CN109957604B - 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109957604B CN109957604B CN201711420283.5A CN201711420283A CN109957604B CN 109957604 B CN109957604 B CN 109957604B CN 201711420283 A CN201711420283 A CN 201711420283A CN 109957604 B CN109957604 B CN 109957604B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- luciferase
- fusion
- drra
- sidm
- rab1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用,所述体系包括Rab1、SidM/DrrA、荧光素酶C端、荧光素酶N端、连接肽和还原剂TCEP,所述Rab1的C端通过连接肽与荧光素酶N端相连,所述SidM/DrrA通过连接肽与荧光素酶C端片段相连;本发明通过引入特异性相互作用的蛋白对,并设计适宜的柔性肽和结合位置,优化缓冲液中还原剂的种类和浓度,最终显著提高荧光互补效率,最高达到30倍;本发明提供的制备方法简洁高效,便于操作,易于推广,具备广阔的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,尤其涉及一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用。
背景技术
随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入,人类对疾病和对生命本质的认识不断追朔到蛋白质、基因水平。而许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的,细胞的各种重要生理活动,细胞对外界环境及内环境作用的反应等,均是以蛋白质之间的相互作用(Protein-protein interaction,PPIs)为纽带,形成信号转导网络系统。因此,对蛋白质之间的相互作用的深入研究是认识和理解各种生命现象的必要前提。
迄今为止,已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用。传统研究蛋白质之间的相互作用的方法有酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等,但在实际的生理环境中需要破碎细胞造成机械损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质相互作用进行研究的特点。现今最为常见的蛋白质相互作用模型有2种,其主要基于医学影像技术,是探究体内细微生命的重要方法,可实现分子水平上高靶向地实时监测活体内疾病的发生、生长及治疗,是一种新的健康医疗模式。其中一种是基于CFP和YFP等荧光蛋白质来实现的荧光共振能量转移,这种技术由于荧光蛋白的量子产率低,供体与受体荧光光谱的差异小等问题,在实际开展中导致检测通道间相互干扰,高背景噪音等现象,要求非常苛刻的校准过程去除干扰降噪,这些都极大地限制了该技术进一步的发展和广泛的应用。另外一种是双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescencecomplementation,BiFc)克服了传统荧光共振能量转移的诸多缺点,是近几年兴起的一项新技术,而Gaussia荧光素酶(Gluc)因其超高的荧光强度,无需外源激发光干扰,可作为高灵敏度的光信号载体,近年来被广泛用于该技术的研究,其主要原理是将荧光素酶在某些特定的位点切开,形成不发荧光或荧光强度很低的N端和C端2个多肽,称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时,不能自发地组装成完整的荧光素酶,在该荧光素酶在底物的催化氧化作用下不能产生荧光。但是,当这2个荧光素酶的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上,在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时,由于目标蛋白质的相互作用,荧光素酶的2个片段在空间上互相靠近互补,重新构建成完整的具有活性的荧光素酶分子,并在该荧光素酶底物的作用下发射荧光。因此,在荧光互补体系中,发挥重要作用的是这样一组可以发生特异性相互作用的蛋白对,即形成有效的帮助结构域(Helper domains)拉近2种荧光素酶片段的空间距离实现荧光互补重建荧光素酶荧光活性。
双荧光互补技术最大的难点在于空间上自组装形成荧光互补的效率太差,导致双荧光互补技术在实际应用中大大受限。在设计荧光素酶片段融合体时需要注意引入的2个蛋白对对荧光素酶片段的影响,特别是如何形成有效的正确的帮助结构域对荧光互补效率的巨大影响,这就需要在设计上进行巧思。因此,提供一种改进双分子荧光互补体系中的荧光互补效率的技术具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用,通过引入一组具有特异性相互作用的蛋白对,并设计适宜长度的柔性连接肽和有效的互补面,优选还原剂的种类和浓度,最终显著提高荧光互补效率,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种荧光素酶荧光互补体系,所述体系包括Rab1、SidM/DrrA、荧光素酶C端、荧光素酶N端、连接肽和还原剂TCEP;
所述Rab1的C端通过连接肽与荧光素酶N端相连,所述SidM/DrrA通过连接肽与荧光素酶C端片段相连。
