KR102668593B1 - 생체내 영상화를 위한 프로테아제 활성화 조영제 - Google Patents

생체내 영상화를 위한 프로테아제 활성화 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는, 영상 유도 수술에서 조영제로서 유용한 화합물이 제공된다. 상기 화합물은 처리된 조직, 특히 종양 및 다른 병에 걸린 조직 내에서 리소좀 프로테아제에 의한 절단시 검출가능한 잠재적 양이온 리소좀향성 단편을 포함한다. 본 발명에서는 또한 상기 화합물을 포함하는 조성물 및, 예를 들어 영상 유도 종양 절제 수술 동안 생체내 프로테아제 활성을 역학적으로 모니터링하는 데 있어 상기 화합물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

생체내 영상화를 위한 프로테아제 활성화 조영제
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2015년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제62/106,400호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
정부 지원에 대한 진술
본 발명은 미국국립보건원(NIH)이 수여한 프로젝트 번호 R01 EB005011 및 R01 HL116307 하에 정부 지원으로 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
수술적 개입은 실질적으로 모든 유형의 고형 종양을 위한 현재 가장 일반적인 치료법이다(Siegel et al. (2012) CA Cancer J. Clin . 62:220-41; DeSantis et al. (2014) CA Cancer J. Clin . 64:252-71). 따라서, 성공적인 결과는 수술 동안 손상된 원발성 장기 및 잠재적인 전이 부위 모두로부터 모든 암세포를 완전히 제거하는지에 달려 있다(Vahrmeijer et al. (2013) Nat. Rev. Clin . Oncol . 10:507-18). 암에서의 특정 바이오마커를 표적으로 하는 조영제(contrast agent)는 치료 결과를 개선하기 위해 고형 종양의 수술적 절제를 안내하기 위한 수술중 조영제로 사용될 수 있다(Miwa et al. (2014) J. Orthop . Res. 32:1596-601; Fujita (2012) J. Am. Coll . Surg . 215:591). 다양한 영상 기법 중에서, 형광 조영제를 이용하는 광학 기반 기술이 커다란 잠재성이 있다(Rudin and Weissleder (2003) Nat. Rev. Drug Discov . 2:123-31; Bednar et al. (2007) Expert Opin . Drug Discov . 2:65-85). 인도시아닌 그린(ICG), 플루오레세인, 메틸렌 블루, 및 5-아미노레불리르산(5-ALA)이 다양한 종양의 시각화를 위한 주사가능한 증강제로서 현재 승인된 모든 비표적화 조영제이다(Schaafsma et al. (2011) J. Surg . Oncol . 104:323-32; Tanaka et al. (2006) Ann. Surg . Oncol . 13:1671-81). 또한, 몇 가지 표적화 조영제가 다양한 임상 개발 단계에 있다(Kovar et al. (2007) Anal. Biochem . 367: 1-12). 특히, 엽산 수용체-α를 표적으로 하는 FITC 프로브가 난소암의 치료를 위한 수술중 형광 유도 수술(fluorescence-guided surgery; FGS)의 가치를 입증하기 위해 임상 시험에서 사용되었다(van Dam et al. (2011) Nat. Med . 17:1315-9). 또한, 클로로톡신-Cy5.5와 같은 다른 종양 표적화제가 다양한 암 마우스 모델을 사용하여 악성 암세포의 광학 영상화에 대해 검증되었다. 그러나 이 제제의 종양 선택성 기전은 잘 이해되지 않고 있다(Veiseh et al. (2007) Cancer Res. 67:6882-8).
일반적인 종양 표적화 조영제에 대한 대안적인 접근법은 종양 또는 주변 변연부(margin)와 관련된 효소 활성에 의해 작용할 때 종양 조직에서만 신호를 생성하거나 축적하는 소위 "스마트 프로브(smart probe)"의 사용이다. 스마트 프로브 설계에서 한 가지 유용한 전략은 프로테아제에 의해 절단될 때 신호를 생성하는 프로브를 제조하는 것이다. 프로테아제는 종양 성장 및 전이에서뿐만 아니라 섬유증, 염증, 골다공증, 및 관절염과 같은 다양한 병리학에서 중요한 역할을 하기 때문에, 프로테아제에 의해 활성화되는 조영제는 많은 질환의 검출 및 치료에 유용할 수 있다(Turk (2006) Nat. Rev. Drug Discov . 5:785-99; Drag and Salvesen (2010) Nat. Rev. Drug Discov . 9:690-701).
종양 영상화 분야를 위한 많은 프로브는 혈관신생 및 종양 성장에서의 보고된 역할 때문에 기질 금속 단백질분해효소(matrix metallo protease; MMP)를 표적으로 하였다. 이는 절단시 신호를 생성하는 소분자 및 거대 중합체 기반 프로브뿐만 아니라 MMP에 의해 절단될 때 세포 내에 축적되는 잠복성의(masked) 세포 투과 펩타이드를 포함한다. MMP의 대안으로서, 시스테인 카텝신은 종양형성의 다양한 측면의 중요한 조절물질이다(Shree et al. (2011) Genes Dev . 25:2465-79). 이러한 프로테아제는 또한 많은 세포에서 고도로 발현되고 활성화되어 내인성 염증 반응을 조절한다(Mohamed and Sloane (2006) Nat. Rev. Cancer 6:764-75). 일반적으로, 시스테인 카텝신 활성은 면역 세포의 침윤 증가로 인해 실질적으로 모든 고형 종양에서 증가한다(Mitchem et al. (2013) Cancer Res. 73:1128-41; McIntyre and Matrisian (2003) J. Cell. Biochem . 90:1087-97; Fonovic and Bogyo (2007) Curr . Pharm . Des. 13:253-61; Gocheva et al. (2010) Genes Dev . 24:241-55). 따라서, 시스테인 카텝신은 종양 특이적 조영제의 설계에서 표적이 되었다. 이러한 제제는 전환(turnover) 동안 카텝신을 공유적으로 변형시키는 형광 활성 기반 프로브(Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem . Soc . 135:14726-30; Lee and Bogyo (2010) ACS Chem . Biol . 5:233-43; Blum et al. (2005) Nat. Chem . Biol . 1:203-9; Blum et al. (2007) Nat. Chem . Bio. 3:668-677; Verdoes et al. (2012) Chem . Biol . 19:619-28), 다양한 고분자량 및 저분자량 ??칭된 기질 프로브(Watzke et al. (2008) Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 47:406-9; Hu et al. (2014) Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 53:7669-73), 및 형광 턴온(turn-on) 기질 프로브(Kisin-Finfer et al. (2014) Bioorg . Med . Chem . Lett . 24:2453-8; Chowdhury et al. (2014) J. Med. Chem . 57:6092-104; Fujii et al. (2014) Bioconjug . Chem . 25:1838-46)를 포함한다. 상기 보고된 모든 프로테아제 유발 스마트 프로브가 암 마우스 모델에서 종양 변연부의 영상화에 유용한 것으로 입증되었지만(Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem . Soc . 135:14726-30; Hu et al. (2014) Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 53:7669-73; Mito et al. (2012) Cancer 118:5320-30), 모두 종양 대조도(contrast) 측면에서 한계가 있으며, 임상적으로 승인된 영상화 기기와 함께 사용된 것은 없다. 게다가, 대부분은 거대 종양이 피부 표면 또는 그 근처에서 영상화되는 암의 간단한 이식 모델만을 사용하여 검증되었다. 따라서, 다수의 종양 유형에 대해 향상된 대조도를 가지며 기존 수술적 작업 흐름의 범위 내에서 기존 임상 기기와 함께 사용될 수 있는 표적화 조영제의 최적화가 많은 수술 절차를 변화시킬 것이다.
카텝신과 같은 활성 프로테아제를 함유하는 세포의 영상화를 위한 방법 및 물질은 미국 특허 출원 공보 제2007/0036725호에 개시되어 있다. 생체내에서, 카텝신을 포함하는 표적 효소를 방사성표지하는 데 유용한 방사성표지된 활성 기반 프로브는 미국 특허 출원 공보 제2009/0252677호에 개시되어 있다. 각각의 경우, 프로브는 프로테아제 활성 부위를 공유적으로 변형시키기 위해 에스테르 연결된 아실옥시메틸 케톤(AOMK) 반응기를 사용한다. 비펩타이드 활성 기반의 형광 프로브는 PCT 국제 공보 제WO 2012/118715호에 개시되어 있다.
PCT 국제 공보 제WO 2014/145257호는 에테르 연결된, 2,3,5,6-테트라플루오로 치환된 페녹시메틸 케톤(PMK) 이탈 요소를 포함하는 ??칭된 ABP를 개시하고 있다. 상기 개시된 ABP의 검출가능한 성분은 효소 전환(enzymatic turnover) 후에 그의 표적 프로테아제에 공유결합된 상태로 남아 있다.
미국 특허 출원 공보 제2014/0301950호는 다크 ??처(dark quencher), 아미노산 백본, 형광체(fluorophore), 6-아미노헥사노산, 아미노에톡시에톡시아세틸 스페이서, 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 사슬을 포함하는 영상화제를 개시하고 있다. 상기 제제는 알려진 바에 의하면 카텝신에 의해 절단되어 형광 신호를 생성하여 질병에 걸린 세포를 영상화한다. 상기 기술은 조직의 표면 또는 그 근처에 있는 질병에 걸린 세포를 확인하는 것을 목적으로 한다.
이러한 개시에도 불구하고, 높은 세포 흡수율을 가지며, 광범위한 동물 프로테아제를 표적으로 하고, 다양한 파장에서, 특히 질병에 걸린 조직을 투과할 수 있는 파장에서 증가된 검출 감도를 제공하는 신규한 활성 기반 조영제가 본 분야에서 필요하다.
본 발명은 동물 프로테아제를 표적으로 하는 화합물, 조성물, 및 상기 화합물 및 조성물의 사용 방법을 제공함으로써 이들 및 다른 요구를 해결한다. 특히, 본 발명의 일 양태에 따르면, 하기 구조식 (I)로 표시되는 화합물이 제공된다:
여기서 D는 형광 표지를 포함하는 검출가능한 요소이고;
Q는 ??처이며;
L0 및 L1은 링커이고;
AA2는 아미노산 측쇄이며;
U는 O, N, 또는 S이고;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기(protecting group)이며, 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환되고;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알카미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알카미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알카미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알카미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카복시, 카보네이트, 카바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
식 (I)의 일부 화합물 구현예에서, 형광 표지는 플루오레세인(fluorescein), 오레곤 그린(Oregon green), 보라-디아자-인데센(bora-diaza-indecene), 로다민(rhodamine), 또는 시아닌(cyanine) 표지이다. 구체적으로, 형광 표지는 시아닌 표지일 수 있고, 더욱 구체적으로, 시아닌 표지는 Cy5일 수 있다.
식 (I)의 일부 구현예에서, 형광 표지는 근적외선 형광 표지이다. 예를 들어, 근적외선 형광 표지는 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지일 수 있고, 더욱 구체적으로, 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지는 다이라이트(DyLight) 표지일 수 있다.
일부 구현예에서, AA2는, 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환되는, 아르알킬 아미노 측쇄이고, 일부 구현예에서, U는 O이다. 일부 구현예에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬 링커이며, 여기서 각각의 탄소 원자는 선택적으로 헤테로원자로 치환된다. 특정 구현예에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 C2-8 알킬 링커이다. 더욱더 구체적으로, L1은 C4 알킬 링커이다.
일부 구현예에서, Q는 QSY ??처, 더욱 구체적으로 친수성 QSY ??처이고, 더욱더 구체적으로 친수성 QSY ??처는 설포-QSY ??처이다. 다른 특정 구현예에서, Q는 QC-1이다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 하기 구조식 (II)를 가지며:
여기서
n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
R1은 QSY ??처 또는 QC-1이며;
R2는 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지이다.
더욱 구체적으로, n'는 2, 4, 또는 6일 수 있거나, 또는 n"는 4일 수 있다. 더욱더 구체적으로, n'는 2, 4, 또는 6이고, n"는 4이다.
일부 구현예에서, 상기 화합물은 하기 화합물 중 어느 것 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되며:
;
; 및
;
여기서 n'는 2, 4, 또는 6이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기 구조식 (III)으로 표시되는 화합물이 제공되며:
여기서
D는 검출가능한 요소이고;
L0은 링커이며;
T는, 선택적으로 ??처를 포함하는, 프로테아제 표적화 요소이고;
단 L0은 에톡시에톡시 스페이서를 포함하지 않는다.
식 (III)의 구조를 갖는 일부 화합물 구현예에 따르면, D는 형광 표지를 포함하고, T는 ??처를 포함한다.
특정 구현예에서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지이다. 더욱 구체적으로, 형광 표지는 시아닌 표지이고, 더욱더 구체적으로, 시아닌 표지는 Cy5이다.
일부 구현예에서, 형광 표지는 근적외선 형광 표지이다. 구체적으로, 근적외선 형광 표지는 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지일 수 있다. 더욱 구체적으로, 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지는 다이라이트(DyLight) 표지일 수 있다.
식 (III)의 일부 구현예에서, D는 방사성 물질을 포함한다.
식 (III)의 일부 구현예에서, L0은 선택적으로 치환되는 알킬 링커이고, 여기서 각각의 탄소 원자는 선택적으로 헤테로원자로 치환된다. 구체적으로, L0은 C2 -8 알킬 링커일 수 있다.
