CN112592936A - 串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用 - Google Patents

串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及蛋白质相互作用成像技术领域，本申请提供一种串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用。该系统包括第一载体和第二载体。第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2和第一基因序列的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3和第二基因序列的载体。利用该系统，可以在同一细胞内共表达第一蛋白‑IFN132‑IFN132形成的融合蛋白以及IFC133‑IFC133‑第二蛋白形成的融合蛋白。在第一蛋白和第二蛋白的相互作用下，IFN132‑IFN132串联片段和IFC133‑IFC133串联片段相互靠近以重构成近红外光敏色素蛋白IFP2.0并被激发以发出荧光。重构的近红外光敏色素蛋白IFP2.0能够在生理温度下成熟，并且发出的荧光亮度更强，有利于成像观察。

Description

串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用
技术领域
本申请涉及蛋白质相互作用成像技术领域，特别是涉及一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统、该系统的构建方法以及应用。
背景技术
蛋白质之间的相互作用在生物体的生命过程中发挥了重要的作用。比如在基因调控、细胞信号转导以及肿瘤的生长发育过程中均涉及到许多蛋白质之间的相互作用。监测这些蛋白质间的相互作用对于生命过程的解析尤为重要。在过去的几十年里有一些基于荧光成像的方法被发展并用于研究蛋白质间的相互作用，比如：荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)、基于单重态氧三重态能量转移的成像技术以及双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)等。
双分子荧光互补系统是一种以荧光蛋白作为材料的片段互补系统。其基本原理是在荧光蛋白的合适位点将其拆分成各自不发荧光的两个片段。当两个相互作用的蛋白分别与拆分的不发荧光的两个片段相互融合，在这两个相互作用蛋白的作用下，拆分的不发荧光两个片段就会相互靠近，从而恢复完整荧光蛋白的构象而发出特异性的荧光。双分子荧光互补技术是一种检测蛋白质间相互作用的简便、直观、灵敏的方法，近些年得到越来越多的关注。
目前发展的双分子荧光互补系统包括基于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光互补系统。但是，GFP的荧光互补系统需要在低温条件下才能使产生成熟的完整荧光蛋白并发出荧光，从而限制了该系统在生理条件下的应用。并且，在生物组织的荧光成像过程中，600nm-1200nm波长的光具有比较好的组织通透性，能够在动物活体中产生较好的成像效果。而GFP的荧光互补系统产生的荧光波长较短，通常小于600nm，从而限制了基于GFP的荧光片段互补系统在动物活体内的成像应用。
目前发展的双分子荧光互补系统还包括基于近红外光敏色素蛋白的荧光互补系统。近红外光敏色素蛋白是能吸收红外或近红外光的蛋白，能够在生理条件(37℃)下成熟，其产生的荧光波长大于700nm。但是，由于光敏色素蛋白本身的荧光强度较低，从而导致荧光互补系统产生的互补荧光强度较弱，不利于成像观察。
发明内容
本申请主要的目的是提供一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统、一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统的构建方法、以及基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统的应用，能够产生较强的互补荧光强度，有利于成像观察。
为解决上述技术问题，本申请实施例采用的一个技术方案是提供一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统，包括第一载体和第二载体，其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。
其中，序列SEQ ID NO.2用于表达IFN132-IFN132串联片段，序列SEQ ID NO.3用于表达IFC133-IFC133串联片段。当IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段相互靠近时，可重构形成近红外光敏色素蛋白IFP2.0。
其中，第一载体进一步包括第一基因序列，第一基因序列用于表达第一蛋白，第一载体用于表达第一融合蛋白，第一融合蛋白为IFN132-IFN132串联片段与第一蛋白的融合蛋白。
其中，IFN132-IFN132串联片段为两个IFN132片段串联构成的蛋白片段，IFN132片段为由光敏色素蛋白IFP2.0第1号位至第132号位氨基酸构成的蛋白片段。