SidM/DrrA来源于致病性病原菌嗜肺军团菌,可以与Rab1在体外发生特异性相互作用,其对嗜肺军团菌的感染过程起到了关键的调节作用,是一组特别经典的帮助结构域。Rab1蛋白是细胞内ER到高尔基体囊泡转运途径的关键调控因子,而SidM/DrrA与Rab1的相互作用可直接影响嗜肺军团菌在宿主体内的感染。SidM/DrrA是一个十分特别的Rab1互作蛋白,它兼具GDF和GEF活性。SidM/DrrA体外可将Rab1从Rab1-GDI复合物中解离下来,具有典型的GDF活性。同时,它还能有效的促使Rab1上的GDP置换为GTP,并使异戊二稀化修饰的Rab1插入到膜上,发挥重要的GEF活性。因此,它是至今为止第一个由病原微生物编码的,在一种蛋白内兼具GDF和GEF两种活性的Rab1调控蛋白并具有高度的底物特异性。
一直以来,人们对SidM/DrrA蛋白的GDF和GEF酶活性区域存在极大的争议,但随着SidM/DrrA-Rab1复合物晶体结构的解析,酶活区域及相关功能得到了很好的诠释,作为最新的研究成果,SidM/DrrA与Rab1的相互作用仍有许多用途有待开发,发明人创造性地将SidM/DrrA与Rab1的相互作用引入双荧光互补体系,利用其经典的帮助结构域以提高荧光互补效率。
本发明主要基于双荧光互补技术,因其具有诸多优势,可用于蛋白质相互作用的广泛研究。而双荧光互补技术应用的最大难点在于如何提高双荧光互补的效率。本发明通过引入SidM/DrrA和Rab1这样一组蛋白对,利用其特异性相互作用使得荧光素酶片段在空间上彼此靠近,从而最大程度上实现荧光互补效应。本发明以Gaussia荧光素酶为例构建双荧光互补体系,将Gluc分为NGluc和CGluc这2个片段,通过合理设计蛋白对的插入位置及其与荧光素酶片段之间的柔性linker长度,最后通过优化检测体系中的还原剂的浓度,确保还原融合体非正确折叠结构,形成有效的帮助结构域促使2个荧光素酶片段在空间位置上拉进彼此之间的距离,以此最大程度的提高荧光互补的效率。
优选地,所述连接肽为柔性连接肽。
优选地,所述柔性连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)2。
本发明中,为了保证荧光互补体系中荧光素酶片段蛋白在空间上能足够摆动发生碰撞实现荧光互补,在蛋白对及其荧光素酶片段之间都引入了柔性长肽链linker,以此减少空间位阻。
优选地,所述SidM/DrrA的N端或C端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连,优选为所述SidM/DrrA的N端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连。
本发明中,为了验证荧光素酶片段与蛋白对构建融合体时,不同位置对荧光互补效率的影响,设计了2组荧光互补体系,结果证明了Rab1-NGluc与CGluc-SidM/DrrA这一组荧光互补体系形成的互补的信号值更高(约30倍),说明荧光互补的实现更倾向于荧光素酶片段切口面之间的互补。
优选地,所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶或NanoLuc荧光素酶中的任意一种,优选为Gaussia荧光素酶。
优选地,所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM,例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM或6mM,优选为3-5mM。
本发明中验证了还原剂在荧光互补中发挥的重要作用,说明还原剂能有效促进融合体蛋白中非正确折叠结构的还原,从而形成有效的帮助结构域,使得荧光素酶片段的互补面能够充分暴露,最大化提高荧光互补效率;设计了不同浓度TCEP还原剂对荧光互补的影响,终浓度为3mM-5mM的TCEP可以充分还原融合体蛋白中非正确折叠的结构。
发明人在实验过程中发现SidM/DrrA与Rab1这样一组蛋白对在荧光互补体系中发挥重要的作用,提高荧光互补的效率,其可以与Gaussia荧光素酶片段形成特定的融合蛋白结构域,在空间上使得2个片段相互靠近,帮助荧光素酶片段形成互补效应恢复荧光素酶活性实现双分子荧光互补。主要有以下几方面的考虑:1、如何设计将SidM/DrrA与Rab1分别融合到荧光素酶片段中,特别是荧光素酶片段放在蛋白对的N端还是C端对后面荧光互补效率的影响,本发明主要通过在蛋白对之间设计引入(GGGGS)2柔性的长肽链,使得蛋白质能够更好的在空间上自由摆动而不造成空间位阻,增加荧光素酶片段的碰撞几率,而提高荧光互补效率。同时固定将荧光素酶N片段(NGluc)放在Rab1的C端,即形成Rab1-NGluc融合片段,而将荧光素酶C片段(CGluc)设计放入SidM/DrrA的N端(即CGluc-SidM/DrrA)或者C端(即SidM/DrrA-CGluc),以此探讨2种位置的改变对荧光素酶片段的互补面充分暴露,继而实现有效互补面对荧光互补效率的影响;2、如何在荧光互补体系中形成有效的帮助结构域,特别是构建的新融合蛋白体有可能存在非正确折叠结构的现象而影响荧光素酶重建互补,发明人在大量实验摸索后发现在荧光互补体系的缓冲液中添加还原剂Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP),还原蛋白对SidM/DrrA或Rab1与荧光素酶片段之间形成的非正确折叠,以此提高2个荧光素酶片段的互补效率。
第二方面,本发明提供一种制备如第一方面所述互补体系的方法,包括如下步骤:
(1)构建蛋白对SidM/DrrA和Rab1片段与荧光素酶片段融合基因表达载体;
(2)将步骤(1)得到的载体转染细胞并表达纯化;
(3)建立荧光互补体系并检测分析生物发光活性。
优选地,步骤(1)所述表达载体的构建步骤如下:
(1’)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽与荧光素酶N端相连为融合体1;
(2’)将所述SidM/DrrA通过柔性连接肽与荧光素酶C端片段相连为融合体2;
(3’)将融合体1和融合体2通过PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定。