D가 형광 표지를 포함하고 T가 ??처를 포함하는 일부 화합물 구현예에서, ??처는 QSY ??처일 수 있다. 구체적으로, QSY ??처는 친수성 QSY ??처일 수 있고, 더욱 구체적으로, 친수성 QSY ??처는 설포-QSY ??처일 수 있다. D가 형광 표지를 포함하고 T가 ??처를 포함하는 일부 구현예에서, ??처는 QC-1이다.
식 (III)의 일부 구현예에서, T는 펩타이드 표적화 요소이다. 특정 구현예에서, T는 4개 이하의 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, T는, 선택적으로 ??처를 포함하는, 카텝신 표적화 요소이다. 더욱 구체적으로, T는 카텝신 L 또는 카텝신 V에 대해 선택적일 수 있다.
식 (III)의 일부 구현예에서, T는 하기 화학식을 갖고
;
AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄이며;
U는 O, N, 또는 S이고;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기이며, 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환되고;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알카미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알카미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알카미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알카미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카복시, 카보네이트, 카바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
특정 구현예에서, AA1은 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환된다. 다른 특정 구현예에서, U는 O이다. 또 다른 구체적인 구현예에서, D는 형광 표지를 포함하고, T는 ??처를 포함한다. 더욱 구체적으로, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지일 수 있다. 더욱더 구체적으로, 형광 표지는 시아닌 표지, 예컨대 Cy5일 수 있다. 일부 구체적인 구현예에서, 형광 표지는 근적외선 형광 표지, 예컨대 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지, 예를 들어 다이라이트 표지일 수 있다.
T가 하기인 식 (III)의 일부 구현예에서
,
D는 방사성 물질을 포함한다.
T가 하기 화학식을 갖고
,
D가 형광 표지를 포함하는 식 (III)의 일부 구현예에서, AA1은 ??처를 포함한다. 더욱 구체적으로, AA1은 -L1-Q일 수 있고, 여기서 L1은 링커이고, Q는 ??처이다. 이들 구현예에서, L1은 더욱 구체적으로 선택적으로 치환되는 알킬 링커일 수 있고, 여기서 각각의 탄소 원자는 선택적으로 헤테로원자로 치환된다. 더욱더 구체적으로, L1은 C2 -8 알킬 링커, 예컨대 C4 알킬 링커일 수 있다.
상기 식 (III)의 화합물 중 일부에서, AA2는, 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환되는, 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 이들 화합물 중 일부에서, U는 O이다. 상기 화합물 중 일부에서, Q는 QSY ??처, 예컨대 친수성 QSY ??처, 또는 나아가 설포-QSY ??처이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물에서 조직을 표지화하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 상기 화합물 중 어느 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물에서 조직을 표지화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 조성물 중 어느 것을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 동물에서 종양을 시각화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 조성물 중 어느 것을 동물에게 투여하는 단계; 및 상기 조성물과 카텝신 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 단계를 포함하고; 여기서 검출가능한 신호는 동물에서 질병에 걸린 조직과 관련된다.
구현예에서, 검출가능한 신호는 형광 신호이다. 더욱 구체적으로, 형광 신호는 근적외선 신호이다.
다른 구현예에서, 검출가능한 신호는 종양 변연부에서 생성된다.
또 다른 구현예에서, 검출가능한 신호는 영상 유도 수술 장치를 사용하여 측정된다.
도 1A - 도 1C. 카텝신 선택적 프로테아제 기질 프로브의 설계. (A) 프로테아제 절단가능한 아미드 결합을 갖는 6개의 기질 유사체의 화학적 구조. "n" 값이 스페이서 길이에 상응하는(n = 2, 4, 및 6) "nCQ"(화합물 2-4)로 표시된 구조에서, 발색단(C)은 라이신 측쇄(R1)에 부착되는 반면, "nQC"(화합물 5-7)로 표시된 구조에서 "n" 값은 또한 스페이스 길이에 상응하지만, 발색단은 절단가능한 아미드 결합의 C-말단 측면 상의 아민 기(R2)에 부착된다. (B) 프로브 절단의 절단된 형광 생성물의 보유를 개선하기 위해 프로브 설계 내로 도입된 잠재적 리소좀향성 효과( latent lysosomotropic effect; LLE)의 도식적 표현.
도 2. 다수의 카텝신에 의한 기질 절단의 동력학적 분석. 재조합 시스테인 카텝신을 사용한 ??칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질의 효소적 전환. 각 패널에서 상부 선(trace)은 카텝신 L(Cat L)을 이용한 활성에 상응한다. 각 패널에서 다음으로 낮은 선은 카텝신 V(Cat V)를 이용한 활성에 상응한다.
도 3A - 도 3B. 시험관내에서 LLE 및 비LLE 기질의 비교. (A) 다양한 스페이스 길이가 재조합 카텝신 L에 의한 ??칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질의 절단 효율(K cat /K M )에 미치는 효과. (B) 1 μM의 ??칭된 형광 기질(6CQ 및 6QC)과 함께 인큐베이션된 RAW 264.7 세포의 대표적인 살아있는 세포 형광 현미경 분석. 적색(상부 2개의 패널에서 점 모양의(punctate) 세포질 염색)은 프로브의 Cy5 형광이고, 녹색(중간 2개의 패널에서 점 모양의 세포질 염색)은 리소트랙커(lysotracker; 리소좀 선택적 염색)이며, 청색(상부 2개 및 중간 2개 패널에서 핵 염색)은 회흐스트(Hoechst) 33342이다. 축척 막대는 10 μm를 나타낸다. 병합된 형광(하부 2개의 패널)은 Cy5 염색 및 리소트랙커 염색의 중첩을 보여준다.
도 4A - 도 4C. 4T1 유방암 모델에서 형광 기질의 검증. (A) ??칭된 형광 nCQ 및 nQC 기질(n = 2, 6)이 주사된 마우스에서 종양 관련 시스테인 카텝신의 비침습적 시간 경과 형광 영상화 및 프로브의 정맥내 주사후 0.5, 1, 4, 8 및 24시간에 대표적인 시점 영상. 하부 패널은 특정 시점에 각 프로브에 대한 최적 형광 대조도를 나타낸다. (B) 24시간 동안, 비리소좀향성 기질 nCQ 및 리소좀향성 기질 nQC의 종양 표지 동력학 및 약동학적 특성의 비교. 오차 막대는 N ≥ 3마리 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다. 프로브가 없는 대조군 마우스를 자가형광을 보정하기 위해 사용하였다. (C) 2가지 유형의 기질의 주사 후 4시간 및 24시간에 생체외 종양 영상화. 오차 막대는 N ≥ 3마리 마우스의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 5A - 도 5B. 생체내 조직에서 LLE 기질의 특이적 축적의 확인. (A) 24시간 종료점에 기질 nCQ 및 nQC가 주사된 마우스로부터 절제된 종양의 동결 절편에 대한 조직학. Cy5 형광은 상부 패널에 나타나 있고(적색 염색; 2QC 처리된 및 6QC 처리된 동물에서만 관찰됨), 대식세포에 대한 CD68 면역염색은 중간 패널에 나타나 있으며(녹색 염색; 모든 동물에서 관찰됨), DAPI(핵 염색)는 상부 및 중간 패널에 나타나 있다(청색 염색). 하부 열의 패널들은 병합된 형광을 나타낸다. (B) 정맥내 투여 후 4시간 및 24시간에 다양한 장기에서의 프로브의 생체 분포. 오차 막대는 각 시점에 대해 N ≥ 3의 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 6A - 도 6E. 최적화된 NIR 프로브의 생체내 특성의 평가. (A) 근적외선 ??칭된 비리소좀향성 기질 6CQNIR(8) 및 리소좀향성 유사체 6QCNIR(9)의 화학적 구조. (B) NIR 프로브를 사용한 유방암 마우스 모델에서 종양 관련 시스테인 카텝신의 비침습적 형광 영상화의 시간 경과. 영상은 1, 2, 3, 4, 6, 12 및 24시간 시점에 대해 나타나 있다. 하부 패널은 특정 시점에 각 프로브에 대한 최적 형광 대조도를 나타낸다. (C) 24시간 시간 경과 동안 6CQNIR 및 6QCNIR의 종양 표지화 동력학의 정량화. 각 프로브에 대해 N ≥ 3 마우스. 오차 막대는 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다. (D) 2가지 유형의 기질을 투여받은 마우스로부터 단리된 종양을 비교한 생체외 영상. 단리는 4시간 및 24시간 시점에 이뤄졌다. (E) 주사 후 24시간에 다양한 장기 및 종양에서의 프로브의 생체 분포.
도 7A - 도 7D. 설계된 카텝신 프로브와 함께 임상적 다빈치(da Vinci) 수술 기구를 사용한, 결장, 유방 및 폐 선암의 수술중 형광 영상 유도 검출 및 절제. (A) NIR 카메라가 장착된 다빈치 수술 로봇 시스템의 그래픽 예시. (B) LLE 프로테아제 표적화 조영제인 6QCNIR(9)의 정맥내 투여 후 6시간에 결장암 APCmin + 마우스 모델의 결장에서 폴립(polyp)의 검출. 영상은 벌린(splayed) 결장의 실시간 수술중 영상의 스크린샷으로부터 수득되었다. 상기 패널은 절제된 종양의 백색광(좌측), 형광(중앙) 및 H&E 염색(우측)에 의해 조명된 동일한 마우스의 결장에서 검출된 폴립의 대표적인 영상을 나타내다. (C) 임상 기기 및 조영제 6QCNIR을 사용한 마우스 유방 종양(4T1)의 검출 및 형광 영상 유도 수술 제거. 상기 영상은 종양 및 종양상(tumor bed)의 백색광 조명(좌측), 형광(중앙), 및 H&E 염색에 의한 종양의 악성의 확인(우측)을 비교한다. (D) 마우스 폐암의 검출 및 절제에서 프로브의 적용 및 암과 조직학과의 상관관계.
도 8A - 도 8C. 카텝신을 영상화하기 위한 PET 기질 프로브의 설계 및 검증. (A) 기질 프로브 LO263의 구조. (B) 영상화의 2시간 및 24시간에 7일에 염수 또는 블레오마이신으로 처리된 마우스의 비침습적 PET/CT 스캔. 관상면(Coronal)(좌측), 경축(transaxial)(상부 우측) 및 정중(sagittal)(하부 우측) 영상이 표시된 시점에 염수 또는 블레오마이신 처리된 그룹의 대표적인 마우스에 대해 나타나 있다. (C) 상이한 치료 그룹에서 7일에 모든 마우스의 폐로부터 PET/CT 강도의 정량. 오차 막대는 평균 ± SEM, 7일(염수 n=4; 블레오마이신 n=4. t-검정에 의해 *p< 0.05)을 나타낸다.
본 명세서는 그 중에서도 비침습적 영상화 분야에서 사용하기 위한 ??칭된 형광 기질 프로브의 설계 및 최적화를 개시한다. 특히, ??처 및 형광체 쌍 또는 방사성동위원소 표지를 함유하는 변형된 펩타이드가 제공된다. 상기 화합물은 프로테아제 절단시 리포터(비??칭된 형광체 또는 방사성동위원소) 및 양성자화 가능한(protonable) 아민을 함유하는 단편을 방출하여, 상기 방출된 단편의 리소좀 보유를 향상시킨다.
본 발명의 화합물은 염증을 수반하는 임의의 병태에서 대조 영상화(contrast imaging)에 유용하다. 상기 화합물은 다양한 고형 종양(유방, 결장, 폐 등)의 영상 유도 수술에서 특히 유용하지만, 아테롬성동맥경화증(atherosclerosis), 섬유증, 감염 질환(예컨대, 결핵 감염), 및 카텝신, 또는 다른 프로테아제가 염증성 반응에서 분비되는 임의의 병태를 진단하고 모니터링하는 데 유용하다.
시스테인 프로테아제를 표적으로 하는 것으로 알려진 활성 기반 프로브(ABP)의 종래의 예는 시스테인 프로테아제의 파파인 계열을 공유적으로 표적으로 하는 일련의 ??칭된 근적외선 형광 활성 기반의 프로브(qNIRF-ABP)(Blum et al. (2007) Nat. Chem . Bio. 3:668-677) 및 에테르 연결된 이탈기를 갖는 일련의 강력한 시스테인 프로테아제 선택적 ABP 화합물(Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem . Soc . 135:14726-30; PCT 국제 공보 제WO2014/145257호)을 포함한다. 종래의 ABP는 효소 전환 동안 반응성 프로브에 의해 프로테아제 활성 부위의 공유 변형을 야기한다. 형광 표지는 프로테아제에 공유 부착된 상태로 있으며, 그의 잠재적 형광은 효소 전환 동안 ??처를 함유하는 프로브 부분의 방출에 의해 노출(unmask)된다.
