CN103813713A - 细胞识别缀合物及使用maldi-ms成像对癌症组织进行组织学分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可结合至癌细胞表面的一个或多个位点的缀合物，所述位点例如表面蛋白、化合物特异性受体以及包含特异性细胞类型表面的碳水化合物。所公开的缀合物可由此用作识别癌组织存在的指示剂。

Description

细胞识别缀合物及使用MALDI-MS成像对癌症组织进行组织学分析的方法

优先权

本申请要求2011年7月20日提交的美国临时申请61/509,675的优先权，该申请的全文以引用的方式纳入本说明书。

技术领域

本发明公开了可结合至癌细胞表面的一个或多个位点的缀合物（conjugate），所述位点例如表面蛋白、化合物特异性受体以及含有特异性细胞类型表面的碳水化合物。因此，所公开的缀合物可用作识别癌症组织存在的指示剂。

背景技术

已知基于生物标记物的组织学工作可挽救生命、有助于制定治疗性干预策略并且能改善预后（参见Nathwani B.N.et al,Adv.Anat.Pathol,2007,14,375-400和J.Teruya-Feldstein,Arch.Pathol.Lab.Med.,2010,134,1659-1665）。在所有已知的生物标记物中，癌细胞表面碳水化合物抗原起着非常重要的作用，并且临床上测定最多的癌症生物标记物为糖蛋白（参见Ludwig J.A.et al,Nat.Rev.Cancer,2005,5,845-856）。作为糖基蛋白、肽和脂质的部分的细胞表面碳水化合物结构是不同细胞类型的特征性标志并且它们与许多癌症形式相关。例如，目前在许多癌症中评估唾液酸化的Lewis X（sLe^X）抗原；据说血清sLe^X和细胞角蛋白19片段在患有I期非小细胞肺癌患者中为复发预测因子；并且据报道sLe^X附加乳癌血清中的CA15.3水平比CA15.3附加CEA更有效（参见，Mizuquchi S.et al,E.J.Cancer Suppl,2007,6554和Kurebayashi J.et al,Jpn.J.Clin.Oncol,2006,36,150-153）。此外，sLe^X和sLe^a表达的结合已经显示出介导尿路上皮癌细胞粘附至活化内皮细胞。在癌症组织学工作中，检测这些细胞表面碳水化合物表达的改变显然非常重要。

叶酸受体是一种与肿瘤相关的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，其在高于90%的非粘液性卵巢癌中有所上调。其还以高水平至中水平见于肾癌、脑癌、肺癌和乳腺癌中，而其在大多数正常组织中处于极低的水平（KamenB.A.,et al,"A Review of Folate Receptor Alpha Cycling and5-Methyltetrahydrofolate Accumulation with an Emphasis on CellModels in vitro,"Adv.Drug Delivery Rev.2004,561085-1097）。叶酸受体密度还似乎随着癌症病程的增加而增加（Elnakat,FL,et al.,"Distribution,Functionality and Gene Regulation of Folate Receptor Isoforms:Implication in Targeted Therapy,"Adv.Drug Delivery Rev.2004,561067-1084）。

肿瘤细胞的特征是非受控性生长、侵入周围组织和转移扩散到远处部位。自从手术移除肿瘤可增强和延长生存，由癌症引发的死亡通常是由于转移的缘故。整合素（integrin）构成跨膜受体蛋白家族，所述跨膜受体蛋白由非共价连接的α链和β链的异二聚体复合物组成。整合素在细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质（ECM）之间的粘附性相互作用中起作用并且转导来自ECM的信号到细胞内，反之亦然。因此，整合素介导ECM对细胞生长和分化的影响。由于这些特性表明整合素参与细胞迁移、侵入、内渗和外渗以及血小板相互作用，因此，已经确定整合素在肿瘤生长和转移中的作用。这些发现通过观察到整合素与肌动蛋白细胞骨架相连得到证实，所述肌动蛋白细胞骨架包含作为媒介物的踝蛋白（talin）、纽蛋白和α-辅肌动蛋白。该细胞骨架变化可由圆形细胞形态显示，圆形细胞形态通常通过减少或增加的整合素表达模式而与肿瘤转化同步。对于不同癌症类型而言，整合素表达的不同改变还与肿瘤生长和转移有关。导致转移的肿瘤进展似乎涉及为癌细胞提供合适粘合剂（整合素）表形以与ECM相互作用。目前正在开发旨在影响整合素细胞表达和功能的疗法以抑制肿瘤生长、转移和血管生成。所述治疗策略包括抗整合素单克隆抗体、（环化和线性的）肽抑制剂、钙结合蛋白拮抗剂、脯氨酸类似物、细胞凋亡促进剂和反义寡核苷酸。此外，肿瘤细胞诱导的血小板聚集——其促进转移扩散——可通过去整合素得到抑制，所述去整合素为蛇素样肽。因此，整合素家族的粘附分子和血管生成成分可用作用于预测和诊断目的的肿瘤进展标记物。开发用于单个肿瘤的整合素细胞表达谱在识别特定肿瘤类型和/或病程的细胞表面标志中还可具有其它潜能。因此，最近在阐明整合素的结构、功能、ECM结合和信号通路方面的进展已经引导了癌症治疗和诊断的新的且令人兴奋的形式。

在组织学工作中，最常使用荧光和/或彩色染色剂。然而，由于光谱分辨率/重叠问题，该方法在多重测定（multiplex）方面存在困难，并且在定量方面存在困难。一种新颖但成熟的技术——MALDI成像质谱（MALDI-IMS）——能够直接进行组织活检而不需要显微解剖和在分析前溶解组织生物标记物，并且电离解吸可以栅格图中的特定“点”和栅格化数据为靶标。然后，所形成的光谱可用于生成直接来自组织切片表面的数百个生物分子的二维分子图谱。这些分子图谱显示出这些分子的相对丰度和空间分布。MALDI组织谱能够将质谱的分子详情与分子组织学相关联，进而生成与在薄组织切片中的已知位置相关的质谱。最近我们和他人已证明了MALDI-IMS对临床组织病理学应用的潜力。

因此，长期以来需要使用可用于识别癌症组织的细胞表面特异性试剂的技术，并因此需要细胞表面特异性生物标记物。

附图说明

图1示出了由实施例3公开的二羟硼基外源凝集素-MS标签（boronolectin-MS tag）缀合物生成的稳定碳正离子的MALDI-IMS峰，所述缀合物取自冷冻的肾组织切片并且在-80℃下储存。

图2示出了实施例3公开的二羟硼基外源凝集素-MS标签缀合物生成的稳定碳正离子的MALDI-IMS图，所述缀合物用于新鲜冷冻的包含肿瘤区域和正常区域的肾组织。肾细胞癌（RCC）的面积作为正常肾细胞的对照来表示。生物标记物形成的稳定阳离子的区域用红色表示。

图3示出了相同肾样品的免疫染色图。示出了肾细胞癌（RCC）的区域并且该区域为正常肾细胞的免疫染色对照。

图4示出了使用实施例3公开的二羟硼基外源凝集素可见的UMFIX/Sakura醇固定的真性肿瘤组织的免疫染色。

图5示出了在图4中成像的UMFIX/Sakura醇固定的真性肿瘤组织。

发明详述

本文中所述的材料、化合物、组合物、制品和方法可参考以下所公开主题具体方面的详细描述和其中包括的具体实施方式而被更容易地理解。

在公开和描述本发明的材料、化合物、组合物、制品、装置和方法前，应理解以下所述的各方面不限于具体合成方法或具体试剂，因为这些当然可变化。还应理解，本文中所使用的术语仅用于描述具体方面的目的，并不意欲进行限制。

同时，在本说明书中，参考了多篇出版物。这些出版物的公开文本全文以引用的方式纳入本说明书，以便更加全面地描述所公开的主题所属的技术领域的情况。所公开的参考文献还以引用的方式独立地且具体地纳入本文，用于在标注参考文献的句子中所讨论的参考文献所包含的材料。

一般定义

在本说明书和随附的权利要求中，将提及许多术语，所述术语将定义为具有以下含义：

除非另外明确说明，本文中的所有百分数、比值和比例都以重量计。除非另外明确说明，所有温度时都以摄氏度(℃)计。

“药学上可接受的”意指无生物上或其他不希望的物质，即所述物质可与相关的活性化合物一起给予个体，而不造成临床上不可接受的生物效应或以有害的方式与其包含在药学组合物中的任何其他组分相互作用。

除非特别相反说明，否则组分的重量百分数基于包含该组分在内的制剂或组合物的总重量计。

本文所使用的“有效量”意指“一种或多种所公开的化合物，在获得所需结果或治疗结果所需要的剂量和时间周期下有效的量”。有效量可根据本领域已知的因素而变化，例如被治疗的人或动物的疾病状况、年龄、性别和重量。虽然具体的剂量方案会在本说明书的实施例中描述，但本领域技术人员应了解，所述剂量方案可改变以提供最佳的治疗响应。例如，可每日给予数个分开的剂量或可由如治疗情形的紧急情况所标示地成比例减少剂量。此外，本公开的组合物可按需频繁给药，以实现治疗量。

本文中通常使用的“混合物”或“掺合物”意指两种或多种不同组分的物理组合物。

本文所使用的“受试者”意指个体。因此，所述“受试者”可包括家养动物（例如，猫、狗等）、家畜（例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等）、实验动物（例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等），以及禽类。“受试者”还可包括哺乳动物，例如灵长类动物或人。

“减少（reduce）”或该词的其他形式如“减少（reducing，reduction）”意指事件或特征(如，血管渗漏)的降低。应理解，这通常相对于一些标准值或预计值，换句话说，它是相对的，但对于待参照的标准值或相对值不总是必需的。

本文中使用的术语“治疗（treat）”或该词的其他形式如“治疗（treated，treatment）”意指给予本发明的化合物来缓解宿主疾病或障碍和/或减少、抑制、或消除与障碍相关的具体特征或事件(例如，血管渗漏)。因此，术语“治疗”包括预防障碍在宿主中发生，尤其是当宿主易于患上疾病但还没有诊断出患有所述疾病时；抑制障碍；和/或缓解或扭转障碍。就本发明的方法而言，其涉及预防障碍，应理解术语“预防”并不要求完全阻止疾病状态。更确切地说，如在本文中使用的，术语预防是指技术人员识别易患障碍的人群，从而在疾病可能发生前给予本发明化合物的能力。该术语不意味疾病状态被完全免除。

在本申请的说明书和权利要求书的通篇中，词“包含（comprise）”和该词的其他形式如包含（comprising，comprises）意指包括但不局限于且不意欲排除，例如，其他添加剂、组分、整体或步骤。

如本说明书和所附的权利要求书中所使用，除非上下文明确有另外指示，单数形式“一（a）”、“一（an）”和“该（the）”包括复数指示物。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。

本文中范围可表示为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当通过使用前缀“约”将数值表示为近似值时，应理解所述具体值构成另一方面。还应理解，每个范围的端点明显与另一端点有意义地相关并独立于另一端点。还应理解，本文公开了很多数值，并且每个数值在本文中也公开为除了具体值本身之外的“约”该具体数值。例如，如果公开了数值“10”，那么也就公开了“约10”。还应理解，当一个数值被公开时，也就公开了“小于或等于”该数值，“大于或等于该数值”，并且还公开了数值之间的可能范围，这可由本领域技术人员适当理解。例如，如果公开了数值“10”，那么也就公开了“小于或等于10”和“大于或等于10”。还应理解，在本申请通篇中，数据以多种不同形式提供，并且该数据代表终点和起点以及所述数据点任意结合的范围。例如，如果公开了具体的数据点“10”和具体的数据点“15”，应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10和15之间的数值。还应理解，还公开了两个具体单元之间的每个单元。

术语“亲和（affinity）”、“亲和连接（affinity attachment）”或“亲和结合（affinity binding）”涉及一种方式，通过该方式，所公开的X单元可通过任意合适的方法连接至目标多聚糖。非限制性的实例包括在多聚糖和X单元之间形成一个或多个共价键、在多聚糖和X单元之间形成一个或多个氢键、在多聚糖和X单元之间形成一个或多个静电键，及其结合。

术语“特异性亲和（specific affinity）”涉及公开的X单元结合或对多聚糖具有亲和力的能力，其意为所公开的显像剂（imaging agent）仅与单一的多聚糖结合，例如，仅对唾液酸化的Lewis X(SLe^X)有亲和力或仅对唾液酸化的Lewis a(SLe^a)有亲和力的显像剂。类似地，所公开的显像剂具有特定的整合素特异性，例如对在纤连蛋白上可见的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）细胞粘附序列有特异性。此外，“特殊亲和（specialaffinity）”是指结合到细胞叶酸受体上。