其中，第二载体进一步包括第二基因序列，第二基因序列用于表达第二蛋白，第二载体用于表达第二融合蛋白，第二融合蛋白为IFC133-IFC133串联片段与第二蛋白的融合蛋白。
其中，IFC133-IFC133串联片段为两个IFC133片段串联构成的蛋白片段，IFC133片段为由光敏色素蛋白IFP2.0的第133号位至第321号位氨基酸构成的蛋白片段。
为解决上述技术问题，本申请实施例采用的一个技术方案是提供一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统构建方法，包括：以近红外光敏色素蛋白IFP2.0的基因序列为模板进行聚合酶链式反应(PCR)得到序列SEQ ID NO.2和序列SEQ IDNO.3；利用第一质粒的双酶切位点，将序列SEQ ID NO.2插入第一质粒的多克隆位点；利用第二质粒的双酶切位点，将序列SEQ ID NO.3插入第二质粒的多克隆位点。
其中，该方法还包括：利用第一质粒的另一组双酶切位点，将用于表达第一蛋白的核苷酸序列插入第一质粒的另一处多克隆位点以得到第一载体，其中，用于表达第一蛋白的核苷酸序列位于序列SEQ ID NO.2的上游；利用第二质粒的另一组双酶切位点，将用于表达第二蛋白的核苷酸序列插入第二质粒的另一处多克隆位点以得到第二载体，其中，用于表达第二蛋白的核苷酸序列位于序列SEQ ID NO.3的下游。
其中，序列SEQ ID NO.2用于表达IFN132-IFN132串联片段，IFN132-IFN132串联片段为两个IFN132片段串联的蛋白片段，IFN132片段为由所述光敏色素蛋白IFP2.0第1号位至132号位氨基酸构成的蛋白片段；第一载体用于表达IFN132-IFN132串联片段和第一蛋白的融合蛋白；序列SEQ ID NO.3用于表达IFC133-IFC133串联片段，IFC133-IFC133串联片段为两个IFC133片段串联的蛋白片段，IFC133片段为由光敏色素蛋白IFP2.0的第133号位至第321号位氨基酸构成的蛋白片段；第二载体用于表达IFC133-IFC133串联片段和第二蛋白的融合蛋白；第一蛋白和所述第二蛋白为相互作用蛋白，用于使IFN132-IFN132串联片段靠近IFC133-IFC133串联片段。
为解决上述技术问题，本申请实施例采用的一个技术方案是提供一种如上的基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统的应用。其中，基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统应用于对活体和/或活细胞内蛋白质相互作用进行成像。
相比于现有的双分子荧光互补系统，本申请提供一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统，包括第一载体和第二载体。其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。该系统是基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的荧光互补系统，由于近红外光敏色素蛋白IFP2.0可被激发产生波长较长的荧光，因此，该系统产生的荧光具有比较好的组织通透性。并且重构后的近红外光敏色素蛋白IFP2.0能够在生理温度下成熟，因此可以在细胞正常的生理温度条件下来研究蛋白质间的相互作用。进一步地，序列SEQ ID NO.2可表达IFN132-IFN132串联片段，序列SEQ IDNO.3可表达IFC133-IFC133串联片段，由于IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段分别包含有两个IFN132蛋白片段和两个IFC133蛋白片段，因此，重构得到的近红外光敏色素蛋白IFP2.0发出的荧光亮度更强，有利于成像观察。
附图说明
本申请将结合附图对实施方式进行说明。本申请的附图仅用于描述实施例，以展示为目的。在不偏离本发明的原理的条件下，本领域技术人员能够轻松地通过以下描述根据所述步骤做出其他实施例。
图1为本申请实施例提供的载体pcDNA3.1-IFP2.0的示意图。
图2A为本申请实施例提供的包含有用于表达IFN132-IFN132串联片段的序列SEQID NO.2的第一载体示意图。
图2B为本申请实施例提供的包含有用于表达IFC133-IFC133串联片段的序列SEQID NO.3的第二载体示意图。
图3A为本申请实施例提供的包含有用于表达bJun-IFN132-IFN132融合蛋白的第一载体示意图。
图3B为本申请实施例提供的包含有用于表达IFC133-IFC133-bFos融合蛋白的第二载体示意图。
图4A为本申请实施例提供的基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统在HEK293T细胞中发出荧光的示意图。
图4B为本申请实施例提供的基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统的荧光效率统计图。
