(예를 들어, 피부에 도포하는 크림, 연고 또는 스프레이로서)를 포함하는 다수의 임의 투여 경로에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 흡입을 위해 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 멸균수 중에 단순히 용해 또는 현탁될 수 있다. 적합한 투여 경로 및 이를 위해 적합한 조성물의 상세한 내용은 미국 특허 6,110,973; 5,763,493; 5,731,000; 5,541,231; 5,427,798; 5,358,970 및 4,172,896뿐만 아니라 본 출원에 인용된 특허에서 확인할 수 있다.
조직을 레이블링하고 종양을 시각화하는 방법
다른 관점에서, 본 개시 내용은 동물에서 조직을 레이블링하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
아직 다른 관점에서, 본 개시 내용은 동물에서 종양을 시각화하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계, 및 상기 조성물과 프로테아제, 구체적으로 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 상기 동물에서 생성된 검출 가능한 신호를 측정하는 단계로서, 이때 상기 검출 가능한 신호는 동물에서 종양과 관련되는 것인 단계를 포함한다.
몇몇 방법 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 형광 신호이다. 몇몇 실시양태에서, 형광 신호는 종양 마진에서 생성된다.
동물에 대한 펩티드 이미징제의 투여는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해된다. 바람직한 실시양태에서, 임의의 다른 적합한 투여 수단이 본 발명의 범위 내에서 고려됨에도 불구하고, 이미징제는 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 방법은 동물에서 프로테아제, 특히 시스테인 프로테아제의 레이블링 및 시각화에 관한 것이다. 적합한 동물은 특히 종양 세포에서 시스테인 프로테아제를 발현하는 동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 동물은 포유동물이다. 매우 바람직한 실시양태에서, 동물은 인간이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 동물은 가축동물 또는 애완동물이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 동물에서 생성된 검출 가능한 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 검출 가능한 신호를 측정하는 방법은 이미징 방법, 예를 들어 형광 이미징 방법을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 형광 이미징 시스템은, 예를 들어 Xenogen IVIS 100 시스템, IVIS 스펙트럼 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA), 또는 임의의 다른 적합한 비침습적인 생체 내 형광 이미징 시스템이다. 몇몇 실시양태에서, 검출 가능한 형광 신호는 다빈치 수술 시스템(Intuitive Surgical, Inc., Sunnyvale, CA)을 이용하여 측정된다. 추가로 상세히 후술하는 바와 같이, 그러한 시스템은 즉각적인 이미징제로 처리된 환자 조직에서 수술중 형광 유도 수술 기법과 함께 즉각적인 레이블링 및 시각화 방법을 실행하기 위해 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 명세서는 동물에서 조직을 레이블링하는데 사용하기 위한 화합물을 제공한다. 상기 화합물의 상세한 내용은 앞에서 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 이들 화합물은 조직을 레이블링하기 위해 동물에게 투여된다. 또한, 상기 화합물은 동물에서 종양을 시각화하는데 사용하기 위해 제공된다. 상기한 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 상기 화합물은 동물에게 투여되고, 동물에서 상기 화합물과 프로테아제, 구체적으로 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 생성된 검출 가능한 신호는 종양을 시각화하기 위해 측정된다.
본 발명 또는 이의 임의의 실시양태의 범위를 벗어나지 않으면서 본 출원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 변경이 가능하다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 너무나 명백할 것이다. 지금까지 상세하게 설명한 본 발명은 후술하는 실시예를 참조하여 더 명확하게 이해될 것이다. 실시예는 단지 본 발명을 예시할 목적으로 기재된 것이며, 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.
실시예
켄칭된 형광 기질의 디자인 및 합성
강력하고 선택적인 ABP(이하, 화합물 1로서 예시함)의 최근 보고된 시리즈의 화학 구조는 본 출원에 보고된 켄칭된 형광 기질 프로브를 디자인하기 위한 출발점으로서 사용되었다[참조: Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135: 14726-30 및 PCT 국제 공보 WO 2014/145257].
디자인 과정의 일부분으로서, 개선된 수용해도와 결부된, 타겟 프로테아제를 억제하지 않으면서 신호를 생성할 수 있는 기질의 능력은 본래의 공유결합 프로브와 비교하여 생체 내에서 더 신속하게 활성화되고 더 밝은 신호를 생성하는 기질 유사체로 귀착되었다. 절단 가능한 아마이드 결합은 비가역적인 티올-반응성 테트라플루오로 페녹시메틸케톤(PMK) 친전자체 대신에 사용되었다(도 1a). 카텝신 활성을 이미징하기 위한 최적의 기질을 선택하기 위해, 켄칭된 형광 기질 프로브의 6원 라이브러리는 2가지의 구조적 변형의 도입에 의해 디자인되었다. 첫째, 기질과 켄처 사이의 알킬 스페이서의 길이는 카텝신에 의한 프로브의 절단/비켄칭 효율에 대한 스페이서 길이의 영향을 측정하기 위해 변화시켰다. 3가지의 상이한 스페이서 길이는 [(CH2)n], n= 2, 4 및 6의 범위에서 선택되었는데, 이는 기질 2CQ(화합물 2), 4CQ(화합물 3), 6CQ(화합물 4)를 나타낸다. 둘째, Cy5 형광단의 위치는 라이신 측쇄의 아민기로부터 P1 아마이드 결합에 인접한 말단 아민으로 스위칭되어 각각 기질 2QC(화합물 5), 4QC(화합물 6), 및 6QC(화합물 7)를 생성하였다(도 1a). 문자 C 및 Q는 각각 형광단(Cy5) 및 켄처(QSY21-설포) 성분에 대응된다. 이론에 구속되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 라이소좀 내 nQC 프로브의 효소적 절단 후에, 절단된 생성물의 Cy5 부분 상의 유리 말단 아민은 라이소좀 내 산성 pH 환경으로 인해 양성자화되는 것으로 생각된다. 따라서, 생성된 양이온성 Cy5는 라이소좀 구획 내에 유지되는데, 그 이유는 막을 가로지르는 양이온 종의 확산이 느리기 때문이다. 이러한 잠재 라이소좀자극성 효과(LLE)에 기인하는 라이소좀 구획 내에서 양이온성 형광단의 증강된 체류는 차례로 비침습성 이미징 중에 종양 부위에서 형광 신호의 지속기간을 증폭 및 유지시킨다(도 1b).