术语“选择性亲和（selective affinity）”涉及所公开的X单元结合至多糖、RGD细胞粘附序列或叶酸结合受体的能力或对其具有亲和性的能力，“选择性亲和”意为所公开的显像剂可结合至许多显像剂靶向的不同结合位点。一个涉及细胞表面多聚糖的非限制性实例为特定的X单元对多于一种多聚糖可具有亲和性，或者配制人员可将可结合至不同多聚糖的部分纳入特定X单元中。本公开内容所包括的是X单元，其包含可结合至第一多聚糖的部分和可结合至第二多聚糖的部分。一个非限制性的实例为一种X单元，其具有能够对唾液酸化的Lewis X(SLe^X)有特异性亲和力的部分和能够对唾液酸化的Lewis a(SLe^a)有特异性亲和力的部分。

术语例如“多糖（saccharide）”、“多聚糖（polysaccharide）”、“碳水化合物（carbohydrate）”和聚糖（glycan）可在本公开内容中交换使用并且代表包含一个或多个戊糖、己糖等的化合物。

术语精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）整合素是指对于显像剂结合至细胞表面所必要的三个氨基酸序列及所有其它氨基酸。

基质辅助激光解吸/电离（MALDI）

所公开的显像剂可与MALDI和其它组织兼容性质谱方法结合使用。一般而言（非进行限定），MALDI是一种在质谱中使用的软电离技术，其能够分析生物分子（生物聚合物例如蛋白质、肽和糖）和有机大分子（例如聚合物、树形分子（dendrimer）和其它大分子），当通过另外的常规电离方法电离这些生物分子和有机大分子时，它们易于断裂和形成碎片。MALDI与电喷雾电离在软度和产生离子（虽然MALDI产生许多较少的多电荷离子）方面的性能最为相近。通过电磁辐射源，即激光束（通常为氮激光器）引发电离。基质用于保护生物分子不受直射激光束破坏并且有助于蒸发和电离，然而，本文所公开的显像剂可与不使用基质的技术一起使用。

除非相反描述，否则具有化学键的式——所述化学键仅以实线显示而非楔形线或虚线显示——考虑每个可能的异构体，例如每个对映异构体、非对映异构体、内消旋化合物，以及异构体混合物，例如外消旋混合物或差向异构混合物。

以下化学体系用于整个说明书，以描述本公开的范围并使该范围可行，并且特别地指出并清楚地要求包含本公开化合物的单元，然而，除非另外明确定义，本文使用的术语与本领域普通技术人员所理解的相同。术语“烃基”表示任何基于碳原子的单元（有机分子），所述单元任选包含一个或多个有机官能团，包括含有无机原子的盐，尤其是羧酸盐、季铵盐。在术语“烃基”的广义含义中有“非环状烃基”和“环状烃基”类，所述术语用于将烃基单元分为环状类和非环状类。

以下化学体系用于整个说明书，以描述本公开的范围并使该范围可行，并且特别地指出并清楚地要求包含本公开化合物的单元，然而，除非另外明确定义，本文使用的术语与本领域普通技术人员所理解的相同。术语“烃基”表示任何基于碳原子的单元（有机分子），所述单元任选包含一个或多个有机官能团，包括含有无机原子的盐，尤其是羧酸盐、季铵盐。在术语“烃基”的广义含义中有“非环状烃基”和“环状烃基”类，所述术语用于将烃基单元分为环状类和非环状类。

当“环烃基”单元涉及以下定义时，在其环上可仅包含碳原子（碳环和芳基环），或者在其环上可包含一个或多个杂原子（杂环和杂芳环）。对于“碳环”，环中最少的碳原子数是3个碳原子——环丙基。对于“芳基”环，环中最少的碳原子数是6个碳原子——苯环。对于“杂环”，环中最少的碳原子数是1个碳原子——三双吖丙啶基（diazirinyl）。环氧乙烷包含2个碳原子，是C₂杂环。对于“杂芳基”环，环中最少的碳原子数是1个碳原子；1,2,3,4-四唑基。以下是本文所用的术语“非环状烃基”和“环状烃基”的非限制性描述。

A.取代的和未取代的非环状烃基：

对于本公开的目的，术语“取代的和未取代的非环状烃基”包括3类单元：

1)直链或支链烷基，其非限制性实例包括，甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、叔丁基(C₄)等；取代的直链或支链烷基，其非限制性实例包括，羟基甲基(C₁)、氯甲基(C₁)、三氟甲基(C₁)、氨基甲基(C₁)、1-氯乙基(C₂)、2-羟基乙基(C₂)、1,2-二氟乙基(C₂)、3-羧基丙基(C₃)等。

2)直链或支链烯基，其非限制性实例包括，乙烯基(C₂)、3-丙烯基(C₃)、1-丙烯基(也称作2-甲基乙烯基)(C₃)、异丙烯基(也称作2-甲基乙烯-2-基)(C₃)、丁烯-4-基(C₄)等；取代的直链或支链烯基，其非限制性实例包括，2-氯乙烯基(也称作2-氯乙烯基)(C₂)、4-羟基丁烯-1-基(C₄)、7-羟基-7-甲基辛-4-烯-2-基(C₉)、7-羟基-7-甲基辛-3,5-二烯-2-基(C₉)等。

3)直链或支链炔基，其非限制性实例包括，乙炔基(C₂)、丙-2-炔基(也称作炔丙基)(C₃)、丙炔-1-基(C₃)和2-甲基-己-4-炔-1-基(C₇)；取代的直链或支链炔基，其非限制性实例包括，5-羟基-5-甲基己-3-炔基(C₇)、6-羟基-6-甲基庚-3-炔-2-基(C₈)、5-羟基-5-乙基庚-3-炔基(C₉)等。

B.取代的或未取代的环状烃基：

对于本公开的目的，术语“取代的和未取代的环状烃基”包括5类单元：

1)术语“碳环”在本文中定义为“包括含3至20个碳原子的环，其中组成所述环的原子限于碳原子，并且各个环还可独立地由能够代替一个或多个氢原子的一个或多个部分取代”。以下是“取代的和未取代的碳环”的非限制性实例，包括以下类单元：

i)具有单取代烃环或未取代烃环的碳环，其非限制性实例包括，环丙基(C₃)、2-甲基-环丙基(C₃)、环丙烯基(C₃)、环丁基(C₄)、2,3-二羟基环丁基(C₄)、环丁烯基(C₄)、环戊基(C₅)、环戊烯基(C₅)、环戊二烯基(C₅)、环己基(C₆)、环己烯基(C₆)、环庚基(C₇)、环辛基(C₈)、2,5-二甲基环戊基(C₅)、3,5-二氯环己基(C₆)、4-羟基环己基(C₆)和3,3,5-三甲基环己-1-基(C₆)。

ii)具有两个或多个取代的稠合烃环或未取代的稠合烃环的碳环，其非限制性实例包括，八氢戊烯基(C₈)、八氢-1H-茚基(C₉)、3a,4,5,6,7,7a-六氢-3H-茚-4-基(C₉)、十氢化萘基(C₁₀)、十氢薁基(C₁₀)。

iii)取代双环烃环或未取代双环烃环的碳环，其非限制性实例包括，双环-[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.1.1]庚基、1,3-二甲基[2.2.1]庚-2-基、双环[2.2.2]辛基和双环[3.3.3]十一烷基。

2)术语“芳基”在本文中定义为“包含至少一个苯环或萘环的单元，其中不存在稠合至所述苯环或萘环的杂芳环或杂环且各个环还可独立地由能够替代一个或多个氢原子的一个或多个部分取代”。以下是“取代的和未取代的芳环”的非限制性实例，包括以下类单元：

i)C₆或C₁₀取代芳环或未取代芳环；取代或未取代的苯环或萘环，其非限制性实例包括，苯基(C₆)、萘-1-基(C₁₀)、萘-2-基(C₁₀)、4-氟苯基(C₆)、2-羟基苯基(C₆)、3-甲基苯基(C₆)、2-氨基-4-氟苯基(C₆)、2-(N,N-二乙基氨基)苯基(C₆)、2-氰基苯基(C₆)、2,6-二叔丁基苯基(C₆)、3-甲氧基苯基(C₆)、8-羟基萘-2-基(C₁₀)、4,5-二甲氧基萘-1-基(C₁₀)和6-氰基-萘-1-基(C₁₀)。

ii)与1或2个饱和环稠合的C₆或C₁₀芳环，其非限制性实例包括，双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯基(C₈)和二氢茚基(C₉)。

3)术语“杂环的”和/或“杂环”在本文中定义为“包含一个或多个具有3至20个碳原子的环的单元，其中在至少一个环中的至少一个原子是选自氮(N)、氧(O)或硫(S)的杂原子或者N、O和S的混合物，并且其中另外包含杂原子的环也不是芳环”。以下是“取代杂环和未取代杂环”的非限制性实例，其包括以下类的单元：

i)具有含一个或多个杂原子的单环的杂环单元，其非限制性实例包括，双吖丙啶基(C₁)、吖丙啶基(C₂)、尿唑基(C₂)、氮杂环丁基(C₃),吡唑烷基(C₃)、咪唑烷基(C₃)、噁唑烷基(C₃)、异噁唑烷基(C₃)、噻唑烷基(C₃)、异噻唑烷基(C₃)、氧杂噻唑烷酮基(C₃)、噁唑烷酮基(C₃)、乙内酰脲基(C₃)、四氢呋喃基(C₄)、吡咯烷酮基(C₄)、吗啉基(C₄)、哌嗪基(C₄)、哌啶基(C₄)、二氢吡喃基(C₅)、四氢吡喃基(C₅)、哌啶-2-酮基(戊内酰胺)(C₅)、2,3,4,5-四氢-1H-氮杂卓基(C₆)、2,3-二氢-1H-吲哚(C₈)、和1,2,3,4-四氢喹啉(C₉)。

ii)具有其中之一为杂环的2个或多个环的杂环单元，其非限制性实例包括六氢-1H-吡咯里嗪基（pyrrolizinyl）(C₇)、3a,4,5,6,7,7a-六氢-1H-苯并[d]咪唑基(C₇)、3a,4,5,6,7,7a-六氢-1H-吲哚基(C₉)、1,2,3,4-四氢喹啉基(C₉)和十氢-1H-环辛并[b]吡咯基(C₁₀)。

4)术语“杂芳基”在本文中定义为“包括一个或多个含5至20个原子的环，其中在至少一个环中的至少一个原子是选自氮(N)、氧(O)或硫(S)的杂原子或者N、O和S的混合物，并且其中另外至少一个包含杂原子的环是芳环”。以下是“取代杂环和未取代杂环”的非限制性实例，其包括以下类的单元：

i)含单环的杂芳环，其非限制性实例包括，1,2,3,4-四唑基(C₁)、[1,2,3]三唑基(C₂)、[1,2,4]三唑基(C₂)、三嗪基(C₃)、噻唑基(C₃)、1H-咪唑基(C₃)、噁唑基(C₃)、异噁唑基(C₃)、异噻唑基(C₃)、呋喃基(C₄)、噻吩基（thiopheneyl）(C₄)、嘧啶基(C₄)、2-苯基嘧啶基(C₄)、吡啶基(C₅)、3-甲基吡啶基(C₅)和4-二甲基氨基吡啶基(C₅)

ii)含2个或多个稠环的杂芳环，所述稠环之一为杂芳环，其非限制性实例包括：7H-嘌呤基(C₅)、9H-嘌呤基(C₅)、6-氨基-9H-嘌呤基(C₅)、5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶基(C₆)、7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基(C₆)、吡啶并[2,3-d]嘧啶基(C₇)、2-苯基苯并[d]噻唑基(C₇)、1H-吲哚基(C₈)、4,5,6,7-四氢-1-H-吲哚基(C₈)、喹喔啉基(C₈)、5-甲基喹喔啉基(C₈)、喹唑啉基(C₈)、喹啉基(C₉)、8-羟基-喹啉基(C₉)和异喹啉基(C₉)。

5)连接有（tethered）C₁-C₆的环烃基单元(碳环单元、C₆或C₁₀芳基单元、杂环单元或杂芳基单元)，其通过C₁-C₆亚烷基单元连接至所述分子的其他部分、单元或核。连接的环烃基单元的非限制性实例包括具有下式的苄基C₁-(C₆)：

其中R^a任选是一个或多个独立选择的氢的取代基。其他实例包括其他芳基单元，尤其是(2-羟基苯基)己基C₆-(C₆)；萘-2-基甲基C₁-(C₁₀)、4-氟苄基C₁-(C₆)、2-(3-羟基苯基)乙基C₂-(C₆)，还有取代的和未取代的C₃-C₁₀亚烷基碳环单元，例如环丙基甲基C₁-(C₃)、环戊基乙基C₂-(C₅)、环己基甲基C₁-(C₆)。该类中包括取代的和未取代的C₁-C₁₀亚烷基-杂芳基单元，例如具有下式的2-吡啶甲基C₁-(C₆)单元：

