CN101743022A - 光学成像剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适用于体内光学成像的成像剂，其包含与例如血浆蛋白质具有降低的非特异性结合的五甲炔花青染料共轭物。这通过控制磺酸取代基，特别是磺烷基的性质和位置来实现。还公开了药物组合物和试剂盒，以及体内成像法。
Description
发明领域
本发明涉及适用于体内光学成像的成像剂，其包含与例如血浆蛋白质具有降低的非特异性结合的五甲炔花青(pentamethine cyanine)染料的共轭物。这通过控制磺酸取代基，特别是磺烷基的性质和位置来实现。还公开了药物组合物和试剂盒，以及体内成像法。
发明背景
US 6083485和同族公开了使用具有2.0或更小的辛醇-水分配系数的花青染料的体内近红外(NIR)光学成像法。还公开了所述染料与分子量最多30kDa的“生物检测单元”的共轭物(conjugate)，其结合到特定细胞群体上或选择性结合到受体上，或积聚在组织或肿瘤中。US 6083485的染料也可以共轭到大分子，如聚赖氨酸、葡聚糖或聚乙二醇上。没有公开特异性染料-共轭物。
WO 00/16810公开了在分子中具有3个或更多磺酸基并具有式A的NIR荧光对比剂：
其中：
R1和R2相同或不同并且各自是取代或未取代的烷基；
Z1和Z2各自是形成取代或未取代的稠合苯并环或稠合萘并环所必需的非金属原子；
r是0、1或2；
L1至L7相同或不同并且各自是取代或未取代的次甲基(methine)，条件是当r是2时，成双出现的L6和L7相同或不同；X和Y相同或不同并且各自是式-O-、-S-、-CH＝CH-或-C(R3R4)-的基团，其中R3和R4相同或不同并且各自是取代或未取代的烷基。
WO 00/16810教导了式A的r优选为1，即该染料是七甲炔花青(heptamethine cyanine)染料，且在分子中具有3个或更多磺酸基的优选染料是式B的苯并吲哚染料：
其中R1、R2、L1-L7、X和Y如对式A所定义，且
R5至R16相同或不同并且各自是H、磺酸基、羧基、OH、烷基(磺烷基)氨基、双(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酰基或(磺烷基)氨基磺酰基，排除了几种具体化合物。
WO 00/16810的L1至L7聚甲炔(polymethine)链优选具有式C：
其中Z3是形成5-或6-元环所必需的非金属原子；A是H或一价基团。
WO 00/16810教导，为了优异的水溶性，磺酸基的数量优选为4或更大，但为了合成的简易性，该总数应不大于10，优选不大于8。WO 00/16810还教导了磺酸基的优选位置：
式A-位置R1、R2、Z1和/或Z2。
式B-位置R1、R2、R5、R7、R11和/或R13；
式C-经由二价基团，如亚烷基的位置A。
WO 01/43781公开了具有7个次甲基碳的花青染料(即七甲炔或Cy7染料)，相当于在上式A中r＝1。WO 01/43781的染料具有4至6个磺酸取代基。
Licha等人[Photochem.Photobiol.，72(3)，392-398(2000)]报道了具有至少一个亲水葡糖酰胺(glucamide)或葡萄糖酰胺(glucosamide)取代基的花青染料与母体染料相比表现出降低的血浆蛋白质结合(PPB)。两个这样的取代基而不是一个取代基据说进一步降低PPB。该亲水取代基也据说改进该染料的光物理性质，并改变药物代谢动力学以增强肿瘤和正常组织之间的对比。
US 6977305(Molecular Probes，Inc.)提供了下式的化合物：
其中：
R2和R12独立地为烷基或磺烷基；
R3是羧基烷基；
R4、R13和R14独立地为烷基；
R6至R9和R16至R19独立地为H或磺基；且
n为1、2或3。
还公开了该染料的活化酯。相关专利US 6974873公开了使用该染料将生物样品染色的方法以及使用该染料的N-羟基琥珀酰亚胺酯形成与蛋白质、肽或核酸聚合物的染料-共轭物的方法。
WO 2005/044923公开了适用于生物材料的标记和检测的染料。该染料是式D的三甲炔(trimethine)、五甲炔(pentamethine)和七甲炔花青染料(即，n为1、2或3)：
其中：
R1和R2是C1-6烷基；未取代或被磺酸或-(CH2)k-W取代的苄基；
其中W是磺酸或膦酸，且k是值为1至10的整数；
R3至R6是H、SO3H或-E-F；
其中E是单键或具有由1-20个选自C、N和O的连接原子构成的链的间隔基，且F是靶键合基；
R11、R12、R13和R14是C1-6烷基或-(CH2)k-W；
Z1和Z2独立地为完成单环或双环芳族体系所必需的碳原子；
条件是：
(i)R11、R12、R13和R14中的一个或多个独立地为-(CH2)k-W，
(ii)R1至R7中的至少一个是-E-F。
WO 2005/044923的靶键合基团(F)被设计成与靶组分(例如蛋白质、肽、核酸或碳水化合物)的官能团反应。WO 2005/044923教导了在二氢吲哚鎓(indolinium)环的3-位置(即R11或R12)处连接的一个或优选多个水增溶性基团的存在降低染料-染料相互作用，特别是在该染料连接到如核酸、蛋白质、抗体等组分上时，并因此有助于尽量降低由染料-染料堆积引起的荧光强度损失。WO 2005/044923教导了W优选是磺酸，且应该存在至少2个-(CH2)k-W基团，优选选择它们以使R11/R12基团之一和R13/R14基团之一是-(CH2)k-W，且另一个优选是-CH3。WO 2005/044923教导了W优选是磺酸，且k优选是3或4。在另一实施方案中，WO 2005/044923教导了染料优选被3至5个磺酸基取代，且使用这类染料标记生物靶分子降低了由染料-染料聚集引起的荧光损失。WO 2005/044923也公开了用式D的染料标记生物分子的方法。WO 2005/044923涉及体外染料应用，没有提及体内应用。
WO 2005/123768公开了用于血管生成的体内光学成像的花青染料(其是羰花青(carbacyanines)；氧杂花青(oxacyanines)、噻花青或氮杂花青(azacyanines))与RGD型肽的共轭物。WO 2005/123768的花青染料优选是五甲炔或七甲炔染料，并优选具有0、1或2个磺酸取代基。与现有技术的花青染料相比，减少磺酸根的数量据说实现降低的血浆蛋白质结合(PPB)和因此降低的非特异性体内吸收。2005/123768的实施例5提供了关于PPB与具有1、2和4个磺酸基的五甲炔花青染料的共轭物的数据。PPB据发现随磺酸基数量的提高而提高(PPB分别为17、21和45％)。
Bullok等人[Biochem.，46(13)，4055-4065(2007)]公开了细胞凋亡探针TcapQ547，其包含效应子半胱氨酸蛋白酶(caspase)识别序列(四肽DEVD)，其共轭到：(i)膜转运子肽(Tat肽)；(ii)远红外猝灭剂(QSY 21)和(iii)花青染料荧光团Alexa FluorTM 647上。由于QSY 21的猝灭，完整探针表现出极小荧光。在半胱氨酸蛋白酶活性位点处被半胱氨酸蛋白酶裂解后，由于共轭的Alexa FluorTM 647如今在与猝灭剂不同的分子中的事实，裂解的肽表现出荧光。该论文提到使用分离的细胞、完整细胞和体内动物模型的研究。
Strong等人[Eur.Cytokine Netw.，17，49-59(2006)]公开了在其序列的特定位置用Alexa FluorTM 647改性的趋化因子蛋白。评测了体外细胞染色特异性，致使该作者暗示该化合物可能可用于基于完整细胞的趋化因子受体检验法。
本发明
本发明提供了适用于体内光学成像的成像剂，其包含具有特定磺化模式并共轭到生物靶向部分(BTM)上的特定类型的五甲炔花青染料。本发明人已经发现，对五甲炔染料而言，磺烷基在降低血浆蛋白质结合(PPB)方面具有重要作用。这对体内和体外应用都是重要的，因为其有助于抑制非特异性结合。推测这归因于这种改性染料与基本2维(或“平面”)芳基磺化染料(例如Cy5和Cy5.5)相比的更3维或“大体积”性质。
本发明人已经发现，即使在相关系列的五甲炔花青染料中，当共轭到生物靶向分子(例如RGD肽)上时，生物特性-特别是非特异性结合-显著变化。这造成不想要的体内背景吸收，和因此降低的图像对比度以及更慢的背景清除，这需要在成像之前的不想要的延迟。此外且在现有技术中没有公认的是，与胶原(其广泛分布在哺乳动物体内)的非特异性结合显著改变。本发明提供了用于体内成像的具有优选特征的五甲炔花青染料的具体亚类。
发明详述
在第一方面中，本发明提供了适用于哺乳动物身体的体内光学成像的成像剂，其包含式I的共轭物：
[BTM]-(L)n-CyD
(I)
其中：
BTM是生物靶向分子；
CyD是式II的花青染料：
其中：
Y1和Y2独立地为-O-、-S-、-NR6-或-CR7R8-并选择它们以使Y1和Y2中的至少一个是-CR7R8-；
