JP2019528080A - 組織サンプルにおける癌細胞を検出するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、術野などの組織サンプルにおける癌細胞の容易で正確な同定のための方法に関する。特に、組成物および方法は、葉酸またはプテロイン酸標的化部分と任意にリンカーによって結合されるプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分を含む共役体を使用する。プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分は非蛍光性であるが、細胞内プロセスによって蛍光を発するようにすることができる。共役体は葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を検出するために使用され、これによってこれらの細胞におけるこれら共役体の差異的蓄積をもたらす。【選択図】図３

Description

関連案件の相互参照
本出願は、２０１６年８月２２日に出願された、米国仮出願第６２／３７８，１２８号の優先権利益を主張し、この出願はその全体が参考によって援用される。

発明の分野
本発明は組織サンプルにおける癌細胞の容易で正確な同定のための方法に関する。特に、本方法は葉酸受容体を過剰発現する癌細胞と結合して吸収される標的化剤を使用する。有利には、標的化剤はこのような癌細胞によって吸収されるまで蛍光を生じないプロ蛍光性フルオレセインをベースとする化合物と共役体化され、細胞内プロセスがプロ蛍光性フルオレセイン部分を蛍光部分に変換する。このようなプロ蛍光性フルオレセイン部分の使用は、組織サンプル中の芳香族アミノ酸、蛍光を示す体液などの多くの要因を含む組織サンプルによって生じるバックグランド蛍光を計算によって除去することを可能にする。従って、本明細書で説明される方法は、術野または組織サンプルにおける癌細胞の存在を決定する特異性レベルを提供し、これ以外では半視覚的蛍光の評価を含め、現在の技術によって得ることができない。

技術の説明
蛍光タグを標的化剤と共役体化させて、共役体が体内で移動する場所を特定することは一般的なことである。このように使用されるとき、微小量の蛍光の検出は、生じる強い蛍光シグナルを位置決めすることに比べて重要ではない。簡単に説明すると、強い蛍光シグナルは共役体の標的化剤によって指定されるその主要な標的ポイントの共役体を臨床医が追うことを可能にする。

癌の治療において、腫瘍切除後にこのような細胞と結合するように使用される共役体の蛍光マーカーによって、残存癌細胞の存在を判断する術野の評価は困難である。これはごくわずかな癌細胞集団によって生じる蛍光は一般的に検出できないためである。具体的には、術野には芳香族アミノ酸から他の生理学的成分までの範囲にわたって多くの蛍光発生物質が含まれる。このことおよび装置限界などの他の要因が、推定的な癌細胞を検出する手段として蛍光における肉眼による差以外で術者が評価することを妨げる。このことが今度は、腫瘍切除後に患者に存在し続ける残存癌細胞の容認できない量をもたらし、これによって再発のリスクを高める。

従って、バックグランドの蛍光と残存癌細胞から生じる蛍光を区別することができる、癌細胞を検出するための高度に特異的な方法を得ることが必要とされている。

本発明はバックグランド蛍光を考慮し、そしてこのようなバックグランド蛍光を全体の蛍光から区別して、残存癌細胞における蛍光フルオレセインをベースとする部分にのみ関与する蛍光を評価する方法を提供する。本方法では、従来は可能になっていないわずかな量でさえ、癌細胞の正確な評価ができる。

具体的には、本発明は任意にリンカーによって葉酸またはプテロイン酸標的化部分と結合されたプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分を含む共役体を使用する。プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分は非蛍光性であるが、細胞内プロセスによって蛍光性にすることができる。共役体が葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を検出するために使用され、これによってこれらの細胞におけるこれら共役体の示差的蓄積をもたらす。

細胞塊のバックグランド蛍光が、蛍光高解像度デジタル写真画像を得る塊への共役体組成物の適用前に評価され、以後「前画像」と呼ぶ。共役体組成物の細胞塊へのこの後の適用にはインキュベーションが続き、プロ蛍光部分の蛍光部分への変換を伴う標的化癌細胞への共役体吸収を可能にする。任意に、細胞塊を洗浄して過剰な非吸収共役体化組成物を取り除く。組織サンプルの後蛍光画像化が実施される。第二およびその後の画像は以後「後画像」と呼ぶ。そして前画像と後画像の間の画像差をハイライト化し、第三画像、つまり「識別画像」として保存し、標的化癌細胞内のその時点の蛍光共役体から生じる蛍光を同定する。

一つの実施形態では、術野におけるマーカーが提供され、前蛍光画像を後蛍光画像と正確に整列させることができ、これによって後画像に対する前画像の正確な識別が可能になる。このような識別は第三画像を生じるために使用され、標的化癌細胞によって生じる蛍光をハイライト化する。これは後蛍光画像の蛍光から前蛍光画像のバックグランド蛍光の識別を可能にし、これによって共役体のフルオレセインベース部分のみに起因する蛍光の真の読み取りをもたらす。

一つの実施形態では、葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法が提供され、本方法は、
ａ）バックグランド蛍光と関連する蛍光部分を同定し、
ｂ）組織サンプルにおける全蛍光を測定し、ここでプロ蛍光部分は当該細胞におけるプロ蛍光部分の蛍光部分への変換を伴う吸収によるこれらの蛍光方式におけるものであり、
ｃ）バックグランド蛍光を考慮して全蛍光を調整して差異蛍光を得、
ｄ）差異蛍光を癌細胞に帰することを含む。

別の実施形態では、葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法が提供され、本方法は、
ａ）当該サンプルのバックグランド蛍光を評価して前蛍光画像を得、
ｂ）標的化部分を含む１種類以上の共役体を選択し、ここで当該共役体はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分と任意にリンカーによって共有結合される葉酸またはプテロイン酸標的化部分を含み、
ｃ）当該共役体の効果的な量を、当該癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルに適用し、
ｄ）当該組織サンプルと当該適用される共役体を十分な時間インキュベーションして、共役体をプロ蛍光部分の蛍光を発することができる部分への変換を伴う当該癌細胞と結合させて吸収させ、
ｅ）インキュベーションした組織サンプルの蛍光を評価して後蛍光画像を得、
ｆ）前蛍光画像を後蛍光画像から識別して、現在の蛍光フルオレセインをベースとする部分から蛍光を生じる癌細胞に帰することができる差異蛍光マップを得、
ｇ）当該差異蛍光マップを癌細胞の存在に帰することを含む。

一つの実施形態では、前および後蛍光画像が電子的に保存され、差異蛍光マップの作製が適切なソフトウェアを用いて実施される。このようなソフトウェアは好ましくはピクセル単位で評価し、前蛍光画像を後蛍光画像から識別して残存癌細胞に帰される差異蛍光のマップを得る。

別の実施形態では、術野の前および後画像がそこに配置される１つ以上のマーカーとともに生じる。これは前および後画像を、正確な識別を可能にする方法で配列させる。好ましくは、マーカー数は２〜１０の範囲である。いくつかの実施形態では、蛍光は異なる角度で複数画像に測定され、術者は術野などの組織サンプルで一般的である不均一な表面を評価できる。

フルオレセインが注入されている寒天組成物の粒子によって生じた蛍光を示す写真である。 図１の写真をピクセル単位ベースで非蛍光バックグランドの写真と比較することによって得られる差異蛍光を示す写真である。 本開示の蛍光共役体化合物と共にインキュベーションした後にＭＣＦ７細胞によって生じた蛍光を示す写真である。

本発明の詳細説明
本発明は組織サンプルにおける癌細胞の容易で正確な同定のための方法を提供する。

本発明をさらに詳細に考察する前に、次の用語が定められる。

本明細書で使用されるとき、他に指示がない限り、次の定義が適用される。さらに、本明細書で使用されるいずれかの用語またはシンボルが下記で定められない場合、従来技術におけるその通常の意味を有する。

本明細書および添付請求項で使用されるとき、構成要素を説明する文脈における（特に以下の請求項の文脈における）「一つ（ａおよびａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの単数冠詞および同様な指示対象は、本明細書において他に指示がない、または文脈によって明らかに矛盾しない場合、単数および複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に他に指示がない限り、範囲内にあるそれぞれ異なる値を個別的に言及する簡略法として扱うことが単に意図され、それぞれ異なる値はそれが個別的に列挙されているように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されるすべての方法は、他に指示がない、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意に適切な順序で実施され得る。本明細書で示される任意またはすべての例、あるいは例示的な語法（例えば、「など」）の使用は、単に実施形態をより理解し易くすることが意図され、明言されない限り、請求項の範囲に制限を与えない。本明細書における語法は、いずれかの非請求構成要素を必須なものとして示すと解釈されるべきでない。

