KR102174196B1 - 소수성기가 도입된 실리콘-로다민 형광 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실리콘-로다민 코어에 소수성기가 도입되어 미토콘드리아 특이성을 갖는 신규한 근적외선 형광 프로브 및 이의 미토콘드리아 검출 및 암 진단 용도에 관한 것으로, 본 발명의 형광 프로브는 실리콘-로다민 코어에 소수성기를 도입함으로써, 미토콘드리아 표적화 효율을 종래 프로브에 비해 향상시켰으며, 근적외선(near-infrared, NIR) 영역(700~ 1700nm)에서 생체조직 내의 미토콘드리아를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있고, 인체에 유해하지 않으면서 3차원의 고해상도 생체 이미지를 획득할 수 있는 장점이 있어, 실험실에서 세포 내 미토콘드리아 검출 용도 뿐만 아니라 암 진단 및 수술시 조영제, 기타 약물 전달체로의 활용이 가능하다.

Description

소수성기가 도입된 실리콘-로다민 형광 프로브 및 이의 용도{Hydrophobic Silicon-rhodamine Fluorescent Probes and Use Thereof}
본 발명은 소수성기가 도입된 실리콘-로다민 형광 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 실리콘-로다민 코어에 소수성기가 도입되어 미토콘드리아 특이성을 갖는 신규한 근적외선 형광 프로브 및 이의 미토콘드리아 검출 및 암 진단 용도에 관한 것이다.
미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성함으로써 세포 에너지를 제공한다. 또한, ROS 생산 조절, 세포 사멸의 조절, 산화 환원 항상성 유지, 선천성 면역 및 자가포식을 포함하는 세포 신호에서 중요한 역할을 담당한다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 신경 퇴행성 질환에서 중상 경화증 및 당뇨병에 이르기까지 다양한 인체 상태를 초래한다.
미토콘드리아는 내막과 외막을 포함하는 이중막으로 둘러싸여 있으며 미토콘드리아 형태는 세포 유형에 따라 크게 상이하다. 살아있는 세포에서, 미토콘드리아의 형태는 세포 스트레스 하에서 미토콘드리아 기능을 유지하는데 중요한, 핵분열과 핵융합 사건들이 결합된 작용에 의해 끊임없이 변형된다. 따라서, 미토콘드리아의 형태는 세포의 기능과 질환의 상태에 의존적이다. 최근 연구에 따르면, 미토콘드리아 형태학은 암 표현형의 진단 및 약물 반응 모니터링을 위한 생물학적 표지자로 활용될 수 있다. 결과적으로, 세포 신호 전달을 연구하고, 분자 진단 도구로서의 역할을 하는 형광 미토콘드리아 바이오 프로브에 대한 요구가 높아지고 있다.
미토콘드리아의 내막을 가로지르는 막 전위 (미토콘드리아 막간 공간에서 양성이고 미토콘드리아 매트릭스에서 음성)의 큰 차이는 화합물을 미토콘드리아로 표적화하는데 효율적으로 이용될 수 있다. 따라서 대부분의 미토콘드리아 형광 바이오 프로브는 지방 친화성 양이온 (일반적으로 트리페닐 포스포늄 이온)과의 화합물 접합에 기반을 두고 있으며Zielonka, J. et al., (2017) Mitochondria-Targeted Triphenylphosphonium-Based Compounds: Syntheses, Mechanisms of Action, and Therapeutic and Diagnostic Applications. Chemical Reviews 117, 10043- 10120), 지질 이중층을 통한 분자의 효율적인 전달과 미토콘드리아 기질에의 축적을 가능하게 한다(Murphy, M. P. (2008) Targeting lipophilic cations to mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta ( BBA ) - Bioenergetics 1777, 1028-1031). 그러나 소수성이 특정 형광체에 의한 미토콘드리아 표적화에 미치는 영향을 다룬 연구는 아직까지 보고되지 않고 있다. 미토콘드리아 기능을 모니터링하기 위해 형광 프로브를 개발하는 것은 적절한 최적화가 선행되어야하기 때문에 어려운 작업이 될 수 있다. 이러한 맥락에서 본 발명자들은 발형관단의 소수성의 체계적인 변형이 효과적인 미토콘드리아 형광 프로브 개발에 훌륭한 가이드를 제공할 수 있을 것이라고 예측하였다. 또한, 미토콘드리아 특이적 약물 전달에 대한 최근의 증가되는 관심도에 비추어 볼 때, 이러한 미토콘드리아를 표적화하는 신규한 전략은 미토콘드리아 관련 질환에 대한 유용한 테라그노시스(theragnosis)를 위한 화학적 도구로 개발하는데 도움이 될 것이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 미토콘드리아 염색을 위한 근적외선 형광 프로브를 개발하고자 예의 노력한 결과, 실리콘-로다민 코어에 10개의 상이한 상업용 아민의 첨가 반응을 통하여, 유사한 광 물리학적 특성을 가지지만 프로브 자체의 소수성은 상이한 다양한 형광 프로브가 합성할 수 있었고, 이렇게 합성된 신규한 형광 프로브들이 살아있는 세포에서 미토콘드리아 염색에 탁월한 효과를 발휘하고, 암 세포주를 정상 세포주에서 구별해 낼 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
Zielonka, J. et al., (2017) Mitochondria-Targeted Triphenylphosphonium-Based Compounds: Syntheses, Mechanisms of Action, and Therapeutic and Diagnostic Applications. Chemical Reviews 117, 10043- 10120. Murphy, M. P. (2008) Targeting lipophilic cations to mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1777, 1028-1031.
본 발명은 로다민-실리콘 코어에 소수성기를 부착시킨 신규한 화합물 및 이의 미토콘드리아 표적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019043953019-pat00001
여기서, 상기 R은 소수성기를 나타냄.
