CN113981004B - 细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针及其制备方法与应用。所述遗传编码纳米探针包括：光学遗传模块，主要由腺病毒和腺病毒感染的神经元组成，并表达在腺病毒基因感染的神经元细胞膜上，所述光学遗传模块具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因，VSD基因、HaloTag基因的序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；以及近红外二区荧光探针，主要包括近红外二区有机纳米探针、量子点探针和长度可调的连接子。本发明通过将遗传编码的膜电位检测方法与近红外二区荧光技术协同，可以对单个神经元的电生理活动进行观测，为观测神经元细胞膜电活动提供方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米探针，具体涉及一种细胞膜电位检测的遗传编码的近红外二区纳米探针及其制备方法与应用，属于基因工程、脑科学技术领域。
背景技术
脑科学的研究重点之一就是脑的结构和功能，在细胞水平上实现对神经元活动的实时观察和特定神经环路的结构追踪是解析脑结构功能必不可少的。目前依托光和电这两种基本物理信号的神经生物学观测手段主要有微电极检测、钙成像、电压敏感成像三大门类。电压敏感成像中荧光成像利用化学探针即电压敏感染料灌注靶向细胞或组织，当激发光照射下，细胞膜电位收到刺激而发生变化，化学探针同步出现荧光或者吸光变化。通过光学成像系统记录细胞膜表面荧光的变化，将其转化为响应电信号，通过计算机系统进行数据存储、分析、图像处理。相较化学探针，量子点(Quantum,QD)的荧光强度高，响应速度快，光稳定性强，在光、声、磁、电方向均有其优势，QD在脑科学领域已经有了相当的应用。光遗传技术主要利用光来调控生物的生理功能，脑科学领域中光遗传学被用来调控神经元的兴奋、抑制、稳态调节、生化信息的调节。HaloTag技术是一种成熟的蛋白质标记方法，常被用做蛋白质检验与细胞荧光成像。电压感应域(Voltage-sensing domains,VSD)作为电压门控离子通道的一部分，VSD内部结构的相互作用介导了膜电位的变化，在维持细胞的兴奋性方面起着关键作用。已有研究针对VSD设计出光学遗传工具，设计对细胞膜电位敏感、信噪比高，更够分辨单个动作电位的荧光分子探针，实现对神经元电活动的检测。通过光学遗传手段结合纳米探针检测细胞膜电位的研究目前还较少进行。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针及其制备方法与应用，克服现有技术的不足。
为了达到前述发明目的，本发明采用了以下方案：
本发明实施例提供了一种细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其包括：
光学遗传模块，包括重组蛋白，主要由腺病毒和腺病毒感染的神经元组成，并表达在腺病毒基因感染的神经元细胞膜上，所述光学遗传模块具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因，所述电压传感域VSD基因具有如SEQID No.1所示的序列，所述标签蛋白HaloTag基因具有如SEQ ID No.2所示的序列；
以及，近红外二区荧光探针，主要包括近红外二区有机纳米探针、量子点探针和长度可调的连接子。
进一步地，所述重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述近红外二区荧光探针的吸收波长在800nm～1000nm，发射波长位于1000nm～1200nm，尺寸粒径规模在2-500nm。
进一步地，还包括HaloTag反应连接子即HaloTag配体与纳米探针相连，该配体与HaloTag蛋白以共价键相连。
进一步地，长度可调连接子与HaloTag反应连接子相连，实现对不同尺寸近红外二区探针在膜内外位置的调控。
本发明实施例还提供了所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针的制备方法，其包括：
构建含有报告基团的腺病毒，之后感染神经元细胞，获得表达重组蛋白的神经元；报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因；
将HaloTag配体及连接子与所述近红外二区荧光探针通过反应相连；实现在膜内外的运动及荧光变化；
将所获近红外二区荧光探针在缓冲溶液中稀释分散，孵育表达重组蛋白的神经元，实现近红外二区荧光探针与神经元的特异性标记，获得细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针。
本发明实施例还提供了所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针于细胞膜电位检测中的应用。
相应的，本发明实施例还提供了一种细胞膜电位的检测方法，主要基于所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针而实施，其包括：
提供光学遗传模块；
利用所述光学遗传模块建立神经元模型；
利用近红外二区纳米探针对神经元进行标记，获得标记的神经元；