本明細書で使用されるとき、「約」は従来技術の当業者によって理解されており、それが使用される文脈に応じていくつかの範囲に変動する。従来技術の当業者に明白ではない用語の使用があり、それが使用される文脈がある場合、「約」は特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。

「後画像」または「後蛍光画像」は、共役体がプロ蛍光状態から蛍光状態に変換されている後に本共役体を含む、または接触される蛍光組織サンプルの高解像度デジタルカメラ写真を指す。画像は電子形式で保存され、一般的なコンピュータまたはＴＶディスプレイで表示され得る。

「前画像」または「前蛍光画像」は、バックグランド蛍光を測定するために得られた組織サンプルの高解像度デジタルカメラ写真を指す。画像は電子形式で保存され、一般的なコンピュータまたはＴＶディスプレイで表示され得る。

「識別画像」または「差異画像」は、前および後画像を比較して、異なる色値を有するピクセルまたはセルを同定およびハイライト化するソフトウェアによって作製される高解像度デジタル画像を指す。このため、識別画像は癌細胞と関連する組織サンプルの部分をハイライト化する。識別画像は電子形式で保存され、一般的なコンピュータまたはＴＶディスプレイで表示され得る。

「アルキル」は、４〜３０個の炭素原子、好ましくは５〜２０個の炭素原子を有する一価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指し、任意にビニル（二重結合）またはアセチレン（三重結合）不飽和の１〜３部位を含み得る。本用語は、例として、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、シクロペンチル、オクチル、ステアリル、オレイルなどのＣ_４〜Ｃ_３０の直鎖および分枝ヒドロカルビル基を含む。Ｃ_ｘアルキルはｘ個の炭素原子を有するアルキルを指す。

「アルキレン」は二価アルキル基を指す。

「置換アルキル」は、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ハロ、フェニル、置換フェニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヒドロキシ、複素環、置換複素環、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヒドロキシ、およびニトロからなる群から選択される１〜５個、好ましくは１〜３個、またはより好ましくは１〜２個の置換基を有するアルキル基を指し、ここで当該置換基は本明細書で定められる。一つの実施形態では、好ましい置換アルキル基はＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３である。

「置換アルキレン」は二価置換アルキル基を指す。

「アルコキシ」は、基−Ｏ−アルキルを指し、ここでアルキルは本明細書で定められる。アルコキシは、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｎ−ペントキシを含む。

「置換アルコキシ」は基−Ｏ−（置換アルキル）を指す。

「アシル」は、基アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、フェニル−Ｃ（Ｏ）−、置換フェニル−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、複素環−Ｃ（Ｏ）−、および置換複素環−Ｃ（Ｏ）−、イソシアネート、イソチオシアネートを指す。

「アシルオキシ」は、基−Ｏ−アシルを指し、ここでアシルは本明細書で定められる。

「アシルアミノ」は、基−アシル−アミノおよび−アシル−置換アミノを指す。

「アミノ」は基−ＮＨ_２を指す。

「置換アミノ」は、基−ＮＲ^１Ｒ^２を指し、ここでＲ^１およびＲ^２は独立して水素、アルキル、置換アルキル、フェニル、置換フェニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環からなる群から選択され、ここでＲ^１およびＲ^２はこれらと結合される窒素と共に任意に結合されて複素環または置換複素環基を形成し、Ｒ^１およびＲ^２はともに水素ではない。

「フェニル」は単環を有する６個の炭素を有する一価芳香族炭素環基を指す。

「置換フェニル」は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、およびニトロからなる群から選択される１〜５個、好ましくは１〜３個、またはより好ましくは１〜２個の置換基によって置換されるフェニル基を指す。

「カルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−に相当する二価基−Ｃ（Ｏ）−を指す。

「カルボキシ」または「カルボキシル」は、−ＣＯＯＨまたはこの塩を指す。

「カルボキシルエステル」／「カルボキシエステル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−フェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換フェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環を指す。

「共役体」は、葉酸またはプテロイン酸と任意にリンカーによって共有結合された蛍光またはプロ蛍光分子を指す。

「シクロアルキル」は、融合、架橋、およびスピロ環式を含む単環または多環を有する３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。融合環は、非アリール部分が分子の残余と結合されるアリール環であり得る。適切なシクロアルキル基の例には、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロオクチルが含まれる。

「シクロアルケニル」は、単環または多環を有する３〜１０個の炭素原子の非芳香族環状アルキル基を指し、ここでこのような付加環はフェニル、置換フェニル、シクロアルキルなどであり得、結合点はシクロアルケニル環によるものである。このようなシクロアルケニル基は、少なくとも１つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和、好ましくは＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和の１〜２部位を有し、任意に酸素原子によって置換される１〜２個の炭素原子を有する。

「置換シクロアルキル」および「置換シクロアルケニル」は、オキソ、チオキソ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アジド、イソシアネート、イソチオシアネート、フェニル、置換フェニル、カルボキシ、カルボキシエステル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環（マレイミドを含む）、およびニトロからなる群から選択される１〜５個、または好ましくは１〜３個の置換基を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル基を指す。置換シクロアルケニルの一つの例には、

を含む。

「ハロ」または「ハロゲン」は、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。

「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は基−ＯＨを指す。

「ヘテロアリール」は、１〜１０個の炭素原子、および酸素、イオウ、−ＳＯ−、−ＳＯ_２−、窒素、＞ＮＲ^３でＲ^３は水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロアリール基を指す。

「置換ヘテロアリール」は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、およびニトロからなる群から選択される１〜５個、好ましくは１〜３個、またはより好ましくは１〜２個の置換基によって置換されるヘテロアリール基を指す。

「複素環」または「複素環式」または「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」は、１〜１０個の環炭素原子、および窒素、イオウ、または酸素からなる群から選択される１〜４個の環ヘテロ原子を有する飽和基を指す。複素環は、単環、または融合、架橋、およびスピロ環系を含む多縮合環を包含する。

「置換複素環」は、オキソ、チオキソ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アジド、フェニル、置換フェニル、カルボキシ、カルボキシエステル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、およびニトロからなる群から選択される１〜５個、または好ましくは１〜３個の置換基によって置換された複素環基を指す。

「マーカー」は、蛍光画像における特定座標を特定する成分を意味する。成分は、蛍光画像でマーカーとして自己同定する任意の物質であり得、強い蛍光物質、金属、蛍光クエンチャーが加えられた地点で画像が蛍光の欠如を示す蛍光クエンチャーが含まれる。

「ニトロ」は、基−ＮＯ_２を指す。

「オキソ」は、原子（＝Ｏ）または（−Ｏ^-）を指す。

「バックグランド蛍光」は、例えば、継続的な蛍光を発すると評価されている標的化剤または組織／細胞の他の成分によって生じ、これと関連する蛍光アミノ酸が含まれる。このような他の成分は、標的化剤に結合される蛍光部分がマスク化（プロ蛍光）または非マスク化（蛍光）されているかどうかに関わらず蛍光を発し、そのためバックグランド蛍光と考えられる。

「プロ蛍光部分」は、非蛍光状態にあるように可逆的に修飾されて、標的化部分と共有結合され得るフルオレセインをベースとする蛍光分子を指す。前述のように、細胞内状態は非蛍光状態を蛍光状態に逆転することができる。

用語「フルオレセインをベースとする蛍光分子」は、

のコア構造を含み、ここで、Ｒはシクロアルケニル、置換シクロアルケニル、フェニル、置換フェニルなどである。適切なフルオレセインをベースとする蛍光分子の例には下記を含む。

これらの化合物は互変異性体であり、非蛍光互変異性体は２つのフェノールアルコール基のエステル化によってその互変異性体型に固定され得る。これらのエステルの一方または両方の除去は、蛍光互変異性体型を再出現させて蛍光シグナルをもたらすことを可能にする。

プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分の非限定的な例には、式：

のフルオレセイン化合物を含み、ここで各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合または酸素、炭素（例えば、メチレン単位、メチルなど）、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基である。適切なＸ基は、好ましくはヒドロキシル、アミノ、置換アミノ、チオールなどである。

化合物の立体異性体（光学異性体としても知られる）には、具体的な立体化学が明確に示されない限り、構造のすべてのキラル、ｄ、ｌ立体異性型、およびラセミ型が含まれる。このため、本発明で使用される化合物には、描写から明らかであるいずれかまたはすべての非対称原子で豊富化または分割された光学異性体を含む。ラセミおよびジアステレオマーの両混合物、ならびに個別の光学異性体は、これらのエナンチオマーまたはジアステレオマーのパートナーをほとんど含まないように分離または合成され得、これらの立体異性体はすべて本発明の範囲内である。