优选地,所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签。
优选地,步骤(3)所述建立荧光互补体系的具体步骤为:
将表达的融合体1蛋白与融合体2蛋白加入缓冲液混匀后,再加入还原剂TCEP,4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性。
本发明中,所述缓冲液为常规缓冲液,可以是HEPES、Tris或PBS,本发明中选用的缓冲液包括25mM pH 8.0的HEPES,50mM的NaCl和5mM的MgCl2。
优选地,所述荧光互补体系中的蛋白浓度为4-6μM,例如可以是4μM、5μM或6μM。
优选地,所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM,例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM或6mM,优选为3-5mM。
优选地,所述检测的荧光素酶的底物添加量为5.5-6.2μM,例如可以是5.5μM、5.9μM、6.0μM或6.2μM。
作为优选技术方案,一种制备如第一方面所述互补体系的方法,具体包括如下步骤:
(1)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽(GGGGS)2与Gaussia荧光素酶N端相连为融合体1;
其中在Rab1的C端设计引入荧光素酶N端片段NGluc所用引物为:
上游引物SEQ ID NO:1的序列为:
5’AAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGAACCCCGAGTACGACTACCT 3’。
下游引物序列SEQ ID NO:2的序列为:
5’GAGGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCCTATGCCGCCCTGTGCGGACTCTT 3’。
(2)将所述SidM/DrrA的N端通过柔性连接肽(GGGGS)2与Gaussia荧光素酶C端片段相连为融合体2,所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签;
其中在SidM/DrrA的N端引入C端片段CGluc所用引物为:
上游引物SEQ ID NO:3的序列如下:
5’AAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGGAGGCGATCGTCGACATTCC3’;
下游引物SEQ ID NO:4的序列如下:
5’AGATCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT 3’;
上游引物SEQ ID NO:5的序列如下:
5’GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTCCCTACAGCGACGCTAAGG 3’;
下游引物SEQ ID NO:6的序列如下:
5’GAGGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGTATCTGTGCTCCCTGCCCTCGTCCTT3’;
(3)将融合体1和融合体2通过PCR和重叠延伸PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定;
(4)将步骤(3)得到的载体转染细胞并表达纯化;
(5)将融合体1蛋白与融合体2加入缓冲液中混匀后,体系中蛋白浓度为4-6μM,再加入终浓度为2mM-6mM的还原剂TCEP,4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性;
本发明中,所述缓冲液为常规缓冲液,可以是HEPES、Tris或PBS,本发明中选用的缓冲液包括25mM pH 8.0的HEPES,50mM的NaCl和5mM的MgCl2。
第三方面,本发明提供一种如第一方面所述荧光素酶荧光互补体系用作光信号载体、体外诊断检测探针或检测设备中的任意一种或至少两种的组合,例如可以是光信号载体和体外诊断探针的组合,光信号载体和检测设备的组合或光信号载体、体外诊断检测探针和检测设备的组合。
其中,光信号载体可通过搭建其他元件,例如抗原抗体、小分子、纳米材料及其他生物标志物,用于开发体外诊断检测探针或检测设备。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明提供的荧光互补体系通过引入特异性相互作用的蛋白对,并设计适宜的柔性肽和结合位置,优化缓冲液中还原剂的种类和浓度,最终显著提高荧光互补效率,最高达到30倍;
(2)本发明提供的制备方法简洁高效,便于操作,易于推广,可应用于诸多方面,具备广阔的应用前景和市场价值。
附图说明
图1为本发明实施例4的蛋白检测结果图,其中,图1(A)为Western Blot蛋白质免疫印迹检测Rab1-NGluc蛋白结果图,图1(B)为SDS-PAGE电泳检测SidM/DrrA-CGluc蛋白结果图,图1(C)为SDS-PAGE电泳检测CGluc-SidM/DrrA蛋白结果图;
图2为本发明实施例6的添加还原剂TCEP的结果图,其中,图2(A)为Rab1-NGluc与SidM/DrrA-CGluc荧光互补体系及其对照组的荧光活性图,图2(B)为Rab1-NGluc与CGluc-SidM/DrrA荧光互补体系及其对照组的荧光活性图;
图3为本发明对比例1的不添加还原剂TCEP的结果图,其中,图3(A)为Rab1-NGluc与SidM/DrrA-CGluc荧光互补体系及其对照组的荧光活性图,图3(B)为Rab1-NGluc与CGluc-SidM/DrrA荧光互补体系及其对照组的荧光活性图;