R1和R2独立地为H、-SO3M1或Ra，其中M1是H或Bc，且Bc是生物相容的阳离子；
R3是H、C1-5烷基、C1-6羧基烷基或Ra基团；
R4至R6独立地为C1-5烷基、C1-6羧基烷基或Ra；
R7是C1-3烷基；
R8是Ra或C1-6羧基烷基；
Ra是C1-4磺烷基；
L是式-(A)m-的合成连接基，其中各A独立地为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或单分散的聚乙二醇(PEG)结构单元；
各R独立地选自H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m是值为1至20的整数；
n是值为0或1的整数；
条件是：
(i)该花青染料包含至少一个Ra基团和总共3至6个来自R1、R2和Ra基团的磺酸取代基；
(ii)该成像剂不含荧光猝灭剂。
术语“成像剂”是指适用于整个(即完整)哺乳动物身体的目标区域的体内光学成像的化合物。该哺乳动物优选是人类对象。该成像可以是侵入性(例如手术或内窥镜的)或非侵入性的。该成像可任选用于促进活组织检查(例如经由内窥镜仪器中的活检管道)或肿瘤切除术(例如经由肿瘤边缘识别的手术程序)。
尽管式I的共轭物适用于体内成像，但其也可以具有体外用途(例如量化生物样品中的BTM的检验法或组织样品中的BTM的可视化)。该成像剂优选用于体内成像。
术语“磺酸取代基”是指式-SO3M1的取代基，其中M1是H或Bc，且Bc是生物相容阳离子。该-SO3M1取代基共价键合到碳原子上，且该碳原子可以是芳基(如R1或R2基团)或烷基(即Ra基团)。术语“生物相容阳离子”(Bc)是指带正电的抗衡离子，其与离子化的带负电的基团(在这种情况下为磺酸根)形成盐，其中所述带正电的抗衡离子也是非毒性的，因此适合施用于哺乳动物身体，尤其是人体。合适的生物相容阳离子的实例包括：碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。优选的生物相容阳离子是钠和钾，最优选为钠。
术语“荧光猝灭剂”是指抑制CyD的荧光的部分，以致既连接有猝灭剂又连接有CyD的BTM具有最小化的荧光。猝灭剂分子是本领域中已知的[Johansson，Meth.Mol.Biol.，335，17-29(2006)，和Bullok等人(前述)]。由于存在CyD，本发明的成像剂共轭物因此合适地已经是荧光的，并且不需要代谢活化来将CyD与猝灭剂分离。其优点在于，该BTM上没有共轭的、可能影响(由于例如位阻或由该猝灭剂和CyD之间或该猝灭剂和BTM之间或该猝灭剂和连接基之间的相互作用引起的构型变化)该BTM在体内与其生物识别位点的相互作用的附加分子。此外，对猝灭剂的需求将BTM限制于作为生物靶的底物(即被酶促裂解)，或在结合时发生显著构型变化的BTM。没有猝灭剂则允许使用更多种BTM，这又能够诊断更大范围的病状。也无需考虑由猝灭剂引起的任何潜在毒性问题。
术语“生物靶向部分”(BTM)是指在施用后被选择性吸收或定位于哺乳动物身体的特定位置的化合物。这类位置可能例如牵涉在特定病状中以指示器官或代谢过程如何工作。该生物靶向部分优选包含：3-100mer肽、肽类似物、类肽或肽模拟物，其可以是线型肽或环状肽或其组合；或酶底物、酶拮抗剂或酶抑制剂；合成受体-结合性化合物；寡核苷酸或寡-DNA或寡-RNA片段。
术语“肽”是指包含通过肽键(即，将某氨基酸的胺与另一氨基酸的羧基相连的酰胺键)连接的两个或更多个如下定义的氨基酸的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”是指模拟肽或蛋白质的生物活性但在化学性质上不再是肽的生物活性化合物，即它们不再含有任何肽键(即，氨基酸之间的酰胺键)。在此，术语肽模拟物以更广义地使用以包括在性质上不再完全是肽的分子，如假肽(pseudo-peptide)、半肽(semi-peptide)和类肽。术语“肽类似物”是指包含如下所述的一个或多个氨基酸类似物的肽。也参见“Synthesis of Peptides andPeptidomimetics”，M.Goodman等人，Houben-Weyl E22c，Thieme。
术语“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，它们可能天然存在或是纯合成来源的，并且可能是旋光纯的，即单对映体，并因此是手性的，或是对映体的混合物。在本文中使用氨基酸的传统3字母或单字母缩写。本发明的氨基酸优选是旋光纯的。术语“氨基酸模拟物”是指天然存在的氨基酸的合成类似物，其是等排体(isostere)，即被设计成模拟天然化合物的空间结构和电子结构。这类等排体是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于，缩酚肽、逆反(retro-inverso)肽、硫代酰胺、环烷或1，5-二取代四唑[参见M.Goodman，Biopolymers，24，137，(1985)]。
合适的酶底物、拮抗剂或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物，如氟脱氧葡萄糖；脂肪酸或弹性蛋白酶、血管紧张素II或金属蛋白酶抑制剂。优选的非肽血管紧张素II拮抗剂是氯沙坦。合适的合成受体-结合性化合物包括雌二醇、雌激素、孕激素、孕酮和其它甾类激素；多巴胺D-1或D-2受体的配体或多巴胺转运子，如莨菪烷；和5-羟色胺受体的配体。
式II的花青染料(CyD)是能在光学成像程序中使用绿至近红外光波长(500-1200纳米，优选600-1000纳米)的光直接或间接检出的荧光染料或发色团。该CyD优选具有荧光性质。
式I的连接基-(A)m-的作用之一预计是将CyD与BTM的活性位点隔开。这特别重要，因为CyD相对体积较大，因此可能发生不利的空间相互作用。这可以通过挠性(例如简单烷基链)(以使该CyD具有使其自身的位置远离活性位点的自由度)和/或刚性(例如使CyD背向活性位点的环烷基或芳基间隔基)的结合实现。也可以利用连接基的性质改变成像剂的生物分布。因此，例如，连接基中醚基团的引入将有助于使血浆蛋白质结合最小化。当-(A)m-包含聚乙二醇(PEG)结构单元或具有1至10个氨基酸残基的肽链时，该连接基可用于改变该成像剂的体内药物代谢动力学和血液清除速率。这类“生物改性剂”连接基可以加速成像剂从背景组织，如肌肉或肝，和/或从血液中清除，由此由于较少的背景干扰而产生更好的诊断图像。生物改性剂连接基也可用于促进特定代谢途径，例如经由肾而非经由肝。
术语“糖”是指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。任选地，该糖可以被官能化以允许方便偶联到氨基酸上。因此，例如，氨基酸的葡糖胺衍生物可以经由肽键共轭到其它氨基酸上。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(可购自NovaBiochem)是其一个实例：
式I表明，-(L)n[CyD]部分可以连接在BTM的任何合适的位置。对适用于-(L)n[CyD]部分的这类位置进行选择以远离负责体内结合到活性位点上的BTM部分。式I的[BTM]-(L)n-部分可以连接在式II的CyD的任何合适的位置。该[BTM]-(L)n-部分代替现有取代基(例如R1至R8基团之一)或共价连接到CyD的现有取代基上。[BTM]-(L)n-部分优选经由CyD的羧基烷基取代基连接。
优选特征
成像剂的分子量合适地为最多30,000道尔顿。该分子量优选为1,000至20,000道尔顿，最优选2000至18,000道尔顿，2,500至16,000道尔顿尤其优选。
该BTM可以是合成或天然来源的，但优选是合成的。术语“合成”具有其常规含义，即人造的，而非分离自天然来源，例如分离自哺乳动物身体。这类化合物的优点在于，可以充分控制它们的制造和杂质状况。天然来源的单克隆抗体及其片段因此不在本文所用的术语“合成”的范围内。
该BTM优选选自：3-100mer肽、酶底物、酶拮抗剂或酶抑制剂、BTM最优选是3-100mer肽或肽类似物。当该BTM是肽时，其优选为4-30mer肽，最优选为5至28-mer肽。
在式II中，Y1和Y2优选都独立地为-CR7R8-。在式II中，R3优选为H或Ra基团，最优选为H。R7优选为CH3。
式I的[BTM]-(L)n-部分优选连接在式II的CyD的位置R3、R4、R5、R6、R7或R8处，更优选在R3、R4或R5处，最优选在R4或R5处。BTM在R3位置处的连接具有下列优点：
(i)能够为磺烷基(Ra)提供额外的优选位置；
(ii)染料的体容度(bulkiness)提高，因此有助于减少PPB。