본 발명은 또한, 하기 화학식 1로 표시되는 미토콘드리아 표적용 프로브를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019043953019-pat00002
여기서, 상기 R은 소수성기를 나타냄.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 미토콘드리아 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 조영제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 시험관 내 세포에서 미토콘드리아를 시각화하는 방법을 제공한다:
상기 프로브를 시험관 내 세포에 주입하는 단계; 및
상기 세포에서 생성된 검출 가능한 형광 신호를 측정하는 단계.
본 발명의 형광 프로브는 실리콘-로다민 코어에 소수성기를 도입함으로써, 미토콘드리아 표적화 효율을 종래 프로브에 비해 향상시켰으며, 근적외선(near-infrared, NIR) 영역(700~ 1700nm)에서 생체조직 내의 미토콘드리아를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있고, 인체에 유해하지 않으면서 3차원의 고해상도 생체 이미지를 획득할 수 있는 장점이 있어, 실험실에서 세포 내 미토콘드리아 검출 용도 뿐만 아니라 암 진단 및 수술시 조영제, 기타 약물 전달체로의 활용이 가능하다.
도 1은 실리콘 로다민 코어에 기초한 근적외선 형광 미토콘드리아 프로브에 대한 합성을 보여주는 모식도이다. a) 포름알데히드, AcOH, 60 ℃, 1.5 h, b) sec-BuLi, SiCl2Me2, THF, -78 ℃, 이후 KMnO4, 아세톤, 0 ℃, c) 3, tert-BuLi, THF, -78 ℃, 이후 6N HCl, 40 ℃ d) Di-tert-butyl dicarbonate, DMAP, THF, 역류, e) PyBOP, DIPEA, 아민 유사체, DMF, 상온.
도 2는 SiR-Mito와 MitoTracker Green으로 염색된 HeLa 세포에서의 공존 실험 결과를 나타낸다. HeLa 세포를 1 μM SiR-Mito 프로브와 0.5 μM MitoTracker green이 들어있는 세포 배양 배지로 배양하고 1 시간 후, HeLa 세포를 1X PBS로 3회 세척하고 라이카 DMi8 형광 현미경으로 관찰하였다. 각 실험은 FITC 채널 (MitoTracker Green의 경우)에 대해 512-542nm emitter, Cy5 채널에 대해 (SiR-Mito 프로브의 경우) 545-625nm emitter, 663-738nm exciter를 사용하여 관찰하였다. 스케일 바 : 50 μm.
도 3은 동일한 농도의 개별 프로브로 배양한 HeLa 세포의 형광 강도(왼쪽)와 표준화된 형광 강도(오른쪽)를 비교한 결과이다.
도 4는 미토콘드리아에서 SiR-Mito 8의 고해상도 형광 이미지를 나타낸다. (a) HeLa와 Hep3B 세포를 MitoTracker Green (0.5 μM), SiR-Mito 8 (1 μM)과 함께 1 시간 배양하고, 신선한 배지로 3 번 세척한 후, 라이카 DMi8 현미경으로 형광 라이브 세포 이미지를 얻었다. (MitoTracker green : FITC 채널, SiR-Mito 8 : Cy 5 채널, Scale bar : 15 μm); (b) mitochondrial YFP를 발현하는 Chang 세포를 1 시간 동안 SiR-Mito 8 (1 μM)과 함께 배양하고, 신선한 배지로 3 번 세척한 후, 라이카 DMi8 현미경으로 형광 라이브 세포 이미지를 얻었다. (미토콘드리아 -YFP : 로다민 채널, 스케일 바 : 15 ㎛)
도 5는 간암 Hep3B 세포를 Hoechst (0.01 μg / ml), Lysotracker red (1 μM) 및 SiR-Mito 8 (1 μM)과 함께 1 시간 동안 배양하고, 신선한 배지로 3 번 세척 한 후, 형광 라이브 세포 이미지를 라이카 DMi8 현미경으로 확인한 결과(왼쪽) 피어슨 계수를 통해 SiR-Mito 8이 리소좀과 같은 다른 기관에 위치되지 않음을 확인한 결과(오른쪽)이다. 스케일 바 : 50 ㎛
도 6은 HeLa, Hep3B, HepG2 및 Raw 264.7 세포를 1, 4, 12 및 24 시간 동안 0.25 μM 내지 10 μM 농도 범위의 SiR-Mito 8로 배양하며, 세포 독성을 확인한 결과이다. 세포의 생존력은 DMSO 대조군으로 표준화되었다.
도 7은 Hep3B (간암 세포), L02 또는 Chang 간세포 (정상 간)의 세포 형광 이미지를 나타낸 것이다. (a) 세포를 1 시간 동안 SiR-Mito 8 (1 μM)과 Hoechst 염료 (0.01 μg / ml)가 함유된 완전 성장 배지와 함께 배양하고, 세포를 배지로 3 회 세척한 후, 라이카 DMi8 형광 현미경으로 관찰한 결과, 암세포는 정상 세포보다 높은 형광 강도를 나타내었다. (b) L02, Chang 간 세포 및 Hep3B 세포에서 SiR-Mito 8의 형광 강도를 정량한 결과이다. 스케일 바 : 50 μm.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
미토콘드리아는 미토콘드리아 막을 가로지르는 호흡 전자 전달 사슬 (ETC)에 의해 생성된 양성자 전기 화학적 전위차를 이용하여 세포 에너지를 제공한다. 내부 미토콘드리아 막에서 일어나는 전자 전달은 미토콘드리아 매트릭스에서 막 간 공간 (I, III, IV 복합체)으로 양성자 이온을 이동시키기 위해 펌프가 요구하는 에너지를 제공한다. 그러므로, 미토콘드리아를 표적으로 하는 가장 직접적인 접근방법은 전기 화학적 구배에 의해 미토콘드리아 매트릭스 내부에서 프로브 축적을 허용하는 친유성 양이온(lipophilic cations)을 생성하는 것이다.