현재의 프로브는 PMK 탄두(warhead)가 프로테아제에 의해 절단가능한 천연 아미드 결합에 의해 대체된 본 발명자들의 기존 ABP의 새로운 변형이다(Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem . Soc . 135:14726-30; PCT 국제 공보 제WO2014/145257호)(도 1A). 기질 및 절단기 사이의 알킬 스페이서의 길이는 새로운 기질에서 다양하였고, 리포터 형광체 및 ??처를 기질 상의 상이한 위치에 배치하는 효과가 평가되었다. 이론에 구속됨이 없이, 리소좀(pH ~ 4-5)에서 상기 절단된 기질 단편의 유리 아미노기의 양성자화는 리소좀 막을 가로지르는 양이온성 중간체의 확산 속도를 감소시켜(Soulet et al. (2004) J. Biol . Chem . 279:49355-66), 리소좀에서 상기 절단된 단편의 보유를 향상시키고 이에 의해 신호의 강도를 증가시키고 절단된 단편 상에 형광체를 함유하는 기질에 대한 종양의 지속시간을 연장시킨다. 또한 문헌[Kazmi et al. (2013) 41:897-905]을 참고한다.
시험관내 효소 동력학적 분석은 상기 설계된 기질이 다양한 시스테인 카텝신에 의해, 특히 카텝신 L에 의해 효율적으로 절단(비??칭)된다는 것을 보여주었다. 상기 기질에 대한 전환수(turnover number) 및 친화도는 시스테인 카텝신에 대한 상업적인 기질과 대등하다. 유방암의 동계(syngeneic) 동소(orthotopic) 마우스 모델을 사용한 비침습적 영상화 연구에서, 설계된 기질 프로브는 빠른 표지화 동력학, 종양 및 종양 주위 영역에서 유의한 축적 후 장기로부터의 빠른 제거와 같은 이상적인 약리학적 특성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 프로브 설계에 잠재적 양이온성 향성(cationic tropism)을 도입함으로써 신호 강도 및 전반적인 대조도를 증가시킬 수 있음을 확인시켜 준다.
화합물
따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 동물 조직에서의 프로테아제 활성, 특히 카텝신의 활성의 검출 및 영상화에서 영상화제로 사용하기 위한 신규 화합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 화합물은 하기 식 (I)을 가지며:
여기서 D는 형광 표지를 포함하는 검출가능한 요소이고;
Q는 ??처이며;
L0 및 L1은 링커이고;
AA2는 아미노산 측쇄이며;
U는 O, N, 또는 S이고;
R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴, 헤테로아르알킬, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴알킬, 또는 보호기이며, 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환되고;
각각의 A는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알킬아미노, 아릴, 아릴옥시, 아릴아미노, 아르알킬, 아르알콕시, 아르알카노일, 아르알카미노, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴아미노, 헤테로아르알킬, 헤테로아르알콕시, 헤테로아르알카노일, 헤테로아르알카미노, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알킬알킬, 사이클로알콕시, 사이클로알카노일, 사이클로알카미노, 헤테로사이클릴, 헤테로사이클릴옥시, 헤테로사이클릴아미노, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알콕시, 헤테로사이클릴알카노일, 헤테로사이클릴알카미노, 하이드록실, 티오, 아미노, 알카노일아미노, 아로일아미노, 아르알카노일아미노, 알킬카복시, 카보네이트, 카바메이트, 구아니디닐, 우레아, 할로, 트리할로메틸, 시아노, 니트로, 포스포릴, 설포닐, 설폰아미도, 또는 아지도이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 포화된 지방족기의 라디칼을 지칭하며, 이는 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 사이클로알킬(알리사이클릭)기, 알킬 치환된 사이클로알킬기, 및 사이클로알킬 치환된 알킬기를 포함한다. 일부 구현예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그의 백본 내에 30개 이하의 탄소 원자를 가지며(예컨대, 직쇄의 경우 C1-C30, 분지쇄의 경우 C3-C30), 더욱 구체적으로 20개 이하를 갖는다. 유사하게, 일부 사이클로알킬은 그의 고리 구조 내에 3-10개의 탄소 원자를 가지며, 더욱 구체적으로 고리 구조 내에 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다.
더욱이, 명세서, 실시예, 및 청구범위 전반에 사용된 용어 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 모두를 포함하는 것으로 의도되며, 후자는 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는, 예를 들어, 할로, 하이드록실, 카보닐(예컨대, 케토, 카복시, 알콕시카보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카보닐(예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 티오, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티는, 적절한 경우, 그 자체가 치환될 수 있음이 본 기술분야의 숙련가에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함), 및 실릴기, 뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카보닐(케톤, 알데히드, 카복실레이트, 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등의 치환된 및 비치환된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 하기에 기재되어 있다. 사이클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카보닐 치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알콕시"는 산소가 부착된, 알킬기, 특정 구체적인 구현예에서, 저급 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, t-부톡시 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 지방족기를 지칭하고, "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 모두를 포함하는 것으로 의도되며, 후자는 알케닐기의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알케닐 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 이러한 치환기는, 안정성이 방해받는 경우를 제외하고, 상기 논의된 바와 같이, 알킬기에 대해 고려되는 모든 것을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴기에 의한 알케닐기의 치환이 고려된다.
화학적 모이어티, 예컨대 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 함께 사용될 때, 용어 "Cx -y"는 사슬 내에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "Cx -y-알킬"은 트리플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등과 같은 할로알킬기를 포함하는, 사슬 내에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 직쇄 알킬 및 분지쇄 알킬기를 포함하는, 치환된 또는 비치환된 포화된 탄화수소기를 지칭한다. "C0-알킬"은 상기 기가 말단 위치에 있는 경우 수소를 가리키거나, 내부에 있는 경우 결합이다. 용어 "C2 -y-알케닐" 및 "C2 -y-알키닐"은 상기 기재된 알킬과 길이 및 가능한 치환이 유사하나, 각각 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 치환된 또는 비치환된 불포화된 지방족기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬아미노"는 적어도 하나의 알킬기로 치환된 아미노기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알킬티오"는 알킬기로 치환된 티올기를 지칭하며, 이는 일반식 알킬-S-로 표시될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 함유하는 지방족기를 지칭하며, 이는 "비치환된 알키닐" 및 "치환된 알키닐" 모두를 포함하는 것으로 의도되고, 후자는 알키닐기의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알키닐 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는 하나 이상의 삼중 결합에 포함되거나 포함되지 않는 하나 이상의 탄소 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 이러한 치환기는 안정성이 방해받는 경우를 제외하고 상기 논의된 바와 같이, 알킬기에 대해 고려되는 모든 것을 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴기에 의한 알키닐기의 치환이 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미드"는 하기 기를 지칭하며
여기서 Rx 및 Ry는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 N 원자와 함께 결합된 Rx 및 Ry는 고리 구조 내에 4개 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성시킨다.
용어 "아민" 및 "아미노"가 당업계에 인식되며, 이는 비치환된 및 치환된 아민 모두 및 이의 염, 예컨대 하기에 의해 표시될 수 있는 모이어티를 지칭하며
또는
여기서 Rx, Ry, 및 Rz는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 N 원자와 함께 결합된 Rx 및 Ry는 고리 구조 내에 4개 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노알킬"은 아미노기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아르알킬"은 아릴기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아릴"은 고리의 각 원자가 탄소인, 치환된 또는 비치환된 단일 고리 방향족기를 포함한다. 특정 구현예에서, 고리는 5 내지 7원 고리이고, 더욱 구체적인 구현예에서 6원 고리이다. 용어 "아릴"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 대해 공통인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서 상기 고리 중 적어도 하나는 방향족이며, 예컨대, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 아릴기는 벤젠, 나프탈렌, 페난트렌, 페놀, 아닐린 등을 포함한다.
용어 "카바메이트"는 당업계에서 인식되고 하기 기를 지칭하며
또는
여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌기를 나타내거나, 또는 이들이 부착된 원자와 함께 결합된 Rx 및 Ry는 고리 구조 내에 4개 내지 8개의 원자를 갖는 헤테로사이클을 완성시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이클로알킬"은 고리의 각 원자가 탄소인, 비방향족 포화된 또는 불포화된 고리를 지칭한다. 특정 구현예에서, 사이클로알킬 고리는 3개 내지 10개의 원자, 더욱 구체적인 구현예에서 5개 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "카보네이트"는 당업계에서 인식되고, 기 -OCO2-Rx를 지칭하며, 여기서 Rx는 하이드로카르빌기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "카복시"는 식 -CO2H로 표시되는 기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에스테르"는 기 -C(O)ORx를 지칭하며, 여기서 Rx는 하이드로카르빌기를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에테르"는 산소를 통해 또 다른 하이드로카르빌기에 연결된 하이드로카르빌기를 지칭한다. 따라서, 하이드로카르빌기의 에테르 치환기는 하이드로카르빌-O-일 수 있다. 에테르는 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 에테르의 예는 비제한적으로, 헤테로사이클-O-헤테로사이클 및 아릴-O-헤테로사이클을 포함한다. 에테르는 "알콕시알킬"기를 포함하며, 이는 일반식 알킬-O-알킬로 표시될 수 있다.
용어 "구아니디닐"은 당업계에서 인식되고 하기 일반식으로 표시될 수 있으며
여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "할로" 및 "할로겐"은 할로겐을 의미하며, 클로로, 플루오로, 브로모, 및 아이오도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤타르알킬" 및 "헤테로아르알킬"은 헤타릴기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 치환된 또는 비치환된 방향족 단일 고리 구조, 특정 구체적인 구현예에서 5 내지 7원 고리, 더욱 구체적으로 5 내지 6원 고리를 포함하고, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 일부 구현예에서 1 내지 4개의 헤테로원자, 및 더욱 구체적인 구현예에서 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 용어 "헤테로아릴" 및 "헤타릴"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통적인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하고, 여기서 상기 고리 중 적어도 하나는 헤테로방향족이고, 예컨대, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로아릴기는, 예를 들어, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 및 피리미딘 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 요소의 원자를 의미한다. 전형적인 헤테로원자는 질소, 산소, 및 황이다.
용어 "헤테로사이클릴", "헤테로사이클", 및 "헤테로사이클릭"은 치환된 또는 비치환된 비방향족 고리 구조, 특정 구체적인 구현예에서 3 내지 10원 고리, 더욱 구체적으로 3 내지 7원 고리를 지칭하며, 이의 고리 구조는 적어도 하나의 헤테로원자, 일부 구현예에서 1개 내지 4개의 헤테로원자, 및 더욱 구체적인 구현예에서 1개 또는 2개의 헤테로원자를 포함한다. 용어 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭"은 또한 2개 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리에 공통적인 2개 이상의 사이클릭 고리를 갖는 폴리사이클릭 고리 시스템을 포함하며, 여기서 상기 고리 중 적어도 하나는 헤테로사이클릭이고, 예컨대, 다른 사이클릭 고리는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기는, 예를 들어, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 모폴린, 락톤, 락탐 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이드로카르빌"은 =O 또는 =S 치환기를 갖지 않는, 탄소 원자를 통해 결합된 기를 지칭하고, 이는 전형적으로 적어도 하나의 탄소-수소 결합 및 주로 탄소 백본을 가지나, 선택적으로 헤테로원자를 포함할 수 있다. 따라서, 메틸, 에톡시에틸, 2-피리딜, 및 트리플루오로메틸과 같은 기가 본원의 목적을 위한 하이드로카르빌인 것으로 고려되나, 아세틸(연결 탄소 상에 =O 치환기를 가짐) 및 에톡시(탄소가 아닌 산소를 통해 연결됨)와 같은 치환기는 고려되지 않는다. 하이드로카르빌기는, 비제한적으로 아릴, 헤테로아릴, 카보사이클, 헤테로사이클, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 이의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "하이드록시알킬"은 하이드록시기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
화학적 모이어티, 예컨대 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 함께 사용될 때, 용어 "저급"은 치환기 내에 10개 이하, 및 특정 구현예에서 6개 이하의 비수소 원자가 존재하는 기를 포함하는 것을 의미한다. "저급 알킬"은, 예를 들어, 10개 이하의 탄소 원자, 및 특정 구현예에서 6개 이하의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에 정의된 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 알콕시 치환기는, 단독으로 또는 하이드록시알킬 및 아르알킬(이 경우, 예를 들어, 아릴 기 내의 원자는 알킬 치환기 내의 탄소 원자를 계수할 때 계수되지 않음) 언급에서와 같이 다른 치환기와 조합하여 나타나든지 간에, 각각 저급 아실, 저급 아실옥시, 저급 알킬, 저급 알케닐, 저급 알키닐, 및 저급 알콕시이다.
용어 "폴리사이클릴", "폴리사이클", 및 "폴리사이클릭"은 2개 이상의 원자가 2개의 인접한 고리에 공통적인, 예컨대, 고리가 "융합된 고리"인, 2개 이상의 고리(예컨대, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 사이클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 및/또는 헤테로사이클릴)를 지칭한다. 폴리사이클의 각각의 고리는 치환되거나 비치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리사이클의 각 고리는 고리 내에 3 내지 10개, 더욱 구체적으로 5 내지 7개의 원자를 함유한다.