该花青染料(CyD)优选具有总共4个选自R1、R2和Ra基团的磺酸取代基。两个Ra基团优选位于位置Y2、R3、R4或R5，最优选在Y2＝-CR7Ra-或R4＝Ra的情况下位于R5。在式II中，Ra基团优选具有式-(CH2)kSO3M1，其中M1是H或Bc，k是值为1至4的整数，且Bc是生物相容阳离子(如上定义)。k优选是3或4。
在式II中，R1和R2优选都是SO3M1。当R1和R2都是SO3M1时，该SO3M1取代基优选在吲哚/假吲哚环的5-位置。
尤其优选的染料具有式III：
其中：
Rb独立地为Ra基团或C1-6羧基烷基；
R9至R12独立地为C1-5烷基或Rb基团，并选择它们以使R9＝R10＝Rc或R11＝R12＝Rc，其中Rc是C1-2烷基；
Ra和M1如上文对式II所定义。
式III的Ra基团优选独立地为-(CH2)kSO3M1，其中k是值为1至4的整数，且k优选为3或4。式III的染料优选具有C1-6羧基烷基取代基以便于共价连接到BTM上。
选择优选的式III的染料以使R9至R12之一是Rb基团，且另一些各自是Rc基团，最优选各自等于CH3。尤其优选的式III的染料具有式IIIa，其中R9至R12之一是Ra基团，且另一些各自是Rc基团，最优选各自等于CH3。优选的式IIIa的染料的Rb基团之一选自C1-6羧基烷基。
最优选的具体的式III和IIIa的染料分别是Alexa FluorTM 647和Cy5**，其中Cy5**是理想的：
当BTM是肽时，优选的这类肽包括：
-促生长素抑制素、奥曲肽和类似物，
-结合到ST受体上的肽，其中ST是指由埃希氏大肠杆菌和其它微生物产生的热稳定的毒素；
-层粘蛋白片段，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG，
-用于白细胞积聚的靶向位点的N-甲酰基肽，
-血小板因子4(PF4)及其片段，
-含RGD(Arg-Gly-Asp)的肽，其可以例如靶向血管生成[R.Pasqualini等人.，Nat Biotechnol.1997年6月；15(6)：542-6]；[E.Ruoslahti，Kidney Int.1997年5月；51(5)：1413-7]。
-α2-抗纤维蛋白溶酶、纤连蛋白或β-酪蛋白、纤维蛋白原或血小板反应素(thrombospondin)的肽片段。α2-抗纤维蛋白溶酶、纤连蛋白、β-酪蛋白、纤维蛋白原和血小板反应素的氨基酸序列可见于下列参考文献：α2-抗纤维蛋白溶酶前体[M.Tone等人.，J.Biochem，102，1033，(1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等人，Gene，139，193，(1994)]；纤连蛋白[A.Gutman等人，FEBS Lett.，207，145，(1996)]；血小板反应素-1前体[V.Dixit等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，83，5449，(1986)]；R.F.Doolittle，Ann.Rev.Biochem.，53，195，(1984)；
-作为血管紧张素的底物或抑制剂的肽，如：
血管紧张素II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(E.C.Jorgensen等人，J.Med.Chem.，1979，第22卷，9，1038-1044)
[Sar，Ile]血管紧张素II：Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile(R.K.Turker等人.，Science，1972，177，1203)。
-血管紧张素I：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu；
当BTM是肽时，在肽的一端或两端，优选两端上共轭有代谢抑制基团(MIG)。由此保护肽的两端对体内成像用途而言是重要的，否则预计发生迅速代谢，随之损失对BTM肽的选择性结合亲合力。术语“代谢抑制基团”(MIG)是指抑制或遏制该BTM肽在氨基末端或羧基末端的酶(尤其是肽酶，如羧基肽酶)代谢的生物相容基团。这类基团对体内用途而言特别重要并且是本领域技术人员公知的，且对肽胺末端而言，其合适地选自：
N-酰化基团-NH(C＝O)RG，其中酰基-(C＝O)RG的RG选自：C1-6烷基、C3-10芳基或包含聚乙二醇(PEG)结构单元。下面描述适用于连接基(L)的PEG基团。优选的这类PEG基团是式Bio1或Bio2(见下文)的生物改性剂。优选的这类氨基末端MIG基团是乙酰基、苄氧基羰基或三氟乙酰基，最优选为乙酰基。
适用于肽羧基末端的代谢抑制性基团包括：羧酰胺、叔丁基酯、苄基酯、环己基酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。适用于BTM肽的羧基末端氨基酸残基的MIG基团是：其中该氨基酸残基的末端胺被C1-4烷基，优选甲基N-烷基化。优选的这类MIG基团是羧酰胺或PEG，最优选的这类基团是羧酰胺。
当一个或两个肽末端被MIG基团保护时，该-(L)n[CyD]部分可以任选连接到MIG基团上。优选地，至少一个肽末端不含MIG基团，以使-(L)n[CyD]部分在该位置的连接分别产生式IVa或IVb的化合物：
[CyD]-(L)n-[BTM]-Z2 (IVa)；
Z1-[BTM]-(L)n-[CyD] (IVb)；
其中：
Z1连接到BTM肽的N-末端上，并且是H或MIG；
Z2连接到BTM肽的C-末端上，并且是OH、OBc或MIG，
其中Bc是生物相容阳离子(如上定义)。
在式IVa和IVb中，Z1和Z2优选都独立地为MIG。对Z1和Z2而言优选的这类MIG基团如上文对肽末端所述。尽管BTM肽在任一肽末端的代谢抑制也可以通过以此方式连接-(L)n[CyD]部分来实现，但-(L)n[CyD]本身在本发明的MIG的定义外。
该BTM肽可任选包含至少一个具有便于CyD共轭的侧链的附加氨基酸残基，并构成连接基(L)的A残基的一部分。合适的这类氨基酸残基包括用于与胺官能化的CyD染料共轭的Asp或Glu残基，或用于与羧基-或活性酯-官能化的CyD染料共轭的Lys残基。用于CyD共轭的一个或多个附加氨基酸残基合适地远离BTM肽的结合区，并优选位于C-或N-末端。用于共轭的氨基酸残基优选是Lys残基。
当存在合成连接基(L)时，其优选包含利于共轭到[BTM]和CyD上的末端官能团。在第五方面(见下文)中描述了合适的这类基团(Qa)。当L包含具有1至10个氨基酸残基的肽链时，该氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L包含PEG部分时，其优选包含由式Bio1或Bio2的单分散PEG-样结构的低聚形成的单元：
式Bio1的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸
其中p是1至10的整数。或者，可以使用基于式Bio2的丙酸衍生物的PEG-样结构：
其中p如对式Bio1所定义且q是3至15的整数。
在式Bio2中，p优选为1或2，且q优选为5至12。
当该连接基不含PEG或肽链时，优选的L基团具有所连接的原子的骨架链，其构成具有2至10个原子，最优选2至5个原子的-(A)m-部分，2或3个原子尤其优选。2个原子的最小连接基骨架链实现了良好分离CyD以使任何不合意的相互作用最小化的优点。
不可购得的BTM肽可以通过如P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，CRC Press，1997中所述的固相肽合成法合成。
可以如下制备成像剂：
为了利于CyD共轭到BTM上，合适地在该CyD上连接有反应性官能团(Qa)。该Qa基团被设计成与BTM的互补官能团反应，由此在CyD和BTM之间形成共价键。BTM的互补官能团可以是BTM的固有部分，或可以通过用本领域中已知的双官能团衍化来引入。表1显示反应性官能团和它们的互补对应物的实例：
表1：反应性取代基和可与其反应的互补基团
| 反应性基团(Q a ) | 互补基团 |
| 活化酯 | 伯氨基、仲氨基 |
| 酸酐、酰基卤 | 伯氨基、仲氨基、羟基 |
| 异硫氰酸酯 | 氨基 |
| 反应性基团(Q a ) | 互补基团 |
| 乙烯基砜 | 氨基 |
| 二氯三嗪 | 氨基 |
| 卤代乙酰胺、马来酰亚胺 | 硫醇、咪唑、羟基、胺、硫代磷酸酯 |
| 碳二亚胺 | 羧酸 |
| 肼、酰肼 | 羰基，包括醛和酮 |
| 亚磷酰胺(phosphoramidite) | 羟基 |
术语“活化酯”或“活性酯”是指羧酸的酯衍生物，其预计是更好的离去基并因此更容易与亲核体，如胺反应。合适的活性酯的实例是：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、五氟酚、五氟硫代酚、对-硝基酚和羟基苯并三唑。优选的活性酯是N-羟基琥珀酰亚胺和五氟酚酯。