本発明の化合物は、溶媒和物、特に水和物として存在し得る。水和物は化合物または化合物を含む組成物の製造の際に生成し得、あるいは水和物は化合物の吸湿的性質によって時間にともない生成し得る。本発明の化合物は、その上、有機溶媒和物として存在し得、他の中にあってＤＭＦ、エーテル、およびアルコール溶媒和物を含む。いずれかの特定の溶媒和物の同定および調製は、合成有機化学または医薬品化学の従来技術の当業者の技術内である。

「被験体」は哺乳動物を指す。哺乳動物はヒトまたは非ヒト動物の哺乳生物であり得る。

「互変異性体」は陽子の位置の異なる化合物の代替え型を指し、エノール−ケトおよびイミン−エナミン互変異性体、またはピラゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、トリアゾール、およびテトラゾールなどの環−ＮＨ−部および環＝Ｎ−部の両方と結合される環原子を含むヘテロアリール基の互変異性体型などが挙げられる。

他に指示がない限り、本明細書で明確に定められない置換基の命名は、結合点に向けて近接する官能性を伴う官能性の末端部分を名付けることによって達せられる。例えば、置換基「アルコキシカルボニルアルキル」は基（アルコキシ）−Ｃ（Ｏ）−（アルキル）−を指す。同様に、「アルキレンフェニレン」は、基（アルキレン）−（フェニレン）を指し、基「フェニレンアルキレン」は基（フェニレン）−（アルキレン）−を指す。

デジタル画像または写真は、赤、緑、青ピクセルまたはこれらの組み合わせを含み得、ピクセルまたはピクセルの組み合わせは当該デジタル画像または写真で全色スペクトルを構成することができる。いくつかの実施形態では、当該デジタル画像は高精細画像であることができる。このため、デジタル画像の文脈では、用語「赤ピクセル」、「緑ピクセル」、および「青ピクセル」は、デジタル画像または写真で示すことが可能である全色スペクトルを構成するために使用される三原色ピクセルのそれぞれ１つを指す。

「デジタル画像」または「デジタル写真」は本明細書で使用されるとき、スクリーンなどの表示デバイスに示され得るデジタル情報のコレクションを指す。いくつかの実施形態では、デジタル画像または写真は手術環境におけるスクリーンで示される。

本明細書で使用されるとき、デジタル画像を評価または分析する文脈における用語「ピクセル単位」は、ｉ）画像中の個別ピクセルが１つずつ分析される実施形態、およびｉｉ）画像中のピクセルの個別群が１つずつ分析される実施形態、を包含する。いくつかの実施形態では、ピクセルまたはピクセル群が集合して全体画像を構成する。他の実施形態では、ピクセルまたはピクセル群が集合して画像の一部を構成する。

上記で定められるすべての置換基では、これら自体に対するさらなる置換基でこれらの置換基を定めることによって達せられるポリマー（例えば、置換アリール基によってそれ自体が置換されている置換基として置換アリール基を有する置換アリールなど）は、本明細書における包含が意図されないと理解される。このような場合、このような置換基の最大数は３つである。すなわち、上記定義のそれぞれは、例えば、置換アリール基は−置換アリール−（置換アリール）−置換アリールに限定されるという制限によって制約される。

上記定義は容認できない置換パターン（例えば、５個のフルオロ基で置換されたメチル）を含むことは意図されていないと理解される。このような容認できない置換パターンは従来技術の当業者によって良く知られている。

本発明の方法における使用のための共役体
本発明の方法で使用される化合物は、容易に入手可能な出発物質から次の一般的な方法および手順を用いて調製することができる。典型的または好ましい処理条件（すなわち、反応温度、回数、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が示されるが、他の処理条件も他に明言されない限り使用され得ると認識される。最適の反応条件は使用される特定の反応物または溶媒によって変動し得るが、このような条件は定型的な最適化手順によって従来技術の当業者によって決定され得る。

さらに、従来技術の当業者に明らかなように、標準的な保護基が、特定の官能基を所望しない反応の遂行から防止するために必要であり得る。様々な官能基のための適切な保護基、ならびに特定の官能基を保護および脱保護するための適切な条件は従来技術で良く知られている。例えば、多くの保護基がＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（有機合成における保護基），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９，で報告されており、本明細書に参考で引用される。

本発明の化合物が１つ以上のキラル中心を含む場合、このような化合物は純粋な立体異性体、すなわち、個別エナンチオマーまたはｄ（ｌ）ステレオマー、あるいは立体異性体豊富化混合物として調製または分離され得る。このようなすべての立体異性体（および豊富化混合物）は、他に指示がない限り、本発明の範囲内に含まれる。純粋な立体異性体（または豊富化混合物）は、例えば、光学的に活性な出発物質または従来技術で良く知られている立体選択的試薬を用いて調製され得る。あるいは、このような化合物のラセミ混合物は、例えば、キラルカラムクロマトグラフィー、キラル分割剤などを用いて分離され得る。

次の反応用の出発物質は一般的に知られている化合物であり、あるいは知られている手順またはこれらの明らかな変更によって調製され得る。例えば、出発物質の多くはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミルウォーキー，ウィスコンシン州，米国）、Ｂａｃｈｅｍ（トーランス，カリフォルニア州，米国）、Ｅｍｋａ−ＣｈｅｍｃｅまたはＳｉｇｍａ（セントルイス，ミズーリ州，米国）などの商業的供給業者から入手可能である。他は、Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ ＦｉｅｓｅｒのＲｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（有機合成に関する試薬），Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１５（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）、ＲｏｄｄのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（炭素化合物の化学），Ｖｏｌｕｍｅｓ １−５，およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（有機反応），Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４０ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）、ＭａｒｃｈのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（最新有機化学），（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ Ｓｏｎｓ，５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、ならびにＬａｒｏｃｋのＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（広範な有機変換）（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９）などの標準的参考テキストで報告されている手順またはこれらの明白な変更によって調製され得る。

本発明は、プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分との任意にリンカーを介した葉酸またはプテロイン酸共役体を用いて、癌細胞を検出する方法に関する。プテロイン酸（グルタミン酸残基を有さない葉酸）は多くの異なる癌細胞における葉酸受容体によって認識されることが理解されている。

いくつかの実施形態では、プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分は、下記に示す式の化合物を葉酸またはプテロイン酸と結合することによって誘導され、

ここで、ｐは０または１であり、各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基であり、Ｗはアルキレン−Ｘまたは置換アルキレン−Ｘであり、Ｙは結合、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^１０であり、ここでＲ^１０は水素または１〜６個の炭素原子のアルキルであり、Ｚは酸素またはイオウである。一つの実施形態では、Ｘはアミノ、置換アミノ、ヒドロキシル、チオールなどである。

このような化合物は次のように番号が付けられる。

プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分のための出発物質は、１種類以上の５−アミノフルオレセイン、５−イソチオシアネートフルオレセイン、５−ヨードアセチルアミノフルオレセインなど（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州，米国から市販されている）の反応によって容易に調製される。あるいは、後述の反応は同様にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている６−置換フルオレセイン化合物を使用することができる。

本出願の方法に有用な共役体には下記を含み、

ここで、Ｌ’は結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、
Ｘ’はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分であり、
Ｙ’は−Ｏ−または＞ＮＲ^１１であり、ここでＲ^１１は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環であり、
Ｒ^１２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、
あるいはこれらの塩、互変異性体、および／または溶媒和物である。

いくつかの実施形態では、Ｌ’は式−ＨＮ−Ｒ−ＮＨ−のリンカーであり、ここでＲは−（オキシアルキレン）_ｎ−でｎは１〜１０、アルキレン、アリールアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、ヘテロシクロアルキレン、アルキレンフェニレン、フェニレンアルキレン、およびシクロアルキレンからなる群から選択され、それぞれは任意にアルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アシル、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、およびチオールからなる群から選択される１〜５個の置換基によって置換される。