용어 "치환된"은 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 갖는 모이어티를 지칭한다. "치환" 또는 "로 치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용된 원자가에 따른다는 내포된 단서, 및 상기 치환이 안정한 화합물, 예컨대, 화합물이 사용될 조건하에 재배열, 고리화, 제거 등과 같은 변형을 자발적으로 겪지 않는 화합물을 야기한다는 내포된 단서를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용되는 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 광범위한 양태에서, 허용되는 치환기는 유기 화합물의 비사이클릭 및 사이클릭, 분지된 및 비분지된, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 허용되는 치환기는 하나 이상일 수 있고 적절한 유기 화합물에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기를 가질 수 있고/있거나 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용되는 치환기를 가질 수 있다. 치환기는 본원에 기재된 임의의 치환기, 예를 들어, 할로겐, 하이드록실, 카보닐(예컨대, 케토, 카복시, 알콕시카보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카보닐(예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티는 적절한 경우 그 자체가 치환될 수 있음이 본 기술분야의 숙련자에게 이해될 것이다.
"비치환된"으로 구체적으로 기재되지 않는 한, 본원의 화학적 모이어티에 대한 언급은 치환된 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "아릴"기 또는 모이어티에 대한 언급은 함축적으로 치환된 및 비치환된 변이체 모두를 포함한다.
용어 "설페이트"는 당업계에서 인식되고, 기 -OSO3H, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
용어 "설폰아미드"는 당업계에서 인식되고, 하기 일반식으로 표시되는 기를 지칭하며
또는
여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌을 나타낸다.
용어 "설폭사이드"는 당업계에서 인식되고, 기 -S(O)-Rx를 지칭하며, 여기서 Rx는 하이드로카르빌을 나타낸다.
용어 "설포" 또는 "설포네이트"는 당업계에서 인식되고, 기 - SO3H, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
용어 "설폰"은 당업계에서 인식되고, 기 -S(O)2-Rx를 지칭하며, 여기서 Rx는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오알킬"은 티올기로 치환된 알킬기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오에스테르"는 기 -C(O)SRx 또는 - SC(O)Rx를 지칭하고, 여기서 Rx는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "티오에테르"는 산소가 황으로 대체된 에테르와 동등하다.
용어 "우레아"는 당업계에서 인식되고, 하기 일반식으로 표시될 수 있으며
여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 하이드로카르빌을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 표준 합성 화학 기술을 사용하여 합성되며, 예를 들어 하기 실시예 섹션에 기재된 방법을 사용하여 합성된다. 다른 유용한 합성 기술은, 예를 들어, 문헌[March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Ed., (Wiley, 2013); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4th Ed., Vols . A and B (Plenum 2000, 2001); Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27 (Wiley, 2013); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-81 (Wiley, 2013); and Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)](이들 모두는 그 전체가 참조로 포함되어 있음)에 기재되어 있다. 상기 화합물은 일반적으로 상업적 공급원으로부터 이용가능한 출발 물질을 사용하여 정상적으로 합성되거나 본 기술분야의 숙련자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 용이하게 제조된다. 예컨대, 문헌[Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27 (Wiley, 2013), 또는 Beilsteins Handbuch der organischen Chemie , 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin (부록 포함)]을 참고한다.
본 발명의 화합물의 성분을 언급할 때, 용어 "로부터 유래된 잔기"는 공유 결합을 형성하는 제1 성분 상의 제1 반응성 작용기 및 제2 성분 상의 제2 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된 잔기를 기술하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제1 성분 상의 아민기는 제2 성분 상의 활성화된 카복실기와 반응하여 하나 이상의 아미드 모이어티를 포함하는 잔기를 형성할 수 있다. 제1 및 제2 반응성 작용기의 다른 순열(permutation)이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 아지드(azide) 치환된 제1 성분과 알킨 치환된 제2 성분의 구리 촉매된 또는 구리가 없는 반응은, 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 이해되는 바와 같이, 널리 공지된 "클릭(click)" 반응을 통해 트리아졸을 함유하는 잔기를 야기한다. 문헌[Kolb et al. (2001) Angew . Chem . Int . Ed. Engl . 40:2004; Evans (2007) Aus . J. Chem. 60:384]을 참고한다. "클릭" 반응을 사용하여 비펩타이드 형광 영상화 프로브를 생성하는 예시적인 방법이 PCT 국제 공보 제WO 2012/118715호에 제공되어 있다. 본 청구범위의 화합물, 특히 본 화합물의 프로테아제 표적화 요소를 생성하거나 변형시키기 위한 이들 방법의 각색은 본 기술분야의 기술에 속한다.
본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자는 보호기가 분자의 원하는 위치에 가역적으로 부착되어 상기 위치에서 다른 제제의 반응을 제어한다는 것을 이해할 것이다. 본 화합물의 합성에 유용한 보호기는 본 기술분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 4 th edition, by P.G.M. Wuts and T.W. Greene (Wiley-Interscience, 2006); 및 Protecting Groups, by P. Kocienski (Thieme, 2005)]을 참고한다.
본 화합물의 L0 및 L1 기는 검출가능한 요소 D 및 ??처 Q를 각각 대상 화합물에 연결하는 링커 기이다. 각각의 링커 기는, 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 이해되는 바와 같이, 독립적으로 임의의 적합한 화학적 링커일 수 있다. L0 및 L1 기는 바람직하게는 알킬 링커 기이며, 여기서 알킬 링커는 선택적으로 치환되고, 나아가, 여기서 링커 내의 탄소는 생성된 구조가 화학적으로 안정한 정도까지 선택적으로 헤테로원자에 의해 대체된다. 이러한 치환 및 대체는 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 에스테르, 아미드, 카보네이트, 카바메이트 등과 같이 링커 내에 개입(intervening) 기를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직한 링커는 5 내지 40 결합의 길이 범위이며, 분지형, 직쇄일 수 있거나, 또는 고리를 함유할 수 있다. 링커는 일부 경우 이중 결합을 포함할 수 있다. 이들은 링커를 함유하는 화합물의 특정 요건에 따라 원하는 만큼 소수성 또는 친수성일 수 있다.
특정 구현예에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬 링커이며, 여기서 각각의 탄소 원자는 선택적으로 헤테로원자로 치환된다. 더욱 구체적인 구현예에서, L0 및 L1은 각각 독립적으로 C2-8 알킬 링커이다. 더욱더 구체적인 구현예에서, L1은 C4 알킬 링커이다.
L0 기 및 검출가능한 요소 D 간의 연결 및 L1 기 및 ??처 Q 간의 연결은, 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 임의의 적합한 화학적 연결일 수 있음이 추가로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 일부 경우 검출가능한 요소 또는 ??처 전구체 내에, 예를 들어 아미노기, 티올기 등과 같은 특정 화학적 기와 반응하는 모이어티를 포함시킴으로써 간편하게 제조될 수 있다. 상기 반응성 검출가능한 요소 또는 ??처는 이러한 상황에서 화합물 상의 아미노기, 티올기 등과 반응성기와의 반응을 통해 화합물에 용이하게 부착될 수 있다. 따라서, 이러한 유형의 화학적 연결은, 상기 연결의 구조적 세부사항이 명확히 나타나 있지 않음에도 불구하고, 개시된 화합물의 범위에 속하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에 따르면, 식 (I)의 화합물 내의 L1 기는 생체내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 따라서, 이들 구현예에서, L1 기는 변형된 화합물을 안정화하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
본 화합물의 AA1 및 AA2 기는, 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 독립적으로 임의의 천연 또는 비천연 아미노산 측쇄일 수 있거나, 또는 기 "-L1-Q"일 수 있다. 일부 구현예에서, AA1 기는 염기성 아미노산 측쇄이고 AA2 기는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환된다. 특정 구현예에서, AA1 기는 라이신 측쇄이고, AA2 기는 페닐알라닌 측쇄이다. 일부 구현예에서, AA1 기는 -L1-Q이고, AA2 기는 아르알킬 아미노산 측쇄이다. 다른 구현예에서, AA1 기는 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2 기는 -L1-Q이다. 또 다른 구현예에서, AA1 및 AA2 기는 독립적으로, 임의의 조합된, 산성 아미노산 잔기로부터의 측쇄, 예컨대 아스파트산 또는 글루탐산 잔기로부터의 측쇄, 또는 알킬 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 또는 다른 이러한 아미노산 잔기로부터의 측쇄이다. 다른 아미노산 잔기, 예컨대 라이신, 아르기닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴 등으로부터의 측쇄가 또한 본 화합물의 AA1 또는 AA2 기로서 적합하다.
AA1 또는 AA2 기가 "-L1-Q" 기인 화합물 구현예에서, L1 링커 성분은 아미노산 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 라이신 잔기는 적합하게 활성화된 ??처와의 반응을 위한 아미노-알킬기를 간편하게 제공한다.
일부 화합물 구현예에서, U 기는 O이다.
일부 화합물 구현예에서, R 기는 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환된 알킬기이다. 더욱 구체적으로, R 기는 그 자체가 선택적으로 치환된 아릴로 치환된 알킬기일 수 있다. 더욱더 구체적으로, R 기는 선택적으로 치환된 아르알킬기, 예를 들어 벤질기일 수 있다.
본 화합물의 검출가능한 요소 D는 비제한적으로 광학, 전기, 또는 화학 검출 방법을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 화학적 기이다. 특정 구현예에서, 검출가능한 요소는 형광 표지, 발광 종, 인광 종, 방사성 물질, 예컨대 양전자 방출 물질, 나노입자, SERS 나노입자, 양자점(quantum dot) 또는 다른 형광 결정 나노입자, 회절 입자, 라만(Raman) 입자, 금속 입자, 예컨대 킬레이트 금속, 자성 입자, 미세구체, RFID 태그, 마이크로바코드 입자, 또는 이들 표지의 조합이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 검출가능한 요소는 형광 표지, 방사성표지, 예컨대 킬레이트 금속 등이다. 이러한 화합물에 사용하기에 적합한 방사성표지 및 킬레이트 금속의 예는 PCT 국제 공보 제2009/124265호에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
본 화합물의 바람직한 구현예에서, 검출가능한 요소는 형광 표지이다. 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 바와 같이, 형광 표지는 입사 전자기 방사선에 의해 자극될 때 전자기 방사선, 바람직하게는 가시광 또는 근적외선광을 방출한다. 표지를 예를 들어 아미노기, 티올기 등과 같은 반응성기에 결합시키는 데 유용한 반응성 모이어티를 갖는 표지를 포함하는 광범위한 형광 표지가 상업적으로 이용가능하다. 예컨대, 문헌[The Molecular Probes ® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific]을 참고한다. 다양한 근적외선(NIR) 형광 표지를 포함하는 다른 유용한 형광 시약은 써모 사이엔티픽 피어스 프로틴 바이올로지 프로덕츠(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford, IL)로부터 이용가능하다.
전형적으로 700-900 nm의 영역에서 흡수하는 근적외선 형광체가 조직 영상화에 특히 적합한데, 이들 파장의 빛이 더 짧은 파장, 예를 들어, 가시 파장보다 조직 내로 더 깊이 투과할 수 있기 때문이다. 본 발명의 화합물에서 유용하게 이용되는 예시적인 근적외선 형광 표지는 리-코르 바이오사이언시즈(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)로부터 이용가능한 IRDye 적외선 염료이다. 이들 염료의 비제한적인 예는 IRDye 800CW, IRDye 680RD, IRDye 680LT, IRDye 750, IRDye 700DX, IRDye 800RS, 및 IRDye 650이다.
생체내 영상화 분야에 특히 적합한 적외선 염료의 다른 예는 써모 사이엔티픽 피어스 프로틴 바이올로지 프로덕츠(Rockford, IL)로부터 이용가능한 벤조피릴리움 및 벤조시아닌 화합물의 다이라이트(DyLight) 시리즈이다. 이들 염료의 비제한적인 예는 DyLight 675-B1, DyLight 675-B2, DyLight 675-B3, DyLight 675-B4, DyLight 679-C5, DyLight 690-B1, DyLight 690-B2, DyLight 700-B1, DyLight 700-B2, DyLight 730-B1, DyLight 730-B2, DyLight 730-B3, DyLight 730-B4, DyLight 747-B1, DyLight 747-B2, DyLight 747-B3, DyLight 747-B4, DyLight 775-B2, DyLight 775-B3, DyLight 775-B4, DyLight 780-B1, DyLight 780-B2, DyLight 780-B3, DyLight 800, 및 DyLight 830-B2이다. 바람직한 근적외선 형광체는 DyLight 780B 및 DyLight 800이며, 이는 하기 구조를 갖는다:
및 . 상기 염료의 약학적으로 허용가능한 염 역시 이들 분야에 적합한 것으로 간주된다.
가시 파장의 빛을 갖는 유용한 형광표지의 예는 플루오레세인이며, 이는 면역형광 표지에 광범위하게 사용된다. 플루오레세인은 495 nm에서 최대 흡수를 갖는 잔텐(xanthene) 염료이다. 관련된 형광체는 플루오레세인의 불화계 유도체인 오레곤 그린(Oregon green)이다.
본 화합물에 사용하기에 적합한 다른 예시적인 형광 표지는 보라-디아자-인데센(bora-diaza-indecene), 로다민(rhodamine), 및 시아닌(cyanine) 염료이다. 특히, 보라-디아자-인데센 염료는 BODIPY® 염료로 알려진 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센으로 표시된다. 이들 염료의 다양한 유도체가 공지되어 있으며, 본 개시내용의 화합물에서 검출가능한 요소로서 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 예컨대, 문헌[Chen el al. (2000) J. Org . Chem . 65:2900-2906]을 참고한다.