BTM，如蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和类似物中存在的官能团的实例包括：羟基、氨基、巯基(sulphydryl)、羰基(包括醛和酮)和硫代磷酸酯。合适的Qa基团可以选自：羧基、活化酯；异硫氰酸酯；马来酰亚胺；卤代乙酰胺；酰肼；乙烯基砜、二氯三嗪和亚磷酰胺。Qa优选为：羧酸的活化酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺或卤代乙酰胺。
当该互补基团是胺或羟基时，Qa优选为活化酯，优选的这类酯如上所述。CyD上的优选的这类取代基是5-羧基戊基的活化酯。当该互补基团是硫醇时，Qa优选为马来酰亚胺或碘代乙酰胺基团。
Licha等人[Topics Curr.Chem.，222，1-29(2002)；Adv.DrugDeliv.Rev.，57，1087-1108(2005)]描述了用于使花青染料共轭到生物分子上的一般方法。本发明中所用的肽、蛋白质和寡核苷酸底物可以在末端位置，或在一个或多个内部位置被标记。关于使用荧光染料标记试剂的蛋白质标记的综述和实例，参见″Non-Radioactive Labelling，aPractical Introduction″，Garman，A.J.Academic Press，1997；″Bioconjugation-Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences″，Aslam，M.和Dent，A.，Macmillan Reference Ltd，(1998)。在合成肽中获得位置特异性标记的方案可得，例如参见Hermanson，G.T.，“Bioconjugate Techniques”，Academic Press(1996)。
该成像剂的制备方法优选包括：
(i)BTM的胺官能团与式Y1-(L)n-[CyD]的化合物的反应；或
(ii)BTM的羧酸或活化酯官能团与式Y2-(L)n-[CyD]的化合物的反应；
(iii)BTM的硫醇基团与式Y3-(L)n-[CyD]的化合物的反应；
其中BTM、MIG、L、n和CyD定义如上，且
Y1是羧酸、活化酯、异硫氰酸酯或硫氰酸酯基团；
Y2是胺基团；
Y3是马来酰亚胺基团。
Y2优选是伯胺或仲胺基团，最优选为伯胺基团。在步骤(iii)中，BTM的硫醇基团优选来自半胱氨酸残基。
在步骤(i)至(iii)中，该BTM可任选具有可能与CyD衍生物反应，用合适的保护基保护以便仅在所需位点选择性发生化学反应的其它官能团。术语“保护基”是指抑制或遏制不合意的化学反应但被设计为反应性足以使其可以在足够温和以致不会改变分子其余部分的条件下从所述官能团上裂解的基团。在脱保护后，获得所需产物。胺保护基是本领域技术人员公知的并合适地选自：Boc(其中Boc是叔丁氧基羰基)、Fmoc(其中Fmoc是芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。合适的硫醇保护基是Trt(三苯甲基)、Acm(乙酰氨基甲基)、t-Bu(叔丁基)、叔-丁基硫基、甲氧基苄基、甲基苄基或Npys(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。在‘ProtectiveGroups in Organic Synthesis’，Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，(John Wiley & Sons，1991)中描述了其它保护基的使用。优选的胺保护基是Boc和Fmoc，最优选为Boc。优选的胺保护基是Trt和Acm。
适合共轭到肽上的官能化花青染料(CyD)可购自GE HealthcareLimited、Atto-Tec、Dyomics、Molecular Probes等等。多数这样的染料以NHS酯形式获得。用酰肼、马来酰亚胺或琥珀酰亚氨基酯基团官能化的Alexa FluorTM 647可购自Molecular Probes。可以以类似于EP 1816475 A1的方式制备在R3位置用羧基或马来酰亚胺基团官能化的CyD。
Licha(见上文)以及Flanagan等人[Bioconj.Chem.，8，751-756(1997)]；Lin等人，[ibid，13，605-610(2002)]和Zaheer[Mol.Imaging，1(4)，354-364(2002)]描述了使光学指示染料共轭到氨基酸和肽上的方法。使连接基(L)共轭到BTM上的方法使用与独立的染料类似的化学(见上文)并且是本领域中已知的。
下面在第五方面中描述式III的染料。
在第二方面中，本发明提供适合哺乳动物施用的形式的包含所述第一方面的成像剂以及生物相容载体的药物组合物。
该“生物相容载体”是流体，尤其是液体，可以将成像剂悬浮或溶解在其中，以使该组合物生理学耐受，即可以在无毒性或没有不适当不适的情况下施用于哺乳动物身体。该生物相容载体合适地为可注射的载体液体，如注射用的无菌无热原水；水溶液，如盐水(其可以有利地平衡以使最终注射产品是等渗的)；一种或多种张力调节物质(例如血浆阳离子与生物相容的抗衡离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇和类似物)的水溶液。该生物相容载体优选是注射用的无热原水或等渗盐水。
该成像剂和生物相容载体各自在合适的管瓶或容器中供应，其包含能够保持无菌完整性和/或放射性安全的密封容器以及任选惰性顶空气体(例如氮气或氩气)，同时能够通过注射器或套管添加和提取溶液。优选的这类容器是隔膜密封的管瓶，其中用顶封(overseal)(通常为铝)压接上气密盖子。该盖子适合在保持无菌完整性的同时用皮下注射针单次或多次刺穿(例如压接上的隔膜密封盖子)。这类容器的额外优点在于，如果需要，该盖子可以在不允许外部大气，如氧气或水蒸汽侵入的情况下承受真空(例如改变顶空气体或脱气溶液)和承受压力变化，例如压降。
优选的多剂量容器包含单个大体积管瓶(例如10至30立方厘米体积)，其含有多患者剂量，由此可以在制剂的可用寿命中以各种时间间隔将单患者剂量提取到临床级注射器中以适应临床状况。预填充的注射器被设计为容纳单人剂量或“单位剂量”，因此优选为适合临床用途的一次性或其它注射器。本发明的药物组合物优选具有适合单患者的剂量并在如上所述的合适的注射器或容器中提供。
该药物组合物可任选含有附加赋形剂，如抗微生物防腐剂、pH调节剂、填料、稳定剂或摩尔渗透压浓度调节剂。术语“抗微生物防腐剂”是指抑制可能有害的微生物，如细菌、酵母或霉菌的生长的试剂。该抗微生物防腐剂也可以根据所用剂量表现出一些抗菌性质。本发明的一种或多种抗微生物防腐剂的主要作用是抑制该药物组合物中任何这类微生物的生长。但是，该抗微生物防腐剂也可任选用于抑制在施用之前在用于制备所述组合物的一个或多个试剂盒(kit)组分中可能有害的微生物的生长。合适的抗微生物防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯，即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或其混合物；苄醇；酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂是对羟基苯甲酸酯。
术语“pH调节剂”是指可用于确保该组合物的pH值在人或哺乳动物施用的可接受限度内(大约pH4.0至10.5)的化合物或化合物混合物。合适的这类pH调节剂包括可药用缓冲剂，如tricine、磷酸盐或TRIS[即，三(羟甲基)氨基甲烷]和可药用碱，如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。当该组合物以试剂盒形式使用时，该pH调节剂可任选在独立管瓶或容器中提供，以使试剂盒使用者可以作为多步骤程序的一部分调节pH值。
术语“填料”是指在制造和冻干过程中有助于材料操作的可药用填充剂。合适的填料包括无机盐，如氯化钠，和水溶性糖或糖醇，如蔗糖、麦芽糖、甘露醇或海藻糖。
该第二方面的药物组合物可以在无菌制造(即清洁室)条件下制备以产生所需无菌非热原产品。关键组分，尤其是相关试剂以及与成像剂接触的那些装置部件(例如管瓶)优选是无菌的。该组分和试剂可通过本领域已知的方法灭菌，包括：无菌过滤、使用例如γ-辐射的最终灭菌、高压灭菌、干热处理或化学处理(例如用环氧乙烷)。优选预先将一些组分灭菌，以使需要进行的操作数最小化。但是，作为预防措施，优选至少包括无菌过滤步骤作为该药物组合物的制备中的最终步骤。
该第二方面的药物组合物优选由如对下列第三方面所述的试剂盒制备。
在第三方面中，本发明提供用于制备所述第二方面的药物组合物的试剂盒，其包含无菌固体形式的所述第一方面的成像剂，从而在用第二方面的生物相容载体的无菌供给品重构时发生溶解以产生所需药物组合物。