모두 6개 기질 프로브의 합성은 하기 스킴 1에 나타낸 바와 같이 고체 상 및 용액 상 화학의 조합에 의해 수행되었다. Fmoc 고체 상 화학은 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 상에서 n-알킬 디아민, Boc-N-라이신, 및 Z-페닐알라닌을 어셈블링하기 위해 사용되었다. 디클로로메탄 중의 1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 이용하는 수지로부터 기질의 선택적인 절단은 상이한 길이의 알킬 스페이서를 갖는 각각의 기질의 코어 구조를 생성하였다. 역상 분취용 HPLC에 의한 정제 후, 생성물은 2개의 부분으로 분할되었다. 설포-QSY21-NHS 또는 Cy5-NHS는 DMSO 중의 별개의 절반의 유리 말단 아민에 커플링되고, 이어서 DCM 중의 50% TFA 내의 라이신 상의 Boc-보호기가 제거되었다. 최종 켄칭된 기질은 라이신 측쇄 상에 Cy5-NHS(nCQ 기질에 대해) 또는 설포-QSY21-NHS(nQC 기질에 대해)를 커플링함으로써 수득되었다. HPLC에 의한 정제 후, 프로브는 시험관 내에서 여러 가지 재조합 시스테인 카텝신에 대한 활성에 대해 테스트되었다.
켄칭된 형광 기질의 시험관내 분석
모두 6개 기질의 활성 및 선택성은 여러 가지 재조합 시스테인 프로테아제, 구체적으로 카텝신 L, S, K, B, 및 V의 존재 하에서 각각 내적으로 켄칭된 프로브의 전환 곡선을 모니터링함으로써 결정되었다. 각 효소의 동일한 농도(5 nM)는 50 mM의 시트레이트 완충액(pH = 5.5, 5 mM DTT, 0.1% 트리톤 X, 0.5% CHAPS)에서 상이한 프로브와 함께 37℃에서 항온처리하였다. 사용된 여러 가지 카텝신의 정확한 농도는 공유결합 시스테인 프로테아제 억제제 ZFK-PMK 및 카텝신 S, L, B, 및 V를 위한 시판되는 기질 Z-VVR-AMC 또는 카텝신 K를 위한 Z-KR-AMC를 이용하여 활성 부위 적정[참조: Boucher et al. (2014) Methods Mol. Biol. 1133:3-39]에 의해 확인되었다. Cy5 형광(카텝신에 의한 프로브 절단의 지표임)의 증가 속도는 각각의 프로브에 대해 측정되었다.
켄칭된 기질(nQC 및 nCQ, n = 2, 4, 6) 모두는 카텝신 L, V, S 및 K에 의해 절단되었지만, 사용된 조건 하에서 카텝신 B에 의한 형광의 증가는 관찰되지 않았다(도 2). 테스트된 카텝신 중에서, Cat L은 모든 프로브를 이용하여 가장 높은 형광의 증가를 생성하였는데, 이는 시스테인 카텝신 L에 대한 라이브러리의 강한 선택성을 암시한다(도 2, 각 패널의 상부 기록). 흥미롭게도, 기질의 절단은 형광단 및 켄처 쌍의 배향에 의해 영향을 받지 않았는데, 그 이유는 nCQ 및 nQC 프로브 둘 다 여러 가지 카텝신에 의해 동일한 정도로 절단되었기 때문이다(도 2, 우측 패널과 비교하여 좌측 패널). 대조적으로, 효소에 의한 촉매/절단 효율(K cat /K M)과 기질의 p1 위치에 인접한 알킬 스페이서의 길이 사이에 강한 상관관계가 존재하는 것으로 나타났다(도 3a). 예를 들어, Cat L에 관해, 촉매 효율의 4배 증가는 2CQ 및 6CQ 사이에서 관찰되었지만, 6배 증가는 2QC 및 6QC 사이에서 관찰되었다(표 1 및 도 3a). 이러한 관찰은 Cat V에 대해서도 일관되었는데, 효율의 8배 및 4배 증가는 각각 2 및 6과 동일한 스페이서 길이 n 사이에서 관찰되었다(표 2). 촉매 효율에서 이러한 차이는 전적으로 전환수(kcat)의 차이에 기인하는데, 그 이유는 모든 기질의 Km은 Cat L에 대해 상당히 동일하게 유지되었기 때문이다(표 1). 시험관 내에서 기질의 더 높은 효소적 전환은 특히 주목할 만 한데, 그 이유는 더 높은 전환수는 비침습적 이미징 중 세포에서 그러한 프로브의 더 신속한 활성화를 나타낼 수 있기 때문이다.