以及，将所述的标记的神经元进行膜电位的电生理检测、光学信号检测。
与现有的技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，具有稳定表达电压传感域VSD的腺病毒载体，该段蛋白序列中插入HaloTag蛋白形成重组蛋白，携带于腺病毒基因中，能够感染进入靶细胞。进入靶细胞的蛋白表达在细胞膜外，实现特异性细胞标记，同时标签蛋白与相应配体-级联放大子-探针复合物结合，存在近红外二区激发光且膜电位由静息膜电位转变为动作电位时，VSD结构变化使HaloTag相对于细胞膜发生空间位移，该位移带动配体-级联放大子-探针在细胞膜/细胞外液两界面上运动。在800nm～1000nm波长的激发光照射下，纳米探针在细胞膜/细胞外液的油水环境中荧光强度不同。通过电生理手段测定染料荧光变化率，测量探针效率，通过光电变化实现对膜电位的检测，增加了能够检测膜电位的神经元近红外二区荧光探针，为实现对活体的原位神经元电生理活动提供了一个可用的探针；
2)本发明提供的细胞膜电位检测的遗传编码纳米中，VSD结构中插入HaloTag蛋白，同步实现了对细胞的特异性标记和细胞兴奋性感应。通过级联放大作用结合近红外二区纳米探针的发射波长位于1000nm～1200nm的荧光特性，增强了细胞膜电位监测的空间穿透率和时间分辨率。纳米探针的尺寸可调，实现单个神经实时同时可视化体外膜电位监测；可用于神经元集群的示踪和电生理检测和特定神经环路的功能研究；
3)本发明通过将遗传编码的膜电位检测方法与近红外二区荧光技术协同，可以对单个神经元的电生理活动进行观测，有助于建立一种通用的病毒表达光遗传学系统和近红外二区纳米探针协同工作策略，病毒表达系统赋予细胞新功能、近红外二区纳米探针对神经元膜电位检测提供了新的方法。
附图说明
为了更清楚的说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施例中细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针的设计示意图；
图2是本发明一典型实施例中腺病毒上携带的目的基因的设计序列示意图；
图3a和图3b是本发明实施例1中拍摄的表达VSD-HaloTag的转基因293A细胞的明场细胞示意图和荧光示意图；
图4a、图4b和图4c分别是本发明实施例1中电压钳钳制电压程序性改变记录示意图，原代培养神经细胞的明场图与染料FluoVolt标记荧光图，膜电位变化时对应的荧光变化图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是选用近红外二区有机纳米探针或量子点探针，设计能够特异性标记并感应膜电位的遗传编码原件。将能与配体特异性结合的标签蛋白HaloTag插入跨膜电位蛋白元件VSD构成重组载体，实现感应细胞膜电位的同时在特定类型细胞的细胞膜上选择性表达。配体与近红外二区荧光探针相连形成配体-探针复合物，在细胞电位发放的过程中，VSD感受到膜电位变化而形态改变引发探针周围环境改变，在近红外二区激光激发下纳米探针在油水界面中迁移，使荧光发生改变，通过荧光强度反应细胞膜电位，从而实现高组织穿透深度、高时空分辨率的膜电位响应检测。解决了传统方法较难以实现的强荧光、高穿透、特异性检测神经元膜电位在体外的变化状况。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一个标签蛋白表达的平台，其包括：
光学遗传工具，包括重组蛋白，主要由携带设计的插入了标签蛋白HaloTag的电压传感域VSD的腺病毒组成，表达在被基因递送的神经元细胞上，所述工具具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因；所述电压传感域VSD基因具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述标签蛋白HaloTag基因具有如SEQ ID No.2所示的序列。
其中，具体的，所述电压传感域VSD基因的序列具体包括：ATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACAGGGGTCAGAGCTCACTAAAACTTCGAGCTCTCCAACAGCAGATGAGCCCACGATAAAGATTGATGATGGTCGTGATGAGGGTAATGAACAAGACAGCTGTTCCAATACCATTAGGAGAAAAATTTCCCCGTTTGTGATGTCATTTGGATTCAGAGTATTTGGAGTTGTGCTTATCATTGTAGACATCATAGTGGTGATTGTGGATCTGGCCATCAGTGAGAAGAAAAGAGGCATTAGAGAGATTCTTGAAGGTGTTTCCCTGGCTATAGCACTCTTCTTCCTTGTTGATGTTCTCATGAGAGTGTTTGTTGAAGGCTTCAAGAACTATTTCCGGTCCAAACTGAATACTTTGGATGCAGTCATAGTAGTGGGCACTCTGCTAATTAATATGACCTACTCCTTCTCTGACCTTGCTGCCACAGATCAGATGCCGCAGATGGTTACTCTTCTTCGAGTTCTGAGAATTGTTATCTTAATAAGAATATTTCGCCTGGCTTCACAGAAGAAACAACTTGAAGTGGTAACCTAA。