图4C为本申请实施例提供的基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统在动物活体内产生荧光的示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请，而非对本申请的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本申请相关的部分而非全部结构。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本申请提供一种基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统，包括第一载体和第二载体，其中，所述第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，所述第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。
具体地，如图1所示，图1为载体pcDNA3.1-IFP2.0的示意图。载体pcDNA3.1-IFP2.0为包含有序列SEQ ID NO.1的载体，其中序列SEQ ID NO.1为用于表达近红外光敏色素蛋白IFP2.0的序列，近红外光敏色素蛋白IFP2.0是由321个氨基酸形成的蛋白，其氨基酸序列如序列SEQ ID NO.4所示。通过双酶切位点将序列SEQ ID NO.1插入到质粒pcDNA3.1的多克隆位点中，即可得到载体pcDNA3.1-IFP2.0。可以理解的是，序列SEQ ID NO.1也可插入其他的真核表达载体，例如pEGFP-C1，pEGFP-N1等，在不同的真核表达载体中，可选择合适的双酶切位点将序列SEQ ID NO.1插入，本申请对真核表达载体的选择以及酶切位点的选择不做限制。在本申请实施例中，载体pcDNA3.1-IFP2.0为商业购得(苏州金唯智生物科技有限公司)，其中，序列SEQ ID NO.1通过NheI和HindIII酶切位点插入到质粒pcDNA3.1中。
在本申请实施例中，近红外光敏色素蛋白IFP2.0将在132号位氨基酸和133号位氨基酸之间，被拆分成两个蛋白片段，分别为IFN132片段和IFC133片段。其中，IFN132片段可以理解为包含有近红外光敏色素蛋白IFP2.0(即如SEQ ID NO.4所示的序列)的第1号位至第132号位氨基酸的蛋白片段；IFC133片段可以理解为包含有近红外光敏色素蛋白IFP2.0的第133号位至第321号位氨基酸的蛋白片段。
获得载体pcDNA3.1-IFP2.0后，以该载体为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)，可扩增得到序列SEQ ID NO.2。其中，PCR扩增用到的第一个上游引物为：
5’-GGGGTACCATGGCTCGGGACCCTCAACCTTTCTTCC-3’，
第一个下游引物为：
5’-TCCCGCCACCTCCACTCCCGCCACCTCCCCATGCCTCAGTAGGCTCAATTCCAGAATC-3’；
第二个上游引物为：
5’-GGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGGAGTATGGCTCGGGACCCTCAACCTTTCTTC-3’，
第二个下游引物为：
5’-CGGGATCCTTACCATGCCTCAGTAGGCTCGAATTCCAG-3’。
通过PCR扩增得到的序列SEQ ID NO.2为两个能够表达IFN132片段的核苷酸序列串联构成的序列。也就是说，序列SEQ ID NO.2能够表达两个串联的IFN132片段，即IFN132-IFN132串联片段。
进一步地，以载体pcDNA3.1-IFP2.0为模板，通过PCR还可获得序列SEQ ID NO.3。此时的PCR扩增用到的第三个上游引物为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGACTCTATTGGACCCCACGCTCTGAG-3’，
第三个下游引物为：
5’-ACTCCCGCCACCTCCACTCCCGCCACCTCCGGCTTCTTTCCTCTGCACCTGCAGGGAC-3’；
第四个上游引物为：
5’-GGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGGAGTGACTCTATTGGACCCCACGCTCTGAG-3’，
第四个下游引物为：
5’-CCCAAGCTTGGCTTCTTTCCTCTGCACCTGCAGGGACAGGAGC-3’。
此时，通过PCR扩增得到的序列SEQ ID NO.3为两个能够表达IFC133片段的核苷酸序列串联构成的序列。也就是说，序列SEQ ID NO.3能够表达两个串联的IFC133片段，即IFC133-IFC133串联片段。
进一步地，将用于表达IFN132-IFN132串联片段的序列SEQ ID NO.2和用于表达IFC133-IFC133串联片段的序列SEQ ID NO.3分别插入到两个真核表达载体中，构建得到包含有序列SEQ ID NO.2的第一载体和包含有序列SEQ ID NO.3的第二载体。本申请对真核表达载体不做限制，例如可以为pEGFP-C1、pEGFP-N1、pcDNA3.1等真核表达载体。本实施例将以质粒pcDNA3.1为例进行描述。
具体地，如图2A所示，图2A为包含有SEQ ID NO.2的第一载体的示意图。在本申请实施例中，利用双酶切位点KpnI和BamHI，将用于表达IFN132-IFN132串联片段的序列SEQID NO.2插入到pcDNA3.1的多克隆位点，构建成包含有序列SEQ ID NO.2的第一载体。