로다민 염료는 로다민 고리 구조에 기초한 염료의 계열이다. 로다민은, 그 중에서도, 단백질 접합체, 특히 항체 및 아비딘 접합체를 제조하기 위한 매우 통상적인 형광체인 테트라메틸로다민(TMR), 및 올리고뉴클레오타이드 표지화 및 자동화 핵산 시퀀싱을 위해 통상적으로 사용되는 염료인 카복시 테트라메틸-로다민(TAMRA)을 포함한다. 로다민은 플루오레세인 기반 형광체에 대한 천연 보충제로서 확립되었고, 이는 더 긴 파장 최대 방출을 제공하여 다색 표지화 또는 염색을 위한 기회를 열어준다.
또한, 로다민 염료의 그룹 내에는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료로서 알려진 형광체의 설폰화된 로다민 시리즈가 포함된다. 최신 형광체 기술의 극적인 진보는 몰리큘러 프로브즈(Molecular Probes)에 의해 도입된 알렉사 플루오르 염료에 의해 예시된다. 이러한 설폰화된 로다민 유도체는 스펙트럼이 유사한 프로브보다 더 강한 형광 방출을 위한 더 높은 양자 수율을 나타내고, 향상된 광안정성, 일반적인 레이저 라인에 일치하는 흡수 스펙트럼, pH 무감각, 및 높은 정도의 수용해도를 포함하는 몇 가지 추가적인 개선된 특징을 갖는다.
시아닌 염료는 다양한 탄소수의 폴리알켄 브릿지를 통해 연결되는 2개의 방향족 단위를 갖는 부분적으로 포화된 인돌 질소 헤테로사이클릭 핵에 기초한, 관련된 염료, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 및 이들의 유도체의 부류에 상응한다. 이들 프로브는 많은 전통적인 염료, 예컨대 플루오레세인 및 테트라메틸로다민과 유사한 형광 여기 및 방출 프로파일을 나타내지만, 향상된 수용해도, 광안정성, 및 더 높은 양자 수율을 갖는다. 대부분의 시아닌 염료는 이들의 전통적인 대응물보다 환경적으로 더 안정적이어서, 이들의 형광 방출 강도는 pH 및 유기 마운팅(mounting) 매질에 대해 덜 민감하다. 알렉사 플루오르와 유사한 방식으로, 합성 염료의 Cy 시리즈의 여기 파장은 일반적인 레이저 및 아크방전(arcdischarge) 소스와 함께 사용하기 위해 특별히 조정되며, 형광 방출은 전통적인 필터 조합으로 검출될 수 있다. 시아닌 염료는 반응성 염료 또는 형광체로서 쉽게 이용가능하다. 시아닌 염료는 일반적으로 알렉사 플루오르 부류의 구성원보다 더 넓은 흡수 스펙트럼을 가지며, 이는 공초점 현미경 검사를 위한 레이저 여기 소스의 선택에 있어 시아닌 염료를 더 다재다능하게 만든다.
특정 구현예에서, 본 화합물의 검출가능한 요소는 시아닌 염료 Cy5이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물의 검출가능한 요소에서 사용되는 형광 표지는 pH 의존적 형광체일 수 있다. 이러한 형광 표지는, 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 표지의 환경의 pH에 의존하는 형광 스펙트럼을 나타내며, 따라서, 반응 후 표지의 환경에 관한 정보, 예를 들어 반응성 화합물에 의해 표지된 프로테아제의 위치 또는 유형에 관한 정보를 보고하는 데 유용할 수 있다. 본 화합물의 검출가능한 요소에 유용하게 포함되는 다양한 표지의 pH 의존적 형광은 널리 알려져 있다. 예컨대, 그 전체가 참조로 본원에 포함된 문헌[The Molecular Probes ® Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies]을 참고한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물의 검출가능한 요소 내에 다수의 검출가능한 그룹, 예컨대, 형광 표지, 방사성표지, 킬레이트 금속 등을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 다중 표지화는 숙련자가 이해하는 바와 같이 일상적인 커플링 화학을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서의 화합물은 전형적으로 또한 ??처 기 Q를 포함한다. 용어 "??처"는 형광체의 방출을 조절하는 화학적 독립체(entity)를 지칭한다. 일부 경우, ??처 자체는 형광이 ??칭되고 있는 표지와 구별되는 특징적인 파장에서 형광을 방출하는 형광 분자일 수 있다. 따라서, 형광체는 또 다른 염료와 적절하게 결합될 때 ??처로서 작용할 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. 이러한 상황에서, 공여체(donor) 표지의 파장과 상이한 파장의 수용체(acceptor) 분자로부터의 형광의 증가는 표지된 화합물과 그의 환경, 예를 들어, 리소좀의 내부 또는 다른 세포 구획과의 상호작용을 개별적으로 보고할 수 있다. 일부 경우, ??처는 그 자체가 형광을 나타내지 않는다(즉, ??처는 "다크 수용체"임). 이러한 ??처는, 예를 들어, 답실(dabcyl), 메틸 레드, QSY 디아릴로다민 염료 등을 포함한다. 특히, 답실 (4-디메틸아미노-페닐아조)벤조산)은 DNA 검출을 위한 "분자 비콘"과 같이, 많은 분석에서 광범위하게 사용되는 통상적인 다크 ??처이다(미국 특허 제5,989,823호). "블랙 홀 ??처"로 지칭되는 BHQ 시리즈의 디아조 염료는 많은 형광체의 방출과 잘 중첩되는 광범위한 흡수 범위를 제공한다. PCT 국제 공보 제WO01/86001호를 참고한다. 몰리큘러 프로브즈로부터의 QSY 시리즈 염료는 많은 생물분석에서 ??칭 시약으로서 광범위하게 사용되어 온 다크 ??처 염료의 또 다른 예이다(미국 특허 제6,399,392호).
특히, QSY 7은 비형광 디아릴로다민 유도체이다(미국 특허 출원 공보 제2005/0014160호). QSY21은 가시 스펙트럼에서 강한 흡수를 갖는 비형광 디아릴로다민 발색단이며, 효과적인 형광 ??처이다. 설포-QSY21은 QSY21의 설포네이트 형태이다(도 1A 참고). 형광체/??처 쌍은 미국 특허 출원 공보 제2004/0241679호에 더 예시되어 있다.
IRDye QC-1(Li-Cor로부터 이용가능함)은 본 화합물에서 ??처로서 사용하기에 적합한 비형광 염료의 또 다른 예이다(도 6A 참고). 그것은 가시 영역부터 근적외선까지의 파장 범위의 형광체를 포함하는, 광범위한 형광체로부터의 형광을 효율적으로 ??칭한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서는 하기 식 (II)를 갖는 화합물을 제공하며:
여기서 n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
R1은 QSY ??처 또는 QC-1이며;
R2는 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지이다.
이들 화합물의 일부 구현예에서, n"는 4이다.
이들 화합물의 일부 구현예에서, n'는 2, 4, 또는 6이다.
특정 구현예에서, 상기 화합물은 하기 화합물 중 어느 것 또는 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
;
; 및
;
여기서 n'는 2, 4, 또는 6이다.
또 다른 양태에 따라, 본 개시내용의 화합물 구현예는 하기 식 (III)의 구조를 가지며:
여기서 D는 검출가능한 요소이고;
L0은 링커이며;
T는, 선택적으로 ??처를 포함하는, 프로테아제 표적화 요소이며;
단, L0은 에톡시에톡시 스페이서를 포함하지 않는다.
식 (III)의 화합물에서 프로테아제 표적화 요소 T는 프로테아제에 의해 인식될 수 있고 프로테아제에 의해 촉매적으로 가수분해되어 리소좀향성 단편인 D-L0-NH3 +를 방출할 수 있는 임의의 적합한 화학적 구조이다. 비제한적으로 펩타이드성 및 비펩타이드성 프로테아제 표적화 요소를 포함하는 이러한 구조의 예는 프로테아제 효소학 분야에서 널리 알려져 있다. 특정 구현예에서, 프로테아제 표적화 요소는 4개 이하의 아미노산 잔기 또는 3개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 구조이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 프로테아제 표적화 요소는 2개 이하의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 구조이다. 예를 들어, 상기에 나타난 바와 같은 식 (I)의 화합물은 2개의 아미노산 잔기를 함유하는 프로테아제 표적화 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로테아제 표적화 요소는 카텝신, 및 특히 카텝신 L 또는 카텝신 V에 의한 절단에 대해 선택적인 구조이다.
일부 구현예에 따르면, 식 (III)의 화합물 내의 T 기는 생체내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 따라서, 이들 구현예에서, T 기는 변형된 화합물을 안정화시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
식 (III)의 일부 구현예에서, L0은 폴리에틸렌 글리콜 기를 포함하지 않는다.
식 (III)의 일부 구현예에서, 프로테아제 표적화 요소는 하기 화학식을 갖고
여기서 AA1 및 AA2는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄이고,
U는 O, N, 또는 S이며,
R은 식 (I)의 화합물에 대해 상기 정의된 바와 같다.
특정 구현예에서, AA1은 염기성 아미노산 측쇄이고, AA2는 아르알킬 아미노산 측쇄이며, 각각은 선택적으로 1개 내지 3개의 A 기로 치환된다. 다른 특정 구현예에서, U는 0이다. 또 다른 구체적인 구현예에서, R 기는 예를 들어, 벤질기와 같은 아르알킬기이다.
상기 프로테아제 표적화 요소의 일부 구현예에서, AA1은 ??처를 포함한다. 이들 구현예에서, AA1은 구조 -L1-Q를 가질 수 있고, 여기서 L1은 상기 정의된 바와 같은 링커이며, Q는 ??처이다.
이들 구현예 중 일부에서, L1 기는 생체내에서 대상 화합물의 반감기를 증가시키도록 변형될 수 있다. 따라서, 이들 구현예에서, L1 기는 변형된 화합물을 안정화시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 팔미테이트 또는 다른 장쇄 지방산 모이어티, 알부민 결합 단백질 등을 포함할 수 있다.
식 (III)의 화합물에서 검출가능한 요소 D는 상기 기재된 검출가능한 기 중 어느 것이다. 특정 구현예에서, 검출가능한 요소는 양전자 방출 물질을 포함하는, 형광 표지 또는 방사성 물질을 포함한다. 더욱 구체적인 구현예에서, 검출가능한 요소는 형광 표지를 포함하고, 카스파아제 표적화 요소 T는 ??처를 포함한다.
특정 구현예에서, 형광 표지는 플루오레세인, 오레곤 그린, 보라-디아자-인데센, 로다민, 또는 시아닌 표지이다. 구체적으로, 형광 표지는 시아닌 표지, 예컨대 Cy5일 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 형광 표지는 근적외선 형광 표지, 예컨대 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지이다. 특정 구현예에서, 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지는 다이라이트(DyLight) 표지, 예컨대 다이라이트 780B 염료 또는 다이라이트 800이다.
식 (III)의 화합물의 일부 구현예에서, 검출가능한 요소는 방사성 물질을 포함한다.
식 (III)의 화합물의 L0 링커 기는 상기 기재된 링커 중 어느 것일 수 있다.
약학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 동물에서 조직의 영상화에서 유용하며, 추가로 동물에서 효소, 예를 들어, 프로테아제 효소의 활성을 평가하는 데 유용하다. 특히, 프로테아제 기질, 및 특히 카텝신 기질인 본 발명의 화합물의 경우, 약학적 조성물은 암세포의 비침습적 광학 영상화를 위한 제제로서 유용하게 작용할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 본 기술분야에서 널리 알려져 있으며, 이는 예를 들어, 수용액, 예컨대 물 또는 생리학적으로 완충된 염수 또는 다른 용매 또는 비히클, 예컨대 글리콜, 글리세롤, 오일, 예컨대 올리브유 또는 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 이러한 약학적 조성물이 인간 투여용인 경우, 수용액은 무발열원(pyrogen free)이거나, 또는 실질적으로 무발열원이다. 부형제는, 예를 들어, 제제의 지연된 방출을 달성하기 위해 또는 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기를 선택적으로 표적화하기 위해 선택될 수 있다. 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 스프링클 캡슐(sprinkle capsule), 과립, 분말, 시럽, 좌제, 주사 등과 같은 투여 단위 형태일 수 있다. 조성물은 또한 경피 전달 시스템, 예컨대, 피부 패치 내에 존재할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 흡수를 안정화시키거나 증가시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용가능한 제제를 함유할 수 있다. 이러한 생리학적으로 허용가능한 제제는, 예를 들어, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 생리학적으로 허용가능한 제제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은, 예를 들어, 조성물의 투여 경로에 의존한다. 약학적 조성물은 또한 그 안에 혼입될 수 있는 리포좀 또는 다른 중합체 매트릭스, 예를 들어, 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인지질 또는 다른 지질로 구성된 리포좀은 제조 및 투여가 비교적 간단한 무독성의 생리학적으로 허용가능하고 대사가능한 담체이다.
