CN101636503A

CN101636503A - 萤光素酶信号增强组合物

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Publication number: CN101636503A
Application number: CN200780047931A
Authority: CN
Inventors: 马可·彼得·列伊; 约翰·迈克尔·戴利
Original assignee: Gene Stream Pty Ltd
Current assignee: Gene Stream Pty Ltd
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-24
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2027-10-24
Also published as: IL198355A0; EP2087132B1; WO2008049160A1; JP2016063820A; CN101636503B; EP2843411B1; JP5844029B2; US8232047B2; JP2015051010A; AU2007308745A1; IL233524A; US20100055693A1; EP2087132A1; AU2007308745B2; KR101531424B1; USRE46199E1; IL198355A; EP2843411A1; USRE47607E1; IL233524A0

Abstract

描述了在萤光素酶催化的反应中使用并且特别在基于萤光素酶的报告基因测定中使用的试剂和组合物。本发明也提供了尤其用于提高萤光素酶催化反应的灵敏度和/或改进萤光素酶催化反应的动力学的方法和组合物。

Description

萤光素酶信号增强组合物

发明领域

本发明一般涉及在萤光素酶催化的反应中、例如在基于萤光素酶的报告基因测定和其中使用萤光素酶作为与分子(例如用于免疫细胞化学测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)的抗体)结合的可检测和/或可量化标记的应用中使用的试剂和组合物。本发明也提供了尤其用于提高萤光素酶催化反应的灵敏度和/或改进萤光素酶催化反应的动力学的方法和组合物。

发明背景

报告基因测定代表基因表达研究中一种重要的工具，允许理解控制感兴趣基因表达的因素，例如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA-结合蛋白、信号转导途径和特定的刺激。尤其是，报告基因测定可用来鉴定在基因调节中重要的核酸区域。这样的区域和/或结合或调控它们的因子可以在治疗或预防人类疾病中作为治疗性干预的潜在靶。报告基因测定也可用来根据药物修饰基因表达的能力而筛选药物。

报告基因测定一般被用来鉴定基因启动子区域或启动子内的特定元件，如转录因子结合位点或其他调节元件。可选地，该测定被用来研究启动子或调节元件对各种刺激或物质的响应。在一些应用中，测定中使用的报告基因构建体或转染细胞被引入生物体以在体内研究启动子的功能。进一步，报告基因测定可被用来研究或测定特定启动子上游的信号转导途径。

作为实例，在设计为研究推定的启动子序列或其他转录调节元件的报告基因测定中，待询问的核酸被克隆进报告质粒内的某一位置以允许调节下游报告基因转录并因此调节由报告基因编码的报告蛋白表达。为便于检测，报告蛋白与存在于其中转染了报告质粒的细胞内的内源蛋白应该是可区别的，并且优选地报告蛋白的表达应该是容易量化的。在适当的测定中报告蛋白被定量，并且常常表示为相对于由诸如例如启动子SV40的普遍存在的启动子驱动的对照报告基因的水平。对照报告基因与测试报告基因必须是可区别的，并且一般被包含在与测试载体共转染并用来控制转染率的单独载体上。该测定基于细胞成比例地接纳等量的两种载体的前提。

报告基因测定的多种不同应用涉及测定基因表达随时间或在加入诸如药物、配基、激素等化合物之后的改变。这在药物筛选中特别重要。加入药物后，检测报告蛋白水平的可测定改变可被延迟和稀释，因为表达水平的改变通过mRNA传递至蛋白质。近来由本申请人做出的此类应用的显著进步是在报告载体中组合使用mRNA-和蛋白质-去稳定元件以改进响应的速度和幅度，如同时待审的美国专利申请第10/658,093号所述，其公开内容通过引用并入本文。

使用不同可检测报告蛋白的各种报告基因测定系统是可商业获得的，最常见的可检测报告蛋白是氯霉素转移酶(CAT)、β半乳糖苷酶(β-gal)、分泌型碱性磷酸酶和各种荧光蛋白和萤光素酶。

萤光素酶是用于体外测定系统的最常用的报告蛋白。萤光素酶是能生物发光的酶，并且天然地存在于一些生物体中。在可商业获得的测定系统中，萤光素酶可被分为使用D-萤光素作为底物的萤光素酶和使用腔肠素作为底物的萤光素酶。最广泛采用的前者的实例是萤火虫萤光素酶(一种胞内酶)。使用D-萤光素的萤光素酶的额外实例包括鞘翅目(Coleoptera)的其他成员，如叩头虫和苹果蝇蛆。也可根据它们从其衍生的生物体是陆生的还是水生的(一般海洋的)来区别萤光素酶。使用腔肠素作为底物的萤光素酶一般衍生自海洋动物，如软珊瑚海肾(Renilla)或桡足类Gaussia，而使用D-萤光素的萤光素酶一般衍生自陆生动物。区别萤光素酶的进一步的方法是根据在其天然状态(即在它们从其衍生的生物体中)它们是分泌型还是非分泌型。衍生自陆生生物的萤光素酶一般是非分泌型(胞内的)，而衍生自海洋生物的萤光素酶可以是分泌型或非分泌型(胞内的)。例如海肾萤光素酶是胞内的，而Gaussia萤光素酶在其天然状态是分泌型酶。海洋生物分泌萤光素酶被认为是设计为分散接近的捕食者注意力的保护性响应。其他分泌型萤光素酶包括来自Metridia longa、Vargula hilgendorfii、细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)、剑乳点水蚤(Pleuromamma xiphias)、海萤夜光虫(Cypridina noctiluca)以及长腹水蚤科(Metridinidae)其他成员的萤光素酶。喉萤(Vargula)萤光素酶使用不同于腔肠素或D-萤光素的底物。另一类萤光素酶是衍生自沟鞭藻类(dinoflagellates)的萤光素酶。

基于萤光素酶的测定系统可采用不止一种萤光素酶，一般为不同来源并且每个使用不同的底物，实现了两个测试和对照报告基因在同一测定中被测定。作为实例，推定的启动子元件被克隆到萤火虫萤光素酶报告基因的上游，以致其驱动萤光素酶基因的表达。该质粒与含有由SV40启动子驱动的海肾萤光素酶基因的对照质粒同时瞬时转染到细胞系中。加入第一个萤光素以激活萤火虫萤光素酶，测定该报告基因的活性，然后加入“猝灭和激活”试剂。该“猝灭和激活”试剂含有猝灭萤光素信号的化合物，还含有腔肠素以激活海肾萤光素酶，然后测定其活性。萤火虫萤光素酶的活性水平不仅依赖于启动子活性，而且依赖于转染率。依赖于DNA量、DNA制品的质量和细胞的条件，转染率变化很大。共转染的对照质粒(由诸如SV40启动子的适合启动子驱动的海肾萤光素酶)被用来校正这些变量，基于海肾萤光素酶的活性与细胞接纳的编码萤火虫萤光素酶的质粒的量成比例的前提。可选地或另外地，海肾萤光素酶可用来控制其他变量，如细胞数目、细胞存活率和/或一般转录活性；或者可用来确定应用于细胞的特定处理或化合物影响两个启动子还是特异于它们中的一个。

基于萤光素酶的测定系统(特别是使用一种或多种胞内萤光素酶的测定系统)常常采用两种缓冲液：裂解缓冲液和测定缓冲液。首先将裂解缓冲液加到细胞中以裂解细胞并由此释放萤光素酶，这有助于随后的测定。然后加入含有萤光素酶底物和任何辅因子的测定缓冲液，之后进行萤光素酶活性的测定。测定可在加入测定缓冲液后立即(即几秒内)进行(通常所说的“闪光”反应)或在几分钟或几小时后进行(通常所说的“辉光”反应)，通过在测定缓冲液中使用“辉光”试剂保持光信号稳定持续较长的时间。闪光反应提供最高的信号强度(每秒的光单位)，因此具有提供最高灵敏度的优势。辉光反应在其中例如使用者没有适合的易用发光计(配备有注入器)的应用中或在其中批处理要求注射和测定之间延迟的一些高通量筛选的应用中特别有优势。

分泌型萤光素酶在包围测试细胞的条件培养基样品中测定。因此对分泌型萤光素酶不使用裂解缓冲液。

用于萤光素酶报告基因测定的现有缓冲液和试剂有许多缺点。

尤其是，需要提供提高的萤光素酶反应灵敏度(即比使用现有试剂可获得的更大强度的信号强度)的试剂、反应组合物和试剂盒。在测定的报告基因在感兴趣的细胞中只提供低水平的萤光素酶的情况，例如，被研究的启动子只具有低活性的情况，和/或感兴趣的细胞难与报告载体一起转染/转导的情况，这种需要特别重要。提高的灵敏度也将通过减少产生可被可靠地测定的信号强度所需的最少细胞数目而有助于使报告基因测定小型化。

当使用包括诸如在同时待审的美国专利申请第US 10/658,093号中所述的那些去稳定元件的测定系统时，稳态萤光素酶信号变弱。因此提供更高信号强度的试剂对使用去稳定元件的报告基因测定系统将特别有优势。

此外，目前在“闪光”和“辉光”缓冲液和试剂之间存在抵触。即，为获得强烈的闪光，辉光相被牺牲，反之亦然。明显需要既能提供高灵敏度闪光反应又能提供延长辉光的缓冲液和试剂。有助于从萤光素酶催化的生物发光反应产生高闪光和延长辉光的缓冲液将为使用者提供双重目的试剂，其能在需要时提供高灵敏度(闪光反应)，也能为不需要高灵敏度的应用提供辉光反应的便利。

最后，为了实现同时测定基于发射波长差异的两种或多种不同的萤光素酶，必须有能支持两种或多种不同萤光素酶活性的一种试剂。

发明概述

本发明提供了用于确定样品中萤光素酶的量或活性的试剂组合物和包含该组合物的试剂盒。本发明进一步提供了用于使用试剂组合物和用于确定样品中萤光素酶的量或活性的方法。本发明部分基于本发明人的下述惊人发现：试剂组合物的各种改变可对某类萤光素酶的活性和对新试剂组合物的开发具有深远的影响，新试剂组合物尤其允许产生比使用目前可用的组合物可获得的更高的灵敏度(更强的闪光相)、降低的发光信号衰变速率(更稳定的辉光相)、缩短的裂解时间和/或测定时间、以及提高的酶活性或潜力随时间的稳定性。

尤其是，本发明人发现其天然形式为分泌型的萤光素酶具有不同于更一般使用的胞内萤光素酶的特性，因此对试剂组合物具有完全不同的要求。此外，当这些正常分泌型的萤光素酶在胞内表达时，本发明人发现它们变得不适合与任何目前可用的试剂组合物一起使用。本发明人随后鉴定了制备适合与单独或与不同类萤光素酶组合使用的该萤光素酶一起使用的试剂所需的关键特征和组分。

在第一方面，本发明提供了一种用于确定样品中萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，其中试剂组合物允许在细胞裂解物中产生增强的发光信号、降低的来自萤光素酶的发光信号的衰变速率和/或提高的萤光素酶活性随时间的稳定性。一般地，在存在萤光素酶时，试剂组合物提供适合有助于萤光素酶转变为活性构象的环境。

萤光素酶可以是分泌型或非分泌型，并且可以衍生自其天然形式为分泌型或非分泌型的萤光素酶。在一个实施方案中，萤光素酶衍生自其天然形式为分泌型的萤光素酶。在一个特定实施方案中，萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的修饰形式的非分泌型萤光素酶。非分泌型萤光素酶可在胞质或其他细胞区室中表达，一般其中细胞区室提供还原环境。