많은 암의 한 가지 전형적인 특징은 종양 주변 부위에 대한 카텝신 풍부한 면역 세포, 예를 들어 마크로파지의 증가된 침윤이다[참조: Shree et al. (2011) Genes Dev. 25: 2465-79; Bell-McGuinn et al. (2007) Cancer Res. 67: 7378-85]. 따라서, 시스테인 카텝신 활성의 비침습적 이미징을 위한 가능한 제제로서 켄칭된 기질을 이용하기 이전에, 마크로파지 유래 세포주 RAW264.7에서 프로테아제의 활성화가 먼저 측정되었다. 세포는 프로브와 함께 항온처리하고, 이어서 형광 현미경관찰에 의해 이미징되었다. 1 μM의 각각의 켄칭된 기질 nCQ 및 nQC는 10% FBS와 함께 DMEM 중에서 CO2 분위기 하의 37℃에서 30분 동안 RAW264.7 세포와 함께 항온처리되었다. 세포는 PBS로 세척되고, 라이소좀 선택적 마커 라이소트랙커 레드 및 Hoechst 33342 핵 스테인으로 염색되고, PBS로 3회 세척되고, 이어서 생세포 이미징을 위해 PBS에 현탁되었다. 강한 Cy5 형광 프로브는 세포와 함께 항온처리된 각각의 켄칭된 기질에 대해 관찰되었는데, 이는 이들 프로브가 이러한 마크로파지 유래 세포주에서 시스테인 프로테아제에 의해 활성화된다는 것을 입증한다(도 3b). 생세포에서의 레이블링은, 라이소트랙커 레드를 이용하는 프로브의 강한 동시-국부화에 의해 확인되는 바와 같이, 산성 소낭에 대해 매우 특이적이었다. 비공유결합 기질의 레이블링 형태학은 공유결합 라벨 화합물 1로 처리된 세포의 그것과 유사하였는데, 이는 세포 내로의 유사한 진입 모드를 나타낸다.
가역적 기질을 이용하는 종양의 비침습적 광학적 이미징
시험관 내에서 및 세포 기반 분석에서 기질의 활성을 입증하였으므로, 다음으로 기질은 유방암의 공통 유전자 동일부위 이식 마우스 모델에서 평가되었다. 이 모델에서, 4T1 세포는 종양을 생성하기 위해 마우스의 좌측 넘버 1 및 10 유방 지방 패드 내에 접종된다. LLE의 영향을 결정하기 위해, 라이소좀자극성 프로브 2QC(화합물 5) 및 6QC(화합물 7)의 이미징 신호는 비라이소좀자극성 유사체 2CQ(화합물 2) 및 6CQ(화합물 4)의 이미징 신호와 직접 비교되었다. 기질은 종양 보유 마우스에 정맥 내로 투여되었고, 마우스는 투여 후 다양한 시점에서 이미징되었다. 켄칭된 기질 프로브의 전환으로부터의 Cy5 형광의 신속한 축적은 투여 후 30분 미만에서 종양 내 및 종양 주변에서 관찰되었고, 정상 조직의 주변으로부터 종양의 경계를 표시하는 충분한 조영은 1 시간 이내에 관찰되었다(도 4a). 형광 신호의 강도는 투여 후 4 시간에 최대에 도달하였고, 그 후 신호 세기는 감소되었다(도 4b). 종양에서 전체적인 절대 형광 세기는 비라이소좀자극성 기질 2CQ 및 6CQ와 비교하여 LLE 기질 2QC 및 6QC를 주사한 마우스의 경우 더 높고 더 밝았다. 또한, 신호의 강도는 LLE 기질을 투여한 마우스의 종양에서 24 시간의 기간에 걸쳐 일정하게 유지되었지만, 비-LLE 기질 유래의 신호는 24 시간 후 거의 완전히 사라졌다(도 4a 및 4b). 유사한 경향이 4 시간 후 및 24 시간 후 안락사시킨 마우스로부터 절제한 종양의 생체 외 이미징에 의해 관찰되었다(도 4c). 이들 데이터는 저분자량의 가역적으로 결합하는 조영제의 디자인에서 잠재 라이소좀자극성 효과의 가치를 입증한다.