葉酸共役体に関するいくつかの実施形態では、これらの化合物は、Ｇｕａｒａｇｎａ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，２３：８４−９６、特に８８ページによって記載され、スキーム２で後述されるように、従来技術で良く知られている方法を用いて葉酸を無水葉酸に最初に変換することによって調製される。具体的には、葉酸である化合物３をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）とピリジン（５：１）の溶媒混合物中でＤＣＣと混合する。反応を約３０℃のわずかに高めた温度で実施するが、反応は約０〜約６０℃で進行され得る。反応をほとんど終了まで継続し、生成物である無水葉酸−化合物４がクロマトグラフィー、蒸留、沈殿、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な方法によって回収され得る。あるいは、生成物は精製および／または分離なしで次のステップで使用され得る。

無水葉酸である化合物４は、次に開環されてアミドリンカー部分である化合物５を下記スキーム３に示すように形成する。

具体的には、市販の４−アミノメチル−Ｎ−Ｂｏｃ−アニリンを無水葉酸である化合物４と、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とともに、Ｇｕａｒａｇｎａ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，２３：８４−９６によっても示される条件下で混合し、化合物５を得る。Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）保護基の除去を、トリフルオロ酢酸を用いた標準的な方法を介して進め、遊離アミノ基（化合物６−スキーム４）を得る。反応をほとんど終了するまで継続し、生成物である化合物４をクロマトグラフィー、蒸留、沈殿、ＨＰＬＣなどの標準的な手段によって回収し得る。あるいは、生成物は精製および／または分離なしで次のステップで使用される。

スキーム３では、メタノールなどのＣ_１〜Ｃ_４アルコールの任意の包含が相当するエステル（Ｒ^１２＝Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル）をもたらす。

化合物６を次に化合物２と結合させて下記スキーム４に示されるように化合物（共役体）７を形成し、

ここでＲは上記の通りである。

具体的には、化合物２および化合物６を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの適切な不活性非プロトン性溶媒中で混合する。反応を一般的には約０〜約５０℃で、反応がほとんど終了するのに十分な時間、好ましくは１〜２４時間実施する。反応終了は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってモニタリングし得、生成物はクロマトグラフィー、沈殿、結晶化、ＨＰＬＣなどの標準的な方法によって回収し得る。

プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分は、プロ蛍光性フルオレセインの反応性型の反応によって誘導される。一つの実施形態では、このような化合物は下記スキーム５に示されるフルオレセイン化合物のヒドロキシル基からアシルまたはカルバミル基の形成によって得られ、

ここでＲは上記の通りであり、ｐは０または１である。

スキーム５では、市販の５−アミノまたは５−イソチオシアネートフルオレセインは、３’、６’位でアシルまたはカルバミル基の標準的な形成によって、相当するプロ蛍光構造に容易に変換される。そして得られる化合物が上記反応における化合物２として使用される。

上記反応スキームでは、フルオレセインをベースとする化合物は非フルオレセインをベースとする化合物によって置き換えられ得、このような化合物はマスキング基によって有意に低下または消失されるこれらの蛍光を有することができる。

なおさらに、葉酸のフルオレセインとの結合は、下記に示すようにフェノールアルコールの１つからエーテル結合の形成によって達成され得、

ここでＲおよびＲ^１２は上記で定められる通りであり、Ｌ^２は−Ｌ’−Ｏ−であり、ここでＬ’は上記で定められる通りである。

具体的には、上記反応において、無水葉酸（前述）をフルオレセインモノエステルと混合し、ここで残存ヒドロキシル基が従来技術を用いたリンカーを介して保持または伸長される。一つの実施形態では、リンカーは１〜２０単位のポリオキシアルキレン鎖であり、一つの実施形態では、この鎖は左から右に（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｌとして表され得、ここでｌは１〜２０の整数である。このようなポリオキシアルキレン鎖または他のリンカーの導入は従来技術で良く知られている。エステルの形成もまた従来技術で良く知られており、前述されているが、エステル形成前のナトリウムフェノキシド誘導体の形成は反応を促進する。αカルボキシル基のエステルへの転化も良く知られている化学を介して進められる。さらに、葉酸の代わりとしてこの反応におけるプテロイン酸の使用も前述のように進められる。

あるいは、プテロイン酸は上記反応で葉酸に代えて使用され得る。反応条件はほとんど同一であり、生成物はほとんど同一方法で回収される。プテロイン酸のカルボキシル基は、葉酸のγカルボキシル基と同様に反応することに留意する。

請求される方法で有用な化合物の例には下記を含む。

方法
本発明は、腫瘍切除後の手術部位または皮膚科専門医が基底細胞癌と関連する皮膚の層を除去する後に残存する表面などの組織サンプルにおける癌細胞を検出するための方法を提供する。一つの実施形態では、本発明は癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法を提供し、本方法は、
ａ）バックグランド蛍光と関連する蛍光部分を同定し、
ｂ）組織サンプルにおける全蛍光を測定し、ここでプロ蛍光部分は当該癌細胞におけるプロ蛍光部分の蛍光部分への変換を伴う吸収によるこれらの蛍光方式におけるものであり、
ｃ）バックグランド蛍光を考慮して全蛍光を調整して調整した蛍光を得、
ｄ）調整した蛍光を癌細胞に帰することを含む。

ａ）では、臨床医はアミノ酸であるチロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンなどの自然発生蛍光部分によるバックグランド蛍光を同定する。このようなバックグランド蛍光は、一般的に様々な理由のため取り除くことができない。従って、例えばプロ蛍光部分の使用が用いられなかった。第二に、多くのプロトコルは、標的化剤と結合される蛍光部分の全身送達を使用した。いくつかの例では、これは非関連蛍光をもたらす標的外結合を生じる。本発明では、プロ蛍光部分はバックグランド蛍光ならびに標的外結合を回避し、このような部分は細胞に吸収されるときのみ蛍光を発する。

ｂ）では、細胞内プロ蛍光部分は蛍光部分に変換されており、蛍光後画像が組織サンプルについて得られる。

ｃ）では、前蛍光画像を後蛍光画像と比較して、現時点では蛍光状態にあるそれまでのプロ蛍光性部分によって生じる蛍光のみに起因する蛍光を差異化してハイライト化する。

ｄ）では、ハイライト化蛍光の存在または不存在が、組織サンプルにおける癌細胞の存在または不存在と相互に関連する。

別の実施形態では、葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法が提供され、本方法は、
ａ）当該サンプルのバックグランド蛍光を評価して前蛍光画像を得、
ｂ）標的化部分を含む１種類以上の共役体を選択し、ここで当該共役体はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分と任意にリンカーによって共有結合される葉酸またはプテロイン酸標的化部分を含み、
ｃ）当該共役体の効果的な量を、当該癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルに適用し、
ｄ）当該組織サンプルと当該適用される共役体を十分な時間インキュベーションして、共役体をプロ蛍光部分の蛍光を発することができる部分への変換を伴う当該癌細胞と結合させて吸収させ、
ｅ）インキュベーションした組織サンプルの蛍光を評価して後蛍光画像を得、
ｆ）前蛍光画像を後蛍光画像から識別して、現在の蛍光フルオレセインをベースとする部分から蛍光を生じる癌細胞に帰することができる差異蛍光マップを得、
ｇ）当該差異蛍光マップを癌細胞の存在に帰することを含む。

別の実施形態では、癌細胞、正常細胞、および任意に死滅細胞を含むことが疑われる細胞集団において癌細胞を同定するための方法が提供され、当該方法は、
ａ）当該細胞集団に共役体を含む組成物の効果的な量を加え、ここで当該共役体はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分と任意にリンカーによって共有結合される葉酸またはプテロイン酸標的化部分を含み、
ｂ）当該組成物を十分な時間インキュベーションして、当該共役体を当該プロ蛍光部分の蛍光部分への細胞内変換を伴う当該細胞上の葉酸受容体と結合させ、
ｃ）フルオレセインによる当該細胞集団内おける蛍光発光を開始し、
ｄ）フルオレセイン蛍光と関連するピクセルの強度をピクセル単位ベースで評価し、
ｅ）バックグランドまたは本質的に非癌性として第一所定閾値未満を有する当該ピクセルを判別し、
ｆ）死滅細胞から生じる第二所定閾値を超えるピクセルを判別し、
ｇ）ｅ）およびｆ）において判別されたピクセルをマーカーピクセルに変化させ、
ｈ）判別されていないフルオレセイン蛍光と関連するピクセルからなる変化させた画像を作製し、
ｉ）非判別ピクセルを癌細胞に選定することを含む。

一つの実施形態では、前および後蛍光画像が電子的に保存され、差異蛍光マップの作製が適切なソフトウェアを用いて実施される。このようなソフトウェアは好ましくはピクセルごとに評価し、前蛍光画像を後蛍光画像から識別して残存癌細胞に帰される差異蛍光のマップをもたらす。