새로운 근적외선 미토콘드리아 표적 바이오프로브를 개발하기 위해, 본 발명자들은 친유성 양이온 형광 색소로써 SiR-Me를 선택하였다. 로다민 형광 색소에서 산소 원자의 실리콘 치환이 SiR의 방출 파장을 분자의 작은 크기 (MW ≒470)를 유지하는 NIR 범위 (> 680 nm)로 이동시키기 때문에, 본 발명에서는 SiR-Me가 미토콘드리아 표적화의 효율에 대한 프로브 소수성의 효과를 체계적으로 평가하기에 적합한 형광 색소라고 추론하였다.
3-브로모아닐린으로부터 시작하여, 화합물 1의 리티에이션(lithiation), 실릴화(silyanization) 및 산화(oxidation)을 포함하는 원-팟(one-pot) 합성 공정으로 화합물 2를 합성하였다. 화합물 2와 리튬화된 화합물 3 사이의 반응에 이어서 산성 탈보호(acidic deproteion)를 통해 원하는 SiR-Me 화합물(화합물 4)을 생성하였다. 이후 SiR-Me는 10개의 상이한 상업적 아민과 접합시켜 다양한 cLogP 값과 서로 다른 소수성을 갖는 SiR-Me 유사체의 라이브러리를 생성할 수 있었다(SiR-Mito, 표 1).
Figure 112019043953019-pat00003
광 물리학적 특성, cLogP 값 및 SiR-Mito의 Mito Tracker green과의 공존(colocalization) 상관 계수
이와 같이 생성된 프로브 라이브러리는 470.3 내지 554.4 달톤의 분자량 범위 및 2.29 내지 6.55의 cLogP 값 범위를 나타내었으며, 상이한 아민과의 아미드 결합에 의한 접합체는 상이한 소수성을 가지지만, 유사한 광물리학적 특성(여기 파장 (654 ± 4 nm), 방출 파장 (667 ± 1 nm), 양자 수율 (0.31 ± 0.05))을 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019043953019-pat00004
여기서, 상기 R은 소수성기를 나타냄.
본 발명에 있어서, 상기 R은 2-히드록시리 에틸(2-Hydroxyle ethyl), 에틸(Ethyl), n-부틸(n-Butyl), 벤질(Benzyl), 페닐에틸(Phenylethyl), 사이클로헥실메틸(Cyclohexylmethyl), tert-옥틸(tert-Octyl), 사이클로옥틸(Cyclooctyl), 사이클로헥실에틸(Cyclohexylethyl) 및 2-메틸헵틸(2-Methylheptyl)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
한편, 이와 같이 합성된 화합물과 상용화된 녹색 형광 미토콘드리아 프로브를 동시 염색해 본 결과, 본 발명의 화합물이 녹색 형광 미토콘드리아 프로브와 같이 미토콘드리아 특이적으로 염색할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 미토콘드리아 특이적 표적화는 프로브의 소수성에 따라 다소 상이하게 나타났으며, 사이클로옥틸(cyclooctyl)기가 결합된 실리콘-로다민 형광 프로브의 경우 특히 미토콘드리아 표적화 효율이 가장 우수한 것으로 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에서 하기 화학식 1로 표시되는 미토콘드리아 표적용 프로브에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure 112019043953019-pat00005
여기서, 상기 R은 소수성기를 나타냄.
본 발명에 있어서, 상기 R은 2-히드록시리 에틸(2-Hydroxyle ethyl), 에틸(Ethyl), n-부틸(n-Butyl), 벤질(Benzyl), 페닐에틸(Phenylethyl), 사이클로헥실메틸(Cyclohexylmethyl), tert-옥틸(tert-Octyl), 사이클로옥틸(Cyclooctyl), 사이클로헥실에틸(Cyclohexylethyl) 및 2-메틸헵틸(2-Methylheptyl)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 근적외선 형광 프로브인 것을 특징으로 한다. 형광 프로브를 사용하는 경우, 다른 의료용 영상 기술과 비교하여 인체에 유해하지 않으면서 3차원의 고해상도 생체 이미지를 획득할 수 있는 장점이 있고, 근적외선(near-infrared, NIR) 영역(700~ 1700nm)에서 이루어지는 형광 영상은 여러 가지 기술적 진보를 통해 생체조직의 투과 깊이가 증가되었다. 또한, 본 발명에 따른 프로브는 486 내지 554 달톤의 비교적 작은 분자량을 나타내어, 근적외선 발광 파장을 지니는 종래 미토콘드리아 프로브에 비해 상대적으로 작은 크기를 지니고 있어 의료용 영상 기술 활용에 필요한 물성이 개선되어, 형광 분자 단층 촬영에 적합한 고형암 표지자로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브의 소수성이 미토콘드리아 표적화의 효율성에 중요한 영향을 미친다는 것을 확인한바, 상기 프로브는 2.29 내지 6.33의 clogP 값을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5.50 내지 6.33의 cLogP 값을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 미토콘드리아 표적용 프로브는 또 다른 양태로서 상기 프로브를 포함하는 미토콘드리아 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 미토콘드리아 표적용 프로브는 또 다른 양태로서 다음 단계를 포함하는 시험관 내 세포에서 미토콘드리아를 시각화하는 방법을 제공한다:
상기 프로브를 시험관 내 세포에 주입하는 단계; 및
상기 세포에서 생성된 검출 가능한 형광 신호를 측정하는 단계.
본 발명에 따른 구현예에서, 상기 검출 가능한 형광 신호는 근적외선 신호이다.
또한, 본 발명의 프로브는 HeLa, Hep3B의 살아있는 세포에서도 뚜렷한 미토콘드리아 특이적 염색이 가능하고, 간세포 암 세포주인 Hep3B를 정상 세포주 L02와 성공적으로 구별해 낼 수 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 프로브를 포함하는 조영제에 관한 것이다.