어떤 세포 집단이 생체 내에서 켄칭된 기질 프로브의 활성화를 담당하는지를 결정하기 위해, 각각의 기질이 주사된 마우스로부터 단리된 냉동 조직 절편에 대한 면역형광 염색은 마크로파지 선택적인 마커 CD68을 이용하여 수행되었다. 기질의 Cy5 신호는 단지 CD68-양성 세포(마크로파지)만에 동시국부화되었고, 4T1 종양 세포에서 관찰된 신호는 없었다(도 5a). 더구나, 24 시간 후, Cy5 형광은 단지 nQC 기질이 수용된 마우스 유래의 조직에서만 관찰되었고, nCQ 기질로 처리한 마우스 유래의 조직에서는 관찰되지 않았다(도 5b). 또한, 이들 결과는 종양에서 프로브 체류를 증강시키기 위한 전략으로서 LLE의 유용성을 입증한다.
다빈치 수술 시스템을 이용하는 FGS에서 프로브의 적용
다빈치 수술 시스템은 복강경 수술을 위해 전세계 병원에서 현재 사용되고 있는 Intuitive Surgical Inc.에 의해 제작된 로봇 수술 시스템이다. 그러나 이 시스템을 이용하는 수술 절차는 현재 백색광 조명 하에서 수행되는데, 이는 정상 조직 주변과 종양 마진의 경계를 구분하기 위해 충분한 조영을 제공하지 못한다. 따라서, 기존의 다빈치 시스템과도 양립할 수 있고, 형광 유도 수술(FGS)에서 현저히 개선된 치료 결과를 얻어야 하는 종양 타겟팅된 조영제의 개발은 매우 가치가 있다.
따라서, 상기한 최적화된 기질 프로브는 FGS의 임상적으로 관련된 모델 시스템에서 테스트되어 왔다. 이러한 결과를 획득하기 위해, 가역적 프로브 6CQNIR(화합물 8) 및 이 기질의 라이소좀자극성 유사체 6QCNIR(화합물 9)이 합성되었다. 이들 화합물에서, Cy5 발색단은 유사한 분자량의 근적외선(NIR) DyLight 780-B1 형광단으로 전략적으로 치환되었다. n=6을 갖는 링커를 가진 화합물은 시험관 내에서 카텝신에 의한 최적 전환수에 기초하여 선택되었다. 또한, QSY21-설포 켄처는 다크 NIR 켄처인 IRDye QC-1으로 치환되었다(도 6a). 다빈치 로봇의 카메라 시스템 상에서 검출 가능하다는 것 이외에, NIR 염료의 방출 파장(783/799 nm의 최대 흡수/방출)은 낮은 전체 백그라운드를 가진 윈도우 내에 들어가고, 따라서 조직 투과를 개선시킬 것이고, 이미징 중 신호 대 백그라운드 비율을 개선시킬 것이다[참조: Richards-Kortum 및 Sevick-Muraca (1996) Annu. Rev. Phys. Chem. 47: 555-606]. NIR 프로브는 먼저 IVIS-스펙트럼 이미징 시스템을 이용하는 상기한 4T1 유방암 모델에서 조영제로서 분석되었다. 조영제의 전신 투여 후, 마우스는 4 시간 동안 매시간 마다, 이어서 기질 주사 후 6, 8, 12 및 24 시간에 비침습적으로 이미징되었다. 프로브 신호의 신속한 축적은 이식된 유방 종양에서 관찰되었다. 구체적으로, 건강한 주변 조직과 종양 마진의 경계를 구분하는 실질적인 조영은 프로브 둘 다의 주사 후 1 시간 만큼의 조기에 관찰되었다(도 6b). 종양에서 형광 신호의 강도는 2가지 프로브 유형을 주사한 마우스에서 신속하게 증가하였고, 이는 실질적으로 4 내지 6 시간 사이에서 정점에 달했다. 이 시점은 이러한 부류의 비공유결합 켄칭된 형광 프로브의 전신 투여 후 종양을 이미징하기 위한 최적 윈도우를 의미할 수 있다. 초기 프로브와 유사하게, 근적외선 유사체는, 비-LLE 기질에 비해(도 6b 및 6c) 및 종양의 생체 외 분석 후에(도 6d) LLE 기질 6QCNIR을 주사한 마우스의 종양에서 더 느린 클리어런스 속도 및 더 밝은 신호에 의해 입증되는 바와 같이, 라이소좀 트랩핑 효과를 나타냈다. 1 시간과 4 시간 사이에, 기질 둘 다는 유사한 초기 강도를 나타냈는데, 이는 카텝신에 의한 기질 둘 다의 활성화 속도가 동일하다는 것을 나타낸다. Cy5 프로브와 유사하게, NIR 유사체는 신장 클리어런스에 의해 제거되었는데, 그 이유는 가장 높은 신호 축적이 신장 내에서 및 종양 내에서 관찰되었기 때문이다(도 6e).
소형 동물 이미징 시스템을 이용하여 긍정적인 결과를 얻었으므로, 다음으로 다빈치 수술 시스템을 이용하는 이미지 유도 절제 연구가 수행되었다. 이 로봇 수술 시스템(도 7a)은 최소 침습적인 복강경 수술 절차를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 시스템은 NIR 신호를 갖는 조영제를 시각화하기 위해 백색광 이미징 시스템 이외에도 사용될 수 있는 NIR 카메라가 장착되어 있다. 따라서, 다수의 암 모델에서 종양 절제 연구를 수행할 수 있었다. 결장암 모델에서 수술적 절제(APC 마우스; 도 7b)가 선택되었을 뿐만 아니라, 유방암 모델(4T1 이식 모델; 도 7c) 및 전이성 폐암 모델(도 7d)도 이용하였다. 각각의 수술의 경우, 다빈치 로봇은 양성 프로브 신호의 절제를 수행하기 위해 사용되었다. 또한, 조직은 조직학적 분석을 수행하기 위해 동물로부터 제거되었고, 따라서 기질 양성 조직에서 암 세포의 존재를 확인하였다.