其中R^a与以上所定义的相同。另外，C₁-C₁₂连接的环烃基单元包括C₁-C₁₀亚烷基杂环单元和亚烷基-杂芳基单元，其非限制性实例包括吖丙啶基甲基C₁-(C₂)和噁唑-2-基甲基C₁-(C₃)。

对于本公开的目的，碳环选自C₃至C₂₀；芳环为C₆或C₁₀；杂环选自C₁至C₉；杂芳环选自C₁至C₉。

对于本公开的目的，并为提供本公开定义的一致性，包含单个杂原子的稠环单元，以及螺环、双环等在本文中将表征并意指为由含所述杂原子的环对应的环家族所涵盖，但本领域技术人员可有另外的表征。例如，具有下式的1,2,3,4-四氢喹啉：

就本公开的目的而言被认为是杂环单元。具有下式的6,7-二氢-5H-环戊嘧啶：

就本公开的目的而言被认为是杂芳基单元。当稠环单元在饱和环(杂环)和芳环(杂芳环)中都包含杂原子时，对于描述本发明的目的，芳环将主导并决定所述环在本文中分配的类型。例如，具有下式的1,2,3,4-四氢-[1,8]萘吡啶：

就本公开的目的而言被认为是杂芳基单元。

说明书通篇使用术语“取代的”。术语“取代的”适用于在本文中描述为“取代的单元或部分是烃基单元或部分，非环状或者环状，其一个或多个氢原子由本文下文所定义的一个取代基或多个取代基替换”的单元。所述单元，当替换氢原子时，每次能够替换所述烃基部分的一个氢原子、两个氢原子或三个氢原子。另外，这些取代基可替换相邻的两个碳上的两个氢原子从而形成所述取代基、新部分或单元。例如，需要单个氢原子替代的取代单元包括卤素、羟基等。两个氢原子替代包括羰基、肟基等。自相邻碳原子的两个氢原子替代包括环氧基等。三个氢原子替代包括氰基等。术语取代的在本说明书通篇中使用以指明烃基部分（尤其是芳环、烷基链）的一个或多个氢原子可由取代基替代。当一个部分描述为“取代的”时，任何数目的氢原子可被替代。例如，4-羟基苯基是“取代的芳族碳环（芳环）”，(N,N-二甲基-5-氨基)辛基是“取代的C₈直链烷基单元”，3-胍基丙基是“取代的C₃直链烷基单元”，2-羧基吡啶基是“取代的杂芳基单元”。

以下是可取代碳环、芳基、杂环或杂芳基单元上氢原子的单元的非限制性实例：

i)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链或C₃-C₁₂环状烷基；例如，甲基(C₁)、氯甲基(C₁)、三氟甲基(C₁)、氨基甲基(C₁)、乙基(C₂)、羟基甲基1-氯乙基(C₂)、2-羟基乙基(C₂)、1,2-二氟乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、3-羧基丙基(C₃)、环丙基(C₃)、2-甲基-环丙基(C₃)、正丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、环丁基(C₄)、2,3-二羟基环丁基(C₄)、戊基(C₅)、环戊基(C₅)、己基(C₆)和环己基(C₆)等；

ii)取代的或未取代的C₂-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链或C₃-C₁₂环状烯基；例如，乙烯基(C₂)、2-氯乙烯基(C₂)（也称为2-氯乙烯基）、3-丙烯基(C₃)、1-丙烯基(也称为2-甲基乙烯基)(C₃)、异丙烯基(也称为2-甲基乙烯-2-基)(C₃)、丁烯-4-基(C₄)、4-羟基丁烯-1-基(C₄)、环丁烯基(C₄)、环戊烯基(C₅)、环戊二烯基(C₅)、环己烯基(C₆)、7-羟基-7-甲基辛-4-烯-2-基(C₉)和7-羟基-7-甲基辛-3,5-二烯-2-基(C₉)等；

iii)取代的或未取代的C₂-C₁₂直链或C₃-C₁₂支链炔基；例如，乙炔基(C₂)、丙-2-炔基(也称作炔丙基)(C₃)、丙炔-1-基(C₃)、2-甲基-己-4-炔-1-基(C₇)；5-羟基-5-甲基己-3-炔基(C₇)、6-羟基-6-甲基庚-3-炔-2-基(C₈)、5-羟基-5-乙基庚-3-炔基(C₉)等。

iv)取代的或未取代的C₆或C₁₀亚烷基芳基；例如，苯基、2-氯苯基、3-羟基苯基、4-硝基苯基、2-氟-4-甲基苯基、3,5-二硝基苯基、8-羟基萘-1-基、6-氟萘-2-基等；

v)取代的或未取代的C₁-C₉杂环；如本文进一步所定义的；

vi)取代的或未取代的C₁-C₁₁杂芳环；如本文进一步所定义的；

vii)卤素；例如，氟、氯、溴和碘；

viii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xOR¹⁰；

R¹⁰选自：

a)-H；

b)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

c)C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基或亚烷基芳基；

d)C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；

e)C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

ix)-[C(R^23a)(R^23b)]_xN(R^11a)(R^11b);

R^11a和R^11b各自独立地选自：

a)-H;

b)-OR¹²;

R¹²为氢或C₁-C₄直链烷基；

c)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

d)C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；

e)C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；

f)C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或

g)R^11a和R^11b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

x)-[C(R^23a)(R^23b)]_xC(O)R¹³;

R¹³为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-OR¹⁴；

R¹⁴为氢、取代的或未取代的C₁-C₄直链烷基、C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基、C₁-C₉取代的或未取代的杂环基、C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

c)-N(R^15a)(R^15b)；

R^15a和R^15b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^15a和R^15b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xi)-[C(R^23a)(R^23b)]_xOC(O)R¹⁶；

R¹⁶为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-N(R^17a)(R^17b);

R^17a和R^17b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^17a和R^17b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xNR¹⁸C(O)R¹⁹;

R¹⁸为

a)-H；或

b)取代的或未取代的C₁-C₄直链、C₃-C₄支链或C₃-C₄环烷基；

R¹⁹为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-N(R^20a)(R^20b)；

R^20a和R^20b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^20a和R^20b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xiii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xCN；

xiv)-[C(R^23a)(R^23b)]_xNO₂；

xv)-[C(R^23a)(R^23b)]_xR²¹；

R²¹为C₁-C₁₀直链、C₃-C₁₀支链或C₃-C₁₀环烷基，其被1至21个选自-F、-Cl、-Br或-I的卤原子取代；

xvi)-[C(R^23a)(R^23b)]_xSO₂R²²；

R²²为氢、羟基、取代的或未取代的C₁-C₄直链或C₃-C₄支链烷基；取代的或未取代的C₆、C₁₀或C₁₄芳基；C₇-C₁₅亚烷基芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；或C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

R^23a和R^23b各自独立地为氢或C₁-C₄烷基；并且

下标x为0至5的整数。

本文公开了具有以下通式的化合物：

其中X为能够与癌细胞表面的一个或多个位置结合的单元；

L为连接单元；并且

Z为能够形成稳定碳正离子的单元。

在另一方面，所公开的X单元能够与小分子受体连接。在一个实施方案中，所述X单元包括叶酸部分，所述叶酸部分使得显像剂与肿瘤细胞上的叶酸受体结合。

除了X单元，所公开的化合物还构成指示分子已经结合至特定糖基化分子的方法。所公开的显像剂包括Z单元，当所公开的显像剂在质谱分析条件下断裂时，Z单元能够形成稳定的阳离子。在本文中Z单元还指“报告（reporter）”单元，因为在本方法中检测的是Z单元的稳定碳正离子。

最近开发的MALDI-IMS的变型称为靶向成像质谱（TIMS）或用于靶向多重质谱成像的TAMSIM，其最初由Theiry描述（参见Theiry et al.,Rapid Commun Mass Spectrom,2007,21,823-829），该质谱通过使用与所公开的用作亲和标签的X单元连接的激光活性光可切割的Z单元，可进行靶向分析和实现直接来自组织切片的所公开的显像剂的空间可视化。将Z单元与X单元结合的键是光可切割的，以使得在MALDI质谱中的UV激光下暴露释放形成Z单元的稳定阳离子，该稳定的阳离子不需要使用基质即可检测到。改变Z单元的质量还可在相同的组织中同时多重检测不同分子，并且由常规方法（固定或冷冻）制作的切片可用于TIMS以使得现存的病理学工作流程不变。

X单元

多糖结合显像剂

在一方面，所公开的X单元能够结合至多糖，尤其是作为细胞表面碳水化合物一部分的多聚糖，所述细胞表面碳水化合物是作为不同细胞类型的特征标志的糖基化蛋白质、多肽和脂质的组分。与多糖的结合可通过共价键、氢键、离子吸引等实现。在一些实例中，X单元会通过数种机理的组合与多糖结合。

不囿于理论，与所公开的X单元能够结合的许多这样的糖基化分子和不同的癌症类型相关。因此，所公开的X单元可具有指示癌症存在的生物标记物的作用。例如，唾液酸化的Lewis X(SLe^X)和唾液酸化的Lewisa(SLe^a)是介导肿瘤细胞与内皮细胞粘附的碳水化合物分子。这些抗原不在正常乳腺组织或其他健康细胞的组织上表达。已经发现SLe^X和SLe^a的过表达指示了预后不良和恶性复发。因此，可通过测量分子是否包含粘附至组织的所公开的X单元，来测试通常认为不存在这些指示恶性的多糖的组织是否存在癌细胞。

所述显像剂的一个类别涉及能够结合至细胞表面多糖的显像剂。就这一类别的公开的显像剂而言，X单元包括一个或多个具有式-B(OH)₂的硼酸单元，其中所述X单元可由下式表示：

并且n为具有至少为1的值的整数。

在一方面，X单元包含1个硼酸单元，即n等于1。在另一方面，X单元包括2个硼酸单元，即n等于2。在另一方面，X单元包含3个硼酸单元，即n等于3。在另一方面，X单元包含4个硼酸单元，即n等于4。在另一方面，X单元包含5个硼酸单元，即n等于5。但是，下标n可具有任意值，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

X的一个方面涉及具有下式的单元：

其中W为亲和单元，其包含一个或多个硼酸单元并且下标x为1至5。

W的一个方面涉及具有下式的亲和单元：

其中Y为芳基核，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）；L¹为将W连接至X的连接基团；并且R为含有至少一个硼酸单元的单元；下标m为1至5的整数。

L¹为具有式-R⁴QR⁵-的单元，其中R⁴和R⁵为可存在或可不存在的亚烷基单元，并且其中当存在R⁴和R⁵单元时，每个R⁴和R⁵单元含有1至10个碳原子。Q为具有式(D)_aC(E)(G)_b的单元，其中D和G各自独立地选自-O-、-NH-和-S-；E选自=O、=NH和=S；并且下标a和b各自独立地为0至10。L¹的非限制性实例包括选自以下的单元：

i)-(CH₂)_yC(O)O(CH₂)_z-；

ii)-(CH₂)_yOC(O)(CH₂)_z-；

iii)-(CH₂)_yC(O)NR⁶(CH₂)_z-；

iv)-(CH₂)_yNR⁶C(O)(CH₂)_z-；

v)-(CH₂)_yNR⁶C(O)NH(CH₂)_z-；和

vi)-(CH₂)_yNR⁶C(NR⁶)NR⁶(CH₂)_z-；

其中R⁶为氢或C₁-C₃直链烷基；下标y为0至4的整数并且下标z为0至4的整数。

R单元为可被1至5个硼酸单元取代的单元，所述R单元具有下式：

其中下标k为1至5的整数；并且L²具有下式：

i)(CH₂)_pNR⁷(CH₂)_q；或

ii)(CH₂)_pO(CH₂)_q;

其中R⁷为氢或C₁-C₃直链烷基；下标p为0至5的整数并且下标q为0至5的整数。

X的一个实施方案涉及具有下式的单元：

其中Y为被1至5个R单元取代的蒽基。

该实施方案的一个迭代方案（iteration）涉及具有下式的X单元：

其中L¹为-(CH₂)_yC(O)NR⁶(CH₂)_z-；R⁶为甲基；下标y为0；且下标z为1。

该实施方案的非限制性实例包括其中L为-CH₂NCH₃CH₂-的X单元，例如：

该实施方案的其它非限制性实例包括其中L²为-CH₂OCH₂-的X单元，例如：

该实施方案的另一迭代方案涉及具有下式的X单元：

其中L¹为-(CH₂)_yC(O)NR³(CH₂)_z-；R⁶为甲基；下标y为1；且下标z为0。当L²为-CH₂NCH₃CH₂-时，所公开的显像剂包括具有下式的X单元：