如图2B所示，图2B为包含有SEQ ID NO.3的第二载体的示意图。在本申请实施例中，利用双酶切位点NheI和HindIII，将用于表达IFC133-IFC133串联片段的序列SEQ IDNO.3插入到pcDNA3.1的多克隆位点，构建成包含有序列SEQ ID NO.3的第二载体。
进一步地，第一载体还包括用于表达第一蛋白的序列，第二载体还包括用于表达第二蛋白的序列。这样，第一载体可表达第一蛋白与IFN132-IFN132串联片段形成的第一融合蛋白；第二载体可表达第二蛋白与IFC133-IFC133串联片段形成的第二融合蛋白。其中，第一蛋白与第二蛋白为两个相互作用的蛋白。
具体地，以包含有第一基因序列的质粒为模板，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得第一基因序列。其中，第一基因序列用于表达第一蛋白。再利用双酶切位点将第一基因序列插入第一载体的多克隆位点上。此时构建得到的第一载体可表达第一蛋白-IFN132-IFN132的第一融合蛋白。需要注意到的是，第一基因序列在第一载体上的插入位置应当为序列SEQ ID NO.2的上游。这样，在第一载体表达出的第一融合蛋白中，第一蛋白能够位于IFN132-IFN132串联片段的氮端。
类似地，以包含有第二基因序列的质粒为模板，设计相应的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得第二基因序列。其中，第二基因序列用于表达第二蛋白。再利用双酶切位点将第二基因序列插入第二载体的多克隆位点上。此时构建得到的第二载体可表达IFC133-IFC133-第二蛋白形成的第二融合蛋白。需要注意到的是，第二基因序列在第二载体上的插入位置应当为序列SEQ ID NO.3的下游。这样，在第二载体表达的第二融合蛋白中，第二蛋白能够位于IFC133-IFC133串联片段的碳端。
可以理解的是，本申请对可以互相作用的第一蛋白和第二蛋白不做限制，例如第一蛋白可以为FKBP蛋白，第二蛋白可以为FRB蛋白；第一蛋白可以为Bak蛋白，第二蛋白可以为Bcl-XL蛋白；第一蛋白可以为bJun蛋白，第二蛋白可以为bFos蛋白等。实际应用中，可以根据具体的研究对象确定第一蛋白和第二蛋白。
在本申请实施例中，以bJun蛋白作为第一蛋白，bFos蛋白作为第二蛋白为例。获取包含有bJun基因序列的质粒pbJun-iRN97，设计相应的上游引物为：
5’-CTAGCTAGCGCCACCATGAAGGCGGAGAGGAAGCGCATGAGAAACCGC-3’,
下游引物为：
5’-CCCAAGCTTAAACGTTTGCAACTGCTGCGTTAGCATGAG-3’。
利用双酶切位点NheI和HindIII，把bJun基因序列插入包含有序列SEQ ID NO.2的第一载体的多克隆位点上，构建成包含有bJun基因序列以及序列SEQ ID NO.2的第一载体，如图3A所示。在本实施例中，bJun基因序列位于序列SEQ ID NO.2的上游。因此，第一载体可表达由bJun蛋白和IFN132-IFN132串联片段构成的第一融合蛋白bJun-IFN132-IFN132。
同时，获取包含有bFos基因序列的质粒piRC98-bFos，设计相应的上游引物为：
5’-CGGGATCCGGTCGTGCGCAGTCCATCGGTCGTCG-3’,
下游引物为：
5’-CGGAATTCTTAACCCAGGTCGTTCGGGATTTTGCACGCCGGACGG-3’。
利用双酶切位点BamHI和EcoRI，将bFos基因序列插入包含有序列SEQ ID NO.3的第二载体的多克隆位点上，构建成包含有bFos基因序列以及序列SEQ ID NO.3的第二载体，如图3B所示。在本实施例中，bFos基因序列位于序列SEQ ID NO.3的下游。因此，第二载体可表达由IFC133-IFC133串联片段和bFos蛋白构成的第二融合蛋白IFC133-IFC133-bFos。
进一步地，构建上述基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统之后，可在细胞系以及动物活体中检测该系统的荧光效果。
具体地，构建包含有第一基因序列以及序列SEQ ID NO.2的第一载体、包含有第二基因序列以及序列SEQ ID NO.3的第二载体、对照载体、以及参考载体。其中，对照载体为包含有第三基因序列以及序列SEQ ID NO.3的载体，第三基因序列表达的蛋白片段可以为任何无法与第一基因序列表达的蛋白片段产生相互作用的蛋白片段。构建对照载体的方法可参考上述的构建包含有第二基因序列以及序列SEQ ID NO.3的第二载体的方法，将第二基因序列替换为第三基因序列即可，在此不做赘述。参考载体可表达其他荧光蛋白，其他荧光蛋白产生的荧光可作为荧光亮度的内参。
为了方便描述，同样以bJun基因序列作为第一基因序列和bFos基因序列作为第二基因序列为例，但可以理解是，在实际应用中，可以根据具体的研究对象确定第一基因序列和第二基因序列。在本实施例中，构建的第一载体为bJun-IFN132-IFN132载体，构建的第二载体为IFC133-IFC133-bFos载体，构建的对照载体为IFC133-IFC133-mbFos载体，构建的参考载体为pEGFP载体。其中，对照载体可表达突变的bFos蛋白片段，即mbFos蛋白片段，而mbFos蛋白片段无法与第一载体表达出的bJun蛋白片段进行相互作用。pEGFP载体可表达EGFP，该EGFP能够在488nm激发光的激发下产生荧光，以作为检测本实施例的串联片段荧光互补系统的荧光效果的内参。