图4为本发明实施例7-10的不同浓度的TCEP对互补体系的影响结果图,其中,图4(A)为加入0.1mM TCEP还原剂的荧光互补体系及其对照组的荧光活性图,图4(B)为加入1mMTCEP还原剂的荧光互补体系及其对照组的荧光活性图,图4(C)为加入3mM TCEP还原剂的荧光互补体系及其对照组的荧光活性图,图4(D)为加入5mM TCEP还原剂的荧光互补体系及其对照组的荧光活性图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1蛋白对SidM/DrrA和Rab1片段与Gaussia荧光素酶片段融合基因表达载体的制备
所述融合基因表达载体的制备方法如下:
(1)通过在Rab1的C端设计引入荧光素酶N端片段NGluc,同时在2者之间引入柔性长肽链linker(GGGGS)2,并在融合体的C端引入纯化标签His6标签;
所述PCR反应体系为:25μL 2×Taq Master Mix,1μL DNA模板pCDNA3.1-Rab1-linker-NGluc,2μL上游引物(10μM),2μL下游引物(10μM),并用水补充至50μL;
其中在Rab1的C端设计引入荧光素酶N端片段NGluc所用引物为:
上游引物SEQ ID NO:1的序列为:
5’AAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGAACCCCGAGTACGACTACCT 3’;
下游引物序列SEQ ID NO:2的序列为:
5’GAGGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCCTATGCCGCCCTGTGCGGACTCTT 3’;
(2)通过在SidM/DrrA的N端引入荧光素酶C端片段CGluc,同时也在2者之间引入柔性长肽链linker(GGGGS)2,并在融合体的C端引入纯化标签His6tag;
所述重叠延伸PCR的反应体系为:25μL 2×Taq Master Mix,1μL DNA模板CGluc-linker和1μL DNA模板linker-SidM/DrrA,2μL上游引物(10μM),2μL下游引物(10μM),并用水补充至50μL;
其中在SidM/DrrA的N端引入C端片段CGluc所用引物为:
上游引物SEQ ID NO:3如下:
5’AAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGGAGGCGATCGTCGACATTCC3’;
下游引物SEQ ID NO:4如下:
5’AGATCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT 3’;
上游引物SEQ ID NO:5如下:
5’GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTCCCTACAGCGACGCTAAGG 3’;
下游引物SEQ ID NO:6如下:
5’GAGGTCGAGGTCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGTATCTGTGCTCCCTGCCCTCGTCCTT3’;
(3)以pTT5为融合基因的表达载体,在引物5’端引入EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切限制性酶切位点,通过PCR和重叠延伸PCR分别扩增融合体片段;
利用T4DNA连接酶将具有粘性末端的基因片段与具有同样粘性末端的载体在22℃下孵育连接,随后通过42℃热处理转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,经37℃培养复苏并涂布到LB平板(含有100μg/mL氨苄青霉素)筛选,挑取菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆,筛选到的阳性菌株经培养后提取质粒,最后进行基因测序鉴定;
将测序鉴定正确的质粒热处理分别转化到BL21(DE3)大肠杆菌和SHuffle T7BE.coli表达菌株,并进行甘油菌保种冻存以备用。
实施例2
与实施例1相比,除通过在SidM/DrrA的C端引入荧光素酶C端片段Cgluc外,其他条件与实施例1相同;
所述PCR反应体系为:25μL 2×Taq Master Mix,1μL DNA模板SidM/DrrA-linker-CGluc,2μL上游引物(10μM),2μL下游引物(10μM),并用水补充至50μL;
其中在SidM/DrrA的C端引入C端片段CGluc所用引物为:
上游引物SEQ ID NO:7如下:
5’AAACGGATCTCTAGCGAATTCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAG CCCTACAGCGACGCTAAGG 3’;
下游引物SEQ ID NO:8如下:
5’GAGGTCGAGGTCGGG GGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGTCACCACCGGCCCCCTTGATCTT 3’。
实施例3HEK293F细胞复苏与传代培养
将HEK293F细胞株从液氮罐中快速取出待复苏细胞,放入37℃水浴锅慢慢摇晃直至融化,在超净台中将细胞转入离心管,1000rpm离心5min弃去上清液,用手指轻弹离心管底将细胞分散,加入2mL培养基后用移液枪轻轻吹打细胞使细胞分散;并将细胞转入摇瓶中,并加入HEK293F基础培养基于二氧化碳培养箱中培养;
2天后观察细胞生长状况,并于显微镜下计数,若细胞密度达到2-3×106cells/mL时,说明细胞进入对数生长期应进行传代处理;
将摇瓶培养的细胞悬浮液用移液器轻轻吹打并快速转入离心管中,离心去除上清,加入培养基使得细胞密度达到0.5×106cells/mL,并加入终浓度为4-6mM谷氨酰胺,放回二氧化碳培养箱摇床震荡继续培养,观察细胞生长情况,准备转染。
实施例4蛋白对SidM/DrrA和Rab1片段与Gaussia荧光素酶片段融合表达载体的HEK293F细胞转染表达