전체적으로 이들 결과는, NIR 형광 기질 프로브가 3가지 모든 암 모델에서 종양을 강조할 수 있었음을 확인시켜 주었다. 또한, 기존의 다빈치 로봇 시스템은 암 병변을 확인하고, 추가 분석을 위해 이들을 제거하기 위해 사용될 수 있었다.
도 8a-8c는 이탈기에 킬레이터를 함유하는 카텝신 프로브의 구조 및 동물에서 카텝신 활성을 이미징하기 위한 PET 기질 프로브의 용도를 나타낸다. 폐 섬유증의 블레오마이신 유도된 뮤린 모델에서 섬유성 질환 진행에 대한 마크로파지의 기여를 모니터링하기 위해, 아테롬성경화증의 뮤린 모델에서 활성화된 마크로파지 집단을 이미징하기 위해, 및 인간 경동맥 경화반을 국소적으로 이미징하기 위해 유사한 프로브를 이용하는 것이 최근 보고되어 왔다[참조: Withana et al. (2016) Sci. Rep. 6: 19755 and Withana et al. (2016) J. Nucl. Med. 57: 1583-1590, 이들 각각은 그 전체 내용이 본 출원에 참고로 인용됨].
방법
일반론
모든 수지 및 시약은 상업적인 공급업자로부터 구매되었고, 추가 정제 없이 사용되었다. 반응 및 수성 처리를 위해 사용된 물은 탈이온수 공급물로부터 유리-증류되었다. 시약 등급 용매는 모든 비수성 추출을 위해 사용되었다. 모든 감수성 반응은 아르곤 양압 하의 무수 용매 중에서 수행되었다. 반응은 API 150EX 단일-4극자 질량 분광분석기(Applied Biosystems)를 이용하는 LC-MS에 의해 분석되었다. 합성된 화합물은 C18 컬럼을 이용하는 ÅKTA explorer 100(Amersham Pharmacia Biotech)으로 역상 HPLC에 의해 정제되었다. 화합물은 이중 증류수 및 용매로서 1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴의 구배를 이용하여 용출되었다. NMR 스펙트럼은 펄스장 구배 악세사리가 장착된 Varian 400 MHz(400/100), Varian 500 MHz(500/125) 상에서 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400(400 MHz) 또는 Bruker Avance 500(500 MHz) 장비 상에서 25℃에서 기록되었고, MestReNova NMR 프로세싱 소프트웨어를 이용하여 처리되었다. 화학적 이동(δ)은 테트라메틸실란으로부터 다운필드로 백만분율(ppm)로 기록되었고, NMR 용매(CDCl3, δ = 7.25) 중의 잔류 프로튬 신호에 대해 참조되었다. 데이터는 다음과 같이 기록된다: 화학적 이동, 다중도(s=단일항, d=이중항, t=삼중항, m=다중항 및 q=사중항), 헤르츠(Hz)의 커플링 상수(J) 및 적분. 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DEME(GIBCO Cat# 11995))에서 배양되었다.
화합물 합성
스킴 1은 이들 연구에서 사용된 일련의 초기 형광 기질의 합성을 요약한다.
스킴 1. 비공유결합 켄칭된 형광 활성 기반 기질의 6-멤버 라이브러리의 합성.
중간체 1a, 1b, 및 1c.
0.5 g의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(0.84 mmol/g 로딩)는 3개의 고체 상 반응 용기 내로 중량 측정되었다. 반응 용기는 a 내지 c로 레이블링되었다. 디클로로메탄(DCM)은 수지를 현탁하기 위해 첨가되고, 반응은 실험실 진탕기를 이용하여 15분 동안 교반되었다. DCM으로 2회 세척한 후, 3 mL의 DCM 중의 모노-Fmoc-1,3-에탄올디아민(0.35 g, 1.26 mmol), 모노-Fmoc-1,4-부탄디아민(0.39 g, 1.26 mmol), 및 모노-Fmoc-1,6-헥산디아민(0.43 g, 1.26 mmol)이 용기 a, b 및 c에 각각 첨가되었다. 이어서, 디이소프로필에틸아민(DIPEA, 3eq)이 각각에 첨가되고, 반응물은 실온에서 30분의 기간 동안 교반되었다. 이어서, 수지는 DCM으로 세척되고, 이어서 메탄올 내에서 10분 동안 현탁되어 미반응된 트리틸-클로라이드를 불활성화시켰다. Fmoc 탈보호는 1 시간의 지속 기간 동안 DMF 중의 20% 피페리딘 용액 중에서 수지를 현탁시킴으로써 수행되었고, 이어서 DCM 및 DMF로 각각 3회 세척되었다. 다음으로, 제1 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.58 g, 1.26 mmol)은 3 mL의 DMF 중의 HBTU(0.48 g, 1.26 mmol) 및 DIPEA(0.17 g, 1.26 mmol)를 이용하고 2 시간 동안 혼합물을 회전시켜 수지에 커플링되었다. 세척 사이클 후, Fmoc 탈보호는 1 시간 동안 DMF 중의 20% 피페리딘 5 mL을 이용하여 수행되고, 이어서 세척 사이클이 반복되었다. 잔류 아미노산 Cbz-Phe-OH는 수지 상의 펩티드에 유사하게 커플링되었다. 이어서, 수지는 DMC 중의 1% 트리플루오로아세트산 용액으로 처리하여 수지로부터 펩티드(생성된 Boc-보호된 라이신을 가짐)를 절단하였다. 용매는 톨루엔과 함께 동시 증발에 의해 각각의 절단된 생성물로부터 제거하여 중간체 기질 1a, 1b 및 1c를 생성하였다(스킴 1). 이어서, 각각의 생성물은 역상 분취용 HPLC로 추가 정제하여 순도가 95%를 초과하는 최종 펩티드를 얻었다.
