WO2006061906A1 - 新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

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WO2006061906A1
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gly
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PCT/JP2004/018401
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Hiromi Takenaka
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Nec Soft, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a gene encoding a novel luciferase. Specifically, the present invention relates to a coding gene that can be used for recombinant expression of a novel luciferase derived from marine plankton.
  • Luciferase is an enzyme protein that enzymatically oxidizes a luminescent substrate (luciferin) and emits bioluminescence, and has been conventionally used as a reporter protein in various bioaccessories. It is illustrated. Namely, in vitro cell culture systems, several genes that code for luciferase have been collected for the purpose of recombinant expression in the host cells, and the recombinant expression system has been established. .
  • luciferase a gene encoding luciferase is transcribed in the host cell under the control of a heterologous promoter, and the transcribed mRNA is translated into a peptide chain, which is the target. Luciferase 'protein is produced.
  • Luciferase that is recombinantly expressed in the host cell 'Protein power' When secreted luciferase is secreted outside the cell, the secreted reporter protein without sampling the cultured host cell By sampling the medium containing, the reporter 'protein production amount can be easily monitored. For example, when observing changes in the amount of reporter 1 'protein produced over time in an in vitro cell culture system, using a secreted luciferase, a predetermined amount of medium is sampled and contained at each time point. A technique for monitoring the concentration of secreted luciferase will be available.
  • luciferase As a secreted luciferase that can be used for powerful applications, it can be expressed as a secretory luciferase from Cypridina (Vargul a hilgendorfi) belonging to the crustacea (Thompson, E. M., et al., Proc.
  • a luciferase derived from Metridia longa is also a luciferase derived from Gaussia princeps (GenBank / EBI accession number AY015993) belonging to Met ridinidae (Metridinidae) (GenBank ' M / EBI accession number AY364164; J. Biol. Chem. Vol. 279, No. 5 pp. 3212-3217 (2004))
  • a secretory luciferase capable of causing desired luminescence when utilizing the above is desirable for constructing various bio-assay systems.
  • luciferase from Cypridina (Vargula hilgendorfi) belonging to the crustacean (Ostraco da) luciferase from Oplophorus gracilorostris belonging to the decapod (Decapoda), noreciferase from Gaussia princeps, luciferase from Metridia longa It is reported that coelenterazine can be used as its luminescent substrate (luciferin).
  • 'Coelenterazine can be used as its luminescent substrate (luciferin);
  • the present invention solves the problem. That is, the object of the present invention is to
  • 'Coelenterazine can be used as its luminescent substrate (luciferin);
  • Metridia pacifica force coelenterazine a kind of marine plankton belonging to Metridinidae (Metridinida Tech)
  • Metridinida Tech produces secretory luciferase that can be used for ⁇ IJ with its luminescent substrate (luciferin).
  • luciferin luminescent substrate
  • a gene encoding a luciferase protein derived from M. pacifica that is effective in the first embodiment of the present invention is:
  • the gene is luciferase protein luciferase 1 derived from M. pacifica. Full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 1):
  • Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
  • Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
  • the base sequence encoding the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the luciferase protein luciferase 1 derived from M. pacifica is:
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
  • the gene includes a base sequence that includes a base sequence encoding the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the luciferase protein luciferase 1 derived from M. pacifica,
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
  • CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA
  • It can also be a DNA molecule having TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG 867.
  • the first aspect of the present invention also provides a gene encoding the following luciferase protein mutant derived from M. pacifica.
  • a luciferase tan derived from M. pacifica that is effective in the first embodiment of the present invention
  • the gene encoding the protein variant is
  • the gene is the full-length amino acid sequence of the luciferase protein luciferase 1 mutant derived from M. pacifica (SEQ ID NO: 7):
  • Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
  • Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
  • a gene encoding a luciferase protein variant derived from M. pacifica for example, the luciferase protein luciferase derived from M. pacifica
  • the base sequence encoding the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of one variant is the following base sequence (SEQ ID NO: 9):
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
  • a gene encoding a luciferase protein variant derived from M. pacifica characterized in that
  • the gene is the full-length amino acid sequence of the luciferase protein luciferase 1 mutant derived from M. pacifica (SEQ ID NO: 8):
  • Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
  • Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
  • a gene encoding a luciferase protein variant derived from M. pacifica eg, a base encoding the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of the luciferase protein luciferas e 1 variant derived from M. pacifica
  • the sequence is the following base sequence (SEQ ID NO: 10):
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
  • a gene encoding a luciferase protein variant derived from M. pacifica A gene encoding a luciferase protein variant derived from M. pacifica
  • the gene encoding the luciferase protein derived from M. pacifica according to the first aspect of the present invention is:
  • the gene is the full-length amino acid sequence of the luciferase protein luciferase 1 derived from M. pacifica (SEQ ID NO: 3):
  • the base sequence encoding the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the luciferase protein luciferase 2 derived from M. pacifica is:
  • the gene includes a base sequence that encodes the full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the luciferase protein lucif erase 2 from M. pacifica,
  • Sarasako also provides an invention of the use of the gene encoding the novel luciferase protein described above,
  • the invention of the use of the gene encoding the luciferase protein derived from M. pacifica which is useful in the present invention
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 is used as a full-length amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, as a base sequence encoding a peptide chain having the amino acid sequence described in any of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8.