在细胞转染前一天,取对数生长期的细胞按0.8×106cells/ml密度进行传代。在无菌EP管中各加入200μL HEK293F基础培养基,分别加入20μg DNA和60μl Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen),混匀室温孵育15-20min;将DNA与转染试剂混合液快速加入细胞悬液。培养24h后可检测转染效率,分别在转染48h、96h、144h后加入HEK293F补料培养基为初始转染体积的5%,待细胞活率降至60%左右时,离心收取细胞上清液,备用或纯化。
实施例5融合体蛋白的纯化
收集的细胞上清液即为融合体粗蛋白,利用Ni柱中的填料硫酸镍与表达载体上的组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理进行亲和层析去除杂蛋白,再用咪唑洗脱液(20mM Na3PO4,0.5M NaCl,150mM咪唑,pH 7.4)的竞争性结合到Ni柱填料,将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来,得到的蛋白经透析去除咪唑得到Gluc荧光素酶目的蛋白,并用SDS-PAGE电泳和Western Blot蛋白质免疫印迹检测目的蛋白,结果如图1(A)-图1(C)所示;
由图1(A)可知,Rab1-NGluc蛋白大小约为35KDa;由图1(B)可知,SidM/DrrA-CGluc蛋白大小约为40KDa;由图1(C)可知,CGluc-SidM/DrrA蛋白大小约为45KDa。
实施例6
荧光互补体系建立:将Rab1-NGluc分别与CGluc-SidM/DrrA或SidM/DrrA-CGluc构建荧光互补体系,其中蛋白浓度为5μM,缓冲液中加入5mM TCEP还原剂,在4℃震荡孵育过夜后,待检测发光活性;
所述缓冲液包括25mM pH 8.0的HEPES,50mM的NaCl和5mM的MgCl2。
生物发光活性分析:
将实施例6进行生物发光活性分析,采用Perkin Elmer VICTOR X4多标记微孔板检测仪进行检测,并使用白色96孔板进行反应,其中反应总体系为200μL,使得对照组与荧光互补实验组的蛋白检测量保持一致,底物量为5.9μM,其余的用相应的缓冲液进行补充,检测的滤光片设定为480/40nm进行发光检测,结果如图2(A)和图2(B)所示;
由图2(A)和图2(B)可知,Rab1-NGluc与SidM/DrrA-CGluc荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约6倍;Rab1-NGluc与CGluc-SidM/DrrA荧光互补体系的荧光活性的信号值在互补后提高了约30倍。
实施例7
选择荧光互补体系为Rab1-NGluc和CGluc-SidM/DrrA,其中蛋白浓度为5μM,加入0.1mM TCEP还原剂,检测荧光活性信号值。
实施例8
选择荧光互补体系为Rab1-NGluc和CGluc-SidM/DrrA,其中蛋白浓度为5μM,加入1mM TCEP还原剂,检测荧光活性信号值。
实施例9
选择荧光互补体系为Rab1-NGluc和CGluc-SidM/DrrA,其中蛋白浓度为5μM,加入3mM TCEP还原剂,检测荧光活性信号值。
实施例10
选择荧光互补体系为Rab1-NGluc和CGluc-SidM/DrrA,其中蛋白浓度为5μM,加入5mM TCEP还原剂,检测荧光活性信号值。
对比例1
与实施例6相比,除不加还原剂TCEP外,其他条件与实施例6相同。
生物发光活性分析:
将实施例7-10和对比例1进行生物发光活性分析,采用Perkin Elmer VICTOR X4多标记微孔板检测仪进行检测,并使用白色96孔板进行反应,其中反应总体系为200μL,使得对照组与荧光互补实验组的蛋白检测量保持一致,底物量为5.9μM,其余的用相应的缓冲液进行补充,检测的滤光片设定为480/40nm进行发光检测。
对比例1的结果如图3所示;
由图3(A)和图3(B)可知,Rab1-NGluc与SidM/DrrA-CGluc荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约1倍;Rab1-NGluc与CGluc-SidM/DrrA荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约2倍。
实施例7-实施例10的结果见图4所示;
由图4(A)可知,加入0.1mM TCEP还原剂,荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约2倍;由图4(B)可知,加入1mM TCEP还原剂,荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约3倍。由图4(C)可知,加入3mM TCEP还原剂,荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约25倍。由图4(D)可知,加入5mM TCEP还原剂,荧光互补体系的荧光活性信号值在互补后提高了约30倍。可知,3-5mM TCEP可以完全还原融合体中非正确折叠结构,形成有效的帮助结构域促使荧光素酶片段在空间上靠近而重建互补。
综上所述,本发明提供一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用,通过引入特异性相互作用的蛋白对,并设计适宜的柔性肽和结合位置,优化缓冲液中还原剂的种类和浓度,最终显著提高荧光互补效率,最高达到30倍;制备方法简洁高效,便于操作,易于推广,可应用于诸多方面,具备广阔的应用前景和市场价值。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用
<130> 2017
<141> 2017-12-25
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
aaacggatct ctagcgaatt cgccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg 60
ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac tacaaggacg agaaccccga gtacgactac 120
ct 122
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
gaggtcgagg tcgggggatc cttaatggtg atggtgatga tggcctatgc cgccctgtgc 60
ggactctt 68
<210> 3
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
aaacggatct ctagcgaatt cgccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg 60
ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac tacaaggacg aggaggcgat cgtcgacatt 120
cc 122
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
agatcctcct cctccgcttc ctcctcctcc gtcaccaccg gcccccttga tctt 54
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 5
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct ccctacagcg acgctaagg 49
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 6
gaggtcgagg tcgggggatc cttaatggtg atggtgatga tggtatctgt gctccctgcc 60
ctcgtcctt 69
<210> 7
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 7
aaacggatct ctagcgaatt cgccaccatg gagacagaca cactcctgct atgggtactg 60
ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac tacaaggacg agccctacag cgacgctaag 120
g 121
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 8
gaggtcgagg tcgggggatc cttaatggtg atggtgatga tggtcaccac cggccccctt 60
gatctt 66
Claims (13)
1.一种荧光素酶荧光互补体系,其特征在于,所述体系包括Rab1、SidM/DrrA、荧光素酶C端、荧光素酶N端、连接肽和还原剂TCEP;
所述Rab1的C端通过连接肽与荧光素酶N端相连,所述SidM/DrrA的N端或C端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连;
所述连接肽为柔性连接肽;
所述柔性连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)2。
2.根据权利要求1所述的互补体系,其特征在于,所述SidM/DrrA的N端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连。
3.根据权利要求1或2所述的互补体系,其特征在于,所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶或NanoLuc荧光素酶中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的互补体系,其特征在于,所述荧光素酶为Gaussia荧光素酶;
所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM。
5.根据权利要求4所述的互补体系,其特征在于,所述还原剂TCEP的浓度为3-5mM。
6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述互补体系的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)构建蛋白对SidM/DrrA和Rab1片段与荧光素酶片段融合基因表达载体;
(2)将步骤(1)得到的载体转染细胞并表达纯化;
(3)建立荧光互补体系并检测分析生物发光活性。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述表达载体的构建步骤如下:
(1’)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽与荧光素酶N端相连为融合体1;
(2’)将所述SidM/DrrA通过柔性连接肽与荧光素酶C端片段相连为融合体2;
(3’)将融合体1和融合体2通过PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述建立荧光互补体系的具体步骤为:
将表达的融合体1蛋白与融合体2蛋白加入缓冲液中混匀后,再加入还原剂TCEP,4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述荧光互补体系中的蛋白浓度为4-6μM;
所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM;
所述检测的荧光素酶的底物添加量为5.5-6.2μM。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述还原剂TCEP的浓度为3-5mM。