当L²为-CH₂OCH₂-时，所公开的显像剂包括具有下式的X单元：

当L¹为-(CH₂)_yOC(O)(CH₂)_z-；下标y等于1；下标z等于0；且L²为-CH₂NCH₃CH₂-时，所公开的显像剂包括具有下式的X单元：

X的另一个实施方案涉及具有下式的单元：

其中Y为被1至5个R单元取代的苯基。

该实施方案的一个迭代方案涉及具有下式的X单元：

其中L¹为-(CH₂)_yC(O)NR₆(CH₂)_z-；R⁶为甲基；下标y为0；且下标z为1。

该实施方案的非限制性实例包括其中L²为-CH₂NCH₃CH₂-的X单元，例如：

X的另一个实施方案涉及具有下式的单元：

其中Y为被1至5个R单元取代的萘基。

X的另一个实施方案涉及具有下式的单元：

其中Y为被1至5个R单元取代的菲基。

整合素结合显像剂

所公开的显像剂的另一方面涉及具有下式的化合物：

其中X为能够与一种或多种整合素结合的单元，并且L和Z与上文所限定的相同。在本方面的一个类别中，所公开的X单元包括能够与肿瘤细胞整合素结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。在实施方案中，X单元为具有下式的直链RGD单元：

其中X单元能够与在肿瘤细胞表面可见的蛋白质上的纤连蛋白III型结构域结合。对于该类别的显像剂，L¹具有下式：

其中AA代表xx个天然存在的或合成的氨基酸。下标xx为1至7的整数。在一个实施方案中，xx等于2。在另一个实施方案中，xx等于3。在另一个实施方案中，xx等于4。在另一个实施方案中，xx等于5。仍旧是在另一个实施方案中，xx等于6。在另一个实施方案中，xx等于7。

这一方面的X单元的另一类别具有以下通式：

对于该类别的显像剂，L¹具有下式：

其中AA代表xx个天然存在的或合成的氨基酸。下标xx为1至7的整数。在一个实施方案中，xx等于2。在另一个实施方案中，xx等于3。在另一个实施方案中，xx等于4。在另一个实施方案中，xx等于5。仍旧在另一个实施方案中，xx等于6。在另一个实施方案中，xx等于7。

在一个实施方案中，包含L¹的氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

以下是RGD结合显像剂的非限制性实例，所述显像剂指示包括RGD和L¹的氨基酸：

叶酸受体结合显像剂

在另一个方面，所公开的X单元能够与叶酸受体结合。该类别的X单元具有以下通式：

Z单元

Z单元具有下式：

其中，当Z单元从核分子中断裂出时，Z能够形成具有下式的稳定碳正离子：

R¹和R²是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）。R³是取代的或未取代的芳基基团，其选自还包括锚定基团的苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）。

以下是可取代R¹、R²和R³芳环上的氢原子的单元的非限制性实例：

i)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链或C₃-C₁₂环状烷基；例如，甲基(C₁)、氯甲基(C₁)、三氟甲基(C₁)、氨基甲基(C₁)、乙基(C₂)、羟基甲基1-氯乙基(C₂)、2-羟基乙基(C₂)、1,2-二氟乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、3-羧基丙基(C₃)、环丙基(C₃)、2-甲基-环丙基(C₃)、正丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、环丁基(C₄)、2,3-二羟基环丁基(C₄)、戊基(C₅)、环戊基(C₅)、己基(C₆)和环己基(C₆)等；

ii)取代的或未取代的C₂-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链或C₃-C₁₂环状烯基；例如，乙烯基(C₂)、2-氯乙烯基(C₂)（也称为2-氯乙烯基）、3-丙烯基(C₃)、1-丙烯基(也称为2-甲基乙烯基)(C₃)、异丙烯基(也称为2-甲基乙烯-2-基)(C₃)、丁烯-4-基(C₄)、4-羟基丁烯-1-基(C₄)、环丁烯基(C₄)、环戊烯基(C₅)、环戊二烯基(C₅)、环己烯基(C₆)、7-羟基-7-甲基辛-4-烯-2-基(C₉)和7-羟基-7-甲基辛-3,5-二烯-2-基(C₉)等；

iii)取代的或未取代的C₂-C₁₂直链或C₃-C₁₂支链炔基；例如，乙炔基(C₂)、丙-2-炔基(也称作炔丙基)(C₃)、丙炔-1-基(C₃)、2-甲基-己-4-炔-1-基(C₇)；5-羟基-5-甲基己-3-炔基(C₇)、6-羟基-6-甲基庚-3-炔-2-基(C₈)、5-羟基-5-乙基庚-3-炔基(C₉)等。

iv)取代的或未取代的C₆或C₁₀亚烷基芳基；例如，苯基、2-氯苯基、3-羟基苯基、4-硝基苯基、2-氟-4-甲基苯基、3,5-二硝基苯基、8-羟基萘-1-基、6-氟萘-2-基等；

v)取代的或未取代的C₁-C₉杂环；如本文进一步所定义的；

vi)取代的或未取代的C₁-C₁₁杂芳环；如本文进一步所定义的；

vii)卤素；例如，氟、氯、溴和碘；

viii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xOR¹⁰；

R¹⁰选自：

a)-H；

b)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

c)C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基或亚烷基芳基；

d)C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；

e)C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

ix)-[C(R^23a)(R^23b)]_xN(R^11a)(R^11b);

R^11a和R^11b各自独立地选自：

a)-H;

b)-OR¹²;

R¹²为氢或C₁-C₄直链烷基；

c)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

d)C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；

e)C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；

f)C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或

g)R^11a和R^11b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

x)-[C(R^23a)(R^23b)]_xC(O)R¹³;

R¹³为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-OR¹⁴；

R¹⁴为氢、取代的或未取代的C₁-C₄直链烷基、C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基、C₁-C₉取代的或未取代的杂环基、C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

c)-N(R^15a)(R^15b)；

R^15a和R^15b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^15a和R^15b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xi)-[C(R^23a)(R^23b)]_xOC(O)R¹⁶；

R¹⁶为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-N(R^17a)(R^17b);

R^17a和R^17b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^17a和R^17b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xNR¹⁸C(O)R¹⁹;

R¹⁸为

a)-H；或

b)取代的或未取代的C₁-C₄直链、C₃-C₄支链或C₃-C₄环烷基；

R¹⁹为：

a)取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；

b)-N(R^20a)(R^20b)；

R^20a和R^20b彼此独立地为氢、取代的或未取代的C₁-C₁₂直链、C₃-C₁₂支链、或C₃-C₁₂环烷基；C₆或C₁₀取代的或未取代的芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；或R^20a和R^20b可一起形成具有3至10个碳原子和0至3个选自氧、氮和硫的杂原子的取代的或未取代的环；

xiii)-[C(R^23a)(R^23b)]_xCN；

xiv)-[C(R^23a)(R^23b)]_xNO₂；

xv)-[C(R^23a)(R^23b)]_xR²¹；

R²¹为C₁-C₁₀直链、C₃-C₁₀支链或C₃-C₁₀环烷基，其被1至21个选自-F、-Cl、-Br或-I的卤原子取代；

xvi)-[C(R^23a)(R^23b)]_xSO₂R²²；

R²²为氢、羟基、取代的或未取代的C₁-C₄直链或C₃-C₄支链烷基；取代的或未取代的C₆、C₁₀或C₁₄芳基；C₇-C₁₅亚烷基芳基；C₁-C₉取代的或未取代的杂环基；或C₁-C₁₁取代的或未取代的杂芳基；

R^23a和R^23b各自独立地为氢或C₁-C₄烷基；并且

下标x为0至5的整数。

R³单元包括至少一个具有下式的锚定单元：

其中Q为具有下式的单元：

i）-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_tR⁹；

ii)-(CH₂)_rOC(O)(CH₂)_tR⁹；

iii)-(CH₂)_rC(O)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

iv)-(CH₂)_rNR⁸C(O)(CH₂)_tR⁹；

v)-(CH₂)_rNR⁸C(O)NH(CH₂)_tR⁹；和

vi)-CH₂)_rNR⁸C(NR⁸)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

其中R⁸为氢或C₁-C₃直链烷基；下标r为0至4的整数且下标t为0至4的整数。R⁹为苯基或萘基。下标c为1至100。

L³为连接单元。L³包括一个或多个能够将如在本文中所公开的公开的Q单元与所公开的Z核单元连接的的单元。可包括L³单元的单元的非限制性实例包括含有不饱和单元的单元，即，-CH=CH-和-C≡C-，饱和单元，即，-CH₂-，聚醚，例如，-CH₂CH₂O-、-CH₂CH₂CH₂O-、-CH₂CH(CH₃)O-、-CH(CH₃)CH₂O-等。取决于配制人员所需的L³的性质，L³可以任何顺序和任意量包括这些单元。

Z的一个方面涉及具有下式的单元：

其中R¹⁰⁰、R¹⁰¹和R¹⁰²各自独立地为-OR¹⁰；R¹⁰为C₁-C₄烷基，下标c为1至100，-C≡C-单元可被插入连接基团的任何位点。

Z的这一方面的一个实施方案涉及具有下式的单元：

其中下标c为1至100，-C≡C-单元可被插入连接基团的任何位点。

这一实施方案的非限制性实例包括：

L单元

L单元将显像剂的X抗原亲和性部分与Z单元相连。L单元包括可断裂的键，该键在MALDI-MS或其它质谱条件下释放稳定的碳正离子。对于所述显像剂的一个类别，所述Z单元根据以下方案释放：

对于显像剂的另一个类别，所述Z单元根据以下方案释放：

对于显像剂的另一个类别，所述Z单元根据以下方案释放：

L单元具有下式：

-(J)_d(CH₂)_e(K)_f(CH₂)_g(L)_h(CH₂)_i(M)_j-；

-(J)_d(OCH₂CH₂)_e(K)_f(OCH₂CH₂)_g(L)_h(OCH₂CH₂)_i(M)_j-；

-(J)_d(CH₂)_e(K)_f(OCH₂CH₂)_g(L)_h(CH₂)_i(M)_j-；或

-(J)_d(OCH₂CH₂)_e(K)_f(CH₂)_g(L)_h(OCH₂CH₂)_i(M)_j-；

其中，J、K、L和M各自独立地选自以下的一种或多种：

i)-(CH₂)_yyO(CH₂)_zz-；

ii)-(CH₂)_yyNH(CH₂)_zz-；

iii)-(CH₂)_yyS(CH₂)_zz-；

iv)-(CH₂)_yyC(O)(CH₂)_zz-

v)-(CH₂)_yyOC(O)(CH₂)_zz-；

vi)-(CH₂)_yyC(O)O(CH₂)_zz-；

vii)-(CH₂)_yyNHC(O)(CH₂)_zz-；

viii)-(CH₂)_yyC(O)NH(CH₂)_zz-；

ix)-(CH₂)_yyNHC(O)NH(CH₂)_zz-；

x)-(CH₂)_yyC(S)(CH₂)_zz-；

xi)-(CH₂)_yyNHC(S)(CH₂)_zz-

xii)-(CH₂)_yyC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiii)-(CH₂)_yyNHC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiv)C₃-C₁₀碳环；

xv)选自苯基和萘基的芳环；

xvi)包含1至4个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；和

xvii)包含1至4个杂原子的杂芳环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；以及

xviii)对各种J、K、L和M其的任意结合；

下标d、f、h和j为0或1。当不存在J时，下标d等于0，当存在J时，下标d等于1。当不存在K时，下标f等于0，当存在K时，下标f等于1。当不存在L时，下标h等于0，当存在L时，下标h等于1。当不存在M时，下标j等于0，当存在M时，下标j等于1。下标e、g和i各自独立地为0至10的整数。下标yy为0至5的整数。下标zz为0至5的整数。

可先组装所公开的结合单元L，再与X和Z单元结合，或者可将所公开的结合单元L作为结合过程自身的一部分。形成结合单元的一个方面涉及使用在形成结合单元中作为一个步骤的形成1,2,3-三唑环的反应，例如，根据以下方案：

以下结合单元L的实施方案包括一个或多个1,2,3-三唑环：

该实施方案的一个迭代方案涉及具有下式的单元：

该迭代方案的非限制性实例包括：

该实施方案的另一个迭代方案涉及具有下式的单元：

该迭代方案的非限制性实例包括：

另一个实施方案涉及连接单元L，其包括一个或多个稠合至第二个环上的1,2,3-三唑环：

其中K为4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑环。

L单元的一个实施方案涉及具有下式的L单元：

-(J)_d(OCH₂CH₂)_e(K)_f(OCH₂CH₂)_g(L)_h(OCH₂CH₂)_i(M)_j-；

其非限制性实例包括：

i)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₂NHC(O)CH₂(OCH₂CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₂S-；

ii)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₃NHC(O)CH₂(OCH₂CH₂)₃NHC(O)(CH₂)₂S-；

iii)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₄NHC(O)CH₂(OCH₂CH₂)₄NHC(O)(CH₂)₂S-；

iv)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₂C(O)NHCH₂(OCH₂CH₂)₂NHC(O)(CH₂)₂S-；

v)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₃C(O)NHCH₂(OCH₂CH₂)₃NHC(O)(CH₂)₂S-；和

vi)-C(O)CH₂(OCH₂CH₂)₄C(O)NHCH₂(OCH₂CH₂)₄NHC(O)(CH₂)₂S-.