본 발명의 프로브는 종양(또는 암)과 같은 병태에서 대조 영상화(contrast imaging)에 유용하고, 특이 다양한 고형 종양(유방, 간, 자궁 등)의 진단과 영상 유도 수술에서 특히 유용하고, 해당 병태에 적합한 미토콘드리아를 표적으로 하는 약물 전달 및 기타 다양한 방법으로 전달된 약물이 병태에 미치는 반응을 모니터링하는데 유용하게 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 조영제 이외의 또 다른 양태로서 상기 프로브를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 암 진단용 조성물은 정상 세포와 암 세포에 상기 프로브가 결합하여 발생하는 형광 강도 차이를 이용하여 암 세포와 정상세포를 판별함으로써 암을 진단할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 간암세포 Hep3B 세포와 정상 간세포(L02 또는 Chang 세포) 사이에서 형광 강도의 차이는 약 5.9배를 나타내었으나, 정상세포 사이의 형광 강도는 t-test 결과 p value 값이 높아 유의미한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 암 진단용 조성물은 암 세포가 정상 세포에 비해 형광 강도가 1.5 배 이상 증가하는 경우 암으로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 2배 이상 증가하는 경우 암 세포로 진단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서 상기 프로브를 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 프로브를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계; 및 상기 동물에서 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 단계를 포함하는 동물에서 종양을 시각화하는 방법을 제공하며, 상기 검출가능한 신호는 미토콘드리아 표적에 따른 종양의 특이적 표지와 관련된다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 검출가능한 신호는 형광 신호이고, 바람직하게는 근적외선 형광 신호이다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 동물은 인간을 비롯한 포율 동물일 수 있다.
상기 조영제 또는 조성물을 동물에게 투여하는 방법은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 잘 알려져 있다. 바람직한 구현예에서, 임의의 다른 적합한 투여 수단이 본 발명의 범위 내에서 고려됨에도 불구하고, 상기 제제는 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 동물에서 생성된 검출가능한 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 검출가능한 신호를 측정하는 방법은, 비제한적으로, 영상화 방법, 예를 들어 형광 영상화 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형광 영상화 시스템은, 예를 들어, 제노겐(Xenogen) IVIS 100 시스템, IVIS 스펙트럼 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA), 또는 임의의 다른 적합한 비침습적, 생체내 형광 영상화 시스템이다. 일부 구현예에서, 검출가능한 형광 신호는 다빈치(da Vinci) 수술 시스템(Intuitive Surgical, Inc, Sunnyvale, CA)을 사용하여 측정된다. 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 시스템은 본 영상화제로 처리된 환자 조직에서 수술중 형광 유도 수술 기법과 조합하여 본 표지화 및 시각화 방법을 구현하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 동물에서 조직을 표지화하는 데 사용하기 위한 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 상기에 상세히 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 이들 화합물은 조직을 표지화하기 위해 동물에게 투여된다. 상기 화합물은 또한 동물에서 종양을 시각화하는 데 사용하기 위해 제공된다. 상기와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 화합물은 동물에게 투여되며, 종양을 시각화하기 위해 상기 화합물이 미토콘드리아를 표적으로 하여 동물에서 생성된 검출가능한 신호가 측정된다.
본 발명에서 용어 "표적"이란, 본 발명의 프로브가 검출하고자 하는 대상에 특이적으로 상호작용하여, 검출하고자 하는 대상을 다른 대상과 구별하는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 일 양태로서, 상기 프로브는 시험관 또는 생체 내의 세포 또는 조직 시료에서 미토콘드리아에 특이적으로 위치하거나 분포하며 염색함으로써 이를 세포 또는 조직 샘플 내 다른 대상과 구별한다. 일 예로써, 본 발명의 프로브는 미토콘드리아를 표적으로 하여 미토콘드리아에 특이적으로 위치 또는 분포하여 염색함으로써, 상기 프로브에 약물을 직간접적으로 연결하여 상기 약물을 세포 내로 전달하는 용도로 활용할 수 있다. 또한, 약물을 투여함에 따라 치료 과정에서 세포나 조직이 반응하며 세포 내 미토콘드리아의 형상이 변화하거나 그 수가 증감하는 것을 감지함으로써, 약물 반응을 모니터링하는 용도로 활용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출"이란 본 발명의 프로브가 특이적으로 상호작용하는 대상의 존재 유무를 확인하는 것으로, 구체적으로는 미토콘드리아의 존재 유무를 확인하는 것이다. 본 발명의 프로브가 미토콘드리아를 특이적으로 검출할 수 있는 특성에 기인하여, 본 발명은 시료 내에 존재하는 미토콘드리아 양과 프로브에 의해 발생하는 형광 강도 간에 양의 상관관계를 나타낼 수 있다. 일 예로써, 정상 세포(또는 조직)에 비해 미토콘드리아 양이 증가하는 암(종양) 세포(또는 조직)에서 형광 강도는 강하게 나타나기 때문에, 본 발명의 프로브는 암 진단용 조성물로 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 화합물 합성
모든 반응은 자기 교반하에 공기 건조된 유리 용기에서 질소 또는 아르곤 대기 하에서 수행되었다. 공기 및/또는 습기에 민감한 액체는 주사기로 이동시켰다. 유기 용액은 25-60℃, 15-30 torr에서 회전 증발시켜 농축시켰다. 모든 용제 및 공용 물질은 공급자로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피는 Biotage MPLC 장치를 사용하여 "플래시 크로마토그래피(Flash Chromatography)"로 수행하였다. 1 H NMR 및 13C NMR 데이터는 아주대학교의 JEOL ECZ-600R 자기 공명 시스템 (600 MHz)상에서 기록되었다. 기록된 시프트는 백만분의 일(δ)로 기록되었다: 화학적 시프트(Chemical shift), 다중도(multiplicity (s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quartet, m = multiplet, br = broad)), 커플링 상수(coupling constant (J, Hz)) 및 통합(integration). LC / MS 시스템, Finnigan MSQplus Surveyer (Thermo Scientific) 또는 6120 Quadrupole LC / MS (Agilent Technologies)를 사용하여 저해상도 질량 분석법 (LRMS)을 진행하였다. 반응의 진행은 박층 크로마토그래피(TLC)(실리카겔 60, F254 0.25mm)를 사용하여 모니터링 하였고, 성분들은 UV 광 (254 및 365nm)하에 관찰하거나 TLC 플레이트를 포스포놀리브딕산 (Phosphonolybdic acid, PMA), KMnO4 또는 닌히드린(ninhydrin)으로 처리한 다음 가열함으로써 성분을 가시화하였다. FBS, 배양 배지 및 항생제-항균 용액을 포함하는 세포 배양 시약은 GIBCO에서 구입하였다. MitoTracker Green 및 Hoechst는 Invitrogen에서 구입하였다. 배양 접시 및 유리바닥 접시는 CORNING 및 SPL에서 구입하였다. 모든 스펙트럼 실험은 1 x 1 cm 석영 큐벳에서 수행되었다. 형광 방출 스펙트럼은 JASCO FP-8200 분광 광도계로 기록하고 UV 흡수 스펙트럼은 JASCO V-670 분광 광도계로 기록하였다. 절대 양자 수율은 QE-2000 (Otsuka Electronics)로 측정하였다.