其中，具体的，所述HaloTag基因的序列具体包括：GCAGAAATCGGTACTGGCTTTCCATTCGACCCCCATTATGTGGAAGTCCTGGGCGAGCGCATGCACTACGTCGATGTTGGTCCGCGCGATGGCACCCCTGTGCTGTTCCTGCACGGTAACCCGACCTCCTCCTACGTGTGGCGCAACATCATCCCGCATGTTGCACCGACCCATCGCTGCATTGCTCCAGACCTGATCGGTATGGGCAAATCCGACAAACCAGACCTGGGTTATTTCTTCGACGACCACGTCCGCTTCATGGATGCCTTCATCGAAGCCCTGGGTCTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATTCACGACTGGGGCTCCGCTCTGGGTTTCCACTGGGCCAAGCGCAATCCAGAGCGCGTCAAAGGTATTGCATTTATGGAGTTCATCCGCCCTATCCCGACCTGGGACGAATGGCCAGAATTTGCCCGCGAGACCTTCCAGGCCTTCCGCACCACCGACGTCGGCCGCAAGCTGATCATCGATCAGAACGTTTTTATCGAGGGTACGCTGCCGATGGGTGTCGTCCGCCCGCTGACTGAAGTCGAGATGGACCATTACCGCGAGCCGTTCCTGAATCCTGTTGACCGCGAGCCACTGTGGCGCTTCCCAAACGAGCTGCCAATCGCCGGTGAGCCAGCGAACATCGTCGCGCTGGTCGAAGAATACATGGACTGGCTGCACCAGTCCCCTGTCCCGAAGCTGCTGTTCTGGGGCACCCCAGGCGTTCTGATCCCACCGGCCGAAGCCGCTCGCCTGGCCAAAAGCCTGCCTAACTGCAAGGCTGTGGACATCGGCCCGGGTCTGAATCTGCTGCAAGAAGACAACCCGGACCTGATCGGCAGCGAGATCGCGCGCTGGCTGTCTACTCTGGAGATTTCCGGT。
本发明实施例的一个方面提供了一种细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，包括：
光学遗传模块，包括重组蛋白，主要由腺病毒和腺病毒感染的神经元组成，并表达在腺病毒基因感染的神经元细胞膜上，所述光学遗传模块具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因，所述电压传感域VSD基因具有如SEQID No.1所示的序列，所述标签蛋白HaloTag基因具有如SEQ ID No.2所示的序列；
以及，近红外二区荧光探针，主要包括近红外二区有机纳米探针、量子点探针和长度可调的连接子。
在一些具体的实施方案中，所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针包括：
重组蛋白，表达在腺病毒基因感染的神经元细胞膜上，所述腺病毒基因具有的报告基因为电压传感域VSD和标签蛋白HaloTag；以及近红外二区荧光探针，探针连接卤代标签功能基团，即为HaloTag标签配体，该配体与HaloTag蛋白形成共价键。
进一步地，所述光学遗传模块还包括检测所用标签基因，所述标签基因包括HA-tag。
其中，所述HA-tag具有如SEQ ID No.3所示的序列，具体为：TATCCATATGATGTTCCAGATTATGCT。
在一些实施方案中，所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针包括：
光学遗传工具(亦即前述的“光学遗传模块”)，主要由携带设计的插入了标签蛋白HaloTag的电压传感域VSD的腺病毒组成，表达在被基因递送的神经元细胞上，所述基因具有的报告基因为电压传感域蛋白VSD、目的基因HaloTag及检验基因HA-tag。
在一些较为具体的实施方案中，所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针包括：
光学遗传工具，主要由经由腺病毒感染的神经元组成，所述腺病毒基因组具有以下报告基因：CMV启动子转录表达的GFP基因，CMV启动子转录表达的含有HaloTag的VSD序列，多肽HA-tag，所述腺病毒成功稳定感染神经元细胞后，细胞表达GFP荧光蛋白与VSD结构域，所述经感染后的神经元稳定携带并在细胞膜上表达含VSD和HaloTag的重组蛋白。
在一些实施方案中，本发明中腺病毒的报告基因的设计序列示意图如图2所示。