所公开的显像剂可以对配制人员来说任何常规的方法进行制备，例如，汇集合成、线性合成或其结合。下文公开的是制备所公开的显像剂的方法的非限制性实例。

根据本公开内容制备显像剂

制备碳正离子受体前体

方案I

试剂和条件：(a)I₂,HNO₃,二氧杂环己烷,H₂O;60℃

试剂和条件：(b)4-甲氧基苯基溴化镁，THF;rt

试剂和条件：(c)N-苄基戊炔酰胺，DMF,CuI,Et₃N,Pd(PPh₃)₄;rt

试剂和条件：(d)巯基丙酸，TFA,CH₂Cl₂;rt

试剂和条件：(e)EDCI，N-羟基琥珀酰亚胺,CH₂Cl₂;rt

实施例1

3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5)

制备(3-碘-4-甲氧基苯基)(4-甲氧基苯基)甲酮（1）：在60℃下，向4,4’-二甲氧基二苯甲酮（1.8g,7.5mmol）的二氧杂环己烷（10mL）溶液中加入碘（1.0g,3.9mmol）。混合物搅拌15分钟后，加入水（2mL），接着以滴加的方式在1小时之内加入58%HNO₃（4.1mL）。将反应在60℃下保持搅拌约6小时直至碘的颜色消失。将氮气鼓泡通过反应混合物直到不再放出棕色气体，用水（100mL）稀释混合物以得到浅黄色沉淀，收集该沉淀并用5%NaHCO₃水溶液和水洗涤。从EtOH（20mL）中重结晶，接着使用己烷/EtOAc(10:1)通过柱色谱纯化得到白色针状物（1.1g,收率40%）。

¹H NMR(DMSO-d₆)：8.11(s,1H),7.73(m,3H),7.12(m,3H),3.95(s,3H),和3.87(s,3H)ppm.MS-ESI:[M+H]⁺(m/z,369.0).

制备(3-碘-4-甲氧基苯基)双(4-甲氧基苯基)甲醇（2）：在0℃下，向(3-碘-4-甲氧基苯基)(4-甲氧基苯基)甲酮（1）（1.0g,2.7mmol）的干燥THF溶液中一次性加入1M4-甲氧基苯基溴化镁的THF溶液（5.5ml,5.5mmol）。室温搅拌过夜后，用150mL饱和NaHCO₃溶液稀释反应溶液并且用EtOAc（50mLx3）萃取。用水和盐水洗涤EtOAc层，用Na₂SO₄干燥，过滤并且减压浓缩。通过使用己烷/EtOAc（10:1）通过快速色谱纯化剩余物得到白色晶体（1.2g,收率90%）。

¹H NMR(CDCl₃):7.77(s,1H),7.16(m,5H),6.87(m,4H),6.74(d,J=5.6Hz1H),3.89(s,3H,),和3.82(s,3H)ppm.MS-ESI:[M+H]⁺(m/z,477.3).

制备N-苄基-5-{5-[羟基双(4-甲氧基苯基)甲基]-2-甲氧基-苯基}戊-4-炔酰胺(3)：在N₂保护下，向(3-碘-4-甲氧基苯基)双(4-甲氧基苯基)甲醇（2）(530mg,1.11mmol)和N-苄基戊炔酰胺(219mg,1.17mmol)的DMF(6mL)溶液中依次加入Pd(PPh₃)₄(116mg,0.1mmol)、CuI(38mg,0.2mmol)和Et₃N(235μL,1.68mmol)。反应混合物室温搅拌过夜，然后用水(100mL)稀释并且用EtOAc(60mL x3)萃取。用水(50mL)、0.1M的(NH₄)₂EDTA(50mL)和盐水(50mL)洗涤该EtOAc萃取液，无水Na₂SO₄干燥，过滤并且减压浓缩。使用己烷/EtOAc1:1作为溶剂在硅胶柱色谱上纯化剩余物得到白色固体(400mg,收率67%)。¹H NMR(CD₃OD):7.24(dd，J＝3.6，0.8Hz，2H)，7.14(m，5H)，7.08(m，4H)，6.97(dd，J＝6.8，2.0Hz，1H)，6.81(m，4H)，4.34(s，2H)，3.79(s，3H)，3.76(s，6H)，2.72(t，J＝6.8Hz，2H)，和2.48(t,J=6.8Hz,2H)ppm.MS-ESI:[M+H]⁺(m/z,536.4).

制备3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}-双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸(4)：在N₂下，向N-苄基-5-{5-[羟基双(4-甲氧基苯基)甲基]-2-甲氧基-苯基}戊-4-炔酰胺(3)(340mg,0.64mmol)的6mLCH₂Cl₂溶液中加入3-巯基丙酸(56μL,0.64mmol)和TFA(67μL,0.83mmol)。室温搅拌混合物2小时，在这之后，TLC表明起始原料消耗完毕。减压除去反应溶液中的挥发性物质。使用CH₂Cl₂/MeOH（10:1）通过硅胶色谱纯化剩余物得到无色针状产物（248mg,收率62%）。

¹H NMR(CDCl₃)：7.64(d,J=2.2Hz,1H),7.27-7.11(m,10H),6.78(d,J=8.8Hz，4H)，6.71(d，J＝8.8Hz，1H)，6.50(brs，1H)，4.45(d，J＝5.6Hz，2H)，3.77(s，6H)，3.72(s,3H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H);2.52(t,J=6.6Hz,2H);2.40(t,J=6.8Hz,2H);2.29(t,J=6.8Hz,2H)ppm.MS-ESI:[M+H]⁺(m/z,624.0).

制备3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5)的：将3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}-双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸(4)（248mg,0.4mmol）和N-羟基琥珀酰亚胺（46mg,0.4mmol）溶解于8mL CH₂Cl₂中。然后在室温搅拌下加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺（EDCI）（77mg,0.4mmol）。室温搅拌3小时后，用CH₂Cl₂（60mL）稀释反应溶液，用水（5mL）和盐水（5mL）洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并且减压浓缩。使用CH₂Cl₂/MeOH（20:1）通过硅胶色谱纯化剩余物得到白色固体（204mg,收率72%）。

¹H NMR(CDCl₃)：7.43(d,J=2.5Hz,1H),7.26(m,5H);7.22(m,5H);6.82(m,4H);6.46(brs，1H);3.80(s,6H);3.74(s,3H);2.78(m，6H);2.53(m,4H);2.47(m,2H)ppm.MS-ESI:[M+H]⁺(m/z,721.2).

制备抗原亲和单元

方案II

试剂和条件：(a)炔丙基溴,K₂CO₃,CH₃CN，回流24小时。

试剂和条件：(b)NaOH,CH₃OH，回流3小时。

试剂和条件：(c)CH₂Cl₂,EDCI,HOBt,DMAP,室温18小时。

试剂和条件：(d)TFA,CH₂Cl₂,3小时。

试剂和条件：(e)CuI,DIPEA,DMSO,80℃,微波，0.5小时。

试剂和条件：(f)K₂CO₃,NaI,CH₃CN。

试剂和条件：(g)TFA,CH₂Cl₂,室温4小时。

实施例2

({[({[({2-[(1-{3-氨基丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-对苯二甲酰基}双(甲基脲二基))双(亚甲基)]双(蒽-10,9-二基)}双-(亚甲基))双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(2,1-亚苯基))-二硼酸(12)

制备(2-丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酸二甲酯（6）的：向2-羟基对苯二甲酸二甲酯(24g,114mmol)的250mL CH₃CN溶液中加入K₂CO₃(18.9g,137mmol)和炔丙基溴(16.38mL,137mmol)。氮气下使反应混合物回流24小时。待冷却至室温后，接着将反应混合物倒入EtOAc(100mL)和10%HCl水溶液(10mL)的混合物中。分离有机相并用饱和NaHCO₃、盐水洗涤以及无水Na₂SO₄干燥。除去溶剂得到蜡状浅白色固体（28.25g,定量收率）。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.84-7.82(m,1H),7.71-7.69(m,1H),7.782-7.779(m,1H),4.85(d,J=2.0Hz,2H),3.95(s,3H),3.92(s,3H),2.56(t,J＝2.0Hz，1H).¹³C NMR(CDCl₃)δ166.0，165.9，156.6，134.3，131.6，125.2，122.3，115.1，77.6，76.5，56.9，52.5，52.4.MS(+ESI)m/z249.1[M+H]⁺.

制备1-(丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酸（7）：向(2-丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酸二甲酯（6）(3.0g,143mmol)的15mL CH₃OH溶液中加入25mL氢氧化钠溶液(2M)，反应混合物回流3小时。真空除去溶剂后，用10%HCl溶液将剩余物酸化至pH2。收集形成的固体，用水洗涤，真空干燥以得到呈白色固体的所需产物(2.11g,84%)：

¹H NMR(DMSO-d₆)δ13.22(brs,2H),7.71-7.73(m,2H),7.61-7.63(m,1H),4.96(d,J=2Hz，3H),3.65(s,1H);¹³C NMR(DMSO-d₆)δ167.3，167.0，155.8，134.7，130.9，126.9，122.2，114.7，79.4，79.2，56.6.MS(-ESI)m/z219.1[M-H]^-.

制备{[({[2-(丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酰基]双(甲基脲二基)}双(亚甲基))双(蒽-10,9-二基)]双(亚甲基)}双(甲基氨基甲酸)二叔丁酯[或者N¹,N⁴-双((9-(N-叔丁氧羰基甲基氨基)甲基)蒽-10-基)甲基)-N¹,N⁴-二甲基-2-(丙-2-炔基氧基)对苯二甲酰胺](8)：向({10-[(甲基氨基)甲基]蒽-9-基}甲基)氨基甲酸叔丁基甲酯(1.62g,4.4mmol)和1-(丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酸（7）(488mg,2.2mmol)的320mL干燥CH₂Cl₂溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDCI)(820mg,9.0mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(1.2g,8.9mmol)和二甲基氨基吡啶(DMAP)(108mg,0.9mmol)。在氮气氛下室温搅拌过夜后，用水洗涤反应混合物并且用MgSO₄干燥。除去溶剂后，通过硅胶色谱(CH₂Cl₂/CH₃OH100/1)纯化剩余物以得到呈浅黄色粉末的所需产物(1.76g,88%)：

¹H NMR(CDCl₃)δ8.50(s，8H)，7.58(s，8H)，7.28(s，1H)，7.12(s，1H)，7.02(s，1H)，5.86(s，4H)，5.55(s，4H)，4.55(s，2H)，2.54(s，3H)，2.51(s，6H)，2.32(s，3H)，1.57(s，18H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ170.3，168.0，153.2，138.1，130.9，130.8，130.1，128.4，128.1，128.04，126.2，126.0，125.9，125.0，124.5，124.2，120.2，111.4，79.8，77.5，76.1，55.8，53.3，41.4，38.5，35.5，33.9，28.4.HRMS(+ESI):[C₅₇H₆₁N₄O₇]⁺[M+H]⁺m/z计算值913.4540实测值913.4566.MS(+ESI)m/z：913.4[M+H]⁺.

制备N¹,N⁴-二甲基-N¹,N⁴-双({9-[(甲基氨基)甲基]蒽-10-基}甲基)-2-(丙-2-炔基氧基)对苯二甲酰胺](9)：在室温下，避光搅拌12mLCH₂Cl₂中的{[({[2-(丙-2-炔-1-基氧基)对苯二甲酰基]双(甲基脲二基)}双(亚甲基))双(蒽-10,9-二基)]双(亚甲基)}双(甲基氨基甲酸)二叔丁酯（8）（1.0g,1.1mmol）化合物与三氟乙酸（TFA）（3mL）的混合物。除去溶剂后，向剩余物中加入EtOAc/己烷1:1的混合溶剂（20mL）。形成沉淀，收集固体，用饱和NaHCO₃溶液和水洗涤，真空干燥以得到呈浅黄色固体的所需产物（615mg,82%）：

¹H NMR(CDCl₃)δ8.43-8.39(m,8H),7.57-7.52(m，8H)，7.29-7.26(m，1H)，7.09(s，1H)，6.99-6.97(m，1H)，5.83-5.78(m，4H)，4.69(s，4H)，4.53(s，2H)，2.69(s，6H)，2.51(s，3H)，2.39(s，3H)，2.33(s，1H)，1.94(s，2H).¹³CNMR(CDCl₃)δ170.9，168.6，153.7，138.6，133.5，131.6，131.5，130.5，128.6，128.0，126.7，126.5，126.3，125.5，125.4，125.4，125.0，124.7，120.7，111.9，78.1，76.8，56.4，48.5，42.4，41.9，37.6，36.1，34.5.HRMS(+ESI):[C₄₇H₄₅N₄O₃]⁺[M+H]⁺m/z计算值713.3492，实测值713.3512.MS(-ESI)m/z711.4[M-H]^-.