  • FIG. 1 shows the results of microscopic observation of the outline of the marine plankton, Metridia pacifica, which is the origin of the novel luciferase protein that is useful in the present invention, under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 2 shows a recombinant expression protein of Metridia pacifica luciferase 1 and a recombinant expression protein of Metridia pacifica luciferase 2, which are recombinantly expressed from the coding gene of luciferase protein derived from Metridia pacifica, which is useful in the present invention.
  • Blue luminescence (luminescence measured at a wavelength of 480 nm), which shows pH dependence on luminescence activity and also emits coelenterazine power of the luminescent substrate by the action of the recombinant luciferase protein expression at pH adjusted with various buffer solutions (Intensity) is plotted against pH values adjusted with various buffer solutions.
  • FIG. 3 shows a recombinant expression protein of Metridia pacifica luciferase 1, a recombinant expression protein of Metridia pacifica luciferase 2, which is recombinantly expressed from the coding gene of luciferase protein derived from Metridia pacifica, which is useful in the present invention
  • recombinant luciferase protein expressed at pH 7.5, alkali metal cations (K +, Na +), alkaline earth metal cations (Ca 2+ , Mg 2+)
  • K +, Na + alkali metal cations
  • Ca 2+ , Mg 2+ alkaline earth metal cations
  • FIG. 4 shows the expression of the expression vector; White lucl-10 / pcDNA3.2, and then HeLa cells that have undergone recovery from cell damage are cultured in culture medium to induce recombinant expression. 2 shows the increase in luminescence activity by mature M. pacifica luciferase 1 secreted into the medium.
  • FIG. 5 shows a comparison of amino acid sequences of Metridia pacifica-derived luciferase protein, which is useful in the present invention, and Metridia longa-derived noreluciferase or Gaussia princeps-derived noreluciferase. Comparison between 1 and luciferase from Metridia longa is shown below, and comparison between Metridia pacifica luciferase 1 and Gaussia princeps-derived noluciferase is shown below.
  • Fig. 6 shows a comparison of the amino acid sequences of luciferase derived from Metridia longa and noluciferase derived from Gaussia princeps, and the base sequences encoding them, and the same partial amino acid sequence and the coding base sequence between them. Based on the above, the four types of areas that are the basis for the design of the mixed primer design are shown.
  • the luciferase protein is recombinantly expressed as a protein having an appropriate three-dimensional structure having its natural luminescent properties in various host cells. Is possible.
  • the N-terminal part of the full-length amino acid sequence is expressed. It has the advantage of being produced as a secreted luciferase outside the mammalian cell of the host by utilizing the signal 'peptide present in. That is, mammalian cells using a gene encoding the luciferase protein derived from Metridia pacifica of the present invention.
  • the luciferase protein derived from Metridia pacifica can be used as a reporter protein that is secreted outside the host cell.
  • the gene encoding the luciferase protein derived from Metridia pacifica of the present invention and the novel luciferase protein encoded by the gene will be described in more detail below.
  • zooplankton which is the origin of two novel secreted luciferase proteins according to the present invention, is a crustacean plankton found in deep ocean water collected in the sea near Japan. Its form is a type of White Copepoda (red poda) that appears white when viewed under a microscope under white light irradiation. On the other hand, when viewed under a microscope under ultraviolet irradiation, the appearance shown in FIG. Furthermore, it is a crustacean plankton that produces luciferase using coelenterazin e as a luminescent substrate, and is especially secreted from the shell gland present in the exoskeleton (skin) of the plankton surface. It was found to be a crustacean plankton that produces exocrine luciferase.
  • luciferase derived from Metridia longa and the luciferase derived from Gaussia princeps may have the same evolutionary origin.
  • Luciferase derived from M. pacific a It is not possible to confirm whether it has the same evolutionary origin as the above two types of luciferases, but assuming that possibility, at least a norecifer derived from Metridia loga
  • each mixed primer has the ability to hybridize with the base region of its design on the cDNA base sequence, and when it misfits to other regions, the 3 'end cap of the mixed primer
  • the base sequence of each mixed primer was selected so that it was difficult to extend the DNA strand. [0025] Specifically, the base sequences of two types of upstream mixed primers and two types of downstream mixed primers shown below were selected.
  • a gene encoding a protein derived from Metridia pacifica having a very high homologous base sequence in at least four positions was selected from a luciferase derived from Metridia longa and a luciferase derived from Gaussia princeps.