进一步地，所述重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.4所示，具体为：ATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACAGGGGTCAGAGCTCACTAAAACTTCGAGCTCTCCAACAGCAGATGAGCCCACGATAAAGATTGATGATGGTCGTGATGAGGGTAATGAACAAGACAGCTGTTCCAATACCATTAGGAGAAAAATTTCCCCGTTTGTGATGTCATTTGGATTCAGAGTATTTGGAGTTGTGCTTATCATTGTAGACATCATAGTGGTGATTGTGGATCTGGCCATCAGTGAGAAGAAAAGAGGCATTAGAGAGATTCTTGAAGGTGTTTCCCTGGCTATAGCACTCTTCTTCCTTGTTGATGTTCTCATGAGAGTGTTTGTTGAAGGCTTCAAGAACTATTTCCGGTCCAAACTGAATACTTTGGATGCAGTCATAGTAGTGGGCACTCTGCTAATTAATATGACCTACTCCTTCTCTGACCTTGCTGCCGCAGAAATCGGTACTGGCTTTCCATTCGACCCCCATTATGTGGAAGTCCTGGGCGAGCGCATGCACTACGTCGATGTTGGTCCGCGCGATGGCACCCCTGTGCTGTTCCTGCACGGTAACCCGACCTCCTCCTACGTGTGGCGCAACATCATCCCGCATGTTGCACCGACCCATCGCTGCATTGCTCCAGACCTGATCGGTATGGGCAAATCCGACAAACCAGACCTGGGTTATTTCTTCGACGACCACGTCCGCTTCATGGATGCCTTCATCGAAGCCCTGGGTCTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATTCACGACTGGGGCTCCGCTCTGGGTTTCCACTGGGCCAAGCGCAATCCAGAGCGCGTCAAAGGTATTGCATTTATGGAGTTCATCCGCCCTATCCCGACCTGGGACGAATGGCCAGAATTTGCCCGCGAGACCTTCCAGGCCTTCCGCACCACCGACGTCGGCCGCAAGCTGATCATCGATCAGAACGTTTTTATCGAGGGTACGCTGCCGATGGGTGTCGTCCGCCCGCTGACTGAAGTCGAGATGGACCATTACCGCGAGCCGTTCCTGAATCCTGTTGACCGCGAGCCACTGTGGCGCTTCCCAAACGAGCTGCCAATCGCCGGTGAGCCAGCGAACATCGTCGCGCTGGTCGAAGAATACATGGACTGGCTGCACCAGTCCCCTGTCCCGAAGCTGCTGTTCTGGGGCACCCCAGGCGTTCTGATCCCACCGGCCGAAGCCGCTCGCCTGGCCAAAAGCCTGCCTAACTGCAAGGCTGTGGACATCGGCCCGGGTCTGAATCTGCTGCAAGAAGACAACCCGGACCTGATCGGCAGCGAGATCGCGCGCTGGCTGTCTACTCTGGAGATTTCCGGTTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTACAGATCAGATGCCGCAGATGGTTACTCTTCTTCGAGTTCTGAGAATTGTTATCTTAATAAGAATATTTCGCCTGGCTTCACAGAAGAAACAACTTGAAGTGGTAACCTAA。
在一些较为具体的实施方案中，所述神经元膜电位遗传平台主要由腺病毒pTrack-pAdeasy系统与293细胞系组成；将设计的基因与pTrack穿梭质粒相连，穿梭质粒与骨架质粒在感受态菌株中同源重组，获得含有目的基因的腺病毒重组质粒，将含有目的基因的腺病毒重组质粒在293细胞系中包装、扩增，并获得可以在细胞中稳定表达的重组蛋白膜外表达腺病毒。本发明中腺病毒感染293A的转基因细胞的明场和荧光图如图3a和图3b所示。
腺病毒稳定感染神经元细胞后，神经元能够稳定在细胞膜上表达重组蛋白，近红外二区膜电位化学探针分散在神经元标记液中，探针与HaloTag蛋白通过化学共价键相连；其中，当给定足够量的近红外二区探针时，发射光强度与神经元上HaloTag表达数量、探针浓度成正相关。
在一些实施方案中，所述近红外二区荧光探针包括小分子探针、量子点探针等，且不限于此。
进一步的，所述近红外二区荧光探针的量子点探针包括Ag2Se、Ag2S、AgAuSe、PbS等中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述近红外二区荧光探针的吸收波长为800nm～1000nm，发射波长位于1000nm～1200nm，且不限于此。
进一步的，所述近红外二区荧光探针的尺寸粒径规模为2～500nm。
在一些较为具体的实施方案中，所述近红外二区荧光探针还包括与探针荧光报告部分相连的反应连接子即配体，且不限于此。
进一步的，所述配体包括聚乙二醇修饰的配体，且不限于此。
进一步的，所述配体上修饰的聚乙二醇(PEG)的数量为1～20个，且不限于此。
在一些较为具体的实施例方案中，所述近红外二区荧光探针还包括与荧光探针连接结构相连的长度可调连接子，即聚乙二醇，且不限于此，其至少能够使所述近红外二区荧光探针能够在细胞外膜表面和细胞微环境之间移动。
在一些更为具体的实施方案中，所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针包括：
光学遗传模块，主要由腺病毒和腺病毒感染的神经元组成，所述光学遗传模块具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块HaloTag基因；