基于上述的串联片段荧光互补系统，设置实验组和对照组。
向实验组的HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-IFN132-IFN132)、第二载体(pIFC133-IFC133-bFos)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的实验组HEK293T细胞24小时。向对照组的HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-IFN132-IFN132)、对照载体(pIFC133-IFC133-mbFos)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的对照组HEK293T细胞24小时。
进一步地，利用波长为640nm的激发光激发实验组HEK293T细胞和对照组HEK293T细胞；利用488nm的激发光激发实验组HEK293T细胞和对照组HEK293T细胞；另外，对实验组HEK293T细胞和对照组HEK293T细胞进行Hoechst染色，用于定位细胞核的位置。
通过图4A可以看出，在640nm激发光的激发下，实验组的HEK293T细胞产生了红色荧光，而对照组的HEK293T细胞没有产生荧光。作为参照地，在488nm激发光的激发下，实验组的HEK293T细胞和对照组的HEK293T细胞均产生了绿色荧光。
这是由于实验组中的第一载体和第二载体分别产生了bJun-IFN132-IFN132融合蛋白和IFC133-IFC133-bFos融合蛋白。其中bJun蛋白和bFos蛋白能够相互作用，使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段相互靠近，并重构形成完整的光敏色素蛋白IFP2.0，在相应波长的激发光的激发下，可产生荧光。而在对照组中，第一载体和对照载体分别表达出bJun-IFN132-IFN132融合蛋白和IFC133-IFC133-mbFos融合蛋白。由于bJun蛋白和mbFos蛋白不能相互作用，因此，无法使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段相互靠近以重构成完整的光敏色素蛋白IFP2.0，从而无法产生荧光。
也就是说，在本申请的基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统中，在同一细胞内，表达出第一蛋白与IFN132-IFN132串联片段的融合蛋白以及IFC133-IFC133串联片段与第二蛋白的融合蛋白，通过第一蛋白与第二蛋白的相互作用，可以使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段靠近从而重构形成完整的、能够在激发光的激发下发出荧光的光敏色素蛋白IFP2.0。
进一步地，为了检测本申请提供的串联片段荧光互补系统的荧光效率，将本申请实施例中通过荧光分子互补重构的光敏色素蛋白IFP2.0产生的荧光强度与由参考载体表达的EGFP产生的荧光强度进行比较。例如，可以在图4A中的实验组的HEK293T细胞的图片中选取相对应的分别位于640nm和488nm激发通道的区域，利用图片处理软件比较红色荧光的强度以及绿色荧光的强度。可以理解的是，本申请对用于分析荧光强度的图片处理软件不做限定。
图4B展示了基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统产生的荧光互补效率的统计图。从图中可以看出，能够通过串联片段荧光互补系统实现光敏色素蛋白IFP2.0重构的细胞产生的荧光强度显著高于无法通过串联片段荧光互补系统实现光敏色素蛋白IFP2.0重构的细胞产生的荧光强度。
本申请又进一步在动物活体内检测基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统产生荧光的效果。
具体地，向实验组HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-IFN132-IFN132)、第二载体(pIFC133-IFC133-bFos)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的实验组HEK293T细胞24小时。另向对照组HEK293T细胞中，转染构建好的第一载体(pbJun-IFN132-IFN132)、对照载体(pIFC133-IFC133-mbFos)以及参考载体(pEGFP)，在37℃条件下培养转染后的对照组HEK293T细胞24小时。
收集实验组以及对照组HEK293T细胞，分别接种至裸鼠的皮下。其中，实验组HEK293T细胞接种至裸鼠的左侧皮下，对照组HEK293T细胞接种至同一裸鼠的右侧皮下。
图4C为基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统在动物活体内产生荧光的示意图。