萤光素酶可使用任何已知的萤光素酶底物，如，例如萤光素或腔肠素。在一个实施方案中，萤光素酶使用腔肠素作为底物，并且是海洋来源的。海洋来源的萤光素酶可衍生自例如Gaussia属、水蚤属(Pleuromammaspp.)、长腹水蚤属(Metridia spp.)、海萤属(Cypridina spp.)或刺虾属(Oplophorus spp.)。萤光素酶可以是天然存在的萤光素酶的变体或衍生物。

试剂组合物可包含一种或多种螯合剂、溴化物阴离子、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有大于约8的pH。

螯合剂一般是二价金属螯合剂。二价金属螯合剂可例如选自EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，二价金属螯合剂为EDTA，以至少0.1mM、更优选地在约1mM和30mM之间、更典型地在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

洗涤剂可以是两性离子或更优选地非离子型洗涤剂。洗涤剂优选地是以低于约1％的终浓度。在一个实施方案中，当第一次与样品或细胞接触时，洗涤剂可以在约0.05％和约0.2％之间的浓度存在。洗涤剂可选自例如Triton X-100、NP101或NP40。在一个特定实施方案中，洗涤剂为NP40。

氧化剂或氧化剂和还原剂的组合一般导致萤光素酶的氧化，因此有助于萤光素酶采用活性构象。还原剂可包含硫醇基。在一个特定实施方案中，组合物包含氧化还原缓冲液组合，如氧化型和还原型谷胱甘肽的混合物。

试剂组合物的pH一般为大于约8，更典型地在约8和约9之间，或更典型地在约8.4和8.8之间。

溴化物阴离子可以一种或多种溴化物盐的形式提供。溴化物盐可以是例如溴化钠、溴化钾或溴化铷。溴化物阴离子一般以至少约1mM、一般在约1mM和约500mM之间的浓度存在。

在第二方面，本发明提供了一种用于确定样品中重组萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，试剂组合物包含一种或多种螯合剂，其中重组萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体。

螯合剂可以是二价金属螯合剂。螯合剂可例如选自EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，二价金属螯合剂是EDTA，以至少0.1mM、更优选地在约1mM和30mM之间、更典型地在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

试剂组合物可进一步包含溴化物阴离子、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有大于约8的pH。

试剂组合物可进一步包含萤光素酶底物。

在第三方面，本发明提供了一种用于确定样品中重组萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，试剂组合物包含溴化物阴离子，其中重组萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体。

溴化物阴离子可以一种或多种溴化物盐的形式提供。溴化物盐可选自溴化钠、溴化钾或溴化铷。溴化物阴离子一般以至少约1mM、一般在约1mM和约500mM之间的浓度存在。

试剂组合物可进一步包含一种或多种螯合剂、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有大于约8的pH。

试剂组合物可进一步包含萤光素酶底物。

在第四方面，本发明提供了一种用于确定细胞或细胞样品中萤光素酶的量和/或活性的方法，该方法包括：

(a)提供表达萤光素酶的细胞，其中萤光素酶主要或完全以无活性状态或构象存在；

(b)使细胞与能将萤光素酶从无活性状态或构象转变成活性状态或构象的有效量试剂组合物孵育；

(c)加入萤光素酶底物和任选地萤光素酶生物发光活性所需的辅因子，如CoA、ATP和镁；和

(d)检测活性萤光素酶产生的生物发光信号。

一般地，用于将萤光素酶从无活性状态或构象转变成活性状态或构象的组合物提供螯合剂和/或适合萤光素酶转变为活性构象的氧化还原环境。氧化还原环境可适合或允许萤光素酶的氧化。另外地，试剂组合物可包含一种或多种溴化物阴离子、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，并且具有大于约8的pH。

试剂组合物可以是第一至第三方面的任一方面的组合物。试剂组合物可进一步包含萤光素酶底物。

萤光素酶可以是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

在第五方面，本发明提供了一种用于确定细胞或细胞样品中重组萤光素酶的量和/或活性的方法，该方法包括：

(a)裂解细胞；

(b)使细胞裂解物与有效量包含螯合剂的试剂组合物接触；

(d)检测样品的生物发光；

其中重组萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体。

试剂组合物可包含洗涤剂，以致步骤(a)和(b)可组合为一步。在某些实施方案中，试剂组合物包含萤光素酶底物，以致步骤(b)和(c)可组合为一步。

试剂组合物可以是第一至第三方面的任一方面的组合物。

在第六方面，本发明提供了一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，该方法包括使萤光素酶与提供允许或促进萤光素酶转变为活性状态或构象的环境(如适合的氧化还原环境)的有效量试剂组合物接触。试剂组合物一般包含一种或多种溴化物盐、浓度低于1％的非离子型洗涤剂、二价金属螯合剂(优选地以至少1mM的浓度)、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，并且具有大于约8的pH。

在第七方面，本发明提供了一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，该方法包括萤光素酶与有效量的一种或多种二价金属螯合剂接触。二价金属螯合剂可例如选自EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，二价金属螯合剂是EDTA，以至少0.1mM、更优选地在约1mM和30mM之间、更典型地在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

在第八方面，本发明提供了一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，该方法包括使萤光素酶与有效量的溴化物阴离子(一般以溴化物盐的形式)接触。

在第九方面，本发明提供了一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，该方法包括使萤光素酶与有效量的试剂组合物接触，其中试剂组合物提供适合有助于萤光素酶转变为活性状态或构象的环境，如适合的氧化还原环境。

在加入底物后几分钟开始的相期间，生物发光信号一般被延长。

在第十方面，本发明提供了一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，该方法包括使萤光素酶与一种或多种二价金属螯合剂接触。二价金属螯合剂可例如选自EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，二价金属螯合剂是EDTA，以至少0.1mM、更优选地在约1mM和30mM之间、更典型地在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

在第十一方面，本发明提供了一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，该方法包括使萤光素酶与有效量的溴化物(一般以溴化物盐的形式)接触。

一般地，根据第六至第十一方面，萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

还提供了用于缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间的方法。不受任何一种理论或作用模式所限，缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间可由于或涉及缩短的裂解时间和/或测定时间、以及提高的酶活性或潜力随时间的稳定性。

在第十二方面，本发明提供了一种用于测定萤光素酶的量和/或活性的试剂盒，该试剂盒包含至少一种试剂组合物，其中试剂组合物提供适合有助于萤光素酶转变为活性构象的环境。

试剂组合物可以是第一至第三方面的任一方面的组合物。萤光素酶可以是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

在第十三方面，本发明提供了一种用于测定萤光素酶的量和/或活性的试剂盒，该试剂盒包含溴化物离子和萤光素酶底物。

根据上述方面或实施方案的任一个，试剂组合物可进一步包含抗氧化剂。任选地组合物进一步包含BSA、蛋白酶抑制剂、甘油、尿素或萤光素酶底物。

根据上述方面或实施方案的任一个，试剂组合物可以是用于裂解包含萤光素酶的细胞的缓冲液的形式。相应地，裂解缓冲液可进一步包含额外的组分，如，例如甘油和蛋白酶抑制剂。缓冲剂可以是例如Tris、Hepes或磷酸盐缓冲液。裂解缓冲液可以是组合的细胞裂解/萤光素酶测定缓冲液的形式，相应地，组合物可进一步包含萤光素酶底物，如腔肠素(colenterazine)。

一般地，根据上述方面和实施方案，萤光素酶从报告基因表达，并且萤光素酶的量或活性作为报告基因测定的一部分来确定。报告基因测定可以是多种萤光素酶测定的一部分。

本发明还涉及用于确定样品中萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，其中在存在萤光素酶时，试剂组合物提供适合有助于萤光素酶转变为活性状态或构象的环境。

萤光素酶可以是重组萤光素酶。重组萤光素酶可以是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型形式。

试剂组合物可提供适合有助于萤光素酶折叠为活性构象的氧化还原环境。试剂组合物可提供适合有助于萤光素酶解聚和/或与干扰蛋白分开和/或萤光素酶以有助于随后萤光素酶重折叠为活性状态的方式解折叠的环境。

试剂组合物提供的环境一般有助于无活性的萤光素酶更快速转变成活性构象或采用或保持更高活性的构象。可选地或另外，所述环境可通过增加采用最高活性构象的萤光素酶的比例来增强样品中萤光素酶的总体活性。可选地或另外，所述环境可有助于保持样品中萤光素酶的恒定活性状态或缩短样品达到萤光素酶的恒定活性状态需用的时间。一般地，这通过缩短样品中萤光素酶达到其最大活性的时间来获得。

试剂组合物可包含两性离子或更优选地非离子型洗涤剂。洗涤剂优选地是以低于约1％的终浓度。在一个实施方案中，当第一次与样品或细胞接触时洗涤剂可以约0.05％和约0.2％之间的浓度存在。洗涤剂可选自例如Triton X-100、NP101或NP40。在一个特定的实施方案中，洗涤剂是NP40。

可选地或另外，试剂组合物可包含至少一种适合的氧化剂或氧化剂和还原剂的组合。所述剂可包含硫醇基。所述剂一般导致萤光素酶的氧化，因此有助于萤光素酶采用活性构象。在一个特定实施方案中，组合物包含氧化还原缓冲液组合，如氧化型和还原型谷胱甘肽的混合物。

可选地或另外，试剂组合物的pH可为大于约8，一般地在约8和约9之间，或更典型地在约8.4和8.8之间。

试剂组合物可进一步包含一种或多种螯合剂，如二价金属螯合剂。螯合剂可例如选自EDTA、CDTA和EGTA。在一个实施方案中，螯合剂是EDTA。螯合剂一般以至少0.1mM、更优选地在约1mM和30mM之间、更典型地在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

试剂组合物可进一步包含溴化物阴离子，一般以至少一种溴化物盐的形式。溴化物盐可以是例如溴化钠、溴化钾或溴化铷。溴化物阴离子一般以至少约1mM、一般在约1mM和约500mM之间的浓度存在。

本发明还涉及用于确定样品中萤光素酶的量或活性的方法，该方法包括：

(a)使样品与有效量的根据本发明的试剂组合物孵育；

(b)加入萤光素酶底物；和

(c)检测样品的生物发光。

底物可以在步骤(a)的试剂组合物中或在第二个组合物中存在，任选地还包含萤光素酶生物发光活性所需的辅因子，如CoA、ATP和镁。第二个试剂组合物的pH可低于第一个组合物的pH。

附图简述

现将参考附图来描述仅作为实施例的本发明的实施方案。

图1显示溴化物离子对HeLa细胞中表达的分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图2显示NaBr对HeLa细胞中表达的非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。裂解缓冲液中NaBr的影响与在测定缓冲液中具有NaBr相比较。

图3显示对一些溴化物离子浓度，溴化物离子对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图4显示对一些溴化物和氯化物离子浓度，溴化物和氯化物离子对非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图5A和5B显示在裂解缓冲液或测定缓冲液中的NaBr对HeLa细胞中表达的非分泌型Gaussia萤光素酶和非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性影响的比较。

图6显示盐的阳离子相比阴离子增强非分泌型Gaussia萤光素酶活性的效果。

图7显示NaBr与EDTA缩短在测定非分泌型Gaussia萤光素酶活性之前的裂解时间的效果。

图8A和8B显示一些浓度的作为螯合剂的EDTA对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图9显示EDTA和EGTA作为螯合剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性影响的比较。

图10A和10B显示EDTA、CDTA和EGTA作为螯合剂对非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性影响的比较。

图11A和11B显示一些浓度的作为螯合剂的EDTA对分泌型Gaussia萤光素酶和分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图12显示一些浓度的EDTA对萤火虫和海肾萤光素酶的影响。