1-1. SiR - Mito 프로브의 화학적 합성
실리콘 로다민 코어(도 1의 화합물 4)의 합성은 종래의 연구 (Kim, E., Yang, K. S., Giedt, R. J., and Weissleder, R. (2014) Red Si-rhodamine drug conjugates enable imaging in GFP cells. Chem Commun ( Camb ) 50, 4504-7.)에 기재된 방법으로 재현하였다.
1-2. 일반적 합성 절차
DMF에 화합물 4 (1.0 당량), PyBOP (1.3 당량) 및 DIPEA (3.0 당량)을 첨가한 용액을 아르곤 대기 하에서 실온에서 10분 동안 교반하였다. 10분 후, 아민 유사체 (2.0 당량)를 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 본 발명에서 사용한 아민유도체는 다음과 같다: 2-hydroxyl ethylamine, ethylamine, n-Butylamine, Benzylamine, Phenylethylamine, cyclohexylmethylamine, tert-octylamine, cyclooctyl amine, cyclohexylethyl amine, 2-methylheptyl amine. 반응 혼합물을 Biotage MPLC로 18C 역 컬럼 크로마토그래피로 직접 정제하였다. 정제 결과 생성된 화합물은 다음과 같이 확인되었다.
N -(7-( dimethylamino )-10-(5-((2-hydroxyethyl) carbamoyl )-2- methylphenyl )-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 1)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.970 (dd, J =7.2Hz, 8.4Hz , 1H), 7.64 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.0 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.50 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.35 (s, 12H), 2.10 (s, 3H), 0.62, 0.61 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ155.8, 149.5, 142.1, 141.1, 140.4, 133.2, 131.6, 129.0, 128.8, 128.4, 122.3, 115.4, 61.5, 43.6, 40.9, 19.4, -1.2, -1.3.
N -(7-( dimethylamino )-10-(5-( ethylcarbamoyl )-2- methylphenyl )-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 2)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.95 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 ( d, J = 3Hz, 2H), 7.06 ( d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6Hz, 2H), 3.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.35 (s, 12H), 2.10 (s, 3H), 1.21 (t, J = 6.6Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.3, 169.0, 155.8, 149.5, 142.1, 141.0, 140.4, 133.3, 131.6, 129.0, 128.7, 128.4, 122.3, 115.4, 40.9, 35.9, 19.4, 14.9, -1.2, -1.3.
N -(10-(5-( butylcarbamoyl )-2- methylphenyl )-7-( dimethylamino )-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 3)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.95 (dd, J = 7.2Hz, 1H), 7.61 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.4Hz, 2H), 7.06 (d, J = 9.6Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6Hz, 2H), 3.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.35 (s, 12H), 2.10 (s, 3H), 1.59 (t, J = 7.2Hz, 2H), 1.40 (q, J = 7.8Hz, 2H), 0.96 (t, J = 7.8Hz, 3H), 0.62 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ167.9, 167.6, 154.5, 148.2, 140.8, 139.6, 139.1, 132.0, 130.3, 127.6, 127.4, 127.0, 121.0, 114.0, 39.6, 39.5, 31.3, 19.9, 18.1, 12.8, -2.5, -2.6.
N -(10-(5-( benzylcarbamoyl )-2- methylphenyl )-7-( dimethylamino )-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)- ylidene )- N - methylmethanaminium ( SiR - Mito 4)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.96 (dd, J = 8.4Hz, 1H), 7.62 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.35 (d, J = 3.0Hz, 2H), 7.29 (m, 5H), 7.03 (d, J = 3.6Hz, 2H), 6.76 (dd, J = 9.6Hz, 2H), 4.53 (s, 2H), 3.32 (s, 12H), 2.07 (s, 3H), 0.58 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.2, 168.9, 155.8, 149.5, 142.1, 141.2, 140.5, 140.1, 133.1 ,131.8, 129.5, 129.1, 128.8, 128.6, 128.4, 128.2, 122.3, 115.4, 44.6, 40.9, 19.5, -1.2.
N -(10-(5-((cyclohexylmethyl)carbamoyl)-2-methylphenyl)-7(dimethylamino)-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 5)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.95 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.4Hz, 2H), 7.06 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 12H), 3.21 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.76 (m, 6H), 1.28 (m, 3H), 0.99 (m, 2H), 0.62 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.3, 169.1, 155.8, 149.5, 142.1, 141.0, 140.4, 133.4, 131.6, 129.0, 128.7, 128.4, 122.3, 115.4, 47.4, 40.9, 39.3, 32.1, 27.6, 27.0, 19.5, -1.2.
N -(7-(dimethylamino)-5,5-dimethyl-10-(2-methyl-5-(phenethylcabamoyl)phenyl)dibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 6)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.90 (dd, J = 10.2 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.24 (m, 5H), 7.04 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6 Hz, 2H), 3.58 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.35 (s, 12H), 2.90 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H), 0.62 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ167.9, 167.7, 154.5, 148.2, 140.8, 139.7, 139.2, 139.0, 132.0, 130.3, 128.5, 128.1, 127.7, 127.3, 127.0, 126.0, 121.0, 114.0, 41.3, 39.6, 35.2, 18.1, -2.5, -2.6.