以及，近红外二区纳米探针，主要由近红外二区有机纳米探针、量子点探针、长度可调的连接子。
进一步地，所述近红外二区纳米探针能够通过修饰，实现级联放大的作用，实现荧光的增强。
进一步地，所述近红外二区纳米探针连接子上修饰的柔性连接子使近红外二区纳米探针能够在细胞外膜表面和细胞微环境之间移动。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针的制备方法，其包括：
构建含有报告基团的腺病毒，之后感染神经元细胞，获得表达重组蛋白的神经元；报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因；
将HaloTag配体及连接子与所述近红外二区荧光探针通过反应相连；形成近红外二区荧光探针；以及，
将所获近红外二区荧光探针在缓冲溶液中稀释分散，孵育表达重组蛋白的神经元，实现近红外二区荧光探针与神经元的特异性标记，获得细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针。
请参阅图1所示，本发明提供的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针的设计及作用原理在于：本发明提供了一种稳定表达电压传感域VSD的腺病毒载体，该段蛋白序列中插入HaloTag蛋白形成重组蛋白，携带于腺病毒基因中，能够感染进入靶细胞。进入靶细胞的蛋白表达在细胞膜外，实现特异性细胞标记，同时标签蛋白与相应连接子-配体-探针复合物结合，存在近红外二区激发光且膜电位由静息膜电位转变为动作电位时，VSD结构变化使HaloTag相对于细胞膜发生空间位移，该位移带动配体-探针在细胞膜/细胞外液两界面上运动。在800nm～1000nm波长的激发光照射下，纳米探针在细胞膜/细胞外液的油水环境中荧光强度不同。通过电生理手段测定染料荧光变化率，测量探针效率，通过光电变化实现对膜电位的检测，增加了能够检测膜电位的神经元近红外二区荧光探针，为实现对活体的原位神经元电生理活动提供了一个可用的探针。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针于脑科学领域中的应用。
具体的，本发明实施例的另一个方面还提供了前述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针于细胞膜电位检测中的应用。
本发明提供的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针在VSD结构中插入HaloTag蛋白，同步实现了对细胞的特异性标记和细胞兴奋性感应。通过近红外二区纳米探针的发射波长位于1000nm～1200nm的荧光特性，增强了细胞膜电位监测的空间穿透率和时间分辨率。纳米探针的尺寸可调，实现单个神经实时同时可视化体外膜电位监测；可用于神经元集群的示踪和电生理检测和特定神经环路的功能研究。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞膜电位的检测方法，主要基于所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针而实施，其包括：
提供前述的光学遗传模块；
利用所述光学遗传模块建立神经元模型；
利用近红外二区纳米探针对神经元进行标记，获得标记的神经元；
以及，将所述的标记的神经元进行膜电位的电生理检测、光学信号检测。
本发明提供的细胞膜电位的检测方法，包括膜片钳细胞记录，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述膜片钳细胞记录技术包括单通道记录技术、全细胞记录技术中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述膜电位检测方法包括准备神经元细胞标本、制备玻璃微电极、电极入液、形成高阻封接、破膜、记录电信号。
在一些较为具体的实施方案中，所述神经元膜电位光学检测方法包括用高速近红外相机记录神经元电位变化，且不限于此。
进一步的，所述神经元膜电位变化包括自发神经元电位发放活动、刺激电极诱发动作电位、局部施加神经递质诱导动作电位中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的神经元膜电位遗传编码细胞膜电位探针检测的成像方法，其包括：
提供前述的细胞膜遗传编码细胞膜电位检测系统；
利用所述腺病毒建立VSD-HaloTag目的基因表达系统；
利用近红外二区探针对神经元进行标记，获得标记的神经元；
以及，将所述标记的神经元进行膜电位的检测及同步成像，从而实现对神经元的光电信号转化。
进一步的，所述的神经元感染、近红外二区神经元标记的方式包括体外、组织切片、活体标记中的任意一种，且不限于此。
本发明的一些实施方案中，结合光遗传学工具和近红外二区荧光探针，使用腺病毒系统感染神经元细胞，实现探针对特定细胞的特异性标记。在单个神经元上，对特异性标记神经元的探针进行光信号和电信号的检测与分析，获得对神经元膜电位的精准响应。其中，近红外二区探针的高时空分辨率和空间穿透深度，克服了传统方法难以实现的原位无损检测的难题，为在活体上对细胞膜电位的监测提供了新的方法。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1神经元细胞膜电位检测方法