图13A、13B和13C显示各种洗涤剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图14A和14B显示各种洗涤剂对非分泌型Gaussia萤光素酶和非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图15A和15B显示各种洗涤剂对分泌型Gaussia萤光素酶活性和分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图16A和16B显示洗涤剂浓度对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图17显示洗涤剂浓度对分泌型和非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图18A、18B、18C和18D显示更高pH对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图19显示pH对非分泌型Gaussia萤光素酶和非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图20显示各种浓度和比例的氧化剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图21显示各种浓度和比例的氧化剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图22显示氧化剂对非分泌型Gaussia萤光素酶和非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性影响的比较。

图23A和23B显示在裂解缓冲液和/或测定缓冲液中的氧化剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图24显示各种浓度的尿素对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图25显示组合的NaBr、螯合剂、洗涤剂和氧化剂对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响。

图26显示组合的NaCl或NaBr、螯合剂、洗涤剂和氧化剂对非分泌型长腹水蚤萤光素酶活性的影响。

图27A和27B显示可商业获得的测定试剂盒与根据本发明实施方案的试剂组合物关于对非分泌型Gaussia或海肾萤光素酶的比较。

图28显示可商业获得的测定试剂盒与根据本发明实施方案的试剂组合物关于灵敏度的比较。

图29A和29B显示可商业获得的测定试剂盒与根据本发明实施方案的试剂组合物关于延长辉光的比较。

图30A和30B显示可商业获得的测定试剂盒与根据本发明实施方案的试剂组合物关于灵敏度和裂解时间影响的比较。

发明详述

整个本说明书和接着的权利要求中，除非上下文另外要求，词“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式将被理解为暗指包括所述整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。

冠词“一(a)”和“一(an)”在本文用来指一个或不只一个(即指至少一个)冠词的语法对象。作为实例，“一个元件(an element)”意指一个元件或不只一个元件。

如本文所用，在萤光素酶从一种构象转变成另一种的上下文中，术语“有助于”意指试剂组合物允许、引起或促进该转变。因此，有助于萤光素酶转变为活性构象可以是被动或主动的，以及直接或间接的。例如，试剂组合物可提供其中萤光素酶转变为活性构象可发生的适合的环境。可选地，试剂组合物可直接或间接促进或以其他方式引起或产生该转变。“有助于”萤光素酶转变的物质、添加剂或试剂组分一般是相对于缺少该物质但另外相同或大体上等效的试剂提供更有效转变的物质、添加剂或试剂组分。

如本文所用，术语“转变”指在获得活性状态或构象时萤光素酶的折叠、解聚、重折叠或其他修饰。进一步地，对萤光素酶转变为活性构象的提及被用来意指从无活性状态或构象转变成活性状态或构象、或从部分活性或较低活性状态或构象转变成更高活性状态或构象。在该上下文中，术语“构象”指酶采用的结构(例如三级或四级结构)，并且与酶催化反应和加入底物时产生生物发光信号的能力相关。在缺少底物时，萤光素酶的实际催化活性不存在。然而，被转变成更高活性状态或构象的萤光素酶能够在加入底物时产生比在缺少该转变时可能产生的更强的发光。该增强的发光一般在闪光反应中是明显的，也就是说萤光素酶转变成活性形式是与通过例如阻断负反馈机制实现延长辉光相互独立的过程，所述负反馈机制有效降低荧光素酶在底物存在时其最初催化活性之后的活性。

本文在萤光素酶的生物发光信号强度的上下文中所用的术语“增强”意指相对于在缺少试剂组合物时和/或在存在现有技术的组合物时获得的信号强度，定性地或定量地增强或增加信号强度。相似地，术语“降低的衰变速率”用来表示相对于在缺少试剂组合物时和/或在存在现有技术的组合物时生物发光信号的衰变速率。

如本文所用，术语“有效量”其含义内包括试剂组合物无毒但足以提供所需的效果的量。所需的精确量可以根据情况而变化，依赖于如下因素：分析样品的性质、所用的萤光素酶和萤光素酶是胞内的还是分泌型的以及所用的试剂或组合物的组成。因此不可能指定精确的“有效量”。然而，对任何给定的情况，适当的“有效量”可仅使用常规实验由本领域普通技术人员来确定。

如本文所用，术语“非分泌型萤光素酶”意指不从细胞输出或分泌到胞外环境的萤光素酶。因此“非分泌型”包括以任何形式保留在细胞内的萤光素酶，因此萤光素酶可以是胞质的或膜结合的。一般地，尽管不排他地，当荧光素酶在本文被指为其天然形式为分泌型的萤光素酶的“非分泌”形式时，该分泌和缺少分泌指真核细胞。

本文提到萤光素酶时所使用的术语“底物”意指萤光素酶作用的底物分子，不包括可能有益于或为萤光素酶与底物结合和/或催化作用所需的任何额外的辅因子。例如，萤光素酶催化的反应可能需要或受益于诸如镁、CoA和ATP的辅因子，然而在本发明的上下文中，该辅因子不被认为落入术语“底物”的范围。萤光素酶“底物”包括例如D-萤光素和腔肠素。为本申请的目的，术语“萤光素”指底物D-萤光素及其类似物，其分子是衍生自例如鞘翅目(如萤火虫、叩头虫和苹果蝇蛆)的萤光素酶的底物。术语萤光素不包含腔肠素，其代表由特殊类萤光素酶(如衍生自例如海肾、Gaussia和长腹水蚤的萤光素酶)使用的不同的萤光素酶底物。

如本文公开，本发明人开发了允许改进的萤光素酶报告基因系统的试剂组合物，尤其证明了增强的信号强度(更强的闪光相)、降低的发光信号衰变速率(更稳定的辉光相)、缩短的裂解时间和/或测定时间、以及改进的酶活性或潜力随时间的稳定性。发现该系统应用于其中需要确定或定量萤光素酶的量和/或活性的任何基于萤光素酶的反应。例如，根据本发明实施方案的组合物特别地(但不排他地)适用于和报告基因测定系统(包括使用去稳定元件的测定系统)一起使用，以便除提供高信号强度外，提供快速响应。另外，发现本发明的试剂组合物也应用在其他测定系统中，其中要确定一种或多种萤光素酶的量和/或活性。例如，在免疫测定或核酸杂交测定中萤光素酶可被用作报告分子，并且因此被连接到例如抗体或核酸探针上。因此，萤光素酶可以是报告分子或可检测标记。

如本文公开和示例，本发明人阐明了特定类萤光素酶(在其天然状态为分泌型的萤光素酶)的特有特性。该萤光素酶在萤光素酶测定中的表现可通过使用本发明的试剂组合物和方法被显著改进。此外，本发明人发现当该萤光素酶被修饰以防止分泌并提供在靶细胞的胞内表达时，修饰的萤光素酶的活性被明显降低，但是通过使用本发明的试剂组合物和方法可被迅速恢复。在该背景下，本发明人开发了允许在各种萤光素酶催化的反应中使用如此修饰的萤光素酶蛋白的方法和试剂组合物。

如本文公开，本发明人发现当正常分泌型的萤光素酶被修饰用于胞内表达并且在诸如真核细胞的细胞中表达时，活细胞内修饰萤光素酶的活性被显著降低。细胞裂解后，活性保持低，但随时间部分恢复(尽管非常缓慢)。这对该修饰萤光素酶在萤光素酶测定中的使用提出了许多问题，并且事实上阻止了它们的成功商业化。降低的酶活性造成生物发光信号强度的降低。更长的孵育时间(在加入底物起始反应之前)提供对信号强度的一些改进，但也延长了完成测定所需的时间。然而本发明人发现即使使用长孵育时间，修饰萤光素酶的活性继续增加，以致整个测定变得不准确并且依赖于时间。即，萤光素酶活性被用作样品中存在的萤光素酶蛋白量的量度，以致需要每个样品含有每个单位萤光素酶蛋白的同样的活性。然而就这些修饰萤光素酶来说，与萤光素酶活性有关的细胞裂解物稳定性缺乏妨碍了这一点，因此使测定不准确。尽管一些萤光素酶在细胞裂解缓冲液中显示随时间降低的活性(例如，由于蛋白酶的活性)，正常分泌型的萤光素酶的修饰形式显示随时间的显著增加，如果该修饰萤光素酶被成功地开发，这代表了待克服的全新的困难。

如本文公开和示例，本发明人首次鉴定了当与细胞裂解物接触时显著提高正常分泌型萤光素酶的修饰形式恢复其活性或酶潜力的速率和效率的组分、添加剂或物质。如本文鉴定并根据本发明特定的实施方案，该组分的实例包括螯合剂、溴化物离子、具有相对高pH(例如大于8)的缓冲液和氧化剂和/或氧化还原缓冲液。在存在该物质时，萤光素酶迅速获得高水平的活性并且此后保持恒定的活性。这提供了许多益处，包括缩短的测定时间(缩短在裂解缓冲液中所需的时间)、更高的灵敏度(更强的最大信号)和提高的准确性(信号更少地依赖于裂解时间和在转变成活性形式的效率方面的样品间差异)。

本文还显示正常分泌型萤光素酶的活性(无论以其天然可分泌状态表达还是被修饰用于胞内表达)在溴化物离子存在时增强，而在洗涤剂存在时降低。

本发明的试剂组合物提供萤光素酶催化反应的改进的动力学。尤其是，如本文公开，已发现使用本发明的试剂组合物，加入底物后的前几秒内非常高的生物发光信号强度可与延长的可测定生物发光信号(所谓的“辉光”反应)偶联，例如起始后至少约10分钟。在该“辉光”期间，信号强度只非常缓慢地衰退。

单独或组合的本发明试剂组合物的组分有助于改进的动力学，包括溴化物盐、二价金属螯合剂、高pH(至少约8或更高)和氧化剂(如还原型和氧化型谷胱甘肽的混合物)。试剂组合物还可包括本领域技术人员将容易理解并确定的许多额外组分。

如本文示例，各种改变的细胞裂解缓冲液组合物(例如包括溴化物盐和/或减少水平的洗涤剂)当与修饰的胞内Gaussia或长腹水蚤萤光素酶一起使用时，与同样的萤光素酶与可商业获得的海肾或Gaussia测定试剂一起使用相比，提供非常高的信号强度。这是第一次说明分泌型萤光素酶的高信号强度可与以其天然形式为从细胞分泌的酶的修饰胞内形式的形式的去稳定胞内萤光素酶的快速响应动力学组合。不希望受理论所限，这些数据暗示分泌型萤光素酶的高信号强度不完全依赖于它们的分泌状态，也不是简单地由于在细胞培养基中高萤光素酶蛋白水平的积累。更确切地，高信号强度似乎至少部分是由于在适当条件下这些酶有效催化底物快速氧化的固有能力。

当与目前可用的组合物相比时，本发明的试剂组合物提供高生物发光信号强度和生物发光信号的延长的持续时间(等同于降低的衰变速率)。不希望受理论所限，认为根据本发明实施方案的试剂组合物可提供适合萤光素酶从无活性状态或构象转变为活性状态或构象的环境。构象的改变可包含蛋白质折叠的改变和/或萤光素酶氧化还原状态的改变。进一步，构象改变可包括在萤光素酶蛋白中一个或多个二硫键的形成。萤光素酶状态或构象的改变在许多情况下是需要的或要求的。例如，萤光素酶可作为无活性或部分无活性的蛋白在胞质表达。在该情况下，萤光素酶可以是在其天然形式为分泌型的萤光素酶的修饰的非分泌型形式。

在一个实施方案中，本发明的试剂组合物包含至少一种溴化物阴离子或盐，例如溴化钠、溴化钾或溴化铷。溴化物盐的浓度可在约1mM和约500mM之间。在一个实施方案中，浓度在约75mM和约225mM之间。溴化物阴离子一般以至少约1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、400mM或500mM的浓度存在。