別の実施形態では、前および後画像は術野表面で１つ以上のマーカーとともに得られる。これは前および後画像を、正確な識別を可能にする方法で配列させる。好ましくは、マーカー数は２〜１０の範囲である。いくつかの実施形態では、蛍光は異なる角度で複数画像に測定され、術者は術野などの組織サンプルで一般的である不均一な表面を評価できる。

キット
本発明の方法は、例として無菌等張生理食塩水、無菌リン酸緩衝化生理食塩水、および従来技術で良く知られている他の無菌溶液を含む噴霧可能な水溶液を含む組成物を一般的に使用する。

共役体が好ましくは固体剤形で配達され得るとき、本発明は共役体の固体剤形、異なる容器における適切な水性希釈剤、および得られる組成物を組織表面に適用するためのデバイスを含むパーツのキットも提供する。一つの実施形態では、デバイスは調整可能または固定されたスプレイ構成要素を提供するスプレーデバイスであり得る。別の実施形態では、デバイスは液体組成物を組織サンプルの表面に移す他の表面アプリケータのスポンジを含む。別の実施形態では、水溶液は組成物が術野に適用されている場所を明確に定める着色剤を含む。これによって、術者は評価すべき全表面への組成物の適切な適用を確証することができる。

デバイス
一つの実施形態では、本発明の方法を実施するためのデバイスが提供される。これらのデバイスは、ＵＶまたはＮＩＲ光源、蛍光を検出するためのＵＶまたはＮＩＲ検出器、蛍光画像を処理して保存するためのコンピュータ、およびコンピュータモニターまたはＴＶスクリーンなどのディスプレイデバイスを含む。

光源は術野に再現可能な高さ、ならびに再現可能な強度および波長出力で配置され、各蛍光画像は他の画像と相互に関連する。例えば、光強度は光源からの距離の二乗で低下し、そのため、光源から２フィートの距離の光の強度は光源から１フィートで認められる強度の４分の１である。従って、光源が一貫して術野から同一距離であることを確実にする必要がある。

患者が呼吸している、さもなければ動き得ることを考え、術野から光源までの距離が同一であることを確実にする一例は、術野の特定マーカーまでを正確に計測するためにレーザーを使用することである。光源はレーザー測定がマーカーからの距離が他の画像と同一であることを確証するまで光を放出しないようにプログラムされる。レーザー「巻尺」は従来技術で良く知られている。

同様に、検出器は各画像において患者から同一距離であるべきである。これは光源と検出器を同一デバイスに組み込むことによって確実にされ得る。

一つの実施形態では、光源および検出器は手術室ベッドから固定された距離でスイングアームに装着される。光源と検出器はスイングアームにおいて垂直方向で側面装着され、これによって患者までの垂直距離が測定されて調整され得る。調整されると、蛍光画像化が実施され得る。

術野からのＵＶ光源反射が蛍光画像と干渉することを避けるために、光源にフィルターが使用され得る。例えば、フルオレセインによって生じる蛍光は部分的にその励起波長と重なり、反射した励起光が蛍光として誤って解釈され得ることを意味する。励起光フィルターおよび蛍光検出器におけるフィルターの使用がこの問題を防ぐ。このような例では、励起フィルターは、例えば４５０ｎｍ以上の強度の光でのみ術野表面に適用することができ、一方、検出フィルターは測定される、例えば５５０ｎｍ以下の強度で反射の問題を回避し得る。他の方法には、励起光の方向と９０°の角度で蛍光を測定することが含まれる。蛍光は全角度（すなわち、３６０°）で生じるため、励起光の方向に対して９０°で蛍光を測定することは反射を回避する。

術野に適切なＵＶ光強度をもたらして適切な蛍光強度（弱くなく強すぎない）を得るために、単に手術室ベッドからスイングアームの高さを調整するだけであり得る。適切な調整には、患者のサイズ、使用される標識、および要求される解像度が考慮される。これらはすべて、従来技術の範囲内である。

高解像度デジタルカメラはデジタル画像を捕捉して、画像をコンピュータに保存する。そしてコンピュータソフトウェアは前および後画像を検索して蛍光の差を決定することができる（識別）。カメラによるデジタル画像は、横と縦に数千ピクセルのビットマップ、例えば、縦１，０００に横１，０００で百万ピクセルなどからなる。使用される一般的なビットマップ画像ファイルフォーマットでは、各ピクセルは３２ビットを含み、４つの８ビットバイトに分けられる。最初のバイトは対象ではない。残りの３つの８ビットバイト（セル）は０〜２５５の値を含み、三原色である赤、緑、および青の相対的強度を表し、各セルの色値の組み合わせがヒトの眼が見る色を決定する。ＲＧＢ値を用いることにより、各ピクセル（セル）は１６百万色値を超えて有し得る、このため、前と後画像の間のピクセル値における非常に小さい変化の検出を可能にする。

適切なソフトウェアが各画像を整列させて、１つの画像における各ピクセルを次の画像の同一ピクセルと対応させる。これは各画像でマーカーを配列することによって達成され、一つの画像を次のものと適切に重ね合わせることを確実にする。配列後、コンピュータがバックグランド蛍光を測定するために使用された前画像と、再評価された蛍光の後画像の間のピクセル色における差を検出し、有意に増加した蛍光を有することが測定されるこれらのピクセルを特定する。検出過程が終了すると、３つの画像が視覚化のために利用可能であり、前および後画像、さらにハイライト化された検出蛍光ピクセルを有する後蛍光画像の正確な複写であり、肉眼に対してさらにこれらを明らかにする第三画像である。画像はその後の視覚による比較のためにコンピュータに保存され、さらに画像はコンピュータモニター、ＴＶスクリーン、または任意の他の一般的に使用されるデバイスなどの視覚装置に伝達される。

いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは画像を分析するために特定の閾値を有するように設定される。いくつかの実施形態では、最小強度閾値は３５で設定され、ソフトウェアは強度値≦３５を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは約１０〜約３５の範囲の強度値を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、または１０未満の強度値を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、最小閾値より低い値を有するピクセルは、バックグランド蛍光または非癌性性質の細胞と関連すると考えられる。

いくつかの実施形態では、最大強度閾値は２１０で設定され、ソフトウェアは強度値≧２１０を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは約２１０〜約２５５の範囲の強度値を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは２１０超、２２０超、２３０超、２４０超、または２５０超の強度値を有するピクセルを判別する。いくつかの実施形態では、最大閾値を超える強度値を有するピクセルは、不自然な結果または死滅細胞と関連すると考えられる。

使用
本明細書で説明される方法は、組織サンプルにおける癌細胞を検出するために有用である。一つの実施形態では、組織サンプルは腫瘍の切除後の術野である。別の実施形態では、術野は基底細胞癌の除去後に残存する組織であり、患者に残存する組織が依然として基底細胞癌細胞を保持しているかどうか、臨床医が即座に決定することを可能にする。この後者の態様は、臨床医が癌基底細胞の全てを除去するように適切に組織を除去していると確信することを可能にするため重要である。

なおさらに、このアッセイは疑わし母斑が除去された後の組織表面上、ならびに除去された母斑自体で実施することができ、これによって臨床医は母斑が癌性であるかどうか、または生検組織サンプルで使用されるかどうか決定することができる。

例
本発明は、次の例を参考することによってさらに理解され、これらは本発明の単に例示的なものであることが意図されている。本発明は例示される実施形態によって範囲が限定されず、これらは本発明の一つの態様の説明としてのみ意図されている。機能的に同等である任意の方法は本発明の範囲内である。本明細書で説明されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の説明および付帯図から従来技術の当業者に明らかになるであろう。このような変更は添付される請求項の範囲である。

次の略名が後述の例で使用され、次の意味を有する。略名が定められない場合、それは従来技術で認識されている意味を有する。さらに、すべての温度は注釈がない限り摂氏度である。
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝当量
エーテル＝ジエチルエーテル
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍｍ＝ミリメーター
ｍＭ＝ミリモル
ｍｍｏｌｅ＝ミリモル
ＲＰＭＩ＝ロズウェルパーク記念研究所培地
ＭＰ＝融点
ＲＴ＝室温
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
μＭ＝マイクロモル
μｍ＝マイクロモル
Ｖ／Ｖ＝容量／容量

例１．２−（４−（（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−５−（（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）アミノ−５−オキソペンタン酸（化合物１３）の合成