1、光学遗传工具构建神经元模型
建立携带电压传感域VSD和标签蛋白HaloTag基因的神经元：
采用的电压传感域VSD基因的序列如前述的SEQ ID No.1所示，所述标签蛋白HaloTag基因的序列如前述的SEQ ID No.2所示。
1.1制备携带HaloTag基因的腺病毒
设计将含有VSD-HaloTag的基因插入pTrack质粒，酶切线性化含重组蛋白载体的穿梭载体，将含目的基因的穿梭载体与骨架载体pAdeasy在感受态菌株BJ5183中重组，获得含VSD-HaloTag的pAdeasy质粒；
1.2脂质体转染和腺病毒扩培
将含VSD-HaloTag的pAdeasy质粒与脂质体混合，将脂质体-质粒混合液加入293A细胞中，每孔加入高糖培养基达到终浓度300ng/mL，晃匀孔板，37℃孵化2h，移去含有脂质体和质粒的培养基，加入完全培养基，培养7-14天，待在荧光显微镜下检测出GFP蛋白表达且细胞出现悬浮时，将细胞收集并破碎，用细胞破碎液重新感染293A细胞，扩增出腺病毒。扩增腺病毒结果如图3a和图3b所示。
1.3腺病毒功能和滴度检测
将腺病毒感染神经元，荧光显微镜下观察GFP蛋白表达情况，检测病毒滴度；将细胞用固定液固定，用免疫荧光检验HA-tag表达，确定腺病毒的光学遗传工具功能正常，HA-tag具有如SEQ ID No.3所示的序列。
2、建立表达标签蛋白HaloTag的神经元细胞模型
将收集的腺病毒按照与完全培养基1：100的比例混合，用腺病毒培养基培养细胞1-2天，可以观察到神经元胞内表达GFP蛋白，表达HaloTag的神经元模型构建完成。
其中，所述重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.4所示。
3、神经元纳米探针标记
将发射波长为1000～1200nm的小分子探针溶于0.9％的生理盐水中，超声5-10min使探针分散在生理盐水中，用含有探针的生理盐水替换神经元完全培养基，37℃孵育10-30min，使用近红外二区荧光显微镜检测神经元标记情况。
4、神经元膜电位检测
用近红外二区小分子探针检测表达重组蛋白的神经元去极化状态下的膜电位变化。
4.1用膜片钳技术记录神经元电生理信号；
使用Sutter Instrument公司P-1000激光拉针仪，四步拉制后，将1.5mm玻璃管拉成2μm口径电极，入水电阻2-7MΩ，接着将玻璃电极安装至电极夹持器后，用注射器给予一定正压，操控Sutter MP-255电动微操，使电极缓缓入液。显微镜视野下将入液后电极缓缓移至细胞上方，调节Z轴位置，将电极靠近细胞膜表面，撤去正压，给予一定负压，此时电极电阻可连续升至GΩ。
4.2高速相机记录电位发放下近红外二区去神经元探针的荧光变化。
封接电阻达到GΩ后，先进行快电容补偿，然后继续施加负压，观察电流出现充放电峰形后撤去负压，进行慢电容补偿，膜电阻值800MΩ左右说明破膜状态良好。在全细胞膜片钳模式下，按照预设的刺激程序运行，在-70mV钳制膜电位，然后使细胞去极化到+40mV,去极化时间为500ms，再用808nm波长的红外光照射3-10s，记录电信号。如图4a、4b、4c所示，图4a为电压钳钳制电压程序，利用膜片钳控制细胞膜电位由-100mV依次变化至100mV，按照10mV/次递增，共20次,图4b展示了原代培养神经细胞的明场图像与商业化染料FluoVolt标记荧光结果；图4c为膜电位变化时对应的荧光变化图。
本方法还可用来检测神经元探针对细胞膜电位响应的精确度。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
atggagacga ctgtgaggta tgaacagggg tcagagctca ctaaaacttc gagctctcca 60
acagcagatg agcccacgat aaagattgat gatggtcgtg atgagggtaa tgaacaagac 120
agctgttcca ataccattag gagaaaaatt tccccgtttg tgatgtcatt tggattcaga 180
gtatttggag ttgtgcttat cattgtagac atcatagtgg tgattgtgga tctggccatc 240
agtgagaaga aaagaggcat tagagagatt cttgaaggtg tttccctggc tatagcactc 300
ttcttccttg ttgatgttct catgagagtg tttgttgaag gcttcaagaa ctatttccgg 360
tccaaactga atactttgga tgcagtcata gtagtgggca ctctgctaat taatatgacc 420
tactccttct ctgaccttgc tgccacagat cagatgccgc agatggttac tcttcttcga 480
gttctgagaa ttgttatctt aataagaata tttcgcctgg cttcacagaa gaaacaactt 540
gaagtggtaa cctaa 555
<210> 2
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gcagaaatcg gtactggctt tccattcgac ccccattatg tggaagtcct gggcgagcgc 60