本发明的试剂组合物可包含浓度低于约1％的非离子型洗涤剂。非离子型洗涤剂可以低于约0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.15％或0.1％的浓度存在。本发明的试剂组合物可包含两性离子洗涤剂。在一些实施方案中，特别在使用以剂量依赖性模式被洗涤剂抑制的Gaussia和长腹水蚤萤光素酶的反应和测定中，需要采用获得细胞裂解所需的最低浓度的洗涤剂。相应地，在一个实施方案中，洗涤剂的适合浓度在约0.05％和约0.1％之间。非离子型洗涤剂可选自例如Triton X-100、NP101或NP40。在一个特定的实施方案中，洗涤剂是NP40。两性离子洗涤剂可以是CHAPS。

然而本领域技术人员将容易理解，其中为实践本发明的实施方案要求或需要细胞裂解的情况，可通过本领域已知的许多技术的任何一种裂解细胞。许多此类技术不要求使用洗涤剂，而细胞裂解可通过例如超声处理、渗透压或其他物理压来获得。因此本发明的试剂组合物和方法不限于任何一种特定的细胞裂解方法。

本发明试剂组合物的pH可为至少约8，一般在约8和约10之间、在约8和约9之间、或在约8.4和约8.8之间。适合地，pH可为至少约8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7或8.8。

本发明的试剂组合物可包含至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合。其中使用氧化剂和还原剂的组合的情况，所述剂的相对比例一般使在萤光素酶存在时产生的环境与表达萤光素酶的细胞的胞质相比时为氧化环境。组合物可包含‘氧化还原缓冲液组合’，如氧化型和还原型谷胱甘肽的混合物。公开了在正常真核细胞内存在并起作用的氧化还原对，例如在[Foyer，C.H.(2005)；The Plant Cell第17卷：1866-1875]的表7中。氧化还原对的实例包括：O₂/H₂O、H₂O₂/OH^-、NAD(P)/NAD(P)H、TRX_ox/TRX_red、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺和DHA/ASC。氧化还原缓冲液可包含硫醇的氧化形式(如二硫化物二聚体)和还原形式的混合物。还原型和氧化型硫醇可以是相同的或不同的。

一般意义上，氧化-还原(氧化还原)反应的特征为氧化数的改变，通常通过电子转移。术语“氧化”一般指氧化状态或数的增加(失去电子)。而术语“还原”指氧化状态或数的减少(获得电子)。“氧化剂”有时被称为电子受体，而“还原剂”有时被称为电子供体。具有氧化其他物质能力的物质被称为“氧化的”，并被称为“氧化剂(oxidising agents)”、“氧化剂(oxidants)”或“氧化剂(oxidisers)”。具有还原其他物质能力的物质被称为“还原的”，并被称为“还原剂(reducing agents)”、“还原剂(reductants)”或“还原剂(reducers)”。一般在氧化还原过程中，还原剂(reductant)或还原剂(reducing agent)失去电子并被氧化，而氧化剂(oxidant)或氧化剂(oxidising agent)获得电子并被还原。一种或多种氧化剂和/或还原剂可在试剂组合物中或在使用该试剂的相应的反应混合物中存在，以便在该试剂或反应混合物中提供总体“氧化环境”或总体“还原环境”。

氧化剂或氧化剂和还原剂的组合可促进萤光素酶的氧化，因此促进或以其他方式有助于萤光素酶采用活性(或更高活性)的构象。

本领域技术人员将理解，多种氧化剂适合用于本发明的目的，并且涵盖于本文。例如，氧化剂可以是有助于试剂组合物中电化学电势产生的硫氢基转化剂，以致硫氢基被氧化成二硫键，而萤光素酶蛋白不被变性。作为实例，氧化剂可以是能直接或间接氧化萤光素酶蛋白中的硫醇或半胱氨酸硫醇基的物质。如本文所述，本发明的试剂组合物可包含氧化剂和还原剂的组合。氧化剂可以是能直接或间接氧化萤光素酶蛋白中的硫醇或半胱氨酸硫醇基的物质，而还原剂可以是能直接或间接还原萤光素酶蛋白中的硫醇或半胱氨酸硫醇基的物质。例如，已知作为氧化还原缓冲液还原组分的硫醇影响参与蛋白质折叠的硫醇-二硫化物交换反应的速率。氧化还原缓冲液硫醇可作为亲核体、中心硫醇或离去基团。蛋白质折叠的总体速率可通过氧化还原缓冲液的硫醇组分的变化来调控。

描述硫醇氧化的通用反应式显示为反应式1.0：

R-SH+R¹-SH→R-S-S-R¹+2H⁺+2e^-1.0

氧化剂和还原剂可以是不同的化合物，或可选地可以是同一化合物的氧化和还原形式，例如缓冲液可由R⁵-SH(还原形式)和R⁵-S-S-R⁵(氧化形式)的混合物组成，或可例如由R⁶-SH(还原形式)和R²-S-S-R²(氧化形式)组成。

用在氧化还原缓冲液系统的适合的硫醇的一个实例是谷胱甘肽，其作为硫醇和二硫化物二聚体存在。谷胱甘肽氧化还原缓冲液系统使用二硫化物GSSG来提供氧化等效物和单硫醇GSH以一般催化二硫键的异构化。有效谷胱甘肽系统的折叠效率一般具有与内质网溶液电势相似的溶液电势(E_溶液＝-180mV)。

如上文总体描述的，GSH/GSSG缓冲液系统的GSH组分可被其他硫醇替换。例如，可通过使用小分子芳香族和脂肪族硫醇来增加含有二硫化物的蛋白质的体外折叠速率。具有更低硫醇pKa的单硫醇(如N-甲基巯基乙酰胺(NMA)或4-巯基苯甲酸)形成更不稳定的二硫化物，并且可以更高的浓度使用以产生比谷胱甘肽更快的折叠速率。硫醇的离去基团能力一般与硫醇的pKa呈负相关[Gough，J.，D.，J.Am.Chem.Soc，2002，124，3885-3892；Gough，J.，D.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2005，15，777-781；Gough，J.，G.，Journal of Biotechnology，2005，115，279-290；Gough，J.，G.，Journal of Biotechnology，2006，125，39-47]。适合的小分子芳香族硫醇如下所示：

R	R1	R2	硫醇pKa
R	R1	R2	硫醇pKa	CH₂COOH	H	H	6.6
CH₂OH	H	H	6.5	CH₂COOH	H	H	6.6
CH₂OH	H	H	6.5	COOH	H	H	6.95

SO₃H	H	H	5.7
SO₃H	H	H	5.7	SO₂NHCH₂COOH	H	H	5.2
H	COOH	H	6.3	SO₂NHCH₂COOH	H	H	5.2
H	COOH	H	6.3	H	CH₂COOH	H	6.7
H	H	COOH	8.3	H	CH₂COOH	H	6.7
H	H	COOH	8.3	H	H	CH₂COOH	7.2
H	H	COOC₂H₄OC₂H₄OC₂H₄OH	6.9	H	H	CH₂COOH	7.2

氧化还原缓冲液系统中芳香族硫醇的硫醇浓度可变化很大。在氧化和硫醇二硫化物交换反应中使用诸如2，2′-[(4-巯基苯基)亚氨基]二乙醇的其他芳香族硫醇是已知的[DeCollo，T.V.，J.Org.Chem.，2001，66，4244-4249]。

二硫醇也可用作氧化还原缓冲液的组分。与单硫醇不同，二硫醇可形成环状二硫化物，并且因此形成更不稳定的混合二硫化物。向谷胱甘肽氧化还原缓冲液中加入还原型二硫醇(±)-反式-1，2-二(巯基乙酰氨基)环己烷(BMC或Vectrase-P)可例如增加蛋白质折叠的速率和得率。此外，仅使用共价相互作用，BMC可在体外和在体内都催化天然二硫键的形成。不希望受理论所限，BMC的第二个硫醇可提供用于底物诱导的硫醇-二硫化物交换的分子内钟。

氧化剂可以是诸如内质网oxidoreductin 1蛋白(Erolp)的酶。氧化性蛋白质折叠可涉及硫醇的氧化和非天然二硫键的异构化。相应地，异构酶也可用作蛋白质氧化系统的一部分。因此氧化性缓冲液的适合的其他组分为蛋白二硫化物异构酶(PDI)，其在催化蛋白质中非天然二硫键的重排中起作用。每个PDI分子具有含有-Cys-Xaa-Xaa-Cys-序列的两个活性位点。适合地，氧化还原缓冲液的酶组分可含有-Cys-Xaa-Xaa-Cys-序列。例如，可用在氧化还原缓冲液系统的其他酶包括：硫氧还蛋白、谷氧还蛋白和过氧化物氧还蛋白。

异构组分可以是异构酶的模拟物或活性片段。活性二硫醇肽片段的实例包括Cys-Xaa-Xaa-Cys四肽和CysXaaCys三肽，其中Xaa指任何氨基酸残基[Woycechowsky，K.，J.，Biochemistry，2003，42，5387-5394]。例如，已显示三肽CysGlyCys(CGC)具有与PDI接近的二硫化物还原潜力。适合用在氧化还原缓冲液中用于蛋白质异构化和折叠并且不是硫醇衍生物的还原剂的另一个非限制性实例是三(2-羧乙基膦)(TCEP)[Willis，M.，S.，Protein Science，2005，14，1818-1826]。

氧化剂可以是适合用于氧化蛋白质硫醇基(特别是萤光素酶的半胱氨酸硫醇基)的温和氧化剂。氧化剂本身可含有二硫键，并且可以是氨基酸衍生物。还原剂本身可含有硫醇基，并且是氨基酸衍生物。

其他适合的氧化剂和方法包括：分子氧、金属离子、Bu₃SnOMe/FeCl₃、氧化氮、卤素(例如溴和碘)、过硼酸钠(sodium perbortate)、氢硼化物交换树脂(BER)-转换金属盐系统、吗啉碘复合体、PCC、过硫酸铵、KMnO₄/CuSO₄、H₂O₂、不含溶剂的高锰酸盐、PVP-N₂O₄和氟化铯-硅藻土O₂系统、2，6-二羧基氯铬酸吡啶(2，6-DCPCC)[Tajbakhsh，M.，TetrahedronLetters，45，2004，1889-1893]；二甲亚砜[Shad，S.，T.，A.，Tetrahedron Lett.，2003，44，6789；Sanz，R，Synthesis，2002，856；Karimi，B.，Synthesis，2002，2513]；已证明将硫醇氧化成二硫化物的激光制备的铜纳米粒子[Chen，T-Y.，J.Phys.Chem.B，2002，106，9717-9722]；用于二硫化物形成的电化学方法：Leite，S.，L.，S.，Synth.Commun.，1990，20，393和Do，Q.，T.，TetrahedronLetters，1997，38(19)，3383-3384]；锰结核[Parida，K.，M.，Journal of Colloidand Interface Science；1998，197，236-241]；由可溶的聚合MnO₂氧化[Herszage，J.，Environ.Sci.Technol.，2003，37，3332-3338]；在水化硅胶支持体上的分子溴[Ali，M.，H.，Tetrahedron Letters，2002，6271-6273]；水中的氧化聚合物例如单氯聚(苯乙烯乙内酰脲)微珠[Akdag，A.，TetrahedronLetters，2006，47，3509-3510]；二酰胺；DTNB(5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)；过氧化氢；N-甲基巯基乙酰胺；硒化钠(连同β巯基乙醇)[Rariy，R.V.&KlibanovA.M.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：13520-13523；铁氧还蛋白(还原型和氧化型)；和铜二氮杂菲(Cu:phen)[Webb，T.I.，Zang，Z.，LynchJ.W.(2005)Proceedings of the Australian Physiological Society第36卷：44P]。