기질 2CQ, 4CQ, 및 6CQ (화합물 2, 3, 및 4)
별도의 1 mL 에펜도르프 튜브에서, 중간체 1a(2.0 mg, μmol), 1b(2.0 mg, μmol) 및 1c(2.0 mg, μmol)은 100 μL의 DMSO 중에 용해되었다. DIPEA(3 μL, μmol), 이어서 QSY21-설포-NHS (1.2, mmol)가 첨가되었다. 반응은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 이어서 HPLC에 의해 생성물의 정제가 수행되었다. 용매는 라이신 상의 Boc-보호가 DCM 중의 30% TFA를 이용하는 30분 동안의 처리에 의해 제거된 후 회전 증발에 의해 제거되었다. 용매 제거 후, 생성물은 동결건조되고, 이어서 DMSO 및 3 당량의 DIPEA 중의 Cy5-NHS와 반응되었다(스킴 1). 최종 생성물은 각각 역상 HPLC로 정제되어 비라이소좀자극성 켄칭된 형광 기질 nCQ(이때, 각각 n = 2, 4, 및 6)를 수득하였다.
기질 2QC, 4QC, 및 6QC (화합물 5, 6, 및 7)
별도의 1 mL 에펜도르프 튜브에서, 중간체 1a(2.0 mg, μmol), 1b(2.0 mg, μmol) 및 1c(2.0 mg, μmol)은 100 μL의 DMSO 중에 용해되었다. DIPEA(3 μL, μmol), 이어서 Cy5-NHS (1.2, mmol)가 첨가되었다. 반응은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 이어서 HPLC에 의해 생성물의 정제가 수행되었다. 용매는 라이신 상의 Boc-보호가 DCM 중의 30% TFA를 이용하는 30분 동안의 처리에 의해 제거된 후 회전 증발에 의해 제거되었다. 용매 제거 후, 생성물은 동결건조되고, 이어서 DMSO 및 3 당량의 DIPEA 중의 QSY21-설포-NHS와 반응되었다(스킴 1). 최종 생성물은 각각 역상 HPLC로 정제되어 잠재 라이소좀자극성 효과 켄칭된 형광 기질 nQC(이때, 각각 n = 2, 4, 및 6)를 수득하였다.
스킴 2. 다빈치 수술 로봇과 상용성인 근적외선 비공유결합 켄칭된 형광 활성 기반 프로브의 합성.
방사선레이블링
개략적으로, 64Cu-LO263은 100 μL의 나트륨 아세테이트 완충액(0.1 M, pH 5.5) 내의 4 mCi의 64CuCl2와 함께 90 μL의 나트륨 아세테이트 완충액(0.1 M, pH 5.5) 내의 10 μL의 LO263 10mM)(FIG. 8A)의 37℃에서 1 시간 동안의 항온처리에 의해 제조되었다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물은 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 이어서, 64Cu-LO263은 이동상으로서 3분 동안 95% 용매 A(0.1% TFA를 갖는 증류수) 및 5% 용매 B(0.1% TFA를 갖는 아세토니트릴)로부터 출발하여 23분에 5% 용매 A 및 95% 용매 B까지를 이용하는 RP-HPLC에 의해 정제되었다. 이어서, 64Cu-LO263(체류 시간 18.9분)을 함유하는 용출된 분획은 수집되고, 회전 증발기를 이용하여 건조되었다. 방사선레이블링 수율은 90%였다(HPLC로부터 계산됨). 다른 피크에 대한 주 생성물 피크의 비율로서 규정된 방사화학적 순도는 방사선-HPLC에 의해 >95%로 측정되었고, 프로브의 특이적인 활성은 3-4 Ci/mmol로 결정되었다. 이어서, 64Cu-LO263은 0.9% 염수 내에 재구성하고, 0.22 μm 밀리포어 필터를 통해 멸균 바이알 내로 통과시켜 동물 PET/CT 이미징을 위해 사용되었다.