制备{3-[4({2,5-双[甲基({10-[(甲基氨基)甲基]-蒽-9-基}甲基)氨基甲酰基]苯氧基}甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]丙基}-氨基甲酸叔丁酯(10)：向N¹,N⁴-二甲基-N¹,N⁴-双({9-[(甲基氨基)甲基]蒽-10-基}甲基)-2-(丙-2-炔基氧基)对苯二甲酰胺](9)(105mg,0.14mmol)和(3-叠氮基丙基)氨基甲酸叔丁酯(84mg,0.42mmol)在0.5mL的二甲基亚砜(DMSO)中的混合物中加入二异丙基乙胺(DIPEA)(0.12mL,0.7mmol)和CuI(11mg,0.056mmol)。在80℃下将反应混合物微波辐照30分钟。向反应混合物中缓慢加入水(5mL)。然后用CH₂Cl₂萃取混合物。用盐水洗涤合并的CH₂Cl₂相并且用MgSO₄干燥。减压除去溶剂，通过硅胶色谱(CH₂Cl₂/CH₃OH10/3)纯化剩余物得到浅黄色固体(130mg,97%)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.44-8.43(m,8H),7.58-7.53(m,9H),7.08-6.96(m,3H),5.87-5.69(m,4H),5.10(s,2H),4.76(s,4H),4.20(s,2H),2.94(s,2H),2.84(s,6H),2.40(s,6H),1.78(s,2H),1.44(s,9H);MS(ESI)m/z913.4[M+H]⁺

制备({[({[({2-[(1-{3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]对苯甲酰基}双(甲基脲二基))双(亚甲基)]双(蒽-10,9-二基)}双(亚甲基))双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(2,1-亚苯基))-二硼酸(11)：向{3-[4({2,5-双[甲基({10-[(甲基氨基)甲基]-蒽-9-基}甲基)氨基甲酰基]苯氧基}甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]丙基}-氨基甲酸叔丁酯(10)(200mg,0.11mmol)的12mL CH₃CN溶液中加入2-[2-(溴甲基)-苯基]-5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂硼烷(124mg,0.44mmol)、K₂CO₃(152mg,1.1mmol)和NaI(4mg,0.022mmol)。在氮气氛下、室温下避光搅拌反应混合物16小时。过滤出固体后，除去有机溶剂，将剩余物重新溶解于CH₂Cl₂中，用5%NaHCO₃溶液和盐水洗涤，用MgSO₄干燥。蒸发溶剂得到粗产物，使用CH₂Cl₂/Et₂O重结晶得到浅黄色固体(205mg,收率79%)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ6.80-9.15(m,28H),5.60-5.85(m,4H),5.15(s，2H)，4.53(s，4H)，4.25(s，2H)，3.95(s，4H)，3.31(s，6H)，2.46(s，6H)，2.31(s，2H)，1.34(s,9H).MS(ESI):m/z1163.3[M-H₂O+H]⁺.HRMS(ESI):[C₆₉H₇₃B₂N₈O₈]⁺[M-H₂O+H]⁺m/z计算值1163.5737，实测值163.5760.

制备({[({[({2-[(1-{3-氨基丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-对苯二甲酰}双(甲基脲二基))双(亚甲基)]双(蒽-10,9-二基)}双-(亚甲基))双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(2,1-亚苯基))-二硼酸(12)：在氮气氛下，室温下避光搅拌({[({[({2-[(1-{3-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]对苯甲酰基}双(甲基脲二基))双(亚甲基)]双(蒽-10,9-二基)}双(亚甲基))双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(2,1-亚苯基))-二硼酸(11)（240mg,0.2mmol）和三氟乙酸（1.0mL）在10mL CH₂Cl₂中的混合物4小时。除去溶剂后，将剩余的油状物溶解于3mL EtOAc中。接着缓慢加入50mL Et₂O。收集沉淀，用饱和K₂CO₃溶液和水洗涤。通过快速色谱进一步纯化得到白色固体（133mg,73%）：

¹H NMR(DMSO-d₆)δ6.80-9.40(m，30H)，4.40-6.00(m，12H),3.40(s,6H),3.17-3.10(m,2H),2.82-2.74(m,2H),2.39(s,6H).¹³C NMR(DMSO-d₆)δ：158.9，158.6，136.2，130.9，130.6，127.6，127.0，126.8，125.5，125.0，119.0，116.0，67.8，51.3，47.1，36.8，28.3，21.9，21.7.MS(ESI)m/z1063.4[M-H₂O+H]⁺，1081.5[M+H]⁺.HRMS(+ESI):[C₆₄H₆₇B₂N₈O₇]⁺[M+H]⁺m/z计算值1081.5319，实测值1081.5363;[C₆₄H₆₅B₂N₈O₆]⁺[M-H₂O+H]⁺m/z计算值1063.5213，实测值1063.5253.

下文的方案III列出了形成显像剂13的最终步骤。

方案III

试剂和条件：(a)Et₃N,DMF,CH₂Cl₂,18小时。

实施例3

[({[({[({2-[(1-{3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双(4-甲氧基苯基)甲基)硫代]丙酰胺基}丙-3-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲氧基}对苯二甲酰基)双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(蒽-10,9-二基))双(亚甲基)]双(脲二基)}双(亚甲基))双(2,1-亚苯基)]-二硼酸(13)

制备[({[({[({2-[(1-{3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双(4-甲氧基苯基)甲基)硫代]丙酰胺基}丙-3-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲氧基}对苯二甲酰基)双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(蒽-10,9-二基))双(亚甲基)]双(甲基脲二基)}双(亚甲基))双(2,1-亚苯基)]-二硼酸(13)：在10mL烧瓶中，将({[({[({2-[(1-{3-氨基丙基}-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基]-对苯二甲酰}双(甲基脲二基))双(亚甲基)]双(蒽-10,9-二基)}双-(亚甲基))双(甲基脲二基)]双(亚甲基)}双(2,1-亚苯基))-二硼酸(12)(60mg,0.05mmol)和3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(0.5mL)与CH₂Cl₂(1mL)的混合物中。然后室温下避光加入三乙胺(Et₃N)。室温搅拌混合物过夜，然后蒸发溶剂。向形成的粘稠剩余物中缓慢加入10mL Et₂O以得到悬浮液。过滤固体并用EtOAc洗涤以得到粗产物，使用CH₂Cl₂/MeOH(15:1)通过硅胶色谱纯化该粗产物得到白色固体（30mg,36%）。¹H NMR(DMSO-d₆)9.0(m,3H),8.64-8.41(m,9H),7.94-6.83(m,32H),5.76-5.10(m,5H),4.53-4.32(m，2H)，4.42(s，3H)，3.76(s，3H)，3.69(s，6H)，3.40(s，12H)，3.39-3.01(m，18H)，2.55-2.0(m,8H),1.23(m,2H).MS-ESI:[M-H-H₂O]^-(m/z,1666.6)and[M+H-H₂O]⁺(m/z,1669.2).

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）细胞粘附序列于1984年发现于纤连蛋白（M.D.Pierschbacher和E.Ruoslahti,Nature,1984,309,30-33）。含有RGD结合位点的蛋白质，连同作为这些蛋白质受体的整合素构成了细胞粘附的主要识别系统（E.Ruoslahti,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol,1996,12,697-715）。RGD序列是许多粘附性细胞外基质、血液和细胞表面蛋白的细胞结合位点，并且超过20种已知的整合素的几乎一半在其粘附蛋白配体中识别这一序列。长期以来需要使用这一识别系统，例如，用于药物传送和肿瘤靶向治疗（Z.Liu,F.Wang和X.Chen,Theranostics,2011,1,201-210）。在含有肽的所有RGD中，cRGDfK是最常用于识别癌症相关整合素的RGD之一（R.Stupp和C.Ruegg,J.Clin.Oncol,2007,25,1637-1638）。在本文的方案IV中公开的是本公开的cRGDfK-MS标签缀合物的非限制性实例的制备。

方案IV

实施例4

2-((2S,5S,8S,11S)-5-苄基-8-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲氧基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5,14,23-三氧代-9,12,18,21–四氧杂-2-硫杂-6,15,24-三氮杂二十八烷-28-基)-11-(3-胍基丙基)-3,6,9,12,15-五氧代-1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-2-基)乙酸(15)

向2-((2S,5S,8S,11S)-8-(1-氨基-8,17-二氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十二烷-22-基)-5-苄基-11-(3-胍基丙基)-3,6,9,12,15-五氧代-1,4,7,10,13-五氮杂环十五-2-基)乙酸[c(RGDfK(PEG-PEG))]（14）(4mg,4.5μmol)的800μL磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中加入在600μLCH₃CN中的3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯（5）(3.6mg,5μmol)。使所得混合物在室温下搅拌12小时，然后通过HPLC使用配有Zobax C18反相柱(21.2mm x25cm)的Shimadzu LC-10AT VP系统纯化。使用从缓冲液A（H₂O中的0.05%TFA）至缓冲液B（乙腈中的0.05%THA）5-55%B的线性梯度在50分钟内洗脱（6mL/min）样品。

¹H NMR(CD₃OD):δ7.55-7.75(m,2H),7.21-7.33(m,10H),6.85-7.08(m,6H),6.82-6.85(m,4H),4.53-4.65(m,2H),4.23-4.46(m，5H)，3.98-4.08(m，5H)，3.81(s，3H)，3.78(s，3H)，3.53-3.75(m，9H)，3.38-3.46(m,3H),2.89-3.21(m,9H),2.69-2.78(m,5H),2.50-2.53(m,2H),2.37-2.41(m,2H),2.19-2.23(m，2H)，1.81-1.90(m，2H)，1.45-1.71(m，4H)，1.25-1.38(m，4H).HRMS(ESI)C₇₆H₉₉N₁₂O₁₈S⁺[M+H]⁺计算值1499.6916；实测值1499.6937.

2-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊炔酸

叶酸受体配体

叶酸受体α是另一种充分研究的生物标记物，其被广泛的人肿瘤过表达，所述人肿瘤为例如卵巢癌、子宫内膜癌、乳癌、肺癌、肾癌和结肠癌（J.F.Ross,P.K.Chaudhuri和M.Ratnam,Cancer,1994,73,2432-2443以及S.D.Weitman,R.H.Lark,L.R.Coney,D.W.Fort,V.Frasca,V.R.Zurawski和B.A.Kamen,Cancer Res.,1992,52,3396-3401）。从叶酸、2-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊二酸（16，可商购）起始，按照文献的方法（S.Dhar,Z.Liu,J.r.Thomale,H.Dai和S.J.Lippard,J.Am.Chem.Soc,2008,130,11467-11476）制备了叶酸单活化NHS酯17。如下所示，该酯经过与11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺18（可购自Sigma-Aldrich）酰胺化以得到末端被叠氮化物修饰的叶酸19，叶酸19经由“点击”化学（clickchemistry）可与有张力的环炔23偶合。这两个中间体的形成描述于方案V并描述于下文的实施例5。

方案V

试剂和条件：(a)DCC,NHS,TEA,DMSO;12小时。

试剂和条件：(b)TEA,DMSO;12小时。

试剂和条件：(c)

试剂和条件：(d)

实施例5

N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-1-氟环辛-2-炔基甲酰胺(23)

制备16-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰氨基)-1-叠氮基-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十七烷-17-羧酸(19)：向2-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊酸（17）(100mg,0.19mmol)的DMSO溶液中加入11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺（18）(30mg,0.25mmol)，随后加入Et₃N(80μL,0.6mmol)。反应混合物室温搅拌12小时，然后通过HPLC使用配有Zobax C18反相柱(21.2mm x25cm)的Shimadzu LC-10AT VP系统纯化。使用75%缓冲液A（50mM H₂O中的NH₄HCO₃）和25%缓冲液B（乙腈）洗脱样品。

¹H NMR(DMSO-d6):δ8.63(s,1H),7.90-8.07(m,1H)，7.81-7,89(m，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，2H)，7.07(brs，2H)，6.92(m，1H)，6.64(d，J＝8.0Hz,2H),4.48(d,J=5.2Hz,1H),4.23-4.27(m,1H),3.38-3.59(m,12H),3.16-3.24(m,4H),2.16-2.31(m,2H),1.94-2.18(m,1H),1.86-1.92(m,1H).¹³C NMR(DMSO-d6)δ174.7，174.6，172.3，166.5，154.5，151.2，149.0，148.9，129.5，129.3，128.4，122.0，121.8，111.7，70.3，70.2，70.1，70.0，69.7，69.5，53.0，50.5，46.4，32.5，31.1，27.5.HRMS(ESI)C₂₇H₃₆N₁₁O₈ ⁺[M+H]⁺计算值642.2743;实测值642.2735.