atgcactacg tcgatgttgg tccgcgcgat ggcacccctg tgctgttcct gcacggtaac 120
ccgacctcct cctacgtgtg gcgcaacatc atcccgcatg ttgcaccgac ccatcgctgc 180
attgctccag acctgatcgg tatgggcaaa tccgacaaac cagacctggg ttatttcttc 240
gacgaccacg tccgcttcat ggatgccttc atcgaagccc tgggtctgga agaggtcgtc 300
ctggtcattc acgactgggg ctccgctctg ggtttccact gggccaagcg caatccagag 360
cgcgtcaaag gtattgcatt tatggagttc atccgcccta tcccgacctg ggacgaatgg 420
ccagaatttg cccgcgagac cttccaggcc ttccgcacca ccgacgtcgg ccgcaagctg 480
atcatcgatc agaacgtttt tatcgagggt acgctgccga tgggtgtcgt ccgcccgctg 540
actgaagtcg agatggacca ttaccgcgag ccgttcctga atcctgttga ccgcgagcca 600
ctgtggcgct tcccaaacga gctgccaatc gccggtgagc cagcgaacat cgtcgcgctg 660
gtcgaagaat acatggactg gctgcaccag tcccctgtcc cgaagctgct gttctggggc 720
accccaggcg ttctgatccc accggccgaa gccgctcgcc tggccaaaag cctgcctaac 780
tgcaaggctg tggacatcgg cccgggtctg aatctgctgc aagaagacaa cccggacctg 840
atcggcagcg agatcgcgcg ctggctgtct actctggaga tttccggt 888
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
tatccatatg atgttccaga ttatgct 27
<210> 4
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
atggagacga ctgtgaggta tgaacagggg tcagagctca ctaaaacttc gagctctcca 60
acagcagatg agcccacgat aaagattgat gatggtcgtg atgagggtaa tgaacaagac 120
agctgttcca ataccattag gagaaaaatt tccccgtttg tgatgtcatt tggattcaga 180
gtatttggag ttgtgcttat cattgtagac atcatagtgg tgattgtgga tctggccatc 240
agtgagaaga aaagaggcat tagagagatt cttgaaggtg tttccctggc tatagcactc 300
ttcttccttg ttgatgttct catgagagtg tttgttgaag gcttcaagaa ctatttccgg 360
tccaaactga atactttgga tgcagtcata gtagtgggca ctctgctaat taatatgacc 420
tactccttct ctgaccttgc tgccgcagaa atcggtactg gctttccatt cgacccccat 480
tatgtggaag tcctgggcga gcgcatgcac tacgtcgatg ttggtccgcg cgatggcacc 540
cctgtgctgt tcctgcacgg taacccgacc tcctcctacg tgtggcgcaa catcatcccg 600
catgttgcac cgacccatcg ctgcattgct ccagacctga tcggtatggg caaatccgac 660
aaaccagacc tgggttattt cttcgacgac cacgtccgct tcatggatgc cttcatcgaa 720
gccctgggtc tggaagaggt cgtcctggtc attcacgact ggggctccgc tctgggtttc 780
cactgggcca agcgcaatcc agagcgcgtc aaaggtattg catttatgga gttcatccgc 840
cctatcccga cctgggacga atggccagaa tttgcccgcg agaccttcca ggccttccgc 900
accaccgacg tcggccgcaa gctgatcatc gatcagaacg tttttatcga gggtacgctg 960
ccgatgggtg tcgtccgccc gctgactgaa gtcgagatgg accattaccg cgagccgttc 1020