N -(7-(dimethylamino)-5,5-dimethyl-10-(2-methyl-5-((2,4,4-trimethylpentan-2-yl)carbamoyl)phenyl)dibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 7)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.86 (dd, J = 8.4 or 7.2 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.38 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.05 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 6.78 (dd, J = 10.2 Hz, 2H), 3.35 (s, 12H), 3.16 (m, 6H), 2.91 (s, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.94 (s, 2H), 1.85 (m, 6H), 1.48 (s, 6H), 1.01 (s, 9H), 0.61, 0.60 (6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.5, 168.9, 155.8, 149.6, 142.2, 140.5, 140.2, 134.9, 131.4, 129.0, 128.7, 128.4, 122.3, 115.3, 56.8, 51.2, 47.4, 47.4, 43.8, 40.9, 32.6, 31.9, 30.0, 27.4, 27.3, 19.4, -1.2.
N -(10-(5-((cyclooctylmethyl)carbamoyl)-2-methylphenyl)-7-(dimethylamino)-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 8)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.95 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6 Hz, 2H), 4.15 (m, 1H), 3.34 (s, 12H), 2.09 (s, 3H), 1.65 (m, 13H), 0.62, 0.61 (6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.4, 167.8, 155.8, 149.3, 142.2, 140.8, 140.3, 133.60, 131.5, 129.0, 128.9, 128.4, 122.3, 115.4, 51.6, 40.9, 33.4, 28.1, 26.8, 25.2, 19.4, -1.2.
N -(10-(5-((2-cyclohexylethyl)carbamoyl)-2-methylphenyl)-7-(dimethylamino)-5,5-dimethyldibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium ( SiR - Mito 9)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ7.94 (dd, J = 7.2Hz, 1H), 7.60 (d, J = 1.8Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.2Hz, 1H), 7.38 (d, 3.0Hz, 2H), 7.06 (d, J = 9.6Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 9.6Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.6 or 7.8Hz, 2H), 3.34 (s, 12H), 2.10 (s, 3H), 1.70 (m, 7H), 1.50 (d, J = 8.4Hz, 2H), 1.29 (m, 3H), 0.97 (m, 2H), 0.62,0.59 (6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ168.9, 168.5, 155.4, 149.1, 141.8, 140.6, 140.0, 133.0, 131.2, 128.6, 128.3, 128.0, 121.9, 115.0, 40.5, 38.5, 37.6, 36.4, 34.0, 27.3, 27.0, 19.1, -1.6.
N -(7-(dimethylamino)-5,5-dimethyl-10-(2-methyl-5-(octan-2-ylcarbamoyl)phenyl)dibenzo[b,e]silin-3(5H)-ylidene)- N -methylmethanaminium (SiR-Mito 10)
1H NMR (600 MHz, Methanol-d4) δ8.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.95 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.07 (d, 9.6 Hz, 2H), 6.80 (dd, J = 9.6 Hz, 2H), 4.15 (m, 1H), 3.34 (s, 12H), 2.10 (s, 3H), 1.30 (m, 10H), 1,21 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.87 (m, 3H), 0.62, 0.61 (6H); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d4) δ169.3, 168.5, 155.9, 149.6, 142.2, 142.2, 140.9, 140.3, 133.6, 131.6, 129.0, 128.8, 128.4, 122.3, 155.4, 47.3, 40.9, 17.5, 32.9, 30.2, 27.5, 23.6, 21.0, 19.4, 14.4, -1.2, -1.3.
실시예 2. 세포 배양 및 형광 현미경 영상법
HeLa 인간 자궁 경부암 세포는 10% FBS (GIBCO)과 1 % 페니실린 (GIBCO)을 포함한 Dulbecco 's modified eagle media (DMEM, GIBCO) 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO2로 습식 배양하였다. 형광 현미경 이미징을 위해 세포를 TrypLETM Express (GIBCO)를 사용하여 수확하고 신선한 배지에 재현탁하였다. 4.0 × 103 세포/웰의 밀도로 수확된 세포를 96 검정색 웰 플레이트(CORNING)에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 세포를 SiR-Mito 프로브(1 μM)와 MitoTracker Green (0.5 μM)과 함께 60분간 배양하였다. 배양 후, 세포를 1X PBS로 3회 세척하고 역 형광 현미경 (DMi8, LEICA)으로 관찰하였다. 각 실험은 DAPI 채널를 위해 325-375 nm exciter, 435-485 nm emitter, FITC 채널을 위해 460-500 nm exciter, 512-542 nm emitter, Rhodamine 채널을 위해 541-551 nm exciter, 565-605 nm emitter , Cy5 채널을 위해 663-738 nm exciter, 545-625 nm emitter를 사용하여 관찰하였다.
실시예 3. 실리콘-로다민 형광 프로브의 미토콘드리아 표적화 효율
프로브 소수성의 효과에 기인하는 미토콘드리아에 표적화하는 효율을 확인하기 위해, 상업적 형광 미토콘드리아 바이오프로브인 MitoTracker green과 SiR-Mito ㅍ프로브의 공존(colocalization)에 대한 피어슨 계수를 측정하였다 (도 2). 공존 테스트를 위해, HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 분주하고 1 μM의 각기 다른 SiR-Mito 프로브와 0.5 μM의 MitoTracker green과 함께 1 시간 동안 항온 처리한 후, 1 x PBS로 간단히 세척하고, LEICA DMi8 형광 현미경을 사용하여 40 × 배수로 이미징하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 것과 같이, 상이한 아민에 대한 단순 접합에 따른 SiR-Mito 프로브의 소수성의 변화는 미토콘드리아 표적화에 커다란 영향을 주었다. 피어슨 계수 값은 프로브에 따라 0.01 - 0.94 범위로 유의하게 상이한 것으로 나타났다. 예를 들어, HeLa 세포와 SiR-Mito 1의 배양은 cLogP 값이 3 미만으로 나타나 SiR 채널에 형광 신호가 없음을 알 수 있었다. 이에, 3 보다 낮은 cLogP 값을 갖는 SiR을 함유하는 형광 접합체는 너무 극성이어서 세포에 들어갈 수 없다는 결론을 내렸다. 특히, cLogP 값이 3.38 ~ 4.95인 SiR-Mito 프로브 (SiR-Mito 2 ~ SiR-Mito 5)는 중간의 피어슨 계수 (0.31 ~ 0.79)와 연관이 있었지만 cLogP 값이 5.50 ~ 6.33 인 프로브 (SiR-Mito 6에서 SiR-Mito 10)는 피어슨 계수 값이 더 높아졌다 (> 0.9; 표 1). 따라서, 후자의 cLogP 범위는 SiR 형광 색소를 기반으로하는 효과적인 미토콘드리아 프로브를 개발하는 데 가장 적합한 것으로 나타났다. 특히, SiR-Mito 6에서 SiR-Mito 10까지의 프로브는 유사한 피어슨 계수 (0.91에서 0.93까지)를 나타내었지만 세포 내 형광의 다른 평균을 나타내었다 (도 3).