PET 생체 내 이미징
마우스에게 100 μCi의 64Cu-LO263를 정맥 내 주사하고, Inveon 소형 동물 PET/CT(Siemens)를 이용하여 2 시간 및 24 시간 후에 이미징하였다(도 8b). 개략적으로, CT 해부 이미지 스캔은 약 0.1 mm의 픽셀 크기로 얻었다(80 kV, 500 μA). CT 이미징 후, 전신 PET 이미징은 5분 정지 스캔으로 수행되었다. PET 이미지는 CT 감쇠에 기초한 배열된 부분집합 기대값 최대화 3차원 알고리즘(OSEM-3D)을 이용하여 재구성되고, Inveon Research Workplace(IRW) 소프트웨어(Siemens)를 이용하여 분석되었다. PET 복셀 크기는 총 128 x 128 x 159 복셀에 대해 0.796 x 0.861 x 0.861 mm였다. 이어서, PET/CT 정량화 분석이 수행되었고, 조직 방사선활성이 계산되고, 조직 1 그램당 주사된 투여량의 감쇠-보정된 백분율(%ID/g)로 나타냈다. 실험을 수행한 조사자들은 어떤 그룹이 이미징되고 있었는지 모르게 하였다.
합성 화합물의 NMR 스펙트럼
2CQ(2)
LCMS: C99H108N10O21S5 2+에 대한 계산치: 966.81; 실측치; 966.8, HRMS: C99H108N10O21S5 2+에 대한 계산치: 966.8159; 실측치: 966.8121.
4CQ(3)
LCMS: C101H112N10O21S5 2+에 대한 계산치: 980.8; 실측치; 980.6, HRMS: C101H112N10O21S5 2+에 대한 계산치: 980.8315; 실측치: 980.8264.
6CQ(4)
LCMS: C103H116N10O21S5 2+에 대한 계산치: 994.8; 실측치; 994.8, HRMS: C103H116N10O21S5 2+에 대한 계산치: 994.8472; 실측치: 994.8444.
2QC(5)
LCMS: C99H108N10O21S5 2+에 대한 계산치: 966.81; 실측치; 966.8, HRMS: C99H108N10O21S5 2+에 대한 계산치: 966.8159; 실측치: 966.8122.
4QC(6)
LCMS: C101H112N10O21S5 2+에 대한 계산치: 980.8; 실측치; 980.8, HRMS: C101H112N10O21S5 2+에 대한 계산치: 980.8315; 실측치: 980.8267.
6QC(7)
LCMS: C103H116N10O21S5 2+에 대한 계산치: 994.8; 실측치; 994.8, HRMS: C103H116N10O21S5 2+에 대한 계산치: 994.8472; 실측치: 994.8429.
켄칭된 인도시아닌 그린 레이블링된 형광 기질의 디자인 및 합성
인도시아닌 그린 검출 가능한 요소를 포함하는 이미징 프로브는 하기 스킴에 나타낸 바와 같이 합성되었다:
3 mg의 출발 화합물은 상기 합성 스킴에 나타낸 바와 같이 과량의 인도시아닌 그린(ICG)-NHS 에스테르로 처리되었다. 하룻밤 반응 후, 생성물은 LCMS: m/z = 446[M/3+1], 668.5[M/2+1], 892[2M/3+1]를 이용하여 분석되었다.
반응의 생성물은 분취용 HPLC에 의해 단리되었다. 수율 = 5.7mg, 4.25 μmol, 89%(약간 습윤).
BOC 보호기는 DCM 중의 50% TFA를 이용하여 제거되었다.
ICG-레이블링된 중간체는 다음과 같이 활성화된 QC-1 켄처와 추가로 반응되었다.
2.77 mg의 출발 화합물은 상기 합성 스킴에 나타낸 바와 같이 과량의 QC-1 NHS 에스테르로 처리되었다. 1일 동안 반응 후, 생성물은 LCMS: m/z=1150[M/2+1]를 이용하여 분석되었다.
반응의 생성물은 2회의 분취용 HPLC에 의해 정제되고, 동결건조되었다. 수율 = 2.2 mg, 0.96 μmol, 44%.2.2mg, 0.96umol, 44% 수율.
DyLight 780-B1-레이블링된 및 ICG-레이블링된 켄칭된 기질 프로브를 비교하는 생체 내 마우스 연구
마우스 종양 모델 시스템에서 상기 확인된 ICG-레이블링된 프로브(ex/em: 805/835 nm)와 DyLight 780-B1-레이블링된 프로브(ex/em: 783/799 nm)가 비교되었다. 개략적으로, 4T1 유방암 세포는 대상 마우스의 지방 패드 내로 주사되었다. 종양은 10-12일 동안 성장되도록 하고, 이어서 프로브는 꼬리 정맥에 의해 주사되었다(3가지 투여량: 마우스 당 10, 50, 100 nmol). 이어서, 대상 마우스는 Licor PEARL(785/820 nm) 상에서 이미징되었다.
도 9a 및 9b에서 DyLight 780-B1-레이블링된 프로브 및 ICG-레이블링된 프로브의 비교에서 확인할 수 있는 바와 같이, 가장 밝은 신호는 50 nmol의 6QC-ICG를 이용하여 얻어진다. 비교를 위해, 이 프로브로부터의 신호는 6QC-DyLight 780-B1을 이용하는 상응하는 조건 하에서 관찰된 신호 강도의 거의 3배이다.