문구 "약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율(benefit/risk ratio)에 비례하는, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 문구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상 화합물을 신체의 하나의 장기, 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 장기, 또는 부분으로 운반하거나 전달하는 데 관여하는 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립하고 환자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용가능"해야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는: (1) 당류, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 올레산에틸 및 라우린산에틸; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무발열원수; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) 인산염 완충액; 및 (21) 약학적 제형에서 이용되는 다른 무독성의 양립가능한 물질을 포함한다. 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed. (Alfonso R. Gennaro ed.), 2000]을 참고한다.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구로(예를 들어, 수용액 또는 비수용액에서와 같은 물약(drench) 또는 현탁액, 정제, 볼루스, 분말, 입자, 혀에 도포하기 위한 페이스트); 설하로; 항문으로, 직장으로, 또는 질로(예를 들어, 페서리(pessary), 크림, 또는 거품으로서); 비경구로(예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액으로서, 근육내로, 정맥내로, 피하로, 또는 척추강내로 포함); 비강으로; 복강내로, 피하로; 경피로(예를 들어 피부에 적용되는 패치로서); 또는 국소적으로(예를 들어, 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이로서)를 포함하는 수많은 투여 경로 중 어느 것에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 상기 화합물은 또한 흡입용으로 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 화합물은 간단히 멸균수에 용해되거나 현탁될 수 있다. 적절한 투여 경로 및 이에 적합한 조성물은, 예를 들어, 미국 특허 제6,110,973호; 제5,763,493호; 제5,731,000호; 제5,541,231호; 제5,427,798호; 제5,358,970호; 및 제4,172,896호, 뿐만 아니라 그 안에 인용된 특허에서 발견될 수 있다.
조직을 표지화하고 종양을 시각화하는 방법
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 조직을 표지화하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계, 및 상기 조성물과 프로테아제, 구체적으로 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 단계를 포함하는 동물에서 종양을 시각화하는 방법을 제공하며, 여기서 검출가능한 신호는 동물에서 종양과 관련된다.
일부 방법 구현예에서, 검출가능한 신호는 형광 신호이다. 일부 구현예에서, 형광 신호는 종양 변연부(tumor margin)에서 생성된다.
펩타이드 영상화제를 동물에게 투여하는 것은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 잘 이해된다. 바람직한 구현예에서, 임의의 다른 적합한 투여 수단이 본 발명의 범위 내에서 고려됨에도 불구하고, 상기 제제는 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 방법은 동물에서 프로테아제, 특히 시스테인 프로테아제의 표지화 및 시각화에 관한 것이다. 적합한 동물은, 특히 종양 세포에서 시스테인 프로테아제를 발현하는 동물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 동물은 포유동물이다. 매우 바람직한 구현예에서, 동물은 인간이다. 다른 바람직한 구현예에서, 동물은 가축 동물 또는 애완동물이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 동물에서 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 검출가능한 신호를 측정하는 방법은, 비제한적으로, 영상화 방법, 예를 들어 형광 영상화 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형광 영상화 시스템은, 예를 들어, 제노겐(Xenogen) IVIS 100 시스템, IVIS 스펙트럼 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA), 또는 임의의 다른 적합한 비침습적, 생체내 형광 영상화 시스템이다. 일부 구현예에서, 검출가능한 형광 신호는 다빈치(da Vinci) 수술 시스템(Intuitive Surgical, Inc., Sunnyvale, CA)을 사용하여 측정된다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 시스템은 본 영상화제로 처리된 환자 조직에서 수술중 형광 유도 수술 기법과 조합하여 본 표지화 및 시각화 방법을 구현하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서는 동물에서 조직을 표지화하는 데 사용하기 위한 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 상기에 상세히 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 이들 화합물은 조직을 표지화하기 위해 동물에게 투여된다. 상기 화합물은 또한 동물에서 종양을 시각화하는 데 사용하기 위해 제공된다. 상기와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 화합물은 동물에게 투여되며, 종양을 시각화하기 위해 상기 화합물과 프로테아제, 구체적으로 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출가능한 신호가 측정된다.
본원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 각색이 본 발명 또는 이의 임의의 구현예의 범위를 벗어나지 않으면서 이뤄질 수 있음이 관련 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 쉽게 명백할 것이다. 본 발명을 상세히 설명하였으므로, 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 명확하게 이해될 것이며, 상기 실시예는 단지 예시의 목적을 위해 포함되며 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
[ 실시예 ]
??칭된 형광 기질의 설계 및 합성
최근 보고된 일련의 강력하고 선택적인 ABP(화합물 1로서 하기에 예시됨)의 화학적 구조를 본원에 보고된 ??칭된 형광 기질 프로브를 설계하기 위한 출발점으로 사용하였다. 문헌[Verdoes et al. (2013) J. Am. Chem . Soc . 135:14726-30 및 PCT 국제 공보 제WO2014/145257호]을 참고한다.
(화합물 1)
설계 과정의 일부로서, 개선된 수용해도와 결부된, 표적 프로테아제를 억제하지 않으면서 신호를 생성하는 기질의 능력이 원래의 공유성 프로브와 비교하여 생체 내에서 더 빠르게 활성화하고 더 밝은 신호를 생성하는 기질 유사체를 야기할 것으로 판단되었다. 절단가능한 아미드 결합을 비가역적인 티올 반응성 테트라플루오로 페녹시시메틸 케톤(PMK) 친전자체(electrophile) 대신에 사용하였다(도 1A). 카텝신 활성을 영상화하기 위한 최적의 기질을 선택하기 위해, 2개의 구조 변형의 도입에 의해 ??칭된 형광 기질 프로브의 6원 라이브러리를 설계하였다. 첫째, 스페이서 길이가 카텝신에 의한 프로브의 절단/언퀀칭(unquenching) 효율에 미치는 효과를 측정하기 위해 기질 및 ??처 사이의 알킬 스페이서의 길이를 변화시켰다. 기질 2CQ(화합물 2), 4CQ(화합물 3), 및 6CQ(화합물 4)에 해당하는, [(CH2)n](n=2, 4 및 6) 범위의 3개의 상이한 스페이서 길이를 선택하였다. 둘째, Cy5 형광체의 위치를 라이신 측쇄의 아민기로부터 P1 아미드 결합에 인접한 말단 아민으로 전환시켜 각각 기질 2QC(화합물 5), 4QC(화합물 6), 및 6QC(화합물 7)를 생성하였다(도 1A). 문자 C 및 Q는 각각 형광체(Cy5) 및 ??처(QSY21-설포) 성분에 상응한다. 이론에 구속되지 않으면서, 리소좀에서 nQC 프로브의 효소적 절단 후, 상기 절단된 생성물의 Cy5 부분 상의 유리 말단 아민은 리소좀 내의 산성 pH 환경으로 인해 양성자화되는 것으로 여겨진다. 따라서, 생성된 양이온성 Cy5는 막을 가로지르는 양이온 종의 느린 확산으로 인해 리소좀 구획에 유지된다. 이러한 잠재적 리소좀향성 효과(LLE)로 인한 리소좀 구획에서의 양이온성 형광체의 보유 향상은 결국 비침습적 영상화 동안 종양 부위에서 형광 신호의 지속 시간을 증폭시키고 유지시킨다(도 IB).
6개의 모든 기질 프로브의 합성을 하기 도식 1에 나타낸 바와 같이 고상 및 용액상 화학의 조합에 의해 달성하였다. Fmoc 고상 화학을 사용하여 n-알킬 디아민, Boc-N-라이신, 및 Z-페닐알라닌을 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 위에 조립하였다. 디클로로메탄 중의 1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용한 수지로부터 기질의 선택적 절단은 상이한 길이의 알킬 스페이서를 갖는 각 기질의 코어 구조를 생성하였다. 역상 분취 HPLC에 의한 정제 후, 생성물을 두 부분으로 나누었다. 설포-QSY21-NHS 또는 Cy5-NHS를 DMSO 중에서 각 반절의 자유 말단 아민에 결합한 다음, DCM 중의 50% TFA 중에서 라이신 상의 Boc 보호기를 제거하였다. Cy5-NHS(nCQ 기질의 경우) 또는 설포-QSY21-NHS(nQC 기질의 경우)를 라이신 측쇄 위에 결합시켜 최종 ??칭된 기질을 수득하였다. HPLC에 의한 정제 후, 프로브를 시험관내에서 다양한 재조합 시스테인 카텝신에 대한 활성에 대해 시험하였다.
??칭된 형광 기질의 시험관내 분석
다양한 재조합 시스테인 프로테아제, 구체적으로 카텝신 L, S, K, B, 및 V의 존재하에 각각의 내부적으로 ??칭된 프로브의 전환 곡선을 모니터링함으로써 6개의 모든 기질의 활성 및 선택성을 결정하였다. 동일 농도(5nM)의 각 효소를 37℃에서 50mM 구연산 완충액(pH = 5.5, 5mM DTT, 0.1% 트리톤 X, 0.5% CHAPS)에서 상이한 프로브와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 다양한 카텝신의 정확한 농도를 공유성 시스테인 프로테아제 억제제 ZFK-PMK 및 카텝신 S, L, B, 및 V에 대한 상업적인 기질 Z-VVR-AMC, 또는 카텝신 K에 대한 상업적인 기질 Z-KR-AMC를 사용한 활성 부위 적정(Boucher et al. (2014) Methods Mol . Biol . 1133:3-39)에 의해 확인하였다. Cy5 형광(카텝신에 의한 프로브 절단을 나타냄)의 증가 속도를 각 프로브에 대해 측정하였다.
??칭된 기질(nQC 및 nCQ, n = 2, 4, 6) 모두는 카텝신 L, V, S 및 K에 의해 절단되었지만, 사용된 조건하에서 카텝신 B에 의해 형광의 증가가 관찰되지 않았다(도 2). 시험된 카텝신 중에서, Cat L은 모든 프로브에 대해 가장 높은 형광 증가를 생성하였으며, 이는 시스테인 카텝신 L에 대한 상기 라이브러리의 강한 선택성을 시사한다(도 2, 각 패널에서 상부 선). 흥미롭게도, nCQ 및 nQC 프로브는 다양한 카텝신에 의해 동일한 정도로 절단되었기 때문에, 기질의 절단은 형광체 및 ??처 쌍의 배향에 의해 영향을 받지 않았다(도 2, 우측 패널과 비교된 좌측 패널). 반면, 상기 효소에 의한 촉매/절단 효율(K cat /K M ) 및 기질의 P1 위치에 인접한 알킬 스페이서의 길이 사이에는 강한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, Cat L에 대해, 2CQ 및 6CQ 사이에서 4배의 촉매 효율의 증가가 관찰된 반면, 2QC 및 6QC 기질 사이에서 6배 증가가 관찰되었다(표 1). 이러한 관찰은 Cat V와 일치하였으며, 여기서 n이 각각 2와 6인 스페이서 길이 사이에 8배 및 4배의 효율 증가가 관찰되었다(표 2). 이러한 촉매 효율의 차이는 전적으로 전환수(kcat)의 차이로부터 비롯되었는데, 모든 기질의 Km이 Cat L에 대해 상당히 동일하게 유지되었기 때문이다(표 1). 시험관내에서 기질의 더 높은 효소 전환은 특히 주목할만한데, 더 높은 전환수가 비침습적 영상화 동안 세포에서 이러한 프로브의 더 빠른 활성화를 나타낼 수 있기 때문이다.
표 1: 재조합 카텝신 L을 이용한 ??칭된 기질의 효소 동력학적 매개변수. 데이터는 3개의 반복 실험의 평균 ± 상기 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
표 2: 재조합 카텝신 V를 이용한 ??칭된 기질의 효소 동력학적 매개변수. 데이터는 3개의 반복 실험의 평균 ± 상기 평균에 대한 표준 편차를 나타낸다.
많은 형태의 암의 한 가지 특징은 대식세포와 같은 카텝신이 풍부한 면역 세포의 종양 주변 영역으로의 침투 증가이다(Shree et al. (2011) Genes Dev . 25:2465-79; Bell-McGuinn et al. (2007) Cancer Res. 67:7378-85). 따라서, 시스테인 카텝신 활성의 비침습적 영상화를 위한 가능한 시약으로서 ??칭된 기질을 이용하기 전에, 대식세포 유래 세포주 RAW264.7에서 프로테아제의 활성화를 초기에 측정하였다. 세포를 프로브와 함께 배양한 다음, 형광 현미경 검사에 의해 영상화하였다. 1μM의 각 ??칭된 기질 nCQ 및 nQC를 10% FBS를 갖는 DMEM에서 그리고 37℃에서 CO2 분위기에서 30분간 RAW264.7 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척하고 리소좀 선택적 마커 리소트랙커 레드(Lysotracker Red) 및 회흐스트(Hoechst) 33342 핵 염색으로 염색하고, PBS로 3회 세척한 다음, 살아있는 세포 영상화를 위해 PBS에 현탁시켰다. 강한 Cy5 형광 프로브가 상기 세포와 함께 인큐베이션된 ??칭된 기질 각각에 대해 관찰되었으며, 이는 이러한 프로브가 이러한 대식세포 유래 세포주에서 시스테인 프로테아제에 의해 활성화된다는 것을 입증한다(도 3C). 살아있는 세포에서의 표지화는 프로브와 리소트랙커 레드의 공존(co-localization)에 의해 나타난 바와 같이, 산성 소포(vesicle)에 대해 매우 선택적이었다. 비공유성 기질의 표지화 형태는 공유성 표지, 화합물 1로 처리된 세포의 형태와 유사하였으며, 이는 세포 내로의 유사한 도입 방식을 나타낸다.