在这种情况下，该成像剂以及上述其它任选赋形剂可以在合适的管瓶或容器中以冻干粉末形式提供。该试剂随后被设计成用所需生物相容载体重构以产生准备施用于哺乳动物的无菌非热原形式的药物组合物。
该成像剂的优选的无菌固体形式是冻干固体。该无菌固体形式优选在如对药物组合物(见上文)所述的药物级容器中供应。在将该试剂盒冻干时，该配制剂可任选包含选自糖，优选甘露醇、麦芽糖或tricine的防冻剂。
在第四方面中，本发明提供式Ia的共轭物：
[BTM]-(L)n-CyD
(Ia)
其中：BTM、L和n如对第一方面所述，且CyD具有式IIIa：
其中：
R9至R12独立地为Rb或Rc基团，并选择它们以使R9＝R10之一是Ra基团，且其它各自是Rc基团，其中Rc是C1-2烷基；
Ra、Rb和M1如对式III所定义。
式IIIa在该共轭物中的优选实施方案如上所述。
该第四方面的共轭物可用于制备具有式IIIa的优选花青染料的成像剂和药物组合物。BTM、L、n和式IIIa的染料的优选方面如上所述。可以如第一和第五方面中所述制备该共轭物。
在第五方面中，本发明提供如第四方面中定义的式IIIa的花青染料。该第五方面的染料可用于制备具有式IIIa的优选花青染料的BTM-共轭物、成像剂和药物组合物。
式IIIa的花青染料的优选方面如上所述。该染料优选进一步包含基团Qa，其中Qa是适合共轭到BTM上的反应性官能团。合适和优选的Qa基团如上所述。可以如实施例3中对Cy5**所述制备式IIIa的染料。可以根据实施例4制备包含Qa基团的这类染料，其中Qa是活性酯。
在第六方面中，本发明提供哺乳动物身体的体内光学成像法，其包括使用第一方面的成像剂或第二方面的药物组合物以获得BTM的体内定位位置的图像。
术语“光学成像”是指基于与绿至近红外区(波长500-1200纳米)的光的相互作用形成用于疾病的检测、疾病分期或诊断，跟踪疾病进展或用于跟踪疾病治疗的图像的任何方法。光学成像进一步包括从不使用任何器具的直接可视化到涉及使用器具(如各种观测仪器、导管和光学成像设备，例如用于层析X射线断层法(tomographic)的计算机辅助软件)的所有方法。模态和测量技术包括但不限于：发光成像；内镜检查法；荧光内镜检查法；光学相干断层扫描；透射成像；时间分辨透射成像；共焦成像；非线性显微术；光声成像；声光成像；光谱法；反射光谱法；干涉量度学；相干干涉量度学；扩散光学X射线断层成像和荧光介导的扩散光学X射线断层成像(连续波、时域和频域系统)、和光散射、吸收、偏振、发光、荧光寿命、量子产额和猝灭的测量。(Tuan Vo-Dinh(编辑)：“Biomedical Photonics Handbook”(2003)，CRC Press LCC；Mycek & Pogue(编辑)：“Handbook ofBiomedical Fluorescence”(2003)，Marcel Dekker，Inc.；Splinter &Hopper：“An Introduction to Biomedical Optics”(2007)，CRC Press LCC提供这些技术的进一步细节。
绿至近红外区的光合适地为500-1200纳米波长，优选600-100纳米波长。该光学成像法优选是荧光内镜检查法。该第六方面的哺乳动物身体优选为人体。成像剂的优选实施方案如对第一方面(见上文)所述。特别地，所用CyD染料优选为荧光的。
在第六方面的方法中，该成像剂或药物组合物优选预先施用于所述哺乳动物身体。“预先施用”是指在成像之前已由临床医师实施的步骤，其中该成像剂例如以静脉注射形式给予患者。这种实施方案包括使用第一实施方案的成像剂制造用于哺乳动物身体的涉及BTM的病状的体内诊断成像的诊断剂。
该第六方面的优选光学成像法是荧光反射成像(FRI)。在FRI中，将本发明的成像剂施用于要诊断的对象，随后用激发光-通常连续波(CW)激发-照射该对象的组织表面。该光激发成像剂的CyD染料。使用荧光检测器检测由该激发光产生的来自成像剂的荧光。优选过滤回光以分离出荧光分量(fluorescence component)(独自或部分)。由荧光光形成图像。通常，进行极小处理(没有用处理器计算光学参数，如寿命、量子产额等)且该图像绘制了荧光强度。该成像剂被设计成集中在疾病区域，产生更高的荧光强度。因此，该疾病区域在荧光强度图像中产生正对比。优选使用CCD照相机或芯片获得图像以实现实时成像。
激发波长随所用的特定CyD染料而变，但对本发明的染料而言通常为500-1200纳米。产生激发光的装置可以是传统的激发光源，如激光器(例如离子激光器、染料激光器或半导体激光器)；卤素光源或氙光源。可以任选使用各种滤光器以获得最佳激发波长。
优选的FRI法包括如下步骤：
(i)用激发光照射哺乳动物身体内的目标组织表面；
(ii)使用荧光检测器检测通过CyD的激发产生的来自成像剂的荧光；
(iii)通过荧光检测器检测的光任选过滤以分离出荧光分量；
(iv)由步骤(ii)或(iii)的荧光形成所述目标组织表面的图像。
在步骤(i)中，该激发光优选在性质上是连续波(CW)。在步骤(iii)中，优选过滤检出的光。尤其优选的FRI法是荧光内镜检查法。
该第六方面的另一成像法使用FDPM(频域光子迁移)。这具有优于连续波(CW)法的优点，其中该染料在组织内的更大检测深度是重要的[Sevick-Muraca等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，6，642-650(2002)]。对这类频域/时域成像而言，如果CyD具有可根据要成像的损伤的组织深度和所用仪器类型调节的荧光性质，则是有利的。
FDPM法如下：
(a)使具有不均匀组成的所述哺乳动物身体的光散射性生物组织暴露在具有预定的随时间改变的强度的来自光源的光中以激发该成像剂，该组织多次散射该激发光；
(b)响应所述暴露来检测来自该组织的多次散射光发射；
(c)通过用处理器建立许多数值，由该发射量化整个组织中的荧光特征，这些数值各自对应于在该组织内的不同位置处的荧光特征水平，该荧光特征水平随该组织的不均匀组成而变；和
(d)通过根据步骤(c)的数值绘制该组织的不均匀组成来产生该组织的图像。
步骤(c)的荧光特征优选对应于成像剂的吸收，优选进一步包括绘制与成像剂施用之前组织的吸附和散射系数对应的许多量。步骤(c)的荧光特征优选对应于荧光寿命、荧光量子效率、荧光产额和成像剂吸收中的至少一种。荧光特征优选独立于发射强度和独立于成像剂浓度。
步骤(c)的量化优选包括：(i)建立数值的评估，(ii)作为该评估值的函数测定发射计算值，(iii)将发射计算值与所述检测的发射进行比较以测定误差，(iv)作为该误差的函数提供荧光特征的改良评估值。该量化优选包括由将该组织的多次光散射行为建模的数学关系测定这些数值。第一选项的方法优选进一步包括通过检测所述荧光特征的变动来监测该组织的体内代谢性质。
该第六方面的光学成像优选用于辅助哺乳动物身体的病状的管理。术语“管理”是指用于：检测、疾病分期、诊断、监测疾病进展或监测治疗。该病状合适地为其中涉及该成像剂的BTM的病状。成像用途优选包括基于照相机的表面成像、内镜检查法和手术指导。Sevick-Muraca等人[Curr.Opin.Chem.Biol.，6，642-650(2002)]综述了合适的光学成像法的进一步细节。
在进一步方面中，本发明提供哺乳动物身体的病状的检测、疾病分期、诊断、疾病进展监测或治疗监测的方法，包括该第六方面的体内光学成像法。
通过下面详述的非限制性实施例例证本发明。实施例1a和2分别提供化合物1和3的合成，它们是不在本发明的权利要求范围内的相关染料的对比例。实施例1b提供化合物2的合成，其是对照肽(合成的(scrambled)RGD)的染料共轭物。实施例3提供花青染料Cy5**——本发明的优选CyD——的合成。实施例4提供Cy5**的活性酯的合成。实施例5提供化合物4——Cy5**的肽共轭物——的合成。实施例6提供化合物6——Alexa647的肽共轭物——的合成。实施例7提供化合物1至8的血浆稳定性数据。除化合物5和7(在血浆中培养4小时后分别留下46和70％的主峰)外，所有共轭物都表现出令人满意的血浆稳定性。实施例8提供本发明的化合物的PPB数据。对化合物3和7观察到最高PPB，对化合物4和6观察到最低。实施例9提供化合物1至8的胶原结合数据。大多数化合物表现出在低浓度下的高度结合，而化合物4和6表现出最低胶原结合。实施例10提供化合物1至8的结合检验数据。除化合物7表现出略高Ki值和化合物2(合成的阴性对照)外，所有这些都在亚-nM范围中表现出类似Ki值。这表明，尽管花青染料共轭，但RGD肽的生物结合性质得以保留，且这适用于一系列花青染料。实施例11提供化合物1至8的体内成像数据。该分析软件假定该染料的简单指数washout。估计的washout时间被发现不精确，特别是对皮肤和肌肉信号而言，在此可能低估它们。这被认为归因于RGD与背景组织中的整合蛋白(integrins)和可能胶原的结合，产生明显的双指数washout特征。与肌肉相比，肿瘤中的较慢wash-in和washout被认为有利。该阴性对照(化合物2)在肿瘤和参比组织中表现出类似动力学，表明观察到的与阳性化合物的差异归因于靶向而非灌注效应。化合物6被认为具有最有利的成像动力学。