如图4C所示，在488nm激发光的激发下，裸鼠的左侧皮下和右侧皮下均能够发出绿色荧光。在640nm激发光的激发下，接种了实验组的HEK293T细胞的裸鼠的左侧皮下发出红色荧光，而接种了对照组的HEK293T细胞的裸鼠的右侧皮下没有荧光发出。
这是由于实验组中的第一载体和第二载体分别产生了bJun-IFN132-IFN132融合蛋白和IFC133-IFC133-bFos融合蛋白。其中bJun蛋白和bFos蛋白能够相互作用，使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段相互靠近，并重构形成完整的光敏色素蛋白IFP2.0，在相应波长的激发光的激发下，可产生荧光。而在对照组中，第一载体和对照载体分别表达出bJun-IFN132-IFN132融合蛋白和IFC133-IFC133-mbFos融合蛋白。由于bJun蛋白和mbFos蛋白不能相互作用，因此，无法使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段相互靠近以重构成完整的光敏色素蛋白IFP2.0，从而无法产生荧光。
也就是说，在本申请的基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统中，在同一细胞内，表达出第一蛋白与IFN132-IFN132串联片段的融合蛋白以及IFC133-IFC133与第二蛋白的融合蛋白，通过第一蛋白与第二蛋白的相互作用，可以使IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段靠近从而重构形成完整的、能够在激发光的激发下发出荧光的光敏色素蛋白IFP2.0。
相比于现有的双分子荧光互补系统，本申请提供一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统，包括第一载体和第二载体。其中，第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。该系统是基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的荧光互补系统，由于近红外光敏色素蛋白IFP2.0可被激发产生波长较长的荧光，因此，该系统产生的荧光具有比较好的组织通透性。并且重构后的近红外光敏色素蛋白IFP2.0能够在生理温度下成熟，因此可以在细胞正常的生理温度条件下来研究蛋白质间的相互作用。进一步地，序列SEQ ID NO.2可表达IFN132-IFN132串联片段，序列SEQ IDNO.3可表达IFC133-IFC133串联片段，由于IFN132-IFN132串联片段和IFC133-IFC133串联片段分别包含有两个IFN132蛋白片段和两个IFC133蛋白片段，因此，重构得到的近红外光敏色素蛋白IFP2.0发出的荧光亮度更强，有利于成像观察。
以上仅为本申请的较佳实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 串联片段荧光互补系统及其构建方法及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGGCTCGGGACCCTCAACCTTTCTTCCCTCCTCTGTATCTCGGAGGACCAGAGATCACTACTGAGAACTGCGAGCGGGAACCTATACATATACCAGGTTCTATTCAACCTCATGGAGCACTGCTCACAGCCGATGGACATTCTGGCGAGGTGCTGCAAGTTTCACTCAACGCAGCCACTTTCCTGGGCCAGGAACCAACTGTTCTGCGGGGACAGACCCTGGCAGCCCTGCTGCCAGACCAGTGGCCTGCTCTGCAGACTGCCCTGCCTCCAGGCTGCCAGGACGCCCTGCAGTATCGCGCCACCCTGGATTGGCCCGCCGCCGGACACCTGAGCCTGACCGTGCATAGGGTGGCCGAGCTGCTGATTCTGGAATTCGAGCCTACTGAGGCATGGGACTCTATTGGACCCCACGCTCTGAGAAATGCAATGTTCGCTCTGGAGAGTGCTCCTAATCTCCGGGCACTGGCTGAAGTCGCAACCCAAACAGTCCGGGAACTGTCAGGTTTCGACCGGGTGATGCTGTACAAGTTTGCACCAGACGCAACAGGAGAGGTTATTGCCGAAGCAAGGCGCGAGGGCATGCAGGCTTACCTCGGGCATAGGTTTCCCGCATCCACCACCCCTGCACAAGCTAGGGCCCTCTACACAAGACACCTGCTCCGGCTGACCGCAGACACCAGGGCTGCAGCAGTGCCCCTCGACCCCGTGCTGAATCCCCAGACAAATGCTCCTACACCTCTGGGCGGAGCTGTCCTCAGAGCTACATCCCCAATGCACATGCAGTACCTGAGGAATATGGGAGTGGGCTCCTCCCTGAGCGTCAGCGTCGTGGTCGGCGGCCAGCTGTGGGGACTGATTGTCTGCCACCATCAGACACCCTACGTGCTGCCACCAGATCTGCGGACCACCCTGGAGTATCTGGGGAGGCTCCTGTCCCTGCAGGTGCAGAGGAAAGAAGCC