가역적 기질을 이용한 종양의 비침습적 광학 영상화
시험관내 및 세포 기반 분석에서 기질의 활성을 입증한 후, 기질을 유방암의 동계(syngeneic), 동소(orthotopic) 마우스 모델에서 평가하였다. 이러한 모델에서, 4T1 세포를 마우스의 좌측 1번 및 10번 유방 지방 패드(mammary fat pad)에 접종하여 종양을 생성한다. LLE의 영향을 결정하기 위해, 리소좀향성 프로브 2QC(화합물 5) 및 6QC(화합물 7)의 영상화 신호를 비리소좀향성 유사체 2CQ(화합물 2) 및 6CQ(화합물 4)의 영상화 신호와 직접 비교하였다. 기질을 종양을 갖는 마우스에게 정맥내로 투여하고, 투여 후 다양한 시점에 마우스를 영상화하였다. ??칭된 기질 프로브의 전환으로부터 Cy5 형광의 급속한 축적이 투여 후 30분 이내에 종양 및 그 주변에서 관찰되었고, 종양을 주변 정상 조직과 경계짓는 충분한 대조가 1시간 이내에 관찰되었다(도 4A). 형광 신호의 강도는 투여 후 4시간에 최대에 도달한 후 신호 강도가 감소하였다(도 4B). 종양에서 전체적인 절대 형광 강도는 비리소좀향성 기질 2CQ 및 6CQ와 비교하여 LLE 기질 2QC 및 6QC가 주사된 마우스에 대해 더 높고 더 밝았다. 나아가, LLE 기질이 투여된 마우스의 종양에서 신호 강도는 24시간의 기간 동안 일정하게 유지된 반면, 비LLE 기질로부터의 신호는 24시간 후에 거의 완전히 제거되었다(도 4A 및 4B). 유사한 경향이 4시간 및 24시간 후에 안락사된 마우스로부터 절제된 종양의 생체외 영상화에 의해 관찰되었다(도 4C). 이러한 데이터는 저분자량의 가역적으로 결합하는 조영제의 설계에서 잠재적 리소좀향성 효과의 가치를 입증한다.
어떤 세포 집단이 생체내에서 ??칭된 기질 프로브를 활성화시키는 역할을 하는지 결정하기 위해, 각 기질이 주사된 마우스로부터 단리된 종양의 동결 절단된 절편의 면역형광 염색을 대식세포-선택적 마커 CD68을 사용하여 수행하였다. 기질의 Cy5 신호는 CD68-양성 세포(대식세포)에만 공존하였고, 4T1 종양 세포에서는 신호가 관찰되지 않았다(도 5A). 더욱이, Cy5 형광은 nQC 기질을 투여받은 마우스의 조직에서만 관찰되었고 nCQ 기질로 처리된 마우스의 조직에서는 관찰되지 않았다(도 5A). 이러한 결과는 종양에서 프로브 보유를 향상시키는 전략으로서 LLE의 유용성을 추가로 입증한다.
다빈치 수술 시스템을 사용한 FGS에서 프로브의 적용
다빈치 수술 시스템은 인튜이티브 서지컬사(Intuitive Surgical Inc.)에 의해 제작된 로봇 수술 시스템으로서 현재 복강경 수술을 위해 전 세계 병원에서 사용되고 있다. 이 시스템을 사용한 수술 절차는 현재 백색 조명하에서 수행되고 있지만, 이는 종양의 변연부를 주변 정상 조직과 경계짓기에 충분한 대조를 제공하지 못하고 있다. 따라서, 기존의 다빈치 시스템과도 호환되는 종양 표적화 조영제의 개발은 매우 가치가 높으며, 이는 형광 유도 수술(FGS)에서 현저하게 개선된 치료 결과를 야기할 것이다.
따라서, 상기 기재된 최적화된 기질 프로브를 FGS의 임상학적으로 관련된 모델 시스템에서 시험하였다. 이러한 결과를 달성하기 위해, 가역적인 프로브 6CQNIR(화합물 8) 및 이 기질의 리소좀향성 유사체 6QCNIR(화합물 9)을 합성하였다. 이들 화합물에서, Cy5 발색단을 유사한 분자량의 근적외선(NIR) 다이라이트 780-B1 형광체로 전략적으로 치환하였다. n = 6을 갖는 링커를 갖는 화합물을 시험관내에서 카텝신에 의한 최적 전환수에 기초하여 선택하였다. QSY21-설포 ??처를 또한 다크 NIR ??처인 IRDye QC-1로 치환하였다(도 6A). 다빈치 로봇의 카메라 시스템 상에서 검출될 수 있는 것 외에도, NIR 염료의 방출 파장(783/799 nm의 최대 흡수/방출)은 낮은 전체 배경을 갖는 윈도우 내에 속하므로 조직 침투를 향상시키고 영상화 동안 신호 대 배경 비율을 개선할 것이다(Richards-Kortum and Sevick-Muraca (1996) Annu . Rev. Phys. Chem. 47:555-606). NIR 프로브를 IVIS-스펙트럼 영상화 시스템을 사용하여, 상기 기재된 4T1 유방암 모델에서 조영제로서 먼저 분석하였다. 상기 조영제의 전신 투여 후, 마우스를 4시간 동안 매 시간마다 비침습적으로 영상화한 다음, 기질의 주사 후 6, 8, 12 및 24시간에 영상화하였다. 프로브 신호의 급속한 축적이 이식된 유방 종양에서 관찰되었다. 구체적으로, 종양 변연부를 건강한 주변 조직과 경계짓는 실질적인 대조가 2개의 프로브의 주사 후 1시간 정도로 조기에 관찰되었다(도 6B). 종양에서의 형광 신호의 강도는 두 가지 유형의 프로브가 주사된 마우스에서 급속하게 증가하였고, 결국 4 내지 6시간 사이에 최고에 달하였다. 이 시점은 이러한 계열의 비공유성 ??칭된 형광 프로브의 전신 투여 후 종양을 영상화하기 위한 최적의 원도우를 의미할 수 있다. 초기 프로브와 유사하게, 근적외선 유사체는 비LLE 기질에 비해 LLE 기질 6QCNIR이 주사된 마우스의 종양에서 더 느린 제거율 및 더 밝은 신호에 의한 증거로서 리소좀 포획 효과를 나타내었다(도 6C). 1시간 내지 4시간 사이에, 두 기질은 유사한 초기 강도를 나타내었고, 이는 카텝신에 의한 두 기질의 활성화 속도가 동일하다는 것을 나타낸다.
작은 동물 영상화 시스템을 사용하여 긍정적인 결과를 얻은 다음, 다빈치 수술 시스템을 사용한 영상 유도 절제 연구를 수행하였다. 이러한 로봇 수술 시스템(도 7A)은 최소 침습 복강경 수술 절차를 수행하는 데 사용될 수 있다. 상기 시스템은 또한 NIR 신호를 전달하는 조영제를 시각화하기 위해 백색 영상화 시스템과 함께 사용될 수 있는 NIR 카메라가 장착되어 있다. 따라서 다수의 암의 모델에서 종양 절제 연구를 수행할 수 있었다. 결장암 모델(APC 마우스; 도 7B, 도 7C)뿐만 유방암(4T1 이식 모델; 도 7D, 도 7E) 및 전이성 폐암 모델(도 7F)에 대한 수술적 절제를 선택하였다. 각 수술의 경우, 다빈치 로봇을 사용하여 양성 프로브 신호의 절제를 수행하였다. 조직학적 분석을 수행하여 기질 양성 조직에서 암 세포의 존재를 확인하기 위해, 조직을 또한 동물로부터 제거하였다.
전체적으로 이들 데이터는 NIR 형광 기질 프로브가 암의 3가지 모델 모두에서 종양을 강조할 수 있었음을 확인시켜주었다. 나아가, 기존의 다빈치 로봇 시스템이 암 병변을 확인하고 추가 분석을 위해 이를 제거하는 데 사용될 수 있을 것이다.
도 8A - 도 8C는 이탈기 내에 킬레이터(chelator)를 함유하는 카텝신 프로브의 구조 및 동물에서 카텝신 활성을 영상화하기 위한 PET 기질 프로브의 용도를 나타낸다.
방법
일반
모든 수지 및 시약을 상업적 공급자로부터 구입하였고 추가 정제 없이 사용하였다. 반응 및 수성 정밀검사(workup)에 사용되는 물은 탈이온수 공급물로부터 유리 증류하였다. 시약 등급 용매를 모든 비수성 추출에 사용하였다. 물에 민감한 모든 반응을 아르곤의 정압하에 무수 용매 중에서 수행하였다. 반응을 API 150EΧ 단일 사극자 질량 분광계(single-quadrupole mass spectrometer; Applied Biosystems)를 사용하여 LC-MS에 의해 분석하였다. 합성된 화합물을 C18 컬럼을 사용하는 ÅKTA 익스플로러(explorer) 100(Amersham Pharmacia Biotech)을 갖는 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 화합물을 용매로서 1% 트리플루오르아세트산을 함유하는 재증류수 및 아세토니트릴의 구배로 용출시켰다. NMR 스펙트럼을 펄스장 구배 액세서리가 장착된 바리안(Varian) 400 MHz (400/100), 바리안 500 MHz (500/125) 상에 기록하였다. 1H NMR 스펙트럼을 25℃에서 브루커 아반스(Bruker Avance) 400(400 MHz) 또는 브루커 아반스 500 (500 MHz) 기기 상에 기록하고 메스트레노바(MestReNova) NMR 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 화학적 이동(δ)을 테트라메틸실란으로부터 다운필드로 백만분의 일(ppm)로 보고하고, NMR 용매(CDCl3, δ = 7.25)에서 잔류 프로티움 신호에 대해 참조한다. 데이터를 하기와 같이 보고한다: 화학적 이동, 다중도 (s = 단일항(singlet), d = 이중항(doublet), t = 삼중항(triplet), m = 다중항(multiplet) 및 q = 사중항(quartet)), 커플링 상수(J; 단위 Hertz(Hz)) 및 통합. 세포를 10% FBS 및 1% pen-strep이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM(GIBCO Cat# 11995))에서 배양하였다.
화합물 합성
도식 1은 이들 연구에 사용된 형광 기질의 초기 시리즈의 합성을 요약한다.
도식 1. 비공유성 ??칭된 형광 활성 기반의 기질의 6원 라이브러리의 합성
중간체 la, lb, 및 lc.
0.5 g의 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(0.84 mmol/g 로딩)를 3개의 별개의 고상 반응 용기 내로 칭량하였다. 상기 반응 용기를 a부터 c까지 표시하였다. 디클로로메탄(DCM)을 첨가하여 수지를 현탁시킨 후, 반응을 실험실 쉐이커를 사용하여 15분 동안 교반하였다. DCM으로 2회 세척한 후, 3 mL의 DCM 중의 모노-Fmoc-1,3-에탄디아민(0.35 g, 1.26 mmol), 모노-Fmoc-1,4-부탄디아민(0.39 g, 1.26 mmol), 및 모노-Fmoc1,6-헥산디아민(0.43 g, 1.26 mmol)을 각각 용기 a, b, 및 c 내의 수지에 첨가하였다. 그리고 나서, 디이소프로필틸아민(DIPEA, 3당량)을 각각에 첨가하고, 반응을 실온에서 30분간 교반하였다. 그리고 나서, 수지를 DCM으로 세척한 후, 반응하지 않은 트리틸-클로라이드를 비활성화시키기 위해 10분간 메탄올에 현탁시켰다. 수지를 1시간 동안 DMF 중의 20% 피페리딘의 용액에 현탁시켜 Fmoc 탈보호화를 달성한 다음, 각각 DCM 및 DMF으로 3회 세척하였다. 그 다음, 제1 아미노산 Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.58 g, 1.26 mmol)를 3 mL DMF 중의 HBTU(0.48 g, 1.26 mmol) 및 DIPEA(0.17 g, 1.26 mmol)를 사용하여 수지에 결합시키고 상기 혼합물을 2시간 회전시켰다. 세척 사이클 후, 1시간 동안 DMF 중의 5 mL의 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc 탈보호화를 달성한 다음, 다시 세척 사이클을 수행하였다. 남아 있는 아미노산 Cbz-Phe-OH를 유사하게 수지 상의 펩타이드에 결합시켰다. 그리고 나서, 수지를 DCM 중의 용액 1% 트리플루오로아세트산으로 처리하여 수지로부터 펩타이드(생성된 Boc 보호된 라이신을 가짐)를 선택적으로 절단시켰다. 톨루엔으로 공증발시켜 각 절단된 생성물로부터 용매를 제거하여, 각각 중간체 기질 la, lb, 및 lc를 얻었다(도식 1). 그리고 나서, 각각의 생성물을 역상 분취 HPLC에 의해 추가로 정제하여 95%를 초과하는 순도의 최종 펩타이드를 수득하였다.
기질 2CQ , 4CQ , 및 6CQ (화합물 2, 3, 및 4)
별개의 1 mL 에펜도르프 튜브에, 중간체 1a(2.0 mg, μmol), 1b(2.0 mg, μmol) 및 1c(2.0 mg, μmol)를 100 μL의 DMSO에 용해시켰다. DIPEA(3 μL, μmol)를 첨가한 후 QSY21-설포-NHS(1.2, mmol)를 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 생성물을 HPLC에 의해 정제하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거한 후, DCM 중의 30% TFA로 30분간 처리하여 라이신 상의 Boc 보호를 제거하였다. 용매의 제거 후, 생성물을 동결건조한 다음, DMSO 중의 Cy5-NHS 및 3 당량의 DIPEA와 반응시켰다(도식 1). 최종 생성물을 각각 역상 HPLC에 의해 정제하여 비리소좀향성 ??칭된 형광 기질 nCQ(여기서, n = 2, 4, 및 6)를 각각 수득하였다.