制备(1-(1-氟环辛-2-炔-1-基)-1-氧代-6,9,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯(22)：向在10mL小瓶中的1-氟环辛-2-炔羧酸甲酯20(通过M.K.Schultz,S.G.Parameswarappa和F.C.Pigge,Org.Lett.,2010,12,2398-2401的方法制备)(660mg,3.6mmol)和(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)-乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯21(1.65g,5.2mmol)的净混合物（neat mixture）中加入Et₃N(0.5mL)。在室温下将所得混合物搅拌24小时，然后通过快速色谱法用己烷:EtOAc(从4:1至2:3)纯化得到呈浅黄色油状物的Boc保护的环辛炔酰胺22(1.0g,60%)。

¹H NMR(DMSO-d6)δ7.03(brs,1H),4.99(brs,1H),3.53-3.66(m,10H),3.40-3.43(m,2H),3.22-3.24(m,2H),2.25-2.44(m,3H),1.85-2.08(m,3H),1.49-1.83(m,6H),1.26(s,9H).HRMS(ESI)C₂₄H₄₂FN₂O₆ ⁺[M+H]⁺计算值473.3021;实测值473.3029.

制备N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-1-氟环辛-2-炔基甲酰胺(23)：在-20℃下，向(1-(1-氟环辛-2-炔-1-基)-1-氧代-6,9,12-三氧杂-2-氮杂十五烷-15-基)氨基甲酸叔丁酯（22）(200mg,0.43mmol)的CH₂Cl₂(5mL)溶液中滴加TFA(5mL)。将所得混合物搅拌2小时，然后用DCM(20mL)稀释并真空干燥，加入另一份DCM（20mL）并且再次真空干燥以除去所有TFA。通过硅胶柱色谱，使用DCM:MeOH(50:1至10:1)纯化剩余物以得到呈浅黄色油状物的所需产物(150mg,96%).

¹H NMR(CDCl₃)δ1.34-1.41(m，1H)，1.55-1.63(m，1H)，1.71-1.93(m，7H)，1.96-2.05(m，1H)，2.19-2.36(m，4H)，3.09(m，2H)，3.31(q，2H，J＝6.0Hz)，3.47-3.53(m，4H)，3.56-3.62(m，8H);¹³C NMR(CDCl₃)δ20.6，25.7，26.6，28.8，29.0，33.9，37.8，39.3，46.5(d，J² _C-F＝36.0Hz)，69.6，69.7，69.9，69.9，70.0，70.3，87.3(d，J² _C-F＝31.0Hz)，94.4(d，J_C-F＝185.0Hz)，109.5(d，J³ _C-F＝11.0Hz)，168.8(d，J² _C-F＝24.0Hz).HRMS(ESI)C₁₉H₃₄FN₂O₄ ⁺[M+H]⁺计算值373.2497;实测值373.2501.

下列方案VI和实施例6提供了组装最终的叶酸受体缀合物的非限制性实例。

试剂和条件：(a)TEA,CH₂Cl₂;12小时，室温。

试剂和条件：(a)CH₂Cl₂,DMSO;12小时，室温。

实施例6

18-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰氨基)-1-(1-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲氧基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10,13,16-三氧杂-2-硫杂-6-氮杂十九烷-19-基)-4-氟-4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)-1,15–二氧代-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十九烷-19-羧酸(25)

制备N-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10,13,16-三氧杂-2-硫杂-6-氮杂十九烷-19-基)-1-氟环辛-2-炔酰胺(24)：向2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-[({3-[5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基]-4-甲氧基苯基}双{4-甲氧基苯基}甲基)硫代]丙酸酯（5）(50mg,70μmol)的CH₂Cl₂(0.5mL)溶液中加入溶解于CH₂Cl₂(0.5mL)的N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-1-氟环辛-2-炔基甲酰胺（23）(38mg,0.1mmol)，接着加入Et₃N(25μL,0.18mmol)。室温搅拌所得混合物12小时，然后用CH₂Cl₂(10mL)稀释，用盐水洗涤，Na₂SO₄干燥，真空浓缩。通过快速色谱（CH₂Cl₂/MeOH10:1）纯化剩余物得到浅黄色泡沫物55mg，收率81%。¹H NMR(CDCl₃)(CDCl₃)δ7.49(brs,1H),7.24-7.29(m,6H),7.16-7.20(m,4H),7.02(brs,1H),6.82(d,J=8.8Hz，1H)，6.71-6.76(m，2H)，6.22(brs，1H)，4.45(d，J＝6.4Hz，1H)，3.79(s，6H)，3.74(s，3H)，3.53-3.61(m，12H)，3.37(dd，J＝5.6，6.0Hz，2H)，3.31(dd，J＝5.6，6.0Hz，2H)，2.80(t,J=6.8Hz,2H),2.56(t,J=6.8Hz,2H),2.42(t,J=6.8Hz,2H),2.29-2.32(m,2H)2.12(t,J=7.2Hz,2H),1.85-2.05(m,4H),1.63-1.82(m,6H),1.28-1.49(m,2H);¹³C NMR(CDCl₃)δ171.6，170.9，158.4，158.1，138.4，137.4，132.2，132.1，132.0，131.9，130.5，129.1，128.6，128.5，128.4，127.6，127.5，127.2，113.6，113.2，111.8，109.8，109.2，109.1，95.4，93.5，92.8，87.3，78.3，70.5，70.4，70.3，70.1，69.9，64.9，55.8，55.2，46.5，46.3，43.5，38.1，３７.９，３５.9，３５.４，３３.９，２９.７，２８.９，２８.８，２８.７，２５.７，２０.６，２０.５.ＨRMS(ESI)C₅₆H₆₉FN₃O₉S⁺[M+H]⁺计算值978.4733;实测值，978.4745.

制备18-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰氨基)-1-(1-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲氧基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10,13,16-三氧杂-2-硫杂-6-氮杂十九烷-19-基)-4-氟-4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)-1,15–二氧代-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十九烷-19-羧酸(25)：向16-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-苯甲酰氨基)-1-叠氮基-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十七烷-17-羧酸（19）(17mg,0.17mmol)的DMSO(0.3mL)溶液中加入在CH₂Cl₂中的16-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-苯甲酰氨基)-1-叠氮基-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十七烷-17-羧酸（19）(11mg,0.17mmol)。反应混合物室温搅拌12小时，然后通过HPLC使用配有Zobax C18反相柱(21.2mm x25cm)的Shimadzu LC-10AT VP系统纯化。使用50%缓冲液A（H₂O中的100mM NH₄HCO₃）和50%缓冲液B（乙腈）洗脱（5mL/min）样品。¹H NMR(DMSO-d6)：８.63(s，1H)，8.40(brs，1H)，8.24(brs，1H)，7.92(brs，1H)，7.78-7.85(m，2H)，7.54-7.67(m，2H)，7.15-7.21(m，10H)，6.97(d，Ｊ＝8.4Hz，1H)，6.86(d，Ｊ＝8.4Hz，4H)，6.64(d,J=8.4Hz,2H),4.46(brs,2H),4.24-4.33(m,2H),4.05-4.09(m,2H),3.77(s,3H),3.72(s，6H)，3.42-3.47(m，20H)，3.16-3.28(m，4H)，3.01-3.06(m，3H)，2.89(brs，1H)，2.63(t，J＝6.8Hz，2H)，2.40(t，J＝6.8Hz，2H)，2.08-2.29(m，6H)，1.82-2.03(m，2H)，1.56-1.88(m，6H),1.35-1.51(m,2H);HRMS(ESI)C₈₃H₁₀₄FN₁₄O₁₇S⁺[M+H]⁺计算值1619.7403;实测值1619.7423.

方法

本文公开了检测特定表面抗原，尤其是与癌细胞相关的抗原的方法。癌细胞表面碳水化合物抗原是指示癌细胞存在的生物标记物。例如，唾液酸化的Lewis X抗原包含具有下式的多聚糖：

该多聚糖可见于许多癌细胞表面。不希望囿于理论，所公开的显像剂的一个类别对该多聚糖具有亲和性并且能够通过硼酸单元结合至一个或多个羟基或羰基单元。将所公开的显像剂与组织接触，然后通过MALDI-MS、MALDI-TOF或其它组织兼容性质谱分析该组织。

在又一个实施方案中，公开了检测癌细胞存在的方法，所述方法通过将细胞与所公开的能够和癌细胞的RGD受体结合的显像剂接触，并且使细胞进行MALDI-MS、MALDI-TOF或其它组织兼容性质谱而进行。

在又一个实施方案中，公开了检测癌细胞存在的方法，所述方法通过将细胞与所公开的能够和癌细胞的叶酸受体结合的显像剂接触，并且使细胞进行MALDI-MS、MALDI-TOF或其它组织兼容性质谱而进行。

本文公开了识别与癌细胞相关的表面抗原的方法，所述方法包括将包含细胞的样品与所公开的显像剂接触，然后加工样品以使得任何粘附至细胞上的显像剂均断裂，然后检测形成的稳定阳离子。

本文公开了经由癌细胞表面抗原识别癌细胞的以下方法，所述方法包括：

a)将组织样品与所公开的显像剂接触；

b)使所述组织样品经受质谱分析环境下的电磁辐射；和

c)检测由显像剂断裂形成的稳定碳正离子。

还公开了一种检测癌细胞存在的方法，所述方法包括：

a)将组织与一种或多种所公开的显像剂接触；

b)使所述组织经受MALDI质谱分析的条件；和

c)确定是否存在断裂自显像剂的稳定碳正离子。

配制人员可选择制备对一种或多种表面抗原具有不同程度的亲和性的显像剂。例如，配制人员可制备对包含相似结构的抗原具有“选择性亲和性”的显像剂，例如，能够结合至包含碳水化合物的抗原的显像剂，所述包含碳水化合物的抗原例如为唾液酸化的Lewis A：

然而，如果需要，配制人员可制备具有特异亲和性的显像剂，例如，会仅与包含特异性碳水化合物的抗原结合的显像剂，例如，仅与唾液酸化的Lewis X或唾液酸化的Lewis A结合的显像剂。因此，本文公开了一种用于确定具有包含特异性多聚糖或碳水化合物的抗原的细胞存在的方法。表面抗原的非限制性实例包括Globo H、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、Fucosyl GM₁（岩藻糖酰单唾液酸神经节苷酯GM₁）、Lewis yHapten。

步骤

将含有肾细胞癌的组织切片免疫染色（小鼠单克隆抗体，GenWayBiotech San Diego,CA），该切片的表达区域与肿瘤区域一致（图3的底部尖端深色染色区域；通过病理学分析确定）。

将邻近的组织切片（7μm）置于导电载玻片（conductive slide）上并且在4℃下在湿度箱中，用在100%甲醇中的实施例3的显像剂（2ng/μl）孵育过夜。将载玻片在PBS中洗涤5分钟，接着用水简要地冲洗以除去任何未粘附的物质。将载玻片置于干燥器中20分钟，然后通过利用200μm激光光栅宽度的反射模式的MALDI-TOP直接分析（不加入基质）。

图2示出了该组织样品的MALDI-IMS图像，其中含有肾癌的组织的区域由于存在稳定的碳正离子而显红色，所述稳定的碳正离子由仅与表达唾液酸化的Lewis X抗原的细胞结合的显像剂断裂形成。所述稳定的碳正离子用于该实施例，找出并确定了该样品的免疫学和病理学分析——MALDI指示的区域和与癌组织相关的区域相一致。

图4示出了暴露于实施例3的显像剂的肾细胞癌组织样品的MALDI-IMS。图5示出了用Sakura/UMFx醇染色的相同组织样品。图4中的肿瘤细胞以绿色点示出，其中显像剂粘附于细胞表面。这表明所公开的显像剂可用于探测由醇或福尔马林固定的组织制备的肿瘤组织微阵列。

如在图2和图3中所见，只有具有唾液酸化的Lewis X抗原表达的肿瘤区域与显像剂结合，如以红色像素强度示出（图2）。这些红色像素与图1中示出的谱的MALDI峰相关联，并且色彩强度与表达标尺中示出的峰的丰度相关。在不存在任何化学基质的情况下获得各个峰。如在图4和图5中所示，这些显像剂还能够与醇固定的肾组织结合。由此，本文提供了探测由醇或福尔马林固定的组织制备的肿瘤组织微阵列的方法。

虽然已经说明并描述了本公开的具体实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本公开的精神和范围下可进行各种改变和修饰。因此，所附的权利要求意欲涵盖本公开范围内的所有这些改变和修饰。

Claims (44)