형광에 대한 프로브 농도의 효과는 도 10a 및 10b에 제시되어 있는데, 이때 10 nmol, 50 nmol, 및 100 nmol의 DyLight 780-레이블링된 프로브로 처리된 동물의 이미지(도 10a)는 10 nmol, 50 nmol, 및 100 nmol의 ICG-레이블링된 프로브로 처리된 동물의 이미지(도 10b)와 비교된다. 50 nmol 이미지에서 가장 명료한 바와 같이, ICG-레이블링된 프로브로 처리했을 때의 형광의 양은 DyLight 780-레이블링된 프로브로 처리했을 때의 형광의 양보다 유의적으로 더 컸다.
추가로 두 프로브 사이의 신호에서의 차이는 도 11a-11d에 나타낸 바와 같이, 생체 외 연구에 의해 정량화되었는데, 이때 각각 50 nmol 및 100 nmol의 DyLight 780-B1-레이블링된 프로브 및 ICG-레이블링된 프로브로 처리한 동물은 8 시간에 희생시키고, 여러 가지 동물 조직과 관련된 형광이 정량화되었다. 도 11a 및 11b는 레이블링 8 시간 후 3가지 농도에서 DyLight 780-레이블링된 프로브(도 11a) 및 ICG-레이블링된 프로브(도 11b)로 처리된 동물의 전신 이미지를 비교한다. 도 11c 및 11d는 DyLight 780-레이블링된(도 11c) 또는 ICG-레이블링된(도 11d) 동물을 이용하는 프로브의 각각의 농도에 대해 특정된 조직 각각에서 관찰된 형광을 비교한다. 도 10a, 10b, 11a, 및 11b에 나타낸 전체 동물 이미징 연구로부터 예상된 바와 같이, 유의적으로 더 높은 형광 신호는 DyLight 780-레이블링된 프로브로 처리된 동물 유래의 종양 샘플(도 11c)과 비교하여 ICG-레이블링된 프로브로 처리된 동물 유래의 종양 샘플(도 11d)에서 유의적으로 더 높은 형광 신호가 관찰되었다.
본 출원에 언급된 모든 특허, 특허 공보, 및 기타 간행된 참고문헌은 각각 본 출원에 개별적이고 구체적으로 참고로 인용된 바와 같이, 그 전체 내용이 참고로 인용된 것이다.
구체적인 실시예가 제공되었지만, 상기 기재는 예시적인 것이며 제한적인 것은 아니다. 이전에 기재된 실시양태의 하나 이상의 임의의 특징은 본 발명의 임의의 다른 실시양태의 하나 이상의 특징과 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본 발명의 다수의 변형은 본 명세서에 기초하여 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 전체 범위의 균등물과 함께 첨부된 청구범위를 참조하여 결정되어야 한다.

Claims (49)

  1. 화학식 (I)을 갖는 화합물:

    상기 식에서,
    D는 벤조인돌 염료이고;
    Q는 QC-1 켄처이며;
    L0 및 L1은 각각 독립적으로 (CH2)n이며, 이때 n은 2-8의 정수이며;
    AA2는 아르알킬이며;
    U는 O, NH, 또는 S이며;
    R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴알킬, 또는 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환되며;
    각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알크아미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알크아미노, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시클로알콕시, 시클로알카노일, 시클로알크아미노, 헤테로시클릴, 헤테로시클릴옥시, 헤테로시클릴아미노, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알콕시, 헤테로시클릴알카노일, 헤테로시클릴알크아미노, 히드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카르복시, 카르보네이트, 카르바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이며;
    벤조인돌 염료는 하기 구조를 갖는 것인 화합물이다:

    상기 식에서,
    o는 1 내지 4의 정수이고;
    R1은 설포네이트 또는 카르보네이트로 임의 치환된 C2-C8 알킬기이며;
    각각의 R2는 독립적으로 C1-C6 알킬기이며;
    L2는 C2-8 알킬 링커이다.
  2. 제1항에 있어서, 벤조인돌 염료는 하기 구조를 갖는 것인 화합물:
    .
  3. 제1항에 있어서, AA2는 각각 단일 5원 내지 7원 고리를 갖는 1 내지 3개의 A 기로 임의 치환된 C2-8 알킬기를 포함하는 아르알킬인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, U는 O인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, L1은 C4 알킬 링커인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (II)를 갖는 화합물:

    상기 식에서,
    n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
    R1은 QC-1 켄처이며;
    R2는 벤조인돌 염료이다.
  7. 제6항에 있어서, n"는 4인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, n'은 2, 4, 또는 6인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 하기 구조식에 따른 화합물:
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 동물에서 종양 조직 레이블링에 사용하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 동물에서 종양을 시각화하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 방법은
    조성물을 동물에게 투여하는 단계; 및
    상기 조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출 가능한 신호를 측정하는 단계로서, 이때 검출 가능한 신호는 동물에서 이병 조직과 관련되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 검출 가능한 신호는 형광 신호인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 형광 신호는 근적외선 신호인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 검출 가능한 신호는 종양 마진(tumor margin)에서 생성되는 것인 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 검출 가능한 신호는 이미지 유도 수술 장치를 이용하여 측정되는 것인 조성물.
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