기질 2QC , 4QC , 및 6QC (화합물 5, 6, 및 7)
별개의 1 mL 에펜도르프 튜브에, 중간체 1a(2.0 mg, μmol), 1b(2.0 mg, μmol) 및 1c(2.0 mg, μmol)를 100 μL의 DMSO에 용해시켰다. DIPEA(3 μL, μmol)를 첨가한 후, Cy5-NHS(1.2, mmol)를 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 생성물을 HPLC에 의해 정제하였다. 용매를 회전 증발에 의해 제거한 후, DCM 중의 30% TFA로 30분간 처리하여 라이신 상의 Boc 보호를 제거하였다. 용매의 제거 후, 생성물을 동결건조한 다음, DMSO 중의 QSY21-설포-NHS 및 3 당량의 DIPEA와 반응시켰다(도식 1). 최종 생성물을 각각 역상 HPLC에 의해 정제하여 잠재적 리소좀향성 효과 ??칭된 형광 기질 nCQ(여기서, n = 2, 4, 및 6)를 각각 수득하였다.
도식 2. 다빈치 수술 로봇과 호환가능한 근적외선 비공유성 ??칭된 형광 활성 기반 프로브의 합성
방사성표지화
간략하게, 90μL 아세트산나트륨 완충액(0.1M, pH 5.5) 중의 10μL LO263(10mM)(도 8A)을 100μL 아세트산나트륨 완충액(0.1M, pH 5.5) 중의 4 mCi의 64CuCl2와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 64Cu-LO263을 제조하였다. 실온으로 냉각한 후, 상기 반응 혼합물을 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 그리고 나서, 64Cu-LO263을 3분간 95% 용매 A(0.1% TFA를 갖는 증류수) 및 5% 용매 B(0.1% TFA를 갖는 아세토니트릴)에서 시작하여 23분간 5% 용매 A 및 95% 용매 B까지의 이동상을 갖는 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 그리고 나서, 64Cu-LO263을 함유하는 용리된 분획(체류 시간 18.9분)을 수집하고 회전 증발기를 사용하여 건조시켰다. 방사성 표지화 수율은 90%였다(HPLC로부터 계산됨). 주요 생성물 피크 대 다른 피크의 비율로서 정의되는 방사성화학 순도는 방사성-HPLC에 의해 >95%인 것으로 결정되었고, 프로브의 특이적 활성은 3-4 Ci/mmol인 것으로 결정되었다. 그리고 나서, 64Cu-LO263을 0.9% 염수에서 재구성하고 동물 PET/CT 영상화를 위해 멸균 바이알 내로 0.22 μm 밀리포어(Millipore) 필터를 통과시켰다.
PET 생체내 영상화
마우스에게 100 μCi의 64Cu-LO263을 정맥내로 주사하고 인베온(Inveon) 작은 동물 PET/CT(Siemens)를 사용하여 2시간, 및 24시간 후 영상화하였다(도 8B). 간략하게, CT 해부 영상 스캔을 약 0.1 mm의 픽셀 크기로 수득하였다(80 kV, 500 μA). CT 영상화 후, 전신 PET 영상화를 5분 정적 스캔으로 수행하였다. PET 영상을 CT 감쇠를 기초로 한 배열된 부분집합 기대값 최대화 3차원 알고리즘(ordered-subsets expectation maximization 3-dimensional algorithm)을 사용하여 재구성하고 인베온 리서치 워크플레이스(Inveon Research Workplace(IRW)) 소프트웨어(Siemens)를 사용하여 분석하였다. PET 화소(voxel) 크기는 0.796 X 0.861 X 0.861 mm였고, 총 128 X 128 X 159 화소였다. 그 후, PET/CT 정량 분석을 수행하고, 조직 방사능을 계산하고 조직 1 g 당 붕괴 보정된(decay-corrected) 백분율 주사 용량(%ID/g)으로서 표시하였다. 상기 시험을 수행하는 조사자들은 어떤 기가 영상화되었는지에 대해 알지 못하였다.
합성 화합물의 NMR 스펙트럼
2CQ (2)
LCMS: C99H108N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 966.81; 확인됨; 966.8, HRMS: C99H108N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 966.8159; 확인됨: 966.8121. 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.40 - 8.29 (m, 2H), 8.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.04 - 7.92 (m, 2H), 7.84 (s, 1H), 7.81 (s, 2H), 7.73 (dd, J = 10.7, 5.6 Hz, 2H), 7.70 - 7.57 (m, 9H), 7.57 - 7.47 (m, 5H), 7.34 - 7.15 (m, 14H), 6.54 (t, J = 10.2 Hz, 7H), 6.29 (dd, J = 13.6, 7.9 Hz, 2H), 4.92 (s, 2H), 4.35 (dd, J = 9.5, 7.2 Hz, 4H), 4.30 - 4.22 (m, 1H), 4.10 (tdd, J = 12.7, 7.4, 5.6 Hz, 4H), 3.28 - 3.20 (m, 9H), 3.09 - 2.90 (m, 8H), 2.70 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.69 - 2.64 (m, 1H), 2.34 - 2.32 (m, 1H), 2.02 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.67 (s, 13H), 1.62 - 1.47 (m, 6H), 1.35 - 1.21 (m, 10H).
4CQ (3)
LCMS: C101H112N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 980.8; 확인됨; 980.6, HRMS: C101H112N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 980.8315; 확인됨: 980.8264. 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.33 (t, J = 13.0 Hz, 2H), 8.18 (dd, J = 7.7, 1.1 Hz, 1H), 8.03 - 7.91 (m, 3H), 7.79 (s, 3H), 7.75 - 7.55 (m, 12H), 7.55 - 7.49 (m, 4H), 7.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.35 - 7.11 (m, 15H), 6.54 (t, J = 12.5 Hz, 2H), 6.27 (dd, J = 14.0, 8.0 Hz, 2H), 4.90 (s, 2H), 4.41 - 4.29 (m, 4H), 4.29 - 4.18 (m, 1H), 4.19 - 3.95 (m, 6H), 3.29 - 3.12 (m, 9H), 3.04 - 2.80 (m, 8H), 2.67 (ddd, J = 8.8, 6.3, 5.4 Hz, 2H), 2.31 (dt, J = 3.5, 1.9 Hz, 1H), 2.00 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.65 (s, 14H), 1.50 (dd, J = 11.2, 6.4 Hz, 6H), 1.36-1.17 (m, 16H).
6CQ (4)
LCMS: C103H116N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 994.8; 확인됨; 994.8, HRMS: C103H116N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 994.8472; 확인됨: 994.8444. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.34 (t, J = 12.9 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.04 - 7.91 (m, 3H), 7.79 (s, 2H), 7.71 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.63 (ddd, J = 20.6, 10.2, 5.4 Hz, 10H), 7.50 (dd, J = 17.0, 7.9 Hz, 5H), 7.21 (ddt, J = 23.7, 21.2, 7.0 Hz, 14H), 6.54 (t, J = 12.3 Hz, 4H), 6.27 (dd, J = 13.7, 7.8 Hz, 2H), 4.90 (s, 2H), 4.34 (t, J = 9.9 Hz, 4H), 4.25 (dd, J = 10.2, 6.0 Hz, 1H), 4.19 - 3.97 (m, 5H), 3.23 (dt, J = 17.2, 8.7 Hz, 9H), 3.04 - 2.84 (m, 7H), 2.71 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 2.67 - 2.63 (m, 1H), 2.31 (dt, J = 3.7, 1.9 Hz, 1H), 2.00 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.65 (s, 13H), 1.50 (t, J = 11.5 Hz, 6H), 1.36- 1.05 (m, 20H).
2QC (5)
LCMS: C99H108N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 966.81; 확인됨; 966.8, HRMS: C99H108N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 966.8159; 확인됨: 966.8122. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.33 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.07 - 7.91 (m, 25 3H), 7.90 - 7.84 (m, 1H), 7.79 (s, 3H), 7.70 - 7.57 (m, 10H), 7.50 (dd, J = 18.9, 10.0 Hz, 4H), 7.23 (ddt, J = 24.4, 16.0, 8.0 Hz, 14H), 6.60 - 6.50 (m, 2H), 6.27 (dd, J = 13.4, 10.2 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.43-4.29 (m, 4H), 4.25 (td, J = 11.1, 6.0 Hz, 1H), 4.17 - 4.00 (m, 5H), 3.28 - 3.17 (m, 8H), 3.09 - 2.94 (m, 6H), 2.87 (dt, J = 12.4, 6.4 Hz, 2H), 2.75 - 2.63 (m, 2H), 2.34 - 2.28 (m, 1H), 2.05 - 1.98 (m, 3H), 1.73 (s, 1H), 1.65 (s, 13H), 1.52 (s, 6H), 1.34 - 1.07 (m, 13H).
4QC (6)
LCMS: C101H112N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 980.8; 확인됨; 980.8, HRMS: C101H112N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 980.8315; 확인됨: 980.8267. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.33 (t, J = 13.5 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.03 - 7.90 (m, 3H), 7.79 (s, 3H), 7.72 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.68 - 7.56 (m, 10H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 7.47 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.23 (dq, J = 24.2, 8.1 Hz, 14H), 6.55 (t, J = 12.3 Hz, 3H), 6.27 (dd, J = 13.8, 7.1 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.34 (t, J = 9.5 Hz, 4H), 4.22 (dd, J = 16.2, 7.4 Hz, 1H), 4.16 - 4.00 (m, 5H), 3.28 - 3.15 (m, 8H), 3.07 - 2.90 (m, 6H), 2.86 (dd, J = 11.4, 5.5 Hz, 2H), 2.74 - 2.63 (m, 2H), 2.43 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 3.5, 1.8 Hz, 1H), 1.99 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.65 (s, 14H), 1.57 - 1.43 (m, 6H), 1.36-1.17 (m, 15H).
6QC (7)
LCMS: C103H116N10O21S5 2 +에 대해 계산됨: 994.8; 확인됨; 994.8, HRMS: C103H116N10O21S5 2+에 대해 계산됨: 994.8472; 확인됨: 994.8429. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.34 (t, J = 13.1 Hz, 2H), 8.21 - 8.12 (m, 1H), 7.96 (dt, J = 15.3, 8.5 Hz, 3H), 7.79 (s, 3H), 7.73 - 7.55 (m, 11H), 7.50 (dd, J = 19.7, 8.5 Hz, 5H), 7.23 (dq, J = 16.3, 7.7 Hz, 14H), 6.53 (s, 8H), 6.27 (dd, J = 13.8, 5.6 Hz, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.28 (ddd, J = 19.8, 16.3, 7.2 Hz, 5H), 4.08 (ddd, J = 16.0, 11.8, 6.5 Hz, 5H), 3.27 - 3.13 (m, 7H), 3.04 - 2.90 (m, 5H), 2.86 (dd, J = 12.5, 5.9 Hz, 2H), 2.74 -2.63 (m, 2H), 2.31 (dt, J = 3.5, 1.7 Hz, 1H), 2.00 (t, J = 7.0Hz, 2H), 1.66 (s, 12H), 1.58 - 1.44 (m, 5H), 1.38 - 1.13 (m, 20H).
본원에 언급된 모든 특허, 특허 공보 및 다른 공개된 참고문헌은 각각이 개별적으로 그리고 구체적으로 본원에 참고로 포함되는 것처럼 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
특정 예가 제공되었지만, 상기 설명은 예시적이며 제한적인 것이 아니다. 앞서 기재된 구현예의 어느 하나 이상의 특징은 본 발명의 임의의 다른 구현예의 하나 이상의 특징과 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 나아가, 본 발명의 많은 변형은 본 명세서를 검토시 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 등가물의 전체 범위와 함께, 청부된 청구범위를 참조함으로써 결정되어야 한다.

Claims (67)

  1. 하기 식 (II)를 갖는 화합물:


    여기서
    n' 및 n"는 각각 독립적으로 2-8의 정수이고;
    R1은 QSY ??처 또는 QC-1이며;
    R2는 벤조피릴리움 또는 시아닌 표지이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R2는 Cy5인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 R2는 형광 표지이고, 상기 형광 표지는 근적외선 형광 표지인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화합물 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물:
    ;
    ; 및
    ;
    여기서 n'는 2, 4, 또는 6이다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 동물에서 종양 조직을 표지화하는 데 사용하기 위한 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 동물에서 종양을 시각화하는 데 사용하기 위한 조성물로서,
    상기 화합물과 카텝신 시스테인 프로테아제와의 반응으로부터 동물에서 생성된 검출가능한 신호가 측정되고; 상기 검출가능한 신호는 동물에서 질병에 걸린 조직과 관련된 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 검출가능한 신호는 형광 신호인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형광 신호는 근적외선 신호인 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 검출가능한 신호는 종양 변연부(tumor margin)에서 생성되는 것인 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 검출가능한 신호는 영상 유도 수술 장치를 사용하여 측정되는 것인 조성물.
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