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 G K K L P L E V L I E M
  • CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA
  • luciferase proteins derived from Metridia pacifica Two kinds of luciferase proteins derived from Metridia pacifica according to the present invention; lucif erase 1 and luciferase 2, and Metridinidae (Metridinidae) belonging to Metridia longa-derived noreciferase and Gaussia princeps-derived noluciferase Comparing the full-length amino acid sequences encoded on the gene, as shown in Figure 5, the identity between luciferase 1 and Metridia longa-derived noluciferase, luciferase 2 and Gaussia princeps-derived luciferase Including amino acid residues that are homologous and homologous amino acid residues, considerably high homology has been found.
  • the 65th Asp of luciferas e 1 and 74th Asp of Metridia longa luciferase and the 40th Asp of luciferase 2 and 40th Asp of Gaussia princeps are extremely homologous. Showing sex.
  • two Metridia pacifica-derived noluciferases according to the present invention have the same origin as Metridia longa-derived luciferase and Gaussia princeps-derived luciferase, but with the evolution, the two partially differ in amino acid sequence.
  • Metridia pacifica it is presumed that it is expressed coexistingly.
  • N-terminal side from the 22nd Glu of luc iferase 1 and the N-terminal side from the 21st Glu of the luciferase derived from Metridia longa and the N-terminal side from the 23rd Asn of luciferase 2 and the luciferase derived from Gaussia p rinceps
  • the N-terminal side of the 23rd Asn shows high homology.
  • This N-terminal side is the region containing the signal 'peptide used for secretion, In the luciferase derived from Metridia longa! /, The cleavage site by signal peptidase is presumed in VQA-KS.
  • luciferase 1 the corresponding site is VQA-NP, and Gaussia princeps In origin luciferase, AE A—KP, and in luciferase 1, AQA—AT may correspond.
  • two luciferases derived from Metridia pacifica which are effective in the present invention, are also expressed in mammalian cells by using an N-terminal signal peptide rich in hydrophobic amino acids when recombinantly expressed. It is efficiently secreted outside the host cell.
  • luciferase proteins derived from Metridia pacifica according to the present invention
  • genes (cDNA) encoding luciferase 1 and luciferase 2 respectively
  • plasmid 'vector pcDNA3.
  • M. pacifica-derived luciferase When recombinantly expressing M. pacifica-derived luciferase according to the present invention in a mammalian cell as a reporter 1 'protein, a luciferase derived from a cypridina (Vypula hilgendorfi) belonging to the crustacean (Ostmcoda), A technique for substituting the coding region using an expression system applied to luciferase derived from the lobster (Oplophorus gracilorostris) belonging to the decapoda (Decapo da) can be used.
  • pacifica-derived luciferase can be similarly expressed recombinantly in hosts such as nocteria, yeast, fungi, and insect cells that are capable of recombinant expression of conventional luciferases. is there.
  • the gene encoding M. pacifica-derived luciferase is preferably converted into a codon frequently used in the host, if necessary, and then inserted into an expression vector.
  • no mutation is introduced into the amino acid sequence itself encoded by the gene due to codon conversion.
  • the coding gene When inserted into an expression vector, the coding gene previously codon-converted is In the non-coding region, restriction enzyme digestion and fragmentation.
  • a desired restriction enzyme site may be introduced by introducing a mutation into the base sequence of the non-coding region by site-directed mutagenesis. it can.
  • the present inventors searched for a crustacean plankton that produces luciferase using coelenterazine as a luminescent substrate from a large number of zooplankton collected from the sea near Japan.
  • Copepoda capable of producing the exocrine luciferase, Metazoa (Animal kingdom), Arthropoda (Arthropoda), Crustacea (Crustacea), Maxillopoda (Agoschia class) ), Copepoda (Copepoda), Neocopepoda (Copepoda), Gymnoplea (Forepoda), Calanoida (Melanididae), Metridinidae (Metridinidae), Metridia (Metridia), Metri dia pacifica (Metridia pacifica) It was concluded that
  • luciferase derived from Metridia longa and the luciferase derived from Gaussia princeps may have the same evolutionary origin.
  • Luciferase derived from M. pacific a It is not possible to confirm whether it has the same evolutionary origin as the above two types of luciferases, but assuming that possibility, at least a norecifer derived from Metridia loga
  • each mixed primer has the ability to hybridize with the base region of its design on the cDNA base sequence, and when it misfits to other regions, the 3 'end cap of the mixed primer.
  • the base sequence of each mixed primer was selected so that it was difficult to extend the DNA strand.
  • the cDNA prepared from mRNA was used as a saddle and the above-mentioned two types of upstream mixed primers and two types of downstream mixed primers were combined.
  • PCR reaction is performed for a total of four PCR primer pairs, select those that give PCR amplification products for all primer pairs.
  • Copepoda (M. pacifica) collected from sampled marine water are drained, suspended in 4 mL of TRIZOL reagent, and frozen and stored at 80 ° C.
  • the cryopreserved Copepoda individual is thawed at room temperature, and this suspension is transferred to a 15 mL Teflon homogenizer container and applied to a 10-degree crusher to crush the outer shell and body cells.
  • the cell crushed material is homogenized by applying 10 times of pressure and passing the cell crushed material through the injection needle.