表2：本发明的化合物
| 化合物 | 染料 | 载体 |
| 1 | Cy5(2) | RGD |
| 化合物 | 染料 | 载体 |
| 2 | Cy5(2) | neg-RGD |
| 3 | Cy5(1) | RGD |
| 4 | Cy5** | RGD |
| 5 | Cy5*B | RGD |
| 6 | Alexa647 | RGD |
| 7 | Cy5*F | RGD |
| 8 | Cy5-PEG | RGD |
其中：所用RGD肽列在实施例1中，
neg-RGD是实施例1b中所述的合成的RGD肽，
染料结构列在表3中。
表3：实施例的花青染料的结构
其中：Cy5(1)、Cy5(2)、Cy5*B、Cy5*F和Cy5PEG是对比例
Rd是-(CH2)3SO3H，Re是-(CH2)4SO3H且Rf是-(CH2)5CO2H。
Rp是-(CH2)5CONH(CH2CH2O)3CH2CH2NHCOCH2OCH2CO2H。
缩写
使用传统的3字母和单字母氨基酸缩写。
Acm： 乙酰氨基甲基
ACN： 乙腈
Boc： 叔-丁氧基羰基
DMF： N，N′-二甲基甲酰胺
DMSO： 二甲亚砜
Fmoc： 9-芴基甲氧基羰基
HCl： 盐酸
HPLC： 高效液相色谱法
HSPyU O-(N-琥珀酰亚胺基)-N，N，N′，N′-四亚甲基脲鎓六氟磷酸盐
Ile： 异亮氨酸
LC-MS：液相色谱质谱法
NHS： N-羟基-琥珀酰亚胺
NMM： N-甲基吗啉
NMP： 1-甲基-2-吡咯烷酮
Pbf： 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS： 磷酸盐缓冲盐水
PPB： 血浆蛋白质结合
TFA： 三氟乙酸
Trt： 三苯甲基
TSTU：O-(N-琥珀酰亚氨基)-N，N，N′，N′-四亚甲基脲鎓四氟硼酸盐
实施例1a：RGD-[Cy5(2)]染料共轭物(化合物1，对比例)的合成
将RGD肽(参考WO 2005/123768；24毫克，0.02毫摩尔)以固体形式添加到Cy5(2)单NHS-酯(GE Healthcare目录号PA15104；7.5毫克，0.01毫摩尔)在DMF(2毫升)中的溶液中，然后加入NMM(0.01毫升，0.09毫摩尔)。使反应避光进行过夜。减压蒸发DMF，并通过反相制备色谱法(Vydac C18柱，218TP1022；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-30％B经60分钟；流速10毫升/分钟；在254纳米下检测)提纯粗产物，提供6.6毫克(37％)纯产物(分析HPLC：Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度15-35％B经20分钟；流速1.0毫升/分钟；停留时间19.5分钟；在214和254纳米下检测)。使用质谱法进行进一步表征，产生m/z值949.1[MH2+]。
实施例1b：neg-RGD-[Cy5(2)]染料共轭物(化合物2，对比例)的合
成
如对RDG肽所述(参考WO 2005/123768)制备含有肽序列Lys-Cys-Gly-Asp-Phe-Cys-Arg-Cys的neg-RGD肽。如实施例1中所述制备Neg-RGD-[Cy5(2)]染料共轭物。通过反相制备色谱法(Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度20-30％B经40分钟；流速10毫升/分钟；在214纳米下检测)提纯粗产物，提供4.1毫克标题化合物(分析HPLC：Phenomenex Luna 3□C18(2)20×2mm；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-40％B经20分钟；流速1.0毫升/分钟；停留时间3.23分钟；在214和254纳米下检测)。使用质谱法进行进一步表征，产生m/z值1895.6[M+]。
实施例2：RGD-Cy5(1))染料共轭物(化合物3，对比例)的合成
通过用TSTU(2.1毫克，0.0076毫摩尔)和NMM(0.009毫升，0.08毫摩尔)在DMF(2毫升)中处理Cy5(1)1小时，形成Cy5(1)的NHS-酯(4.5毫克，0.008毫摩尔)。然后将该溶液添加到RGD肽(实施例1；20毫克，0.016毫摩尔)中并使反应避光进行过夜。减压蒸发DMF，并通过反相制备色谱法(Vydac C18柱，218TP1022；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度20-40％B经60分钟；流速10毫升/分钟；在254纳米下检测)提纯粗产物，提供4.9毫克(34％)纯产物(分析HPLC：Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度25-45％B经20分钟；流速1.0毫升/分钟；停留时间15.2分钟；在214和254纳米下检测)。使用质谱法进行进一步表征，产生m/z值902.1[MH2+]。
实施例3：花青染料2-{(1E，3E，5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-磺
基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1，3-二烯基}-3-甲基-1，3-双(4-磺丁
基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(Cy5
＊＊
)的合成
(3a)5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸。
在用冰浴冷却的同时，经1小时(内部温度0-4℃)将在DMF(25毫升)中的2-甲基乙酰乙酸乙酯(50克)逐滴添加到氢化钠(12.0克在矿物油中的60％NaH)在DMF(100毫升)中的悬浮液中。使该混合物在搅拌下升温至环境温度45分钟，然后再冷却。然后经15分钟逐滴加入1，4-丁磺酸内酯(45克)在DMF(25毫升)中的溶液。将最终混合物在60℃加热18小时。通过旋转蒸发除去溶剂，并使残留物在水和二乙醚之间分配。收集水层，用新鲜二乙醚洗涤，并旋转蒸发以产生粘性泡沫。将这种中间体溶解在水(100毫升)中并在搅拌下经15分钟加入氢氧化钠(17.8克)。将该混合物在90℃加热18小时。通过添加浓盐酸(～40毫升)，将冷却的反应混合物调节至～pH2。将该溶液旋转蒸发并在真空下干燥。用含2％盐酸的乙醇(3×150毫升)洗涤该黄色固体。过滤该乙醇溶液，旋转蒸发并在真空下干燥以产生黄色固体。产量70克。
(3b)2，3-二甲基-3-(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸，二钾盐
将4-肼基苯磺酸(40克)、5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸(来自3a；60g)和乙酸(500毫升)混合并在回流下加热6小时。过滤溶剂，旋转蒸发并在真空下干燥。将该固体溶解在甲醇(1升)中。向其中加入2M氢氧化钾的甲醇溶液(300毫升)。将该混合物搅拌3小时，然后使用旋转蒸发将溶剂体积减少50％。过滤所得沉淀物，用甲醇洗涤并在真空下干燥。产量60克。MS(LCMS)：MH+362。Acc.质量：实测值，362.0729。MH+＝C14H20NO6S2要求m/z 362.0732(-0.8ppm)。
(3c)2，3-二甲基-1，3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐，二钾盐
将2，3-二甲基-3-(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸(来自3b；60克)与1，4丁磺酸内酯(180克)和环丁砜(146毫升)一起在140℃加热16小时。用二乙醚洗涤所得红色固体，研磨成粉末并在真空下干燥。产量60克。
(3d)Cy5 ** ，TFA盐