本发明的试剂组合物可包含一种或多种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于二价金属螯合剂，如，例如EDTA、CDTA和EGTA。螯合剂可以任何浓度存在，但优选地以在约0.1mM和约50mM之间的浓度，一般以在约0.1mM和约30mM之间的浓度，更典型地以在约0.1mM和约15mM之间的浓度。浓度可以为至少约0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM或15mM。

本领域技术人员将理解，其中示例范围或组分在本文提供的情况，这些不是穷尽性的，而只是例证的范围和组分，其可在获得快速的细胞裂解或萤光素酶转变成更高活性的状态或构象、增强的生物发光信号强度和/或生物发光信号的延长中被包括在本发明的组合物中。

根据本领域现有定论，即Gaussia和长腹水蚤萤光素酶活性是钠依赖性的和/或对阳离子浓度敏感并且不受可达或大于2％的非离子型洗涤剂的抑制，如本文示例的下述发现是特别惊人的：溴化物盐(包括溴化钠和溴化钾)增强Gaussia和长腹水蚤萤光素酶(以其天然的分泌形式和作为修饰的胞内酶)的活性，并且两种Gaussia萤光素酶和两种长腹水蚤萤光素酶的活性在洗涤剂存在时(洗涤剂浓度低于1％)以浓度依赖性的模式被抑制。

使用本发明的试剂组合物，萤光素酶产生的生物发光信号在加入萤光素酶底物后几分钟开始的“辉光”相期间可被延长。例如，在加入底物后约3分钟和约15分钟之间开始的相期间生物发光信号可被延长。进一步，只作为实例，萤光素酶产生的生物发光信号可这样以致从萤光素酶-催化的反应起始后10分钟开始，生物发光信号以超过20分钟或超过30分钟的半衰期衰变。

萤光素酶底物可以是试剂组合物的组分或可以是独立的。其中萤光素酶底物不是试剂组合物组分的情况，可在加入试剂组合物之前、之后或同时将底物加到含有萤光素酶的样品中。

基于萤光素酶的报告基因测定系统一般采用两种缓冲液：裂解缓冲液和测定缓冲液(在本文统称为“测定试剂”)。裂解缓冲液一般包含用于裂解含有待测定的萤光素酶的细胞的组分，而测定缓冲液一般尤其含有底物和用于萤光素酶反应的任何所需的辅因子。

本发明的试剂组合物一般是细胞裂解缓冲液的形式。有利地，根据本发明的裂解缓冲液有效地提供比目前可用的缓冲液可能提供的更短的裂解时间。不希望受理论所限，本发明人提出这些缓冲液提供适合的环境，用于促进或有助于在细胞裂解后被测定的萤光素酶从无活性状态或构象折叠或转变为活性状态或构象、或从更低活性的状态或构象折叠或转变为更高活性的状态或构象。可选地，本发明的试剂组合物可以是组合的裂解和测定缓冲液的形式，以致只需要一种缓冲液组合物来裂解细胞(潜在地直接在细胞培养于其中的培养基中)和起始萤光素酶-催化的反应。

根据本发明的试剂组合物一般可以是水溶液或可选地可以是固体或干形式(如冻干的)。无论是含水的或冻干的，本发明的试剂组合物可被提供包含所有预先混合的组分或作为在使用前混合的组分的组合。试剂组合物可直接用在用于确定萤光素酶量和/或活性的测定系统中，或者可以被重组、溶解、稀释或以其他方式化学地或物理地处理以便组合物能完成需要的功能。

本发明的试剂组合物适用于确定样品中任何萤光素酶的量和/或活性。萤光素酶可以是天然存在的酶或修饰的酶。天然存在的萤光素酶可衍生自许多生物发光生物体的任一种，一般来自其光器官。该生物体包括但不限于生物发光细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼类、蝇类、甲壳动物和甲虫。按常规，可根据酶使用的底物来对萤光素酶进行分类。诸如萤火虫和叩头虫萤光素酶的一类萤光素酶使用萤光素(D-萤光素)。诸如海洋生物海肾、Gaussia、水蚤、长腹水蚤和海萤萤光素酶的第二类萤光素酶使用腔肠素。诸如喉萤萤光素酶的其他萤光素酶使用不同的底物。本发明的试剂组合物适用于与使用萤光素或腔肠素或任何其他底物的萤光素酶一起使用。

本发明的试剂组合物相似地适用于与胞内或分泌型萤光素酶一起使用。萤火虫和海肾萤光素酶在其天然状态是胞内的，而Gaussia和长腹水蚤萤光素酶在其野生型状态是分泌型的。Gaussia萤光素酶特别受关注，因为已显示其产生的生物发光信号强度高于海肾萤光素酶可获得的强度，并且是最小的已知萤光素酶。也已显示其他分泌型萤光素酶产生强信号强度，例如Metridia longa萤光素酶。

萤光素酶可以是天然存在的萤光素酶的变体或衍生物。例如，发现本发明特别应用在涉及其天然形式为分泌型的荧光素酶的修饰的非分泌形式的反应和测定中。作为实例，可使用标准分子生物学技术通过除去信号序列和/或融合到胞内多肽以致酶不再分泌而保留在胞内来修饰天然分泌型的萤光素酶。可选地或另外，可以产生本领域技术人员熟知的许多其他修饰，例如，改变萤光素酶多肽序列中一个或多个氨基酸以调控酶在选择的细胞培养系统中的表达和/或溶解度。该调控可以是表达和/或溶解度的增加或降低，依赖于其中采用萤光素酶和本发明试剂组合物的特定应用的要求。例如，可能需要通过引入一种或多种去稳定蛋白的去稳定元件来修饰萤光素酶。含有去稳定元件的萤光素酶具有缩短的半衰期，并且以比不含有该元件的萤光素酶更低的稳态水平表达。适合的蛋白去稳定元件包括PEST序列(富含氨基酸脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的氨基酸序列)、编码胞内蛋白降解信号或降解决定子的序列和泛素。使用本发明试剂组合物获得的提高的灵敏度对与去稳定萤光素酶一起使用特别有利(考虑到该萤光素酶更低的稳态表达水平)。用于去稳定蛋白的任何适合的方法涵盖于本文。适合的方法描述于例如同时待审的美国专利申请第US 10/658,093号(其公开内容通过引用整体并入本文)。也可通过例如加入诸如poly(A)尾、转录或翻译增强子的序列和/或在编码的多核苷酸序列中采用针对特定表达系统的密码子使用来修饰萤光素酶的表达。例如，为优化在昆虫细胞或人类细胞中萤光素酶的表达，萤光素酶多核苷酸中的密码子使用可分别被优化为针对昆虫或人类细胞。不同物种的密码子使用适应和优化方法为本领域技术人员所熟知。

可对萤光素酶多肽或多核苷酸序列所做的进一步修饰也为本领域技术人员所熟知。例如，可将限制性内切酶切割位点引入多核苷酸，或可将萤光素酶多肽与不同功能(如选择标记(例如抗生素抗性))的第二个多肽融合或结合。

使用诸如计算机模拟的已知技术，本领域技术人员可容易地预测特别适合于根据本发明使用的那些萤光素酶，以及预测可对分泌型萤光素酶进行的使萤光素酶为非分泌型的修饰。例如，其天然形式为分泌型的萤光素酶一般包含在蛋白的成熟活性构象中形成二硫键的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基可以在氨基酸序列内重复的间隔模式排列，以致它们可被预测形成分子内二硫键。该萤光素酶当在胞内表达时一般显示降低的活性。因此本领域技术人员将理解共有天然分泌型萤光素酶这些特性的一种或多种的同源萤光素酶特别适合根据本发明使用。

本领域技术人员使用已知技术能容易地获得适合的萤光素酶。萤光素酶可直接从生物发光生物体的光器官获得。可选地萤光素酶可从已用编码萤光素酶的核酸转化的例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞的培养细胞中获得。

当在体外报告基因测定中使用分泌型萤光素酶时，一般采用细胞培养基样品而不是细胞裂解物用于萤光素酶活性的测定。尽管在一些应用中(例如来自同一细胞的重复测定)有优势，分泌型萤光素酶不适合用于其他应用。尤其是，分泌型萤光素酶在细胞培养基中积累，以致不能准确监测基因表达的快速改变。这些萤光素酶的突变型非分泌形式(优选地含有去稳定元件)克服了该限制。本文所述的一种特定的修饰萤光素酶是修饰的Gaussia萤光素酶，其中14个氨基酸的N-末端信号肽被缺失，因此产生非分泌型萤光素酶。本文所述的第二种修饰的萤光素酶是修饰的长腹水蚤萤光素酶，其中17个氨基酸的N-末端信号肽被缺失，因此产生非分泌型萤光素酶。可使用本领域技术人员熟知的许多方法类似地修饰其他分泌型萤光素酶用于胞内表达，特别是在真核细胞中。

在特定的实施方案中，发现本发明的试剂组合物应用在使用腔肠素作为底物、并基于胞内或分泌型萤光素酶的报告基因测定系统中，或在其中至少一种萤光素酶使用腔肠素作为底物和/或其天然形式为分泌型的双萤光素酶报告基因测定中。

根据本发明，可通过本领域技术人员熟知的许多方法的任一种来检测和测定萤光素酶的活性，所述方法包括但不限于使用发光计、闪烁计数器、诸如光电倍增管光度计或照相乳胶片的光度计、或电荷耦合摄像装置(CCD)。

本发明的试剂组合物在萤光素酶反应中提供改进的生物发光动力学，并且提供优于现有技术的优势。因此这些组合物可用在根据本发明的萤光素酶测定中、用在制备根据本发明的测定试剂和测试试剂盒中、并且用在根据本发明的测定和试剂盒的标准物和对照中。本发明提供用于进行萤光素酶活性测定的试剂盒，该试剂盒含有如本文所述的根据本发明的试剂组合物。在一种或多种物理容器内并且一般以方便的形式包装以有助于在萤光素酶测定中使用的本发明试剂盒包含适合量的试剂组合物或其组分用于进行萤光素酶测定。多种试剂组合物或试剂组合物的各种组分可被组合，例如在水溶液中或冻干的、在单个容器内或在多个容器内。本发明的试剂盒一般还包含对照和标准物以确保根据本发明进行的测定的可信性和准确性。适合的对照和标准物将为本领域技术人员所已知。

本说明书中对任何现有出版物(或衍生自其的信息)或任何已知内容的引用不被并且不应该被认为承认或允许或任何形式的暗示现有出版物(或衍生自其的信息)或已知内容形成本说明书涉及的努力领域的普通常识的一部分。

现将参考下述具体的实施例来描述本发明，下述具体的实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

部分I：萤光素酶

实施例1

萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶是在商品化的基于萤光素酶的报告系统中最常用的萤光素酶。尽管分泌型Gaussia萤光素酶和分泌型长腹水蚤萤光素酶提供比萤火虫或海肾萤光素酶更高的灵敏度，分泌型萤光素酶在培养基中积累，因此对旨在测定基因表达随时改变的报告基因研究不是理想的。

为确定突变型、非分泌(和去稳定)形式的天然分泌型萤光素酶是否能提供高信号强度和快速响应速率的组合益处，本发明人使用PCR策略将Gaussia萤光素酶编码序列克隆进各种RapidReporter质粒(GeneStream)，其缺失了15个氨基酸的N-末端信号肽并且将剩余的Gaussia萤光素酶cDNA融合到包括编码蛋白去稳定元件序列的N-末端和C-末端编码序列。修饰的Gaussia萤光素酶当在哺乳动物细胞中表达时不是分泌型的。修饰的萤光素酶的精确胞内位置被假定为胞质的。在下文描述的实验中，在各种裂解缓冲液组合物存在时，裂解用表达天然Gaussia萤光素酶(此后被称为“分泌型Gaussia萤光素酶”)或修饰的Gaussia萤光素酶(此后被称为“非分泌型Gaussia萤光素酶”)的质粒转染的哺乳动物细胞并测定生物发光。