1.具有下式的显像剂：

X为能够与肿瘤细胞表面的一个或多个结合位点结合的单元；

L为连接单元；并且

Z为能够形成稳定碳正离子的单元；

其中在L和Z之间的键能够被选择性的断裂。

2.权利要求1的显像剂，其具有下式：

Z具有下式：

其中，R¹、R²和R³是能够提供具有下式的稳定碳正离子的单元：

下标n至少为1。

3.权利要求2的显像剂，其中R¹和R²是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）。

4.权利要求2或3的显像剂，其中R³是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）并且其中R³还包含具有下式的锚定基团：

其中Q为具有下式的单元：

i)-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_tR⁹；

ii)-(CH₂)_rOC(O)(CH₂)_tR⁹；

iii)-(CH₂)_rC(O)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

iv)-(CH₂)_rNR⁸C(O)(CH₂)_tR⁹；

v)-(CH₂)_rNR⁸C(O)NH(CH₂)_tR⁹；和

vi)-(CH₂)_rNR⁸C(NR⁸)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

其中R⁸为氢或C₁-C₃直链烷基；下标r为0至4的整数且下标t为0至4的整数；R⁹为苯基或萘基。

5.权利要求1的显像剂，其中Z具有下式：

其中R¹⁰⁰、R¹⁰¹和R¹⁰²各自独立地为-OR¹⁰；R¹⁰为C₁-C₄烷基，下标c为1至100。

6.权利要求5的显像剂，其中Z具有下式：

7.权利要求2的显像剂，其中X具有下式：

其中W为亲和单元，其包含一个或多个硼酸单元且下标x为1至5。

8.权利要求7的显像剂，其中W具有下式：

Y为芳基核，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）；L¹为将W连接至X的连接基团；并且R为含有至少一个硼酸单元的单元；且下标m为1至5的整数。

9.权利要求8的显像剂，其中R具有下式：

其中下标k为1至5的整数；并且L²具有下式：

i)(CH₂)_pNR⁷(CH₂)_q；或

ii)(CH₂)_pO(CH₂)_q;

其中R⁷为氢或C₁-C₃直链烷基；下标p为0至5的整数；并且下标q为0至5的整数。

10.权利要求8的显像剂，其中R具有下式：

11.权利要求8至10任一项的显像剂，其中L¹具有下式：

-R⁴QR⁵-

R⁴和R⁵为含有1至10个碳原子的亚烷基单元；Q为具有式(D)_aC(E)(G)_b的单元，其中D和G各自独立地选自-O-、-NH-和-S-；E选自=O、=NH和=S；并且下标a和b各自独立地为0至10。

12.权利要求8至10任一项的显像剂，其中L¹选自：

i)-(CH₂)_yC(O)O(CH₂)_z-；

ii)-(CH₂)_yOC(O)(CH₂)_z-；

iii)-(CH₂)_yC(O)NR⁶(CH₂)_z-；

iv)-(CH₂)_yNR⁶C(O)(CH₂)_Z-；

v)-(CH₂)_yNR⁶C(O)NH(CH₂)_z-；和

vi)-(CH₂)_yNR⁶C(NR⁶)NR⁶(CH₂)_z-；

R⁶为氢或C₁-C₃直链烷基；下标y为0至4的整数并且下标z为0至4的整数。

13.权利要求1的显像剂，其中X具有选自以下的式：

14.权利要求13的显像剂，其中L单元具有下式：

-(J)_d(CH₂)_e(K)_f(CH₂)_g(L)_h(CH₂)_i(M)_j-

其中J、K、L和M各自独立地选自：

i)-(CH₂)_yyO(CH₂)_zz-；

ii)-(CH₂)_yyNH(CH₂)_zz-；

iii)-(CH₂)_yyS(CH₂)_zz-；

iv)-(CH₂)_yyC(O)(CH₂)_zz-

v)-(CH₂)_yyOC(O)(CH₂)_zz-；

vi)-(CH₂)_yyC(O)O(CH₂)_zz-；

vii)-(CH₂)_yyNHC(O)(CH₂)_zz-；

viii)-(CH₂)_yyC(O)NH(CH₂)_zz-；

ix)-(CH₂)_yyNHC(O)NH(CH₂)_zz-；

x)-(CH₂)_yyC(S)(CH₂)_zz-；

xi)-(CH₂)_yyNHC(S)(CH₂)_zz-

xii)-(CH₂)_yyC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiii)-(CH₂)_yyNHC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiv)C₃-C₁₀碳环；

xv)选自苯基和萘基的芳环；

xvi)包含1至4个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；和

xvii)包含1至4个杂原子的杂芳环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；以及

xviii)J、K、L和M各自为上述基团的任意结合；

下标d、f、h和j为0或1；下标e、g和i独立地为0至1的整数。

15.权利要求1的显像剂，其中L具有下式：

16.权利要求1的显像剂，其中连接剂选自：

17.具有下式的显像剂：

18.权利要求1的显像剂，其具有下式：

其中AA是天然存在的氨基酸或合成的氨基酸；

Z具有下式：

且

R¹、R²和R³是能够提供具有下式的稳定碳正离子的单元：

19.权利要求18的显像剂，其中R¹和R²是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）。

20.权利要求19的显像剂，其中R³是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）并且其中R³还包含具有下式的锚定基团：

其中Q为具有下式的单元：

i)-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_tR⁹；

ii)-(CH₂)_rOC(O)(CH₂)_tR⁹；

iii)-(CH₂)_rC(O)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

iv)-(CH₂)_rNR⁸C(O)(CH₂)_tR⁹；

v)-(CH₂)_rNR⁸C(O)NH(CH₂)_tR⁹；和

vi)-(CH₂)_rNR⁸C(NR⁸)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

其中R⁸为氢或C₁-C₃直链烷基；下标r为0至4的整数且下标t为0至4的整数；R⁹为苯基或萘基。

21.权利要求18至20任一项的显像剂，其中Z具有下式：

其中R¹⁰⁰、R¹⁰¹和R¹⁰²各自独立地为-OR¹⁰；R¹⁰为C₁-C₄烷基，下标c为1至100。

22.权利要求21的显像剂，其中Z具有下式：

23.权利要求18的显像剂，其中L单元具有下式：

-(J)_d(OCH₂CH₂)_e(K)_f(OCH₂CH₂)_g(L)_h(OCH₂CH₂)_i(M)_j-

其中J、K、L和M各自独立地选自以下的一种或多种：

i)-(CH₂)_yyO(CH₂)_zz-；

ii)-(CH₂)_yyNH(CH₂)_zz-；

iii)-(CH₂)_yyS(CH₂)_zz-；

iv)-(CH₂)_yyC(O)(CH₂)_zz-

v)-(CH₂)_yyOC(O)(CH₂)_zz-；

vi)-(CH₂)_yyC(O)O(CH₂)_zz-；

vii)-(CH₂)_yyNHC(O)(CH₂)_zz-；

viii)-(CH₂)_yyC(O)NH(CH₂)_zz-；

ix)-(CH₂)_yyNHC(O)NH(CH₂)_zz-；

x)-(CH₂)_yyC(S)(CH₂)_zz-；

xi)-(CH₂)_yyNHC(S)(CH₂)_zz-

xii)-(CH₂)_yyC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiii)-(CH₂)_yyNHC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiv)C₃-C₁₀碳环；

xv)选自苯基和萘基的芳环；

xvi)包含1至4个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；和

xvii)包含1至4个杂原子的杂芳环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；以及

xviii)J、K、L和M各自为上述基团的任意结合；

下标d、f、h和j为0或1；下标e、g和i独立地为0至1的整数。

24.权利要求18的显像剂，其中L具有下式：

25.权利要求18至24任一项的显像剂，其中连接剂选自：

26.权利要求18的显像剂，其具有下式：

27.显像剂2-((2S,5S,8S,11S)-5-苄基-8-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲氧基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5,14,23-三氧代-9,12,18,21–四氧杂-2-硫杂-6,15,24-三氮杂二十八烷-28-基)-11-(3-胍基丙基)-3,6,9,12,15-五氧代-1,4,7,10,13-五氮杂环十五烷-2-基)乙酸，其具有下式：

28.权利要求1的显像剂，其具有下式：

其中AA是天然存在的氨基酸或合成的氨基酸；

Z具有下式：

并且

R¹、R²和R³是能够提供具有下式的稳定碳正离子的单元：

29.权利要求28的显像剂，其中R¹和R²是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）。

30.权利要求29的显像剂，其中R³是取代的或未取代的芳基基团，其选自苯基（C₆）、萘基（C₁₀）、蒽基（C₁₄）、菲基（C₁₄）和并四苯基（C₁₈）并且其中R³还包含具有下式的锚定基团：

其中Q为具有下式的单元：

i)-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_tR⁹；

ii)-(CH₂)_rOC(O)(CH₂)_tR⁹；

iii)-(CH₂)_rC(O)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

iv)-(CH₂)_rNR⁸C(O)(CH₂)_tR⁹；

v)-(CH₂)_rNR⁸C(O)NH(CH₂)_tR⁹；和

vi)-(CH₂)_rNR⁸C(NR⁸)NR⁸(CH₂)_tR⁹；

其中R⁸为氢或C₁-C₃直链烷基；下标r为0至4的整数且下标t为0至4的整数；R⁹为苯基或萘基。

31.权利要求28至30任一项的显像剂，其中Z具有下式：

其中R¹⁰⁰、R¹⁰¹和R¹⁰²各自独立地为-OR¹⁰；R¹⁰为C₁-C₄烷基，下标c为1至100。

32.权利要求31的显像剂，其中Z具有下式：

33.权利要求18的显像剂，其中L单元具有下式：

-(J)_d(OCH₂CH₂)_e(K)_f(OCH₂CH₂)_g(L)_h(OCH₂CH₂)_i(M)_j-

其中J、K、L和M各自独立地选自以下的一种或多种：

i)-(CH₂)_yyO(CH₂)_zz-；

ii)-(CH₂)_yyNH(CH₂)_zz-；

iii)-(CH₂)_yyS(CH₂)_zz-；

iv)-(CH₂)_yyC(O)(CH₂)_zz-

v)-(CH₂)_yyOC(O)(CH₂)_zz-；

vi)-(CH₂)_yyC(O)O(CH₂)_zz-；

vii)-(CH₂)_yyNHC(O)(CH₂)_zz-；

viii)-(CH₂)_yyC(O)NH(CH₂)_zz-；

ix)-(CH₂)_yyNHC(O)NH(CH₂)_zz-；

x)-(CH₂)_yyC(S)(CH₂)_zz-；

xi)-(CH₂)_yyNHC(S)(CH₂)_zz-

xii)-(CH₂)_yyC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiii)-(CH₂)_yyNHC(S)NH(CH₂)_zz-；

xiv)C₃-C₁₀碳环；

xv)选自苯基和萘基的芳环；

xvi)包含1至4个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；和

xvii)包含1至4个杂原子的杂芳环，所述杂原子选自氮（N）、氧（O）和硫（S）；以及

xviii)J、K、L和M各自为上述基团的任意结合；

下标d、f、h和j为0或1；下标e、g和i独立地为0至1的整数。

34.权利要求28的显像剂，其中L具有下式：

35.显像剂18-(4-(((2-氨基-4-羟基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰氨基)-1-(1-(1-(3-(5-(苄基氨基)-5-氧代戊-1-炔-1-基)-4-甲氧基苯基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10,13,16-三氧杂-2-硫杂-6-氮杂十九烷-19-基)-4-氟-4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基)-1,15-二氧代-5,8,11-三氧杂-2,14-二氮杂十九烷-19-羧酸，其具有下式：

36.一种识别与癌细胞相关的表面抗原的方法，所述方法包括将包含细胞的样品与能够与癌细胞结合的显像剂接触，然后加工样品以使得粘附至所述细胞的任何显像剂均断裂，并且检测所形成的稳定阳离子。

37.一种经由癌细胞表面抗原识别癌细胞的方法，所述方法包括：

a)将组织样品与显像剂接触；

b)使所述组织样品经受质谱分析环境下的电磁辐射；和

c)检测由显像剂断裂形成的稳定碳正离子。

38.权利要求37的方法，其中所述显像剂能够与包含碳水化合物的抗原结合。

39.权利要求38的方法，其中所述组织与权利要求1至17任一项的显像剂接触。

40.权利要求37的方法，其中所述显像剂能够与抗原结合。

41.权利要求40的方法，其中所述组织与权利要求18至27任一项的显像剂接触。

42.权利要求37的方法，其中所述显像剂能够与叶酸受体结合。

43.权利要求42的方法，其中所述组织与权利要求28至36任一项的显像剂接触。

44.一种检测癌细胞存在的方法，所述方法包括：

a)将组织与一种或多种根据权利要求1、2、6、8、13、14、16-20、22、26-30、33、34和35的显像剂接触；

b)使所述组织处于MALDI质谱分析的条件；和

c)确定是否存在断裂自显像剂的稳定碳正离子。

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