12.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(1)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽(GGGGS)2与Gaussia荧光素酶N端相连为融合体1;
(2)将所述SidM/DrrA的N端通过柔性连接肽(GGGGS)2与Gaussia荧光素酶C端片段相连为融合体2,所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签;
(3)将融合体1和融合体2通过PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定;
(4)将步骤(3)得到的载体转染细胞并表达纯化;
(5)将融合体1蛋白与融合体2加入缓冲液中混匀后,体系中蛋白浓度为4-6μM,再加入终浓度为2-6mM的还原剂TCEP,4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性。
13.一种如权利要求1-5中任一项所述荧光素酶荧光互补体系用于制备光信号载体、体外诊断检测探针或检测设备中的任意一种或至少两种组合的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711420283.5A CN109957604B (zh) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711420283.5A CN109957604B (zh) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109957604A CN109957604A (zh) | 2019-07-02 |
CN109957604B true CN109957604B (zh) | 2022-09-02 |
Family
ID=67020898
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711420283.5A Active CN109957604B (zh) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109957604B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112798786B (zh) * | 2019-11-14 | 2022-04-29 | 深圳先进技术研究院 | 一种基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101636504A (zh) * | 2006-12-21 | 2010-01-27 | 基因流股份有限公司 | 利用分泌性荧光素酶的生物发光测定 |
CN101636503A (zh) * | 2006-10-24 | 2010-01-27 | 基因流股份有限公司 | 萤光素酶信号增强组合物 |
CN106916795A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用 |
CN107034228A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-08-11 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005074436A2 (en) * | 2003-10-24 | 2005-08-18 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling split-fluorescent protein systems |
-
2017
- 2017-12-25 CN CN201711420283.5A patent/CN109957604B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101636503A (zh) * | 2006-10-24 | 2010-01-27 | 基因流股份有限公司 | 萤光素酶信号增强组合物 |
CN101636504A (zh) * | 2006-12-21 | 2010-01-27 | 基因流股份有限公司 | 利用分泌性荧光素酶的生物发光测定 |
CN106916795A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用 |
CN107034228A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-08-11 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种基于双分子荧光互补技术的筛选互作蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Lisette G.G.C. Verhoef,等.Visualization of Protein Interactions in Living Cells Using Bimolecular Luminescence Complementation(BiLC).《Current Protocols in Protein Science》.2017,第90卷第30.5.1-30.5.14页. * |
Structural mechanism of host Rab1 activation by the bifunctional Legionella type IV effector SidM/DrrA;Yongqun Zhu,等;《PNAS》;20100309;第107卷(第10期);摘要 * |
Visualization of Protein Interactions in Living Cells Using Bimolecular Luminescence Complementation(BiLC);Lisette G.G.C. Verhoef,等;《Current Protocols in Protein Science》;20171101;第90卷;参见第1页第3段,第2页第2-5段,第7页第15段,第3页第3段,第4页第9段,第6页第6段,第13页右列第2段,表30.5.1 * |