为确定第二个突变型、非分泌(和去稳定)形式的天然分泌型萤光素酶是否也能提供高信号强度和快速响应速率的组合益处，本发明人使用PCR策略将长腹水蚤萤光素酶编码序列克隆进各种RapidReporter质粒(GeneStream)，其缺失了17个氨基酸的N-末端信号肽并且将剩余的长腹水蚤萤光素酶cDNA融合到包括编码蛋白去稳定元件序列的N-末端和C-末端编码序列。修饰的长腹水蚤萤光素酶当在哺乳动物细胞中表达时不是分泌型的。修饰的萤光素酶的精确胞内位置被假定为胞质的。在下文描述的实验中，在各种裂解缓冲液组合物存在时，裂解用表达天然长腹水蚤萤光素酶(此后被称为“分泌型长腹水蚤萤光素酶”)或修饰的长腹水蚤萤光素酶(此后被称为“非分泌型长腹水蚤萤光素酶”)的质粒转染的哺乳动物细胞并测定生物发光。

使用非分泌型Gaussia或长腹水蚤萤光素酶与可商业获得的缓冲液，生物发光信号强度非常低，特别是在其中细胞裂解后立即测定萤光素酶活性的样品中。只有在裂解缓冲液中孵育几小时后，修饰的萤光素酶才获得高活性。

不希望受理论所限，提出非分泌型Gaussia和长腹水蚤萤光素酶在胞内采用更低活性的构象，但在细胞裂解后可采用活性构象(尽管缓慢地)。然后本发明人测试了裂解缓冲液组分的各种改变，试图开发一种允许更短孵育时间并且其中发光信号包含更强的闪光相(更高的灵敏度)和更稳定的辉光相(信号的衰变速率被降低)的制剂；特别提供在细胞裂解后促进萤光素酶从无活性构象转变成活性构象的环境。

部分II：溴化物阴离子的益处

实施例2

用表达天然分泌型Gaussia萤光素酶的质粒瞬时转染HeLa细胞，24小时后收集条件培养基。将20ul条件培养基加入96孔板的孔中，并通过注入60ul包含26uM Cz(pH 8.1)外加如图1所示的盐的测定缓冲液来测定萤光素酶的活性。结果表示为在缺少盐时获得的光单位的％(图1)。

具有NaBr的光输出高于具有NaCl或没有盐的光输出。从图1可看出NaBr增强了分泌型Gaussia萤光素酶的活性。

实施例3

稳定表达非分泌型和去稳定Gaussia萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在每孔30ul裂解缓冲液中裂解细胞。裂解缓冲液(LB)包含；25mM Tris pH 7.8、0.1％NP40、1mM EDTA外加浓度为(从左至右)0mM、150mM、0mM和75mM的NaBr。通过注入30ul测定缓冲液(AB)测定萤光素酶的活性，测定缓冲液(AB)包含25mM Tris pH 7.8、40uM Cz外加浓度为(从左至右)0mM、0mM、150mM和75mM的NaBr。因此，所有样品中NaBr的终浓度为75mM，除了没有盐的对照。结果表示为相对光单位(RLU)(参见图2)。

图2的数据显示NaBr对分泌型Gaussia萤光素酶的有益作用(图1)也适用于非分泌型和去稳定Gaussia。此外，数据显示相对于测定缓冲液(AB)，在裂解缓冲液(LB)中包括NaBr是有优势的。可看出NaBr增强非分泌型Gaussia萤光素酶的活性，特别当NaBr包括在裂解缓冲液中时。

实施例4

稳定表达非分泌型和去稳定Gaussia萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在每孔20ul裂解缓冲液中裂解细胞。裂解缓冲液包含；25mM Tris pH 8.1、1mM EDTA、0.1％NP40、63.4uM草酸钠、5％甘油外加图3所示的盐的浓度和类型。加入裂解缓冲液后40分钟测定萤光素酶的活性(通过注入60ul包含25mM Tris pH 8.1、1mMEDTA、2mM抗坏血酸、26uM Cz的测定缓冲液。结果表示为在缺少盐时获得的光单位的％(参见图3)。

与没有盐相比两种盐都增加了光输出。然而NaBr提供比NaCl更高的增强，并且发现增强具有一定的浓度依赖性。

实施例5

稳定表达非分泌型和去稳定Gaussia或非分泌型和去稳定长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在每孔20ul裂解缓冲液中裂解细胞。裂解缓冲液包含；25mM Tris pH 8.1、0.1％NP40、63.4uM草酸钠、5％甘油外加图4所示的盐的浓度和类型。在加入裂解缓冲液后30分钟通过注入60ul测定缓冲液测定重复样品的萤光素酶活性。测定缓冲液包含25mM Tris pH 7.75、2mM抗坏血酸、24uM Cz。结果表示为在缺少盐时获得的光单位的％(参见图4)。

如在实施例4中对非分泌型和去稳定Gaussia萤光素酶的观察，对非分泌型和去稳定长腹水蚤萤光素酶，NaBr提供比NaCl更高的增强。发现增强具有一定的浓度依赖性。

实施例6

如实施例5所述对非分泌型和去稳定Gaussia萤光素酶或非分泌型和去稳定长腹水蚤萤光素酶进行萤光素酶的测定。两个实验显示为单独的图，结果显示为以每秒计数(CPS)的相对发光(参见图5A和5B)。每个实验中，裂解缓冲液和测定缓冲液仅在如所示加入的盐的量和类型上不同。加入裂解缓冲液(LB)后120分钟通过注入60ul测定缓冲液(AB)分析重复样品。

对非分泌型Gaussia和非分泌型长腹水蚤萤光素酶，缺少盐时的信号强度最低。通过在裂解缓冲液或测定缓冲液中包括盐，观察到更高的信号强度。此外，对两种萤光素酶，溴化物盐都优于氯化物盐。在四个处理组中，当溴化物被包括在裂解缓冲液中时观察到最高的信号强度，暗示在一些情况下在裂解缓冲液中而不是测定缓冲液中包括溴化物可能更好。

实施例7

如实施例4所述进行萤光素酶的测定。所有盐在裂解缓冲液中以150mM存在。

使用NaBr、RbBr和KBr获得最高水平的信号增强(＞5倍)。使用对应的氯化物盐观察到更低水平的增强，并且使用碘化物盐没有观察到增强。这些数据说明，与现有文献相反，阴离子而不是阳离子对获得高萤光素酶活性是重要的。此外，它们为溴化物盐的有益作用提供了进一步的证据，并且说明许多不同的溴化物盐可被用来获得所需的效果(参见图6)。

实施例8

如实施例7所述进行萤光素酶的测定，除了在裂解缓冲液中使用指示浓度的盐和EDTA。在加入裂解缓冲液后20、30、40和90分钟测定重复样品的萤光素酶活性。结果表示为在同样裂解缓冲液中20分钟裂解后获得的光单位的％(参见图7)。

在缺少盐和EDTA时，在细胞裂解开始后20和90分钟之间萤光素酶活性的显著增加是明显的。通过加入单独的EDTA或NaBr获得更稳定的(并且因此更希望的)萤光素酶活性水平。然而，通过组合两种组分到裂解缓冲液中获得附加的有益作用。可以看出加入NaBr和EDTA允许使用缩短的裂解时间。

部分III：螯合剂的益处：

实施例9

如实施例8所述进行萤光素酶的测定，除了使用含有150mM NaBr和指示浓度EDTA的裂解缓冲液。两个实验显示为单独的图，结果显示为相对光单位(RLU)(参见图8A和8B)。每个实验中，所有样品使用同样的测定缓冲液，并且裂解缓冲液仅在如所示的EDTA的量上不同。在加入裂解缓冲液后30或120分钟测定重复样品的非分泌型Gaussia萤光素酶活性。1mM EDTA对比没有EDTA的益处显示在之前的图中。该图说明在裂解缓冲液中更高量的EDTA在信号强度和萤光素酶信号随时间的稳定性方面的益处。

实施例10

如实施例9所述进行萤光素酶的测定，除了使用指示类型和浓度的螯合剂和30分钟的裂解时间。结果显示EDTA和EGTA都提供对信号强度的浓度依赖性有益作用(参见图9)。

实施例11

如实施例5所述对非分泌型和去稳定长腹水蚤萤光素酶进行萤光素酶的测定，除了裂解缓冲液不含有盐而含有指示类型和浓度的螯合剂。在30或120分钟裂解时间后进行重复萤光素酶测定。来自30分钟时间点的结果表示为在缺少螯合剂时获得的光单位的％(参见图10A)，而来自120分钟时间点的结果表示为使用同样的裂解缓冲液在30分钟获得的光单位的％(参见图10B)。结果显示EDTA、CDTA和EGTA提供对信号强度的浓度依赖性有益作用，并且额外地减少了裂解时间的影响。

实施例12

将瞬时表达分泌型Gaussia或分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞瓶孵育过夜。取出小份的条件培养基，并且1∶10稀释到有或没有5mMEDTA的新鲜培养基中(RPMI+10％胎牛血清)。30分钟后，通过注入20ul含有48uM Cz的培养基测定80ul小份的萤光素酶活性。结果表示为在缺少EDTA时获得的光单位的％(参见图11A)。第二个实验以同样的方式进行，除了孵育时间增加到90分钟并且一些样品接受额外地含有5mMEDTA的测定缓冲液(参见图11B)。

数据显示加入指示的螯合剂对非分泌型Gaussia和非分泌型长腹水蚤萤光素酶的益处(参见实施例9、10和11)不适用于(天然)分泌形式的同一萤光素酶。尤其是，在仅在测定缓冲液中接受螯合剂的样品中缺少任何增强(参见图11B)。这暗示螯合剂的影响不发生在底物水平也不发生在反应起始时。更确切地，似乎螯合剂的益处发生在酶反应之前的萤光素酶蛋白水平，例如通过螯合剂帮助萤光素酶蛋白采用更高活性的形式。

当在胞内表达时，已显示分泌型萤光素酶采用更低活性的形式，以致螯合剂的正效应对要求重折叠或其他修饰以便采用蛋白的高活性状态的胞内形式是显著的。螯合剂对萤光素酶活性的该有益作用先前没有描述。

实施例13

表达萤火虫或海肾萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板中，并孵育过夜。除去培养基并且在20ul裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有25mM Tris pH 8.1、0.1％NP40、63.4uM草酸钠、5％甘油、150mM NaCl外加图12中浓度的EDTA。在30分钟通过注入30ul含有萤火虫底物的萤火虫测定缓冲液II、然后30ul含有海肾底物的Promega的′Stop and Glo″缓冲液测定重复样品的萤光素酶活性。结果表示为在缺少EDTA时获得的光单位的％(参见图12)。

结果表明加入EDTA对海肾和萤火虫萤光素酶没有提供如对非分泌型Gaussia或长腹水蚤萤光素酶观察到的对信号强度同样的有益作用。事实上，加入EDTA明显降低了萤火虫萤光素酶的活性。