<210> 2
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ATGGCTCGGGACCCTCAACCTTTCTTCCCTCCTCTGTATCTCGGAGGACCAGAGATCACTACTGAGAACTGCGAGCGGGAACCTATACATATACCAGGTTCTATTCAACCTCATGGAGCACTGCTCACAGCCGATGGACATTCTGGCGAGGTGCTGCAAGTTTCACTCAACGCAGCCACTTTCCTGGGCCAGGAACCAACTGTTCTGCGGGGACAGACCCTGGCAGCCCTGCTGCCAGACCAGTGGCCTGCTCTGCAGACTGCCCTGCCTCCAGGCTGCCAGGACGCCCTGCAGTATCGCGCCACCCTGGATTGGCCCGCCGCCGGACACCTGAGCCTGACCGTGCATAGGGTGGCCGAGCTGCTGATTCTGGAATTCGAGCCTACTGAGGCATGGGGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGGAGTATGGCTCGGGACCCTCAACCTTTCTTCCCTCCTCTGTATCTCGGAGGACCAGAGATCACTACTGAGAACTGCGAGCGGGAACCTATACATATACCAGGTTCTATTCAACCTCATGGAGCACTGCTCACAGCCGATGGACATTCTGGCGAGGTGCTGCAAGTTTCACTCAACGCAGCCACTTTCCTGGGCCAGGAACCAACTGTTCTGCGGGGACAGACCCTGGCAGCCCTGCTGCCAGACCAGTGGCCTGCTCTGCAGACTGCCCTGCCTCCAGGCTGCCAGGACGCCCTGCAGTATCGCGCCACCCTGGATTGGCCCGCCGCCGGACACCTGAGCCTGACCGTGCATAGGGTGGCCGAGCTGCTGATTCTGGAATTCGAGCCTACTGAGGCATGG
<210> 3
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GACTCTATTGGACCCCACGCTCTGAGAAATGCAATGTTCGCTCTGGAGAGTGCTCCTAATCTCCGGGCACTGGCTGAAGTCGCAACCCAAACAGTCCGGGAACTGTCAGGTTTCGACCGGGTGATGCTGTACAAGTTTGCACCAGACGCAACAGGAGAGGTTATTGCCGAAGCAAGGCGCGAGGGCATGCAGGCTTACCTCGGGCATAGGTTTCCCGCATCCACCACCCCTGCACAAGCTAGGGCCCTCTACACAAGACACCTGCTCCGGCTGACCGCAGACACCAGGGCTGCAGCAGTGCCCCTCGACCCCGTGCTGAATCCCCAGACAAATGCTCCTACACCTCTGGGCGGAGCTGTCCTCAGAGCTACATCCCCAATGCACATGCAGTACCTGAGGAATATGGGAGTGGGCTCCTCCCTGAGCGTCAGCGTCGTGGTCGGCGGCCAGCTGTGGGGACTGATTGTCTGCCACCATCAGACACCCTACGTGCTGCCACCAGATCTGCGGACCACCCTGGAGTATCTGGGGAGGCTCCTGTCCCTGCAGGTGCAGAGGAAAGAAGCCGGAGGTGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGGAGTGACTCTATTGGACCCCACGCTCTGAGAAATGCAATGTTCGCTCTGGAGAGTGCTCCTAATCTCCGGGCACTGGCTGAAGTCGCAACCCAAACAGTCCGGGAACTGTCAGGTTTCGACCGGGTGATGCTGTACAAGTTTGCACCAGACGCAACAGGAGAGGTTATTGCCGAAGCAAGGCGCGAGGGCATGCAGGCTTACCTCGGGCATAGGTTTCCCGCATCCACCACCCCTGCACAAGCTAGGGCCCTCTACACAAGACACCTGCTCCGGCTGACCGCAGACACCAGGGCTGCAGCAGTGCCCCTCGACCCCGTGCTGAATCCCCAGACAAATGCTCCTACACCTCTGGGCGGAGCTGTCCTCAGAGCTACATCCCCAATGCACATGCAGTACCTGAGGAATATGGGAGTGGGCTCCTCCCTGAGCGTCAGCGTCGTGGTCGGCGGCCAGCTGTGGGGACTGATTGTCTGCCACCATCAGACACCCTACGTGCTGCCACCAGATCTGCGGACCACCCTGGAGTATCTGGGGAGGCTCCTGTCCCTGCAGGTGCAGAGGAAAGAAGCC
<210> 4
<211> 321
<212> PRT
<213> IFP2.0
<400> 4