ctgaatcctg ttgaccgcga gccactgtgg cgcttcccaa acgagctgcc aatcgccggt 1080
gagccagcga acatcgtcgc gctggtcgaa gaatacatgg actggctgca ccagtcccct 1140
gtcccgaagc tgctgttctg gggcacccca ggcgttctga tcccaccggc cgaagccgct 1200
cgcctggcca aaagcctgcc taactgcaag gctgtggaca tcggcccggg tctgaatctg 1260
ctgcaagaag acaacccgga cctgatcggc agcgagatcg cgcgctggct gtctactctg 1320
gagatttccg gttatccata tgatgttcca gattatgcta cagatcagat gccgcagatg 1380
gttactcttc ttcgagttct gagaattgtt atcttaataa gaatatttcg cctggcttca 1440
cagaagaaac aacttgaagt ggtaacctaa 1470
Claims (9)
1.一种细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于，包括：光学遗传模块和近红外二区荧光探针；
所述光学遗传模块由腺病毒和腺病毒感染的神经元组成，重组蛋白表达在腺病毒基因感染的神经元细胞膜上；表达重组蛋白的所述神经元由含有报告基团的腺病毒感染神经元细胞构建得到；所述光学遗传模块具有的报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因；
所述电压传感域VSD基因具有如SEQ ID No.1所示的序列；所述标签蛋白HaloTag基因具有如SEQ ID No.2所示的序列；所述重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID No.4所示；
所述近红外二区荧光探针包括量子点探针和连接子；
所述连接子修饰在所述近红外二区荧光探针上，其至少能够使所述近红外二区荧光探针能够在细胞外膜表面和细胞微环境之间移动；
HaloTag配体能够与所述近红外二区荧光探针通过反应相连形成配体-连接子-探针复合物；
HaloTag标签蛋白与所述配体-连接子-探针复合物结合，当存在近红外二区激发光且膜电位由静息膜电位转变为动作电位时，VSD结构变化使所述HaloTag标签蛋白相对于细胞膜发生空间位移，该位移带动所述配体-连接子-探针复合物在细胞膜/细胞外液两界面上运动。
2.根据权利要求1所述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于：所述光学遗传模块还包括检测所用标签基因。
3.根据权利要求2所述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于：所述标签基因包括HA-tag，所述HA-tag具有如SEQ ID No.3所示的序列。
4.根据权利要求3所述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于：所述量子点探针包括Ag2Se、Ag2S、AgAuSe、PbS中的任意一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于：所述近红外二区荧光探针的吸收波长为800nm~1000nm，发射波长位于1000nm~1200nm，尺寸粒径为2~500 nm。
6.根据权利要求1所述的细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针，其特征在于：所述连接子为聚乙二醇。
7.如权利要求1-6中任一项所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针的制备方法，其特征在于，包括：
构建含有报告基团的腺病毒，之后感染神经元细胞，获得表达重组蛋白的神经元；报告基因包括被插入模块电压传感域VSD基因及插入模块标签蛋白HaloTag基因；
将HaloTag配体及连接子与所述近红外二区荧光探针通过反应相连；以及，
将所获近红外二区荧光探针在缓冲溶液中稀释分散，孵育表达重组蛋白的神经元，实现近红外二区荧光探针与神经元的特异性标记，获得细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针。
8.权利要求1-6中任一项所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针于细胞膜电位检测中的应用。
9.一种细胞膜电位的检测方法，主要基于权利要求1-6中任一项所述细胞膜电位检测的遗传编码纳米探针而实施，其特征在于，包括：
提供光学遗传模块；
利用所述光学遗传模块建立神经元模型；
利用近红外二区纳米探针对神经元进行标记，获得标记的神经元；
以及，将所述的标记的神经元进行膜电位的电生理检测、光学信号检测。
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