部分IV：洗涤剂的类型和浓度：

实施例14

表达去稳定、非分泌型Gaussia萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。三个实验显示为单独的图(图13A、13B和13C)。每个实验中，所有样品使用同样的测定缓冲液，并且裂解缓冲液仅在使用的洗涤剂(除非另外指明在裂解缓冲液中0.1％)类型上不同。阴离子型洗涤剂SDS和DOC对Gaussia萤光素酶的表现不好，可能因为它们抑制萤光素酶的活性。两性离子洗涤剂CHAPS在0.1％时似乎不裂解细胞，并且对非离子型洗涤剂吐温20、吐温80和Brij同样可能是这样。其余洗涤剂都是非离子型的，表现良好，其中NP40提供最高的信号强度。

实施例15

表达去稳定、非分泌型Gaussia或非分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在20ul裂解缓冲液中裂解细胞。洗涤剂的类型和浓度如所示变化。通过注入60ul包含25mM Tris pH 8.1、1mM EDTA、2mM抗坏血酸、24uM Cz的测定缓冲液进行萤光素酶的测定。两个实验被显示，在第一个裂解缓冲液中还含有5％甘油、64uM草酸钠、150mM NaBr、25mM Tris pH 8.5、5mM EDTA、0.6mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽、75mM尿素(v6)，并且在40分钟时测定萤光素酶活性。在第二个实验中，裂解缓冲液还含有25mM Tris pH 8.1、63.4uM草酸钠、150mM NaBr、5％甘油，并且在120分钟时测定萤光素酶活性。结果表示为使用0.1％NP40获得的光单位的％(参见图14A和14B)。

来自第一个实验的结果(参见图14A)表明0.1％SDS阻抑了酶活性，并且0.1％CHAPS不足以裂解细胞，因此在第二个实验中使用这些洗涤剂的不同浓度范围(参见图14B)。

结果显示洗涤剂提供对信号强度的浓度依赖性抑制。使用阴离子型洗涤剂SDS和DOC的该影响最明显。两性离子洗涤剂CHAPS提供对非分泌型长腹水蚤萤光素酶的最高活性，明显地，该洗涤剂要求更高的浓度以有效地裂解细胞。其余洗涤剂都是非离子型的，表现良好，其中NP40和Triton X100提供最高的信号强度。

使用阳离子型洗涤剂CTAB的实验(未显示)表明与阴离子型洗涤剂一样，阳离子型洗涤剂对信号强度具有强抑制作用。

实施例16

表达分泌型Gaussia或分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并1∶10稀释到含有如图15A和15B所示类型和浓度的洗涤剂的新鲜培养基中。30分钟后，除去80ul，加入20ul含有48uM Cz的培养基，并且测定样品的萤光素酶(参见图15A和15B)。结果表示为在缺少洗涤剂时获得的光单位的％。

来自两个实验的结果表明，与对非分泌型Gaussia和非分泌型长腹水蚤萤光素酶的影响一样，这些洗涤剂对衍生自这些萤光素酶的分泌形式的信号强度具有浓度依赖性的抑制作用。

实施例17

表达去稳定、非分泌型Gaussia萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。两个实验显示为单独的图(参见图16A和16B)。每个实验中，所有样品使用同样的测定缓冲液并且裂解缓冲液仅在％NP40上不同。使用0.1％的NP40观察到最强的信号，并且信号强度随增加洗涤剂的量而衰退。可以看出洗涤剂以浓度依赖性模式抑制萤光素酶的活性。

实施例18

洗涤剂浓度对非分泌型Gaussia萤光素酶活性的影响如实施例17所述确定，除了也对表达分泌型Gaussia的细胞进行实验。对该细胞，使用条件培养基作为分泌型Gaussia蛋白的来源，其中洗涤剂被以指示浓度加入。结果说明对分泌型和非分泌型Gaussia萤光素酶都发生洗涤剂对萤光素酶活性的抑制(参见图17)。

部分V：pH：

实施例19

如实施例9所述进行萤光素酶的测定，除了使用具有指示pH的裂解缓冲液。除了指明的情况，EDTA以1mM存在。四个实验显示为单独的图(参见图18A、18B、18C和18D)。对A和B裂解时间是40分钟，对C和在D中是30分钟，并且在加入裂解缓冲液后30或120分钟测定重复样品的Gaussia萤光素酶活性。这些数据说明在裂解缓冲液中更高pH在信号强度和萤光素酶信号随时间的稳定性方面的益处。高pH和高EDTA的组合特别有效。

实施例20

表达去稳定、非分泌型Gaussia或非分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在20ul裂解缓冲液中裂解细胞。裂解缓冲液包含63.4uM草酸钠、5％甘油、150mM NaBr和以指示pH的25mM Tris。在30分钟通过注入60ul包含25mM Tris pH7.75、2mM抗坏血酸、24uM Cz的测定缓冲液进行萤光素酶的测定。结果表示为在pH 8.5获得的光单位的％(参见图19)。

数据说明对非分泌型Gaussia和长腹水蚤萤光素酶都观察到具有更高pH的裂解缓冲液在信号强度和萤光素酶信号随时间的稳定性方面的益处。相反，使用萤火虫和海肾萤光素酶进行的相似实验暗示在细胞裂解期间的高pH对这些天然胞内的萤光素酶没有有益作用(数据未显示)。

部分VI：氧化剂：

实施例21

如实施例18所述使用5mM EDTA和pH 8.5进行萤光素酶的测定。裂解缓冲液还含有指示浓度的还原型(red)和氧化型(ox)谷胱甘肽。在加入裂解缓冲液后20或135分钟测定重复样品的Gaussia萤光素酶活性。这些数据说明在裂解缓冲液中氧化型谷胱甘肽的存在，并且更优选地还原型和氧化型谷胱甘肽混合物的存在，增加了在细胞裂解步骤期间萤光素酶获得其最大活性的速率(参见图20)。

实施例22

如实施例21所述使用指示总量的谷胱甘肽和指示比例的氧化型：还原型进行萤光素酶的测定。在加入裂解缓冲液后20或60分钟测定重复样品的Gaussia活性。这些数据说明在所有测试浓度和比例，裂解缓冲液中谷胱甘肽的存在增加了在细胞裂解步骤期间萤光素酶获得其最大活性的速率。在更高浓度的还原型谷胱甘肽时，在60分钟观察到略微降低的信号(参见图21)。

实施例23

瞬时表达非分泌型Gaussia萤光素酶或非分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在每孔20ul裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液包含25mM Tris pH 8.1、63.4uM草酸钠、0.1％NP40、5％甘油和没有谷胱甘肽或0.6mM还原型谷胱甘肽和0.4mM氧化型谷胱甘肽的组合。在加入裂解缓冲液后30分钟通过注入60ul包含25mM Tris pH 7.75、0.6mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽、1mM EDTA、2mM抗坏血酸、24uM Cz的测定缓冲液测定重复样品的萤光素酶活性。结果表示为对同一萤光素酶在缺少谷胱甘肽时获得的光单位的％(参见图22)。

数据说明在测试的比例，在裂解和测定缓冲液中谷胱甘肽的存在也增加了非分泌型Gaussia和非分泌型长腹水蚤萤光素酶的信号。

实施例24

如实施例22所述进行萤光素酶的测定，除了在裂解缓冲液和/或测定缓冲液中使用单一浓度和比率的添加剂(谷胱甘肽；1.2mM还原型、0.8mM氧化型)或在两者中都不使用。两个实验显示为单独的图(参见图23A和23B)。在加入裂解缓冲液后15或60分钟测定重复样品的Gaussia萤光素酶活性。这些数据说明在裂解缓冲液而不是测定缓冲液中谷胱甘肽的存在增加了在短(15分钟)裂解时间后获得的信号。

实施例25

如实施例23所述在裂解缓冲液和测定缓冲液中都使用谷胱甘肽进行萤光素酶的测定。另外地，裂解缓冲液含有指示浓度的尿素。在加入裂解缓冲液后15或60分钟测定重复样品的Gaussia萤光素酶活性，并且60分钟的数据表示为15分钟的信号的％。所有裂解缓冲液显示在此时间期间信号的增加。然而，使用50-100mM尿素的增加更不显著，暗示在这些条件下可更快达到最大活性(参见图24)。

实施例26

表达去稳定、非分泌型Gaussia萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。所有样品使用同样的测定缓冲液。在加入裂解缓冲液后20或120分钟测定重复样品的萤光素酶活性，裂解缓冲液含有5％甘油、64uM草酸钠、0.1％NP40、150mM NaBr外加25mM Tris pH 8.1、1mM EDTA(v3)或25mM Tris pH 8.5、5mM EDTA、0.6mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽、75mM尿素(v6)。尽管在20分钟裂解后v3裂解缓冲液仅获得～50％的最大活性，在20分钟内v6裂解缓冲液获得了100％的活性(参见图25)。

实施例27

表达去稳定、非分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在20ul裂解缓冲液中裂解细胞，裂解缓冲液含有5％甘油、63.4uM草酸钠、0.1％NP40外加指示pH的25mMTris、150mM的指示盐和在指明的情况下1mM EDTA或0.6mM还原型谷胱甘肽和0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)。在加入裂解缓冲液后30或120分钟通过注入60ul含有25mM Tris pH 7.75、2mM抗坏血酸、24uMCz的测定缓冲液测定重复样品的萤光素酶(luciferse)活性。结果表示为在30分钟裂解时获得的光单位的％(参见图26)。

数据显示使用NaCl作为唯一的添加剂，在前30分钟裂解内仅获得小部分最大活性。在该处理组中超过1200％的增加发生在30和120分钟之间。包含氧化还原缓冲液(GSH/GSSG)或螯合剂(EDTA)的处理组表现显著更好，如30分钟裂解后更小的活性增加所示。在每一个案中，NaBr表现好于NaCl，说明溴化物与氧化还原缓冲液或螯合剂组合的附加益处。溴化物、氧化还原缓冲液、螯合剂和高pH组合的益处可清楚地观察到，因为在30和120分钟之间活性的增加更不明显。

总起来说，这些数据说明组合本发明多种不同组分的累积益处。另外地，该数据显示加入溴化物不仅改进了信号强度(参见实施例6和图5A和5B)，而且改进了裂解时间。

部分VII：与现有技术的比较：

实施例28

表达非分泌型Gaussia或海肾萤光素酶的HeLa细胞被铺到96孔板中，并孵育过夜。除去培养基并且在每孔20ul GeneStream的v6(如实施例26)裂解缓冲液或Promega的被动裂解缓冲液(PLB)中裂解细胞。通过注入60l包含25mM Tris pH 7.75、0.6mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽、1mM EDTA、2mM抗坏血酸、24uM Cz的测定缓冲液测定萤光素酶活性(参见图27A)。在同一实验期间，通过除去培养基并加入20ul新鲜培养基(RPMI)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及注入60ul包含24uMCz、在RPMI或PBS中的测定缓冲液到活细胞来测定一些孔在没有细胞裂解的情况下的萤光素酶活性(参见图27B)。结果表示为每秒计数(CPS)。

图27A的结果表明对与海肾萤光素酶一起使用，GeneStream的v6(GSv6)缓冲液至少与Promega的被动裂解缓冲液(PLB)同样有效，但对与非分泌型Gaussia萤光素酶一起使用，GSv6缓冲液优于PLB(10倍更强的信号)。图27B所示的数据显示对活细胞海肾萤光素酶产生最强的信号。组合的数据表明当在胞内表达时Gaussia萤光素酶采用更低活性的形式。

实施例29

表达去稳定、非分泌型Gaussia萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜(参见图28)。PA 1＝按照制造商的说明书使用Promega的双萤光素酶测定试剂盒进行的萤光素酶测定(即在被动裂解缓冲液中裂解细胞并且在加入″Stop & Glo″(海肾)测定缓冲液后测定光发射)；PA2＝使用Gaussia测定试剂盒(NEB)进行的萤光素酶测定，在被动裂解缓冲液(Promega)中裂解细胞，因为NEB测定试剂盒不包括裂解缓冲液；GeneStream＝根据本发明裂解细胞并测定(裂解缓冲液＝0.1％NP40、150mM NaBr、5％甘油、1mM EDTA，pH 8.1；测定缓冲液＝26uM腔肠素、1mM EDTA，pH 8.1)。使用本发明的组合物，获得的信号强度是使用PA 1的252倍，并且是使用PA 2的345倍(图28)。