将1-(5′-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-溴化吲哚鎓-5-磺酸，K+盐(2.7克)、丙二醛(malonaldehyde)双(苯基亚胺)单盐酸盐(960毫克)、乙酸酐(36毫升)和乙酸(18毫升)在120℃加热1小时以产生深褐-红色溶液。将反应混合物冷却至环境温度。将2，3-二甲基-1，3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐(来自3c；8.1克)和乙酸钾(4.5克)添加到该混合物中，将其在环境温度搅拌18小时。使用乙酸乙酯沉淀所得蓝色溶液并在真空下干燥。通过液相色谱法提纯该粗制染料(RPC18水+0.1％TFA/MeCN+0.1％TFA梯度)。收集含有主染料峰的级分，汇集并在真空下蒸发以产生标题染料，2克。UV/Vis(水+0.1％TFA)：650纳米。MS(MALDI-TOF)：MH+887.1.MH+＝C38H50N2O14S4要求m/z 887.1
实施例4：2-[(1E，3E，5E)-5-(1-{6-[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧
代己基}-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)戊-1，3-二烯
基]-3-甲基-1，3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚鎓-5-磺酸盐，二异丙基乙胺盐
(Cy5
＊＊
的NHS酯)的合成
将Cy5**(实施例3；10毫克)溶解在无水DMSO(3毫升)中；向其中加入HSPyU(20毫克)和N，N′-二异丙基乙胺(80微升)。将所得溶液混合3小时，此时TLC(RPC18.水/MeCN)表明完全反应。通过在乙酸乙酯/二乙醚中沉淀来分离该染料，过滤，用乙酸乙酯洗涤并在真空下干燥。UV/Vis(水)650纳米。MS(MALDI-TOF)MH+983.5。MH+＝C42H53N3O16S4要求m/z 984.16。
实施例5：RGD-Cy5＊＊染料共轭物(化合物4)的合成
将溶解在NMP(1毫升)中的Cy5**NHS酯(2毫克，来自实施例4)和sym-三甲基吡啶(2微升)的溶液逐滴添加到溶解在DMF(1毫升)中的RGD肽(来自实施例1，6.4毫克)和sym-三甲基吡啶(2微升)的溶液中，并将反应混合物搅拌过夜。然后将该混合物用10％ACN/水/0.1％TFA(6毫升)稀释，并使用制备HPLC(Phenomenex Luna5μC18(2)250×21.20mm柱；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-20％B经40分钟；流速10毫升/分钟；在214纳米下检测)提纯产物，提供2.3毫克(72％)纯产物(分析HPLC：Phenomenex Luna 3μC18(2)20×2mm柱；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-40％B经5分钟；流速0.6毫升/分钟；停留时间2.28分钟；在214和254纳米下检测)。使用质谱法进行进一步表征，产生m/z值1064.5[MH2+]。
实施例6：RGD-Alexa 647染料共轭物(化合物6)的合成
将溶解在NMP(1.4毫升)中的Alexa Fluor 647NHS酯(2毫克，Molecular Probes A20106)和sym-三甲基吡啶(3.2微升)的溶液逐滴添加到溶解在DMF(1毫升)中的RGD肽(实施例1；15毫克)和sym-三甲基吡啶(3.2微升)的溶液中，并将反应混合物搅拌过夜。然后将该混合物用水/0.1％ TFA(6毫升)稀释，并使用制备HPLC(Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm柱；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-25％B经40分钟；流速10毫升/分钟；在214纳米下检测)提纯产物，提供2.7毫克(53％)纯产物(分析HPLC：Phenomenex Luna 3μC18(2)20×2mm柱；溶剂：A＝水/0.1％TFA和B＝CH3CN/0.1％TFA；梯度10-40％B经5分钟；流速0.6毫升/分钟；停留时间1.99分钟；在214和254纳米下检测)。使用质谱法进行进一步表征，产生m/z值1050.4[MH2+]。
实施例7：化合物1至8的血浆稳定性
小鼠血浆(未灭菌的)购自Rockland，PA，USA。用肝素钠稳定这种血浆。将该物质分别以0.1/0.2毫克/毫升的浓度溶解在PBS和血浆中。空白样品(无肽的溶剂)和溶解在血浆/PBS中的肽都在37℃培养大约4小时。在培养后，通过使用带有来自Millipore Co.(Amicon)的过滤器插入物的未灭菌
-MC离心管超滤，来除去蛋白质。该过滤器的截止值为30,000NMWL。在离心之前，将血浆样品用水1∶1稀释。使用可见检测通过HPLC分析样品。
将该物质溶解在PBS中，浓度0.1毫克/毫升。使用配有板读数器(Thermo Labsystems Oy，Finland)的Fluoroskan
FL测量超离心样品的荧光强度。激发波长为646纳米，发射波长为678纳米，并在两种不同的物质浓度6.5微克/毫升和23微克/毫升血浆下进行测量。
在该研究中采用配有UV-Vis检测器的Ultimate 3000微液相色谱仪。该溶液具有强蓝色并在650纳米下吸收良好。
在X-Terra RP18柱2.1×150mm上进行色谱法，来自Waters的3.5微米粒子，使用乙腈(ACN)和磷酸盐缓冲剂(20mM，pH7.1)的梯度洗脱；650纳米检测；流速0.1毫升/分钟；注射体积：5微升。梯度：在缓冲剂中在22％ACN下开始，经12分钟线性升至50％ACN；在随后的2分钟梯度迅速线性升至90％ACN；然后平衡至起始混合物。总分析时间为20分钟，主峰停留时间～9分钟。作为主峰杂质的变化报道降解/杂质。结果显示在表4中。
表4：化合物1至8的血浆稳定性
| 化合物 | ％主峰面积(在小鼠血浆中4小时培养后) |
| 1 | 未测得 |
| 2 | 未测得 |
| 3 | 未测得 |
| 4 | 100 |
| 5 | 46 |
| 6 | 100 |
| 7 | 70 |
| 8 | 93 |
实施例8：化合物1至8的荧光偏振血浆蛋白质结合检验
使用人血浆和检验缓冲剂(PBS/0.05％ Tween)在荧光偏振蛋白质结合检验法中测试化合物1至8。在40微升PBS或人血浆中培养40微升肽(～5μM)。在Tecan Safire板读数器(Ex635/Em678)中测量荧光偏振，并作为添加等离子体时偏振值的％提高报道数据。
结果显示在表5中：
表5：化合物1至8的偏振值概述(Ex635nm，Em678nm，～2.5μM物质)
| 化合物 | 检验缓冲剂(mP) | 血浆(mP) | 偏振值的提高(％) |
| 1 | 184 | 218 | 18 |
| 2 | 178 | 217 | 21 |
| 3 | 219 | 298 | 36 |
| 4 | 183 | 209 | 14 |
| 5 | 187 | 227 | 22 |
| 化合物 | 检验缓冲剂(mP) | 血浆(mP) | 偏振值的提高(％) |
| 6 | 178 | 199 | 12 |
| 7 | 179 | 232 | 29 |
| 8 | 184 | 215 | 17 |
实施例9：化合物1至8的胶原结合检验
使用市售胶原覆盖的96孔板(BD Biocoat，Art.code BDAA356649，Becton，Dickinson Biosciences，Two Oak Park，Bedford，MA01730)。各试验化合物在30nM、100nM或300nM(在一些情况下包括1000nM)下制备一式三份的孔，并将该板在板读数器中在37℃下培养1小时，每隔一分钟摇振*。各孔中的体积为200微升。在培养结束时，将150微升上清液转移到未处理的96孔板中，并用在646纳米波长下的激发和在678纳米波长下的发射读取荧光。
*化合物3在加热箱中在37℃培养，每5分钟摇振(带盖的微板)。
为了计算结合程度，将来自上清液的荧光与来自具有相同初始浓度的150微升等分试样的荧光比较。在所有情况下，使用来自3个孔的平均值。结果显示在表6中：
表6：胶原结合检验(％结合)，Ex646/Em678nm。
np＝未进行
实施例10：化合物1至8的竞争检验
使用125I-锯鳞蝮蝰血抑环肽(echistatin)进行典型竞争检验以检查RGD-CyD共轭物(化合物1至8)与表达αVβ3受体的膜的亲合力(Ki)。在受体竞争研究中用由人内皮细胞制成的膜测定Ki。制备来自表达几种整合蛋白(包括αVβ3)的人内皮腺癌细胞系EA-Hy926的膜并用作受体源。在冷化合物的不同浓度下进行125I-锯鳞蝮蝰血抑环肽(对几种整合蛋白，包括αVβ3而言，是已知物质)的竞争性结合。
结果显示在表7中：
表7：Ki测量(使用125I-锯鳞蝮蝰血抑环肽的竞争检验)
| 化合物 | Ki(nM) |
| 1 | 1.9 |
| 2 | - |
| 3 | 2.6 |