２０ｍＬ無水ＤＭＦ溶液および４ｍＬピリジンにおける１００ｍｇ（０．２２モル）葉酸（化合物１０）の混合物を加熱して激しく撹拌し、透明な黄金色溶液を得た。この溶液に６当量のＤＣＣ（０．２８０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応混合物を暗所の超音波槽中で１５分間２回混合し、その間、槽を２９℃に加温した。得られる濁った溶液を、１．１当量の５−アミノフルオレセイン（８６．５ｍｇ、０．２４９モル）を含むフラスコに加えた（化合物１１）。得られる反応混合物をアルミホイルで覆って室温で一昼夜撹拌した。約１８時間後、混合物をセライトに通してろ過し、７０ｍＬエーテルおよび３０ｍＬアセトンの混合物に滴下して加えた。濁った混合物をフリーザー中の暗所で数日間保存した。固体（化合物１２）をろ過して取り出し、エーテルで洗浄して１１５．７ｍｇ（６６．３％）の一定量まで空気乾燥させた。

葉酸−フルオレセイン共役体（化合物１２）の２９．４ｍｇを２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、６当量（２３．６ｍｇ）のトリエチルアミン、続いて５当量のプロピオニルクロライド（１７．６ｍｇ）を加えた。反応物を室温で数日間撹拌し、水および酢酸エチルの混合物に注いだ。有機層を水および食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒の蒸発後、固体をさらに乾燥させて２０．６ｍｇ（５４％）得た。ＭＰ：＞２９０°。生成物の確認は、化合物１３のフルオレセインフェノールヒドロキシル基のジエステル化による蛍光の低下によってさらに得られた。
具体的には、化合物１３のサンプルをメタノールに溶解したとき、非蛍光性溶液が得られた。数滴のアンモニア水による処理で、強い蛍光が認められた。アンモニアは強い脱アシル化剤であり、マスクされた蛍光性フルオレセインジエステルを脱マスク化する。

例２．Ｏ，Ｏ’−（５−（３−（４−（（４−（４−（（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−５−メトキシ−５−オキソペンタンアミド）メチル）フェニル）チオウレイド）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス）（２−メトキシエチル）ジスクシネート（化合物１８）の合成

Ａ．Ｏ，Ｏ’−５−イソチオシアネート−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２−メトキシエチル）ジスクシネート（化合物１７）の合成
Ａ１．

上記反応はＪ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２（２６）：４１４２−４１４５によって報告されている文献調製に従う。具体的には、わずかに過剰な無水コハク酸をフラスコで塩化メチレン中の２−メトキシエタノールと約２０℃で混合した。塩化メチレンにトリエチルアミンを含む溶液を約１５分かけて滴下して加え、この間、反応物は溶媒が沸騰し始めるのに十分な熱を生じた。その後で、トリエチルアミンの添加を停止し、反応物を室温に戻した後で一昼夜撹拌した。反応を停止させ、反応溶液を食塩水で洗浄し、有機層を回収した。溶媒を取り除き、得られる生成物をカラムクロマトグラフィー（塩化メチレン中に０〜１０％メタノールｖ／ｖの勾配を用いたシリカゲル）によって精製した。得られる生成物（化合物１２）をさらに精製または分離することなく使用した。

Ａ２．

化合物２２の約１当量を塩化メチレンに溶解し、ついで約１当量のＤＣＣと室温で混合した。混合物を約５分間撹拌し、ついで０．２５当量のＤＭＡＰおよび約０．２５当量のフルオレセインをそこに加えた。そして反応混合物を懸濁がほとんど消えるまで２６℃で超音波処理し、約１５分間にわたった。得られる反応混合物を室温で一昼夜撹拌し、反応終了をＴＬＣによってモニタリングした。ほとんど反応が終了した時点で、非溶解性成分をろ過し、得られる溶液を精製目的でシリカカラムに加えた。カラムを、０％メタノールおよび１００％塩化メチレンで開始し、１０％メタノールおよび９０％塩化メチレン（ｖ／ｖ）で終了する溶媒勾配によって溶出した。所望の化合物を含む溶出物から溶媒を除き、得られる化合物１４はジエステル形成の蛍光性指標がほとんどなかった。化合物の少量小分けを、脱アシル化の蛍光指標を直ちにもたらす水酸化ナトリウム溶液と接触させた。水酸化ナトリウムは強い脱アシル化剤であり、マスクされた蛍光性フルオレセインジエステルを脱マスク化する。

Ａ３．
２０ｍＬ無水ＤＭＦおよび４ｍＬピリジンにおける１００ｍｇ（０．２２モル）葉酸（化合物１０）の混合物を加熱して激しく撹拌し、透明な黄金色溶液を得た。この溶液に６当量のＤＣＣ（２８０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応混合物を暗所の超音波槽中で１５分間２回混合し、その間、槽は２９℃に加温した。得られる濁った溶液を、１．１当量のｔ−ブチル（４−アミノメチル）フェニル）−カルバマート（５８．３ｍｇ）（化合物１５）を含むフラスコに加えた。得られる反応混合物をアルミホイルで覆って室温で一昼夜撹拌した。約１８時間後、１ｍＬのメタノールを加えてαカルボン酸をエステル化した（これは任意のステップである）。さらにＲＴで約２４時間撹拌した後、混合物をセライトに通してろ過し、７０ｍＬエーテルおよび３０ｍＬアセトンの混合物に滴下して加えた。濁った混合物をフリーザー中の暗所で数日間保存した。固体をろ過して取り出し、エーテルで洗浄して７２ｍｇ（４８．２％）の一定量まで空気乾燥させた。さらに精製することなく、この化合物２４ｍｇを０．５ｍＬのＴＦＡ（大過剰）に加えて室温で撹拌し、ついで冷蔵庫に保存した。ＴＦＡを蒸発させて２０ｍｇ（３５．７μｍ）の化合物１６を得た。ついでこの物質を少量のＤＭＦに溶解し、１当量（２５ｍｇ）の化合物１７で処理した。反応物を室温で一昼夜撹拌した。混合物を多量のエーテル（７５ｍＬ）に加えて沈殿を生じさせ、ろ過して取り出し、エーテルで洗浄して２９ｍｇ（６４％）の黄褐色固体に乾燥させ、ＭＰとして２００℃で軟化し、２１６〜２２６℃で融解した（化合物１８）。この物質の少量サンプルをメタノールに溶解して透明な無色溶液を得た。数滴のアンモニア水を加えたとき、溶液は強い蛍光性になった。アンモニアは強い脱アシル化剤であり、マスクされた蛍光性フルオレセインジエステルを脱マスク化する。

比較例Ａ．

化合物２５を比較例（蛍光部分にエステル基がない）として、標記化合物を得る上記手順に従って調製した。

例３．フルオレセインジエステルである化合物２６の合成

例２の手順に従い、メタノールの添加を省いて、化合物２０を調製した。化合物１３のサンプルをメタノールに溶解したとき、非蛍光性溶液が得られた。数滴のアンモニア水による処理で、強い蛍光が認められた。アンモニアは強い脱アシル化剤であり、マスクされた蛍光性フルオレセインジエステルを脱マスク化する。

例４．フルオレセインジエステルである化合物２７の合成

化合物２７を上記の手順に従って調製した。具体的には、化合物１３のサンプルをメタノールに溶解したとき、非蛍光性溶液が得られた。数滴のアンモニア水による処理で、強い蛍光が認められた。アンモニアは強い脱アシル化剤であり、マスクされた蛍光性フルオレセインジエステルを脱マスク化する。

例５．プテロイン酸誘導体の合成

１２ｍｇのプテロイン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を約１．５ｍＬのＤＭＦと混合し、撹拌しながら約８０℃に数分間加熱した。プテロイン酸は溶液にならなかった。ついで混合物をＲＴに冷まし、過剰の塩化チオニルを加え、透明な溶液がほぼすぐに生じ、酸塩化物の形成を示した。８．２ｍｇの４−（アミノメチル）ｔ−Ｂｏｃ−アニリンを加え、透明な溶液を一昼夜撹拌した。透明な黄金色溶液を数滴のトリエチルアミンで処理し、溶液は濃い暗色で粘性になった。３時間撹拌後、溶液を５０ｍＬのエーテルに移すときに数ｍＬのアセトンを用いて加えた。沈殿物をろ過し、暗色で湿潤性だった。これをチャコールで処理し、漏斗に通してＤＭＦそしてアセトンで洗浄した。ろ液を５０ｍＬのエタノールに再度加えて、明るい色の沈殿物が形成された。混合物を冷蔵庫に一昼夜保存した。固体をろ過によって取り出し、過剰なトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理してＢｏｃ基を取り除いた。ジクロロメタンを溶媒として使用した。過剰なＴＦＡを真空下で除去し、残渣をジクロロメタンに溶解して、過剰なトリエチルアミンを溶液が塩基性になるまで加えた。この溶液に、ジクロロメタン中の過剰なフルオレセイン５−イソチオシアネートジエステル（上記スキームで示される）を加えた。そして反応物を室温で一昼夜撹拌した。ついで溶液を氷上で冷却した１０ｍＬのエーテルに加えた。固体を遠心分離後に収集し、ガラスフリットフィルター漏斗に移して過剰なエーテルで洗浄して空気乾燥させた。約８ｍｇの生成物が暗色固体として得られた。
ＭＰ＝１５５〜１５８℃