实施例30

遵照实施例29的方法，除了测定光发射动力学。数据显示与现有技术“辉光”缓冲液相比，本发明主题的组合物提供更稳定的辉光信号和更高的灵敏度(参见图29A和29B)。

实施例31

表达去稳定、非分泌型Gaussia和非分泌型长腹水蚤萤光素酶的HeLa细胞以等份被铺到96孔板上，并孵育过夜。除去培养基并且在20ul裂解缓冲液中裂解细胞。在加入裂解缓冲液后20、30、40、60、90或120分钟测定重复样品的萤光素酶活性。使用的裂解缓冲液是GeneStream的v3和v6(如实施例26)、Promega的被动裂解缓冲液(PLB)和含有25mM TispH 7.7、1％Triton X100、10％glycerol的通用标准裂解缓冲液(STD-LB)。通过注入60ul含有25mM Tris pH 7.75、1mM EDTA、2mM抗坏血酸、0.66mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽、24uM Cz的测定缓冲液测定重复样品的萤光素酶(luciferse)活性。结果表示为使用v6裂解缓冲液获得的光单位的％(参见图30A在120分钟裂解的数据)和使用同样的裂解缓冲液在20分钟获得的光单位的％(参见图30B在所有裂解时间点的数据)。

图30A的数据显示与现有技术相比，本发明主题的组合物对非分泌型Gaussia萤光素酶和非分泌型长腹水蚤萤光素酶提供更高和更稳定的信号强度。另外，图30B的数据说明与现有技术的组合物相比，当使用本发明的组合物时可采用缩短的裂解时间。

部分VIII：根据本发明的基于萤光素酶的报告基因测定试剂盒

实施例32

根据本发明的基于萤光素酶的报告基因测定试剂盒以设计为96孔板每孔20μl的裂解缓冲液和60μl的测定缓冲液的2部分提供。

裂解缓冲液：

0.1％NP40

150mM NaBr

5％甘油

5mM EDTA

25mM Tris pH 8.5

63.4uM草酸钠

0.6mM还原型谷胱甘肽

0.4mM氧化型谷胱甘肽

测定缓冲液：

23.6uM腔肠素

1mM EDTA

25mM Tris pH 7.75

0.6mM还原型谷胱甘肽

0.4mM氧化型谷胱甘肽

2mM抗坏血酸

75mM尿素

一般方法：

表达修饰的非分泌型Gaussia萤光素酶的HeLa细胞在96孔板中培养，除去任何培养基后使用裂解缓冲液(20ul)裂解并使用Wallac Victor 3发光计(Perkin Elmer)在注入测定缓冲液(60ul)后的闪光反应中测定萤光素酶的活性。

本领域技术人员将理解，本文所述的本发明容许不同于具体描述的那些的变化和改变。应理解本发明包括所有此类变化和改变。本发明还包括单独或共同地在本说明书中被提到或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征的任两个或多个的任何和所有组合。

Claims

1.一种用于确定样品中萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，其中所述试剂组合物允许在细胞裂解物中产生增强的发光信号、降低的萤光素酶发光信号的衰变速率和/或提高的萤光素酶活性随时间的稳定性。

2.如权利要求1所述的组合物，其中在萤光素酶存在时，所述试剂组合物提供适合有助于萤光素酶转变为活性构象的环境。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述萤光素酶是分泌型或非分泌型的。

4.如权利要求3所述的组合物，其中所述萤光素酶衍生自其天然形式为分泌型的萤光素酶。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的修饰形式的非分泌型萤光素酶。

6.如权利要求1至5任一项所述的组合物，其中所述萤光素酶是海洋来源的。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述萤光素酶使用腔肠素作为底物。

8.如权利要求6或7所述的组合物，其中所述海洋来源的萤光素酶衍生自Gaussia属、水蚤属、长腹水蚤属、海萤属或刺虾属，或者是其变体或衍生物。

9.如权利要求1至8任一项所述的组合物，其包含下述一种或多种：螯合剂、溴化物阴离子、浓度低于约1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有大于约8的pH。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述螯合剂是二价金属螯合剂。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述二价金属螯合剂选自EDTA、CDTA和EGTA。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述二价金属螯合剂是以至少约0.1mM的浓度存在的EDTA。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述EDTA以在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

14.如权利要求9所述的组合物，其中所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述洗涤剂选自Triton X-100、NP101或NP40。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述洗涤剂是NP40。

17.如权利要求9所述的组合物，其中所述氧化剂或氧化剂和还原剂的组合导致所述萤光素酶的氧化，因此有助于所述萤光素酶采用活性构象。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述还原剂包含硫醇基。

19.如权利要求9所述的组合物，其中所述组合物包含氧化型和还原型谷胱甘肽的混合物。

20.如权利要求9所述的组合物，其pH为大于约8。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述pH是在约8和约9之间。

22.如权利要求9所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以一种或多种溴化物盐的形式提供。

23.如权利要求22所述的组合物，其中所述溴化物盐选自溴化钠、溴化钾或溴化铷。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以至少约1mM的浓度存在。

25.如权利要求23所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以在约1mM和约500mM之间的浓度存在。

26.一种用于确定样品中重组萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，所述试剂组合物包含一种或多种螯合剂，其中所述重组萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述螯合剂是二价金属螯合剂。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述螯合剂选自EDTA、CDTA和EGTA。

29.如权利要求28所述的组合物，其中所述二价金属螯合剂是以至少0.1mM的浓度存在的EDTA。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述EDTA以至少在约4mM和约15mM之间的浓度存在。

31.如权利要求26至30任一项所述的组合物，其进一步包含溴化物阴离子、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有大于约8的pH。

32.如权利要求26至31任一项所述的组合物，其进一步包含所述萤光素酶的底物。

33.一种用于确定样品中重组萤光素酶的量和/或活性的试剂组合物，所述试剂组合物包含溴化物阴离子，其中所述重组萤光素酶是或衍生自其天然形式为分泌型的萤光素酶。

34.如权利要求33所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以一种或多种溴化物盐的形式提供。

35.如权利要求34所述的组合物，其中所述溴化物盐选自溴化钠、溴化钾或溴化铷。

36.如权利要求35所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以至少约1mM的浓度存在。

37.如权利要求35所述的组合物，其中所述溴化物阴离子以在约1mM和约500mM之间的浓度存在。

38.如权利要求33至37任一项所述的组合物，其进一步包含一种或多种螯合剂、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，和/或具有至少约8的pH。

39.如权利要求33至38任一项所述的组合物，其进一步包含所述萤光素酶的底物。

40.一种用于确定细胞或细胞样品中萤光素酶的量和/或活性的方法，所述方法包括：

(a)提供表达萤光素酶的细胞，其中所述萤光素酶主要或完全以无活性状态或构象存在；

(b)使所述细胞与能将所述萤光素酶从无活性状态或构象转变成活性状态或构象的有效量的试剂组合物孵育；

(c)加入所述萤光素酶的底物，和任选地所述萤光素酶生物发光活性所需的辅因子，如CoA、ATP和镁；和

(d)检测所述活性萤光素酶产生的生物发光信号。

41.如权利要求40所述的方法，其中用于将所述萤光素酶从无活性状态或构象转变成活性状态或构象的所述组合物提供螯合剂和/或适合所述萤光素酶转变为活性构象的氧化还原环境。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述氧化还原环境适合或允许所述萤光素酶的氧化。

43.如权利要求40或41所述的方法，其中所述试剂组合物包含一种或多种溴化物阴离子、浓度低于1％的非离子型洗涤剂或两性离子洗涤剂、至少一种氧化剂或氧化剂和还原剂的组合，并且具有大于约8的pH。

44.如权利要求40至43任一项所述的方法，其中所述试剂组合物是权利要求1至39任一项所述的组合物。

45.如权利要求40至44任一项所述的方法，其中所述萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

46.一种用于确定细胞或细胞样品中重组萤光素酶的量和/或活性的方法，所述方法包括：

(a)裂解所述细胞；

(b)使所述细胞裂解物与有效量的包含螯合剂的试剂组合物接触；

(c)加入所述萤光素酶的底物，和任选地所述萤光素酶的生物发光活性所需的辅因子，如CoA、ATP和镁；和

(d)检测所述样品的生物发光；

其中所述重组萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述试剂组合物包含洗涤剂，以致步骤(a)和(b)可组合为一步。

48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述试剂组合物包含所述萤光素酶底物，以致步骤(b)和(c)可组合为一步。

49.如权利要求46至48任一项所述的方法，其中所述试剂组合物是权利要求1至39任一项所述的组合物。

50.如权利要求40至49任一项所述的方法，其中所述方法是报告基因测定的一部分。

51.一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的试剂组合物接触，所述试剂组合物提供允许或促进所述萤光素酶转变为活性状态或构象的环境，如适合的氧化还原环境。

52.一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的一种或多种二价金属螯合剂接触。

53.一种用于增强萤光素酶产生的生物发光信号的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的溴化物阴离子接触。

54.一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的试剂组合物接触，其中所述试剂组合物提供适合有助于所述萤光素酶转变为活性状态或构象的环境，如适合的氧化还原环境。

55.一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与一种或多种二价金属螯合剂接触。

56.一种降低萤光素酶产生的生物发光信号的衰变速率的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的溴化物阴离子接触。

57.一种用于缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的试剂组合物接触，其中所述试剂组合物提供适合有助于所述萤光素酶转变为活性状态或构象的环境，如适合的氧化还原环境。

58.一种用于缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与一种或多种二价金属螯合剂接触。

59.一种用于缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间的方法，所述方法包括使所述萤光素酶与有效量的溴化物阴离子接触。

60.如权利要求57至59任一项所述的方法，其中所述缩短获得最佳或稳定萤光素酶活性所需时间由缩短的裂解时间和/或测定时间和提高的酶活性或潜力随时间的稳定性所导致，或者与缩短的裂解时间和/或测定时间和提高的酶活性或潜力随时间的稳定性有关。

61.如权利要求51至60任一项所述的方法，其中所述萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

62.一种用于测定萤光素酶的量和/或活性的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种试剂组合物，其中所述试剂组合物提供适合有助于所述萤光素酶转变为活性构象的环境。

63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述试剂组合物是权利要求1至39任一项所述的组合物。

64.一种用于测定萤光素酶的量和/或活性的试剂盒，所述试剂盒包含溴化物离子和萤光素酶底物。

65.如权利要求62至64任一项所述的试剂盒，其中所述萤光素酶是其天然形式为分泌型的萤光素酶的非分泌型变体的重组萤光素酶。

66.如权利要求1至39任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于裂解表达所述萤光素酶的细胞的缓冲液。

67.如权利要求66所述的组合物，其中所述裂解缓冲液进一步包含甘油和/或蛋白酶抑制剂，其中所述缓冲剂选自Tris、Hepes和磷酸盐缓冲液。

68.如权利要求40至61任一项所述的方法，其中所述试剂组合物是用于裂解表达所述萤光素酶的细胞的缓冲液。

69.如权利要求1至39任一项所述的组合物，其中所述组合物是包含所述萤光素酶底物的组合的细胞裂解/萤光素酶测定缓冲液。

70.如权利要求40至61任一项所述的方法，其中所述组合物是包含所述萤光素酶底物的组合的细胞裂解/萤光素酶测定缓冲液。