MARDPQPFFPPLYLGGPEITTENCEREPIHIPGSIQPHGALLTADGHSGEVLQVSLNAATFLGQEPTVLRGQTLAALLPDQWPALQTALPPGCQDALQYRATLDWPAAGHLSLTVHRVAELLILEFEPTEAWDSIGPHALRNAMFALESAPNLRALAEVATQTVRELSGFDRVMLYKFAPDATGEVIAEARREGMQAYLGHRFPASTTPAQARALYTRHLLRLTADTRAAAVPLDPVLNPQTNAPTPLGGAVLRATSPMHMQYLRNMGVGSSLSVSVVVGGQLWGLIVCHHQTPYVLPPDLRTTLEYLGRLLSLQVQRKEA

Claims (10)

1.一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统，其特征在于，包括第一载体和第二载体，其中，所述第一载体为包含有序列SEQ ID NO.2的载体，所述第二载体为包含有序列SEQ ID NO.3的载体。
2.根据权利要求1所述的串联片段荧光互补系统，其特征在于，
所述序列SEQ ID NO.2用于表达IFN132-IFN132串联片段，所述序列SEQ ID NO.3用于表达IFC133-IFC133串联片段；
当所述IFN132-IFN132串联片段和所述IFC133-IFC133串联片段相互靠近时，可重构形成所述近红外光敏色素蛋白IFP2.0。
3.根据权利要求2所述的串联片段荧光互补系统，其特征在于，所述第一载体进一步包括第一基因序列，所述第一基因序列用于表达第一蛋白，所述第一载体用于表达第一融合蛋白，所述第一融合蛋白为所述IFN132-IFN132串联片段与所述第一蛋白的融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的串联片段荧光互补系统，其特征在于，所述IFN132-IFN132串联片段为两个IFN132片段串联构成的蛋白片段，所述IFN132片段为由所述光敏色素蛋白IFP2.0第1号位至第132号位氨基酸构成的蛋白片段。
5.根据权利要求2所述的串联片段荧光互补系统，其特征在于，所述第二载体进一步包括第二基因序列，所述第二基因序列用于表达第二蛋白，所述第二载体用于表达第二融合蛋白，所述第二融合蛋白为所述IFC133-IFC133串联片段与所述第二蛋白的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的串联片段荧光互补系统，其特征在于，所述IFC133-IFC133串联片段为两个IFC133片段串联构成的蛋白片段，所述IFC133片段为由所述光敏色素蛋白IFP2.0的第133号位至第321号位氨基酸构成的蛋白片段。
7.一种基于近红外光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统构建方法，其特征在于，包括：
以所述近红外光敏色素蛋白IFP2.0的基因序列为模板进行聚合酶链式反应(PCR)得到序列SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3；
利用第一质粒的双酶切位点，将所述序列SEQ ID NO.2插入所述第一质粒的多克隆位点；
利用第二质粒的双酶切位点，将所述序列SEQ ID NO.3插入所述第二质粒的多克隆位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括：
利用所述第一质粒的另一组双酶切位点，将用于表达第一蛋白的核苷酸序列插入所述第一质粒的另一处多克隆位点以得到第一载体，其中，所述用于表达第一蛋白的核苷酸序列位于所述序列SEQ ID NO.2的上游；
利用所述第二质粒的另一组双酶切位点，将用于表达第二蛋白的核苷酸序列插入所述第二质粒的另一处多克隆位点以得到第二载体，其中，所述用于表达第二蛋白的核苷酸序列位于所述序列SEQ ID NO.3的下游。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述序列SEQ ID NO.2用于表达IFN132-IFN132串联片段，所述IFN132-IFN132串联片段为两个IFN132片段串联的蛋白片段，所述IFN132片段为由所述光敏色素蛋白IFP2.0第1号位至第132号位氨基酸构成的蛋白片段；
所述第一载体用于表达所述IFN132-IFN132串联片段和所述第一蛋白的融合蛋白；
所述序列SEQ ID NO.3用于表达IFC133-IFC133串联片段，所述IFC133-IFC133串联片段为两个IFC133片段串联的蛋白片段，所述IFC133片段为由所述光敏色素蛋白IFP2.0的第133号位至第321号位氨基酸构成的蛋白片段；
所述第二载体用于表达所述IFC133-IFC133串联片段和所述第二蛋白的融合蛋白；以及
所述第一蛋白和所述第二蛋白为相互作用蛋白，用于使所述IFN132-IFN132串联片段靠近所述IFC133-IFC133串联片段。
10.一种权利要求1-7任一项所述的基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统的应用，其特征在于：所述基于光敏色素蛋白IFP2.0的串联片段荧光互补系统应用于对活体以及活细胞内蛋白质相互作用进行成像。
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