SiR-Mito 4 내지 SiR-Mito 10에서 동일 농도에 의해 생성되는 형광 강도(10-5 M in PBS)가 현저히 유사하여, 프로브의 소수성이 미토콘드리아 축적에 주요한 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 프로브들 중, SiR-Mito 8은 가장 강한 Pearson 계수와 가장 강한 세포 내 형광을 나타내었다.
실시예 4. SiR - Mito 8의 라이브 세포에서의 미토콘드리아 특이성 확인
SiR-Mito 8 및 MitoTracker green을 사용한 라이브 세포 표지에 따른 미토콘드리아 특이성을 고해상도 이미징을 통해 확인해 보고자 하였다.
이를 위하여, HeLa 및 Hep3B 세포를 10% FBS (GIBCO) 및 1 % 페니실린 (GIBCO)을 함유한 DMEM (GIBCO) 배지로 5% CO2의 습식 배양기에서 배양하였다. 형광 현미경 이미징을 위해 세포를 TrypLETM Express (GIBCO)를 사용하여 수확하고 신선한 배지에 재현탁하였다. 수확된 세포를 4.0 x 104 세포/웰의 밀도를 갖는 공촛점 접시에 분주하였다. 24시간 배양한 후, 세포를 SiR-Mito 8 (1 μM) 및 Mitotracker green (0.5 uM)과 함께 60분 동안 배양하였다. 세포를 1X PBS로 3회 세척하고 역 형광 현미경 (DMi8, LEICA)으로 관찰하였다.
그 결과, 두 프로브 모두 라이브 세포에서 뛰어난 동시 발현을 관찰할 수 있었으며(도 4a), 이로써 SiR-Mito 8의 라이브 세포에서의 미토콘드리아 특이성을 확인할 수 있었고, 따라서 SiR-Mito 8는 조영제로서 사용 가능할 것이다.
실시예 5. SiR - Mito 8의 라이브 세포에서의 미토콘드리아 표적화 효율
SiR-Mito 8의 라이브 세포에서의 미토콘드리아 표적화 효율을 고해상도 이미징을 통해 확인해 보고자 하였다.
이를 위하여 Mitochondria-YFP 과발현 플라스미드를 카톨릭 대학교(서울, 한국)에서 수득하여, Chang 간세포로 트랜스펙션시켰다. Mitochondria-YFP를 발현하는 안정한 클론을 0.25mg/ml G418을 사용하여 선별하였다. 이후 Mitochondria-YFP에 감염된 Chang 간세포를 10% FBS (GIBCO) 및 1 % 페니실린 (GIBCO)을 함유한 DMEM (GIBCO) 배지로 5% CO2의 습식 배양기에서 배양하였다. 형광 현미경 이미징을 위해 세포를 TrypLETM Express (GIBCO)를 사용하여 수확하고 신선한 배지에 재현탁하였다. 수확된 세포를 4.0 x 104 세포/웰의 밀도를 갖는 공촛점 접시에 분주하였다. 24 시간 배양 후, 세포를 SiR-Mito 8 (1 μM)과 함께 60 분 동안 배양하였다. 세포를 1X PBS로 3 회 세척하고 역 형광 현미경 (DMi8, LEICA)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4b에서와 같이 SiR-Mito 8의 높은 미토콘드리아 타겟팅 효율을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 종양 세포주에서의 SiR - Mito 8의 미토콘드리아 특이성 확인
SiR-Mito 8 프로브의 미토콘드리아 특이성을 확인하기 위해 Hep3B 인간 암 세포주를 SiR-Mito 8 이외에 핵 및 리소좀 추적자와 함께 염색하였다.
이를 위하여, 6.0 x 104의 인간 HCC 세포주 Hep3B 세포를 공촛점 접시에 분주하고 2일 동안 배양하였다. 2일 후, Hep3B 세포를 Hoechst, 1 μM Lysotracker Red 및 1 μM SiR-Mito 8를 포함하는 배양액과 함께 1 시간 배양하였다. 배양 후, Hep3B 세포를 세포 배양 배지로 3회 세척하고 역 형광 현미경 (DMi8, LEICA)으로 관찰하였다.
Lysotracker Red를 이용한 라이브 세포 이미징으로 확인한 결과, 종양 세포의 리소좀에 축적되는 것으로 알려진 다른 소수성 화합물과는 달리 SiR-Mito 8는 높은 미토콘드리아 특이성을 나타내었다 (도 5).
실시예 7. 세포독성 시험
미토콘드리아 염색을 위한 잠재적인 근적외선 형광 추적자로서 SiR-Mito 8을 사용하고자, 상기 프로브의 세포 독성을 평가하고자 하였다. HeLa, Hep3B, HepG2 및 Raw 264.7 세포를 다양한 농도(0.25 내지 10.0 μM)의 SiR-Mito 8과 함께 배양하고 세포 독성을 미토콘드리아 호흡 생존능 분석법으로 측정하였다.