生成物がフルオレセインジエステル部分を含むことを確認するために、生成物のサンプルをメタノールに溶解し、フルオレセイン蛍光の証明を伴わない透明なコハク色を得た。アンモニア水の添加で、強い特徴的な黄緑色蛍光が得られた。

生物学的な例
Ａ．卵巣癌細胞の検出
化合物２４および比較化合物Ａを、細胞癌によって吸収されるこれらの能力について評価し、化合物２４の場合には、蛍光構造を再生するように細胞内エステラーゼによって脱アシル化された。具体的には、約５００，０００個のＳＤＯＶ３細胞（卵巣癌細胞株）を、葉酸フリー増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を含む別々の３５ｍｍ培養皿に接種した。翌日、培地を葉酸フリー培地（ＦＢＳ無含有）に交換した。１つの培養皿では、培地に２５マイクロモルの化合物２４を加え、別の培養培地では、培地に５０マイクロモルの比較化合物Ａを加えた。インキュベーション後、細胞をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）で洗浄して未結合化合物を除去した。ついで細胞を標準的な正立蛍光顕微鏡によって２０×液浸対物レンズを用いて画像化した。化合物２４の場合には、蛍光シグナルがはっきりして一貫的で明確であり、癌細胞が蛍光性であり、蛍光シグナルは溶液中に形跡がなかったことを示した。図１は生じた蛍光を表す写真を示す。癌細胞のみが蛍光を示し、溶液は非蛍光のままだったことに留意する。比較化合物Ａでは、溶液は蛍光の突発を示したが、直ちに蛍光は消失して、組成物はもはや蛍光を発することができなかった。このことは、この組成物が本明細書で説明される方法での使用に適さなかったことを証明する。

これらの結果は、化合物２４が癌細胞を標的にし、癌細胞によって吸収され、細胞内酵素によって脱アシル化されたことを立証する。癌細胞内のみにおける持続的なシグナル化は、脱アシル化された化合物２４が癌細胞から流出しなかったことを証明した。他方、比較化合物Ａも癌細胞によって吸収され、直ちに蛍光を発したが、使用された強い光の下での消失による可能性がある蛍光の低下を伴った。

まとめると、本発明の化合物は残存癌細胞を検出する使用に適している。特定の癌細胞は本発明の共役体を優先的に取り込み、インキュベーション時間後、適用した溶液の術野からの除去が正常細胞への吸収を制限する。これらは従来の灌流／洗浄条件で実施され得る。

Ｂ．卵巣癌細胞の検出は葉酸受容体を介する。
この例は、化合物２４が葉酸受容体に特異的であることを立証する。具体的には、化合物２４を葉酸フリー培地および化合物２４と競合する過剰な葉酸を用いた培地で使用した。根拠として、過剰な葉酸の存在中では、化合物２４は葉酸結合タンパク質との結合で競合し、従って化合物２４が葉酸の単一源だったときよりも低いシグナルであろう。

この仮説を試験するために、ＳＫＯＶ３細胞を１０μＭの化合物２４、または１０μＭの化合物２４＋１ｍＭ葉酸（１００×）とともにインキュベーションした。そして細胞を洗浄し、前述のように画像化した。

全ての画像は同一パラメータを正確に用いて分析した。平均強度を各画像の同一領域から測定した。図２Ａおよび２Ｂに示される画像は、葉酸が卵巣癌細胞を標識するための化合物２４と競合することを明確に示す。これらの画像は化合物２４が葉酸結合タンパク質を通して細胞と結合し、他の経路によるものではないことを立証する。

Ｃ．用量反応
この実験は、化合物２４が、生じた蛍光に対して用量反応をもたらすことを立証する。具体的には、ＳＫＯＶ３細胞を０．２５％ＢＳＡが添加されたＲＰＭＩ中で、１０μＭ、２５μＭ、または５０μＭの化合物２４とインキュベーションした。細胞を１時間インキュベーションしてからＨＢＳＳで洗浄して前述のように画像化した。

画像はすべて、画像Ｊソフトウェア一揃いを用いて同一パラメータを正確に使用して分析した。平均強度を各画像の同一領域から測定した。以下で示される画像は、標識細胞における化合物１２４の明確な用量反応を示す。棒グラフは各画像の平均強度を示し、画像の肉眼検査による結論を裏付ける。ＢＳＡが補充剤として使用されたが、アシル化ＢＳＡがより実際的である。

本実験の結果を下記に示す。

これらの結果は用量依存反応を実証する。

葉酸受容体と蛍光強度の間の相関関係
この実験では、ＳＫＯＶ３細胞をＭＣＦ７細胞−ＳＫＯＶ３細胞よりも低い量ではあるが葉酸結合タンパク質を発現する乳癌細胞株、に交換した以外は、上記の手順を繰り返した。実験の終了時、ＭＣＦ７細胞もＵＶ光への暴露で蛍光を現わし、プロ蛍光部分の蛍光部分への変換を伴う共役体の結合および吸収を示す。しかし、ＭＣＦ７細胞によって生じる蛍光強度はＳＫＯＶ３細胞によって生じるよりも低かった。まとめると、このデータは同一条件下で細胞上の葉酸結合タンパク質（葉酸受容体、例えばＦＲα）の数が、本発明の共役体の細胞に対する適用によって生じる蛍光の量と良く相関することを実証する。

具体的には、ＭＣＦ細胞を葉酸フリーＲＰＭＩ、ＦＢＳ無添加において化合物２４の１０μＭで１時間標識した。細胞を洗浄して画像化した。全体的に標識は死滅している大きい円形細胞以外で弱い。

正常組織におけるＦＲαの発現は、腎臓、腸、肺、網膜、胎盤、および脈絡叢の管腔側に限定されることは十分立証されている。さらに、腎臓を除くこれらの正常細胞はすべて、受容体が循環中の葉酸および任意の葉酸受容体標的化剤と直接的に接触しない上皮の頂端表面に限定される。正常な腎臓細胞では、葉酸は腎臓によって保持されず、そのため関連しない。Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３２，ｐｐ．５２５５３−５２５７４（２０１６）。

差異蛍光画像化の評価
次の例は、高精細デジタル写真における緑色の差異分析によって微小から強烈まで変動する蛍光量を検出する可能性を評価する。フルオレセインをベースとする化合物の蛍光は、ＵＶ光によって照らされるとき、特徴として緑色である。

具体的には、図１で認められるような第一画像はフルオレセインと混合された寒天から生じる蛍光のものだった。そしてゼラチン寒天を微小から比較的大きな粒子まで様々なサイズに砕いて、術野における種々のサイズおよび形状の異なる蛍光性癌細胞塊を表す。第一画像は赤、緑、および青値を含むピクセルからなる。ピクセル単位分析を画像全体について実施して、緑成分がバックグランドよりも大きい値を有する場所を分離した。標的ピクセルを任意に赤色に割り当てて、差異蛍光を迅速に評価した。このように割り当てられた色は、一般的にはバックグランドに対して最も効果的に差を生じる。

ピクセル単位分析は、非常に低い蛍光および非常に高い蛍光の同時選択を可能にする。このような判別力のある分析では、ソフトウェアを使用して緑以外のマーキング色を、正常細胞を表す特定の明るさより低い緑ピクセルに選択的に割り当てることができる。同時に、特定の明るさを超える他の緑ピクセルを、死滅細胞を表す、緑以外のマーキング色に割り当てることができる。このようにすることで、このプロセスは無関係の細胞データを取り除き、臨床医に癌性の可能性があるこれらの生きた細胞のみを視覚化することを可能にする。