| 4 | 1.8 |
| 5 | 1.7 |
| 6 | 1.6 |
| 7 | 7.4 |
| 8 | 2.9 |
实施例11：化合物1至8的体内测试
(a)动物模型
在该研究中使用雌性BALB c/A裸(Bom)小鼠。该动物的使用获得当地道德委员会的批准。由于动物是免疫受损的，将它们圈养在独立的通风笼(IVC，Scanbur BK)中，供以HEPA过滤空气。动物可随意获得“Rat and Mouse nr.3 Breeding”食物(Scanbur BK)和通过添加HCl至1mM的摩尔浓度而酸化的自来水(pH3.0)。为了在操作和在成像程序之前的所有程序的过程中保护动物，它们在层状HEPA过滤空气的条件下操作。
在两个位置(肩部和左下肋腹)用HT-29肿瘤细胞悬浮液以每次注射(体积100微升)2.5-3×106个细胞的标称剂量皮下注射之前，动物经过至少5天驯化期。在轻气体麻醉下进行皮下注射。使肿瘤生长2-4周。
为了在光学成像程序中固定，在同轴开放式麻醉罩中用以氧气为载气的异氟烷(通常1.5-2％)将动物麻醉至轻手术级麻醉。由加热毯向动物供应外部加热以在成像期间(最多3小时)维持正常体温。将Venflon导管插入尾部静脉以施用对比剂。向各动物施以一次对比剂注射。
为避免在皮肤中由成像探针产生的假象(artefact)，在成像之前但在麻醉动物的同时除去肿瘤和肌肉上的～3毫米直径的皮肤块。在实验结束时通过颈部脱位，杀死动物。
(b)成像程序
在实验开始前至少15分钟启动激光器以使输出稳定化。将一小堆白色打印纸成像以获得用于校正照射不均匀性的平面场图像。为了动态成像，将动物放在温度40℃的加热毯(BioVet)上的成像暗箱内。使用呼吸和温度来监测成像过程中的麻醉深度。一次成像一个动物。用激光光源和用白光光源获取所有动物的注射前图像。对于这两种光源，都放置发射滤光器，有效地使白光图像成为用处于接收频率的照射形成的图像。
经由Venflon静脉注射试验物质，然后用0.2毫升盐水冲洗。从注射开始起每30秒获取一个新图像，从而获得随时间变化的一系列图像。该图像在转移到服务器之前储存在当地。
用客户编写的MATLAB软件进行图像分析。在未被皮肤覆盖的肿瘤和肌肉部分周围画出目标区域。第三区域位于下方没有肿瘤或肾脏组织以致抵消该信号的皮肤部分上。计算各区域内的像素值的平均信号。计算平均信号和像素标准偏差。
(c)结果
基于来自实施例7-10的体外数据，列出来自化合物1、2、4和6的体内结果。通过作为平均肿瘤区域强度除以平均肌肉区域强度的比率确定的靶/背景比率(TBR)，量化肿瘤增强。
化合物2(neg-RGD合成肽)产生1.14的TBR。化合物1[Cy5(2)-RGD]产生1.43的比率。化合物4和6分别表现出比率为1.72和1.98的预期改进。结果显示在图1中。
Claims (30)
1.适用于哺乳动物身体的体内光学成像的成像剂，其包含式I的共轭物：
[BTM]-(L)n-CyD
(I)
其中：
BTM是生物靶向部分；
CyD是式II的花青染料：
其中：
Y1和Y2独立地为-O-、-S-、-NR6-或-CR7R8-并选择它们以使Y1和Y2中的至少一个是-CR7R8-；
R1和R2独立地为H、-SO3M1或Ra，其中M1是H或Bc，且Bc是生物相容阳离子；
R3是H、C1-5烷基、C1-6羧基烷基或Ra基团；
R4至R6独立地为C1-5烷基、C1-6羧基烷基或Ra；
R7是H或C1-3烷基；
R8是Ra或C1-6羧基烷基；
Ra是C1-4磺烷基；
L是式-(A)m-的合成连接基，其中各A独立地为-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或单分散的聚乙二醇(PEG)结构单元；
各R独立地选自H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m是值为1至20的整数；
n是值为0或1的整数；
条件是：
(i)该花青染料包含至少一个Ra基团和总共3至6个来自R1、R2和Ra基团的磺酸取代基；
(ii)该成像剂不含荧光猝灭剂。
2.权利要求1的成像剂，其中R3是H。
3.权利要求1或权利要求2的成像剂，其中Y1和Y2各自独立地为-CR7R8。
4.权利要求3的成像剂，其中R7是CH3。
5.权利要求1至4任一项的成像剂，其中CyD具有总共4个选自R1、R2和Ra基团的磺酸取代基。
6.权利要求1至5任一项的成像剂，其中Ra基团独立地具有式-(CH2)kSO3M1，其中M1如权利要求1中所定义，且k是值为1至4的整数。
7.权利要求6的成像剂，其中k为3或4。
8.权利要求1至7任一项的成像剂，其中R1＝R2＝SO3M1。
9.权利要求8的成像剂，其中SO3M1取代基在吲哚/假吲哚环的5-位置。
10.权利要求1至9任一项的成像剂，其中CyD具有式III：
其中：
Rb独立地为Ra基团或C1-6羧基烷基；
R9至R12独立地为C1-5烷基或Rb基团，并选择它们以使R9＝R10＝Rc或R11＝R12＝Rc，其中Rc是C1-2烷基；
Ra和M1如权利要求1中所定义。
11.权利要求1至10任一项的成像剂，其中BTM选自：
(i)3-100mer肽；
(ii)酶底物、酶拮抗剂或酶抑制剂；
(iii)受体结合性化合物；
(iv)寡核苷酸；
(v)寡-DNA或寡-RNA片段。
12.权利要求11的成像剂，其中BTM是3-100mer肽。
13.权利要求12的成像剂，其具有式IVa或IVb：
[CyD]-(L)n-[BTM]-Z2 (IVa)；
Z1-[BTM]-(L)n-[CyD] (IVb)；
其中：
Z1连接到BTM肽的N-末端上，并且是H或MIG；
Z2连接到BTM肽的C-末端上，并且是OH、OBc或MIG，
其中Bc如权利要求1中所定义，且
MIG是代谢抑制基团，其是抑制或遏制BTM肽的酶代谢的生物相容基团。
14.权利要求13的成像剂，其中Z1＝Z2＝MIG。
15.适合哺乳动物施用的形式的包含权利要求1至14任一项的成像剂以及生物相容载体的药物组合物。
16.权利要求15的药物组合物，其具有适合单个患者的剂量并在合适的注射器或容器中提供。
17.用于制备权利要求15或16的药物组合物的试剂盒，其包含无菌固体形式的权利要求1至14的成像剂，从而在用生物相容载体的无菌供给品重构时发生溶解以产生所需药物组合物。
18.权利要求17的试剂盒，其中该无菌固体形式是冻干固体。
19.式Ia的共轭物：
[BTM]-(L)n-CyD
(Ia)
其中：BTM、L和n如权利要求1中所定义，且CyD具有式IIIa：
其中：
R9至R12独立地为Rb或Rc基团，并选择它们以使R9＝R10之一是Ra基团，且其它各自是Rc基团，其中Rc是C1-2烷基；
Ra、Rb和M1如权利要求10中所定义。
20.如权利要求19所述的式IIIa的花青染料，可用于制备权利要求19的共轭物。
21.权利要求20的花青染料，其进一步包含基团Qa，其中Qa是适合共轭到BTM上的反应性官能团。
22.权利要求20或21的花青染料，其中Rb独立地为-(CH2)kSO3M1，其中k是值为1至4的整数。
23.哺乳动物身体的体内光学成像方法，其包括使用权利要求1至14的成像剂或者权利要求15或16的药物组合物获得BTM的体内定位位置的图像。
24.权利要求23的方法，其中权利要求1至14的成像剂或者权利要求15或16的药物组合物已经预先施用于所述哺乳动物身体。
25.权利要求24的方法，其包括下列步骤：
(i)用激发光照射哺乳动物身体内的目标组织表面；
(ii)使用荧光检测器检测通过CyD的激发产生的来自成像剂的荧光；
(iii)通过荧光检测器检测的光任选过滤以分离出荧光分量；
(iv)由步骤(ii)或(iii)的荧光形成所述目标组织表面的图像。
26.权利要求25的方法，其中步骤(i)的激发光在性质上是连续波(CW)。
27.权利要求24的方法，其包括：
(a)使具有不均匀组成的所述哺乳动物身体的光散射性生物组织暴露在具有预定的随时间改变的强度的来自光源的光中以激发该成像剂，该组织多次散射该激发光；
(b)响应于所述暴露检测来自该组织的多次散射光发射；
(c)通过用处理器建立许多数值，由该发射量化整个所述组织中的荧光特征，这些数值各自对应于在该组织内的不同位置处的荧光特征水平，该荧光特征水平随该组织的不均匀组成而变；和
(d)通过根据步骤(c)的数值绘制该组织的不均匀组成来产生该组织的图像。
28.权利要求23至27任一项的方法，其中该光学成像方法包括荧光内镜检查法。
29.权利要求23至28任一项的方法，其中该体内光学成像用于辅助哺乳动物身体的病状的检测、疾病分期、诊断、疾病进展监测或治疗监测。
30.哺乳动物身体的病状的检测、疾病分期、诊断、疾病进展监测或治疗监测的方法，包括权利要求23至29任一项的体内光学成像方法。
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