구체적으로, HeLa 인간 자궁 경부암 세포, Hep3B 및 HepG2 인간 간세포 암종 세포 및 Raw264.7 마우스 대식세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 분주하고 밤새 플레이트에 부착시켰다. 세포를 1, 4, 12 또는 24 시간 동안 각 농도의 SiR-Mito 8 (0.25 μM ~ 10 μM)이 함유 된 세포 배양 배지와 함께 배양하였다. 배양 후, CellTiter 96®Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) 을 각 웰에 첨가 하였다. 2 시간 후, Cytation 3 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek)로 490nm 흡광도를 측정하였다. SiR-Mito 8의 세포 독성은 한 번의 실험에서 3회 반복하고 각 실험을 최소 3회 반복하여 테스트하였다.
그 결과, 적정 용량(1μM 미만)의 SiR-Mito 8은 24 시간까지 급성 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
실시예 8. 정상 세포와 암 세포 사이의 형광 강도 비교 실험
미토콘드리아의 막 전위차는 정상 세포보다 암세포에서 유의하게 높다는 것이 잘 알려져있다. 따라서, SiR-Mito 8은 리간드 접합을 포함하지 않고 정상 세포와 암 세포를 구별할 수 있다고 예측되었다. 형광 종양 이미징을 위하여, 인간 간암 Hep3B 세포와 인간 간세포 주 L02를 1.0 μM의 SiR-Mito 8와 함께 1 시간 동안 배양하고, 배지로 3 회 세척 한 다음 LEICA DMi8 형광 현미경으로 촬영하였다.
구체적으로는, Hep3B 및 HepG2 인간 간암 세포를 10 % FBS (GIBCO) 및 1 % 페니실린 (GIBCO)을 함유하는 DMEM (GIBCO) 배지에서, 그리고 L02 인간 간 정상 세포는 10 % FBS (GIBCO)와 1 % 페니실린 (HyClone)을 포함하는 L - 글루타민과 함께 RPMI 1640 (CAPRICORN) 배지에서, 5 % CO2, 37 ℃조건으로 습식 배양기를 이용하여 배양하였다. 형광 현미경 이미징을 위해 TrypLETM Express (GIBCO)를 사용하여 세포를 수확하고 신선한 배지에 재현탁하였다. 수확된 세포를 암세포의 경우 3.0 × 104 세포/웰, 정상 세포의 경우 4.0 × 104 세포/웰의 밀도로 96-웰 검정색 플레이트 (CORNING)에 분주하였다. 24시간 배양 후, 미토콘드리아의 염색을 위해 세포를 SiR-Mito 8 (1 μM)과 함께 60분 동안 배양하였다. 세포를 세포 배양 배지로 3회 세척하고 역 형광 현미경 (DMi8, LEICA)으로 관찰하였다.
그 결과, 암 세포에서의 형광 강도가 정상 세포에서의 형광 강도보다 현저히 높게 나타나(도 7), 상기 프로브는 암 세포 진단 또는 암 세포 특이적 약물 전달체로 활용 가능함을 알 수 있었다.
본 발명은 실리콘-로다민 형광단의 소수성을 체계적으로 교란시킴으로써 미토콘드리아를 선택적으로 염색하는 근적외선 바이오프로브에 관한 것으로, 본 발명에 의해 10개의 상이한 SiR 형광 색소 접합체가 합성되었고, 이들은 각각의 소수성에 따라 미토콘드리아 특이적 염색에 서로 상이한 효과를 나타내었다. 미토콘드리아 표적화를 위한 cLogP 값의 최적 범위는 5.50 내지 6.33로 확인되었고, 10개의 프로브 중 SiR-Mito 8이 가장 높은 세포 내 형광 강도를 나타냈을 뿐 아니라, 라이브 세포에서 상업적인 형광 미토콘드리아 바이오프로브와 공존 정도가 가장 강하게 나타났다. 또한, SiR-Mito 8은 시험관 내에서 암-특이적 근적외선 이미징에 활용할 수 있음이 확인되었다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112020062870706-pat00006

    여기서, 상기 R은 2-히드록시리 에틸(2-Hydroxyle ethyl), 에틸(Ethyl), n-부틸(n-Butyl), 벤질(Benzyl), 페닐에틸(Phenylethyl), 사이클로헥실메틸(Cyclohexylmethyl), tert-옥틸(tert-Octyl), 사이클로옥틸(Cyclooctyl), 사이클로헥실에틸(Cyclohexylethyl) 및 2-메틸헵틸(2-Methylheptyl)로 구성된 군에서 선택되는 소수성기를 나타냄.
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 미토콘드리아 표적용 프로브로, 상기 프로브는 5.50 내지 6.33의 cLogP 값을 가지는 것을 특징으로 하는 프로브:
    [화학식 1]
    Figure 112020062870706-pat00007

    여기서, 상기 R은 소수성기를 나타냄.
  4. 제3항에 있어서, 상기 R은 2-히드록실 에틸(2-Hydroxyle ethyl), 에틸(Ethyl), n-부틸(n-Butyl), 벤질(Benzyl), 페닐에틸(Phenylethyl), 사이클로헥실메틸(Cyclohexylmethyl), tert-옥틸(tert-Octyl), 사이클로옥틸(Cyclooctyl), 사이클로헥실에틸(Cyclohexylethyl) 및 2-메틸헵틸(2-Methylheptyl)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로브.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 근적외선 형광 프로브인 것을 특징으로 하는 프로브.
  6. 삭제
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는 미토콘드리아 검출용 조성물.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는 조영제.
  9. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는 암 진단용 조성물.
  10. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는 약물 전달체.
  11. 다음 단계를 포함하는 시험관 내 세포에서 미토콘드리아를 시각화하는 방법:
    제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 프로브를 시험관 내 세포에 주입하는 단계; 및
    상기 세포에서 생성된 검출 가능한 형광 신호를 측정하는 단계.
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