この分析の結果を図２に示す。バックグランド量を超える緑値を示したこれらのピクセルは、フルオレセインによって生じた蛍光の代表的なものであると解釈された。この画像では、多くのフラグ化ピクセルがあり、これ以外では図１で視覚化されない、または視覚化が困難である。これらの結果は差異蛍光分析が、リアルタイムおよび相互作用手段の両方で蛍光の微小量を検出することを実証する。得られる画像は、他では検出できないまたは検出が困難であり、従来は検出が見逃された可能性がある癌細胞塊をもたらす。

Claims (21)

1. 癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法であって、
   ａ）バックグランド蛍光と関連する蛍光部分を同定し、
   ｂ）組織サンプルにおける全蛍光を測定し、ここでプロ蛍光部分は前記癌細胞におけるプロ蛍光部分の蛍光部分への変換を伴う吸収によるこれらの蛍光方式におけるものであり、
   ｃ）バックグランド蛍光を考慮して全蛍光を調整して調整した蛍光を得、
   ｄ）調整した蛍光を癌細胞に帰すること
   を含む、方法。
2. 葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルにおける癌細胞の存在を評価するための方法であって、
   ａ）前記サンプルのバックグランド蛍光を評価して前蛍光画像を得、
   ｂ）標的化部分を含む１種類以上の共役体を選択し、ここで前記共役体はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分と任意にリンカーによって共有結合される葉酸またはプテロイン酸標的化部分を含み、
   ｃ）前記共役体の効果的な量を、前記癌細胞を含むことが疑われる組織サンプルに適用し、
   ｄ）前記組織サンプルと前記適用された共役体を十分な時間インキュベーションして、共役体をプロ蛍光部分の蛍光できる部分への変換を伴う前記癌細胞と結合させて吸収させ、
   ｅ）前記インキュベーションした組織サンプルの蛍光を評価して後蛍光画像を得、
   ｆ）前記前蛍光画像を前記後蛍光画像から識別して、現在の蛍光フルオレセインをベースとする部分から蛍光を生じる癌細胞に帰することができる差異蛍光マップを得、
   ｇ）前記差異蛍光マップを癌細胞の存在に帰すること
   を含む、方法。
3. 前記プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分が、式：
   

   

   
   
   の化合物から得られ、
   ここで、ｐは０または１であり、各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基であり、Ｗはアルキレン−Ｘまたは置換アルキレン−Ｘであり、Ｙは結合、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^１０であり、ここでＲ^１０は水素または１〜６個の炭素原子のアルキルであり、Ｚは酸素またはイオウである、請求項１に記載の方法。
4. 前記プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分が、式：
   

   

   
   の化合物から得られ、
   ここで、ｐは０または１であり、各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基であり、Ｗはアルキレン−Ｘまたは置換アルキレン−Ｘであり、Ｙは結合、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^１０であり、ここでＲ^１０は水素または１〜６個の炭素原子のアルキルであり、Ｚは酸素またはイオウである、請求項２に記載の方法。
5. 前記プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分が、式：
   

   

   
   の化合物から得られ、
   ここで、ｐは０または１であり、各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基であり、Ｗはアルキレン−Ｘまたは置換アルキレン−Ｘであり、Ｙは結合、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^１０であり、ここでＲ^１０は水素または１〜６個の炭素原子のアルキルであり、Ｚは酸素またはイオウである、請求項３または４に記載の方法。
6. Ｘがアミノ、置換アミノ、ヒドロキシル、チオールなどである、請求項５に記載の方法。
7. 前記プロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分が、式：
   

   

   
   の化合物、またはこれらの塩、互変異性体、および／または溶媒和物から得られ、
   ここで、Ｌ’は結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、
   Ｘ’はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分であり、
   Ｙ’は−Ｏ−または＞ＮＲ^１１であり、ここでＲ^１１は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環であり、
   Ｒ^１２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである、
   請求項１に記載の方法。
8. 前記共役体が、式：
   

   

   
   またはこれらの塩、互変異性体、および／または溶媒和物によって表され、
   ここで、Ｌ’は結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、
   Ｘ’はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分であり、
   Ｙ’は−Ｏ−または＞ＮＲ^１１であり、ここでＲ^１１は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環であり、
   Ｒ^１２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである、
   請求項２に記載の方法。
9. Ｙ’が＞ＮＲ^１１である、請求項７または８に記載の方法。
10. Ｌ’が式−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−のリンカーであり、ここでＲは−（オキシアルキレン）_ｎ−でｎは１〜１０、アルキレン、アルカリレン、アリールアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、ヘテロシクロアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、およびシクロアルキレンからなる群から選択され、それぞれは任意にアルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アシル、カルボキシル、カルボキシルエステル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、およびチオールからなる群から選択される１〜５個の置換基によって置換される、請求項７または８に記載の方法。
11. 前記組織サンプルが葉酸受容体を過剰発現する癌細胞を含むことが疑われる、請求項１または２に記載の方法。
12. 前記組織サンプルが固形腫瘍の切除後の術野である、請求項１または２に記載の方法。
13. ステップ（ｆ）の前に、ｅ’）前記前蛍光画像と前記後蛍光画像を配列することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
14. ステップｅ’）が、
    少なくとも１種類のマーカーを前記組織サンプルに加え、
    前記前蛍光画像および前記後蛍光画像におけるマーカーのそれぞれの位置に基づいて前記前蛍光画像と前記後蛍光画像を配列すること
    を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記前蛍光画像および前記後蛍光画像が電子的に保存され、前記差異蛍光マップの作製がソフトウェアを用いて実施される、請求項２に記載の方法。
16. 前記ソフトウェアがピクセルごとに評価し、前記前蛍光画像を前記後蛍光画像から識別して前記差異蛍光マップをもたらす、請求項１５に記載の方法。
17. 式：
    

    

    
    の化合物であって、ここで、ｐは０または１であり、各Ｒは独立して−Ｃ（Ｏ）Ｒ^１および−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１から選択され、ここでＲ^１は任意に４〜３０個の炭素原子または５〜２０個の炭素原子のアルキルまたは置換アルキルであり、Ｒ^２はアルキル、置換アルキル、アルキル−Ｘ、または置換アルキル−Ｘであり、Ｌは共有結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、Ｘは標的化部分で相補的な官能基と反応できる適切な基であり、Ｗはアルキレン−Ｘまたは置換アルキレン−Ｘであり、Ｙは結合、ＣＨ_２、Ｏ、またはＮＲ^１０であり、ここでＲ^１０は水素または１〜６個の炭素原子のアルキルであり、Ｚは酸素またはイオウであり、少なくとも１つのＲは−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１である、化合物。
18. 式：
    

    

    
    の化合物、またはこれらの塩、互変異性体、および／または溶媒和物であって、
    ここで、Ｌ’は結合、または酸素、炭素、カルボニル、窒素、イオウ、スルフィニル、およびスルホニルからなる群から選択される１〜２０個の原子を有するリンカーであり、
    Ｘ’は請求項６に記載のプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分であり、
    Ｙ’は−Ｏ−または＞ＮＲ^１１であり、ここでＲ^１１は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、フェニル、置換フェニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環であり、
    Ｒ^１２は水素またはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである、
    化合物。
19. 癌細胞、正常細胞、および任意に死滅細胞を含むことが疑われる細胞集団における癌細胞を同定するための方法であって、
    ａ）前記細胞集団に共役体を含む組成物の効果的な量を適用し、ここで前記共役体はプロ蛍光性フルオレセインをベースとする部分と任意にリンカーによって共有結合される葉酸またはプテロイン酸標的化部分を含み、
    ｂ）前記組成物を十分な時間インキュベーションして、前記共役体を前記プロ蛍光部分の蛍光部分への細胞内変換を伴う前記細胞における葉酸受容体と結合させ、
    ｃ）フルオレセインによる前記細胞集団内における蛍光発光を開始させ、
    ｄ）フルオレセイン蛍光と関連するピクセルの強度をピクセル単位ベースで評価し、
    ｅ）バックグランドまたは本質的に非癌性として第一所定閾値未満を有する前記ピクセルを判別し、
    ｆ）死滅細胞から生じる第二所定閾値を超える前記ピクセルを判別し、
    ｇ）ｅ）およびｆ）において判別された前記ピクセルをマーカーピクセルに変化させ、
    ｈ）判別されていないフルオレセイン蛍光と関連するピクセルからなる変化させた画像を作製し、
    ｉ）非判別ピクセルを癌細胞に選定すること
    を含む、方法。
20. フルオレセイン蛍光と関連する前記ピクセルが、緑ピクセルを含む、請求項１９に記載の方法。
21. フルオレセイン蛍光と関連する前記ピクセルが、手術環境においてスクリーンに表示される、請求項１９に記載の方法。

Images