Yongqun Zhu,等.Structural mechanism of host Rab1 activation by the bifunctional Legionella type IV effector SidM/DrrA.《PNAS》.2010,第107卷(第10期),4699-4704. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109957604A (zh) | 2019-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106916795B (zh) | 一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用 | |
Gu et al. | Protein tag-mediated conjugation of oligonucleotides to recombinant affinity binders for proximity ligation | |
Choi et al. | NSF-mediated disassembly of on-and off-pathway SNARE complexes and inhibition by complexin | |
CN111320684B (zh) | 人源N-甲基-D-天冬氨酸受体的GluN1/GluN2A四聚体的表达及其应用 | |
JP7265487B2 (ja) | 関心対象のアナライトを検出するための全細胞センサにおいて使用するためのキメラ受容体 | |
Huang et al. | Creating red light-switchable protein dimerization systems as genetically encoded actuators with high specificity | |
CN105473745B (zh) | 用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列 | |
US20220259574A1 (en) | Atp-independent bioluminescent reporter variants to improve in vivo imaging | |
CN109134644A (zh) | 远红光荧光蛋白及其融合蛋白 | |
CN109957604B (zh) | 一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用 | |
Fischer et al. | Cyclic derivatives of the chemerin C-terminus as metabolically stable agonists at the chemokine-like receptor 1 for cancer treatment | |
JPWO2008123180A1 (ja) | 標的物質の検出方法、並びに、これに用いるタグ、dna、ベクター、プローブ及び検出キット | |
RU2727685C1 (ru) | Генетически кодируемые индикаторы ионов калия | |
JPWO2013175678A1 (ja) | ヒト心筋由来トロポニンiに特異的にかつ速やかに結合できる変異体タンパク質 | |
JP2019163270A (ja) | 親和性タンパク質及びその使用 | |
CN109265523A (zh) | 源自bdfp近红外光荧光蛋白的新型荧光标记物及其融合蛋白 | |
CN113717986B (zh) | 基于拆分荧光素酶Akaluc的蛋白片段互补系统及其构建方法 | |
CN112961225B (zh) | 近红外荧光蛋白、重组载体、重组细胞及其应用 | |
JPWO2007132555A1 (ja) | 細胞膜透過性ペプチドと細胞内におけるその使用 | |
CN113024674B (zh) | 荧光亮度宽幅变化的环磷酸腺苷荧光探针 | |
Pozdniakova et al. | Using ELP repeats as a scaffold for de novo construction of gadolinium-binding domains within multifunctional recombinant proteins for targeted delivery of gadolinium to tumour cells | |
Liu et al. | A Bright Monomeric Near-Infrared Fluorescent Protein with an Excitation Peak at 633 nm for Labeling Cellular Protein and Reporting Protein–Protein Interaction | |
Karasev et al. | Nuclear Localization Signals for Optimization of Genetically Encoded Tools in Neurons | |
CN116068198B (zh) | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 | |
JP2017035063A (ja) | 任意の標的物質と共有結合可能な(ポリ)ペプチド/タンパク質タグの選択方法及び選択されて得られた(ポリ)ペプチド/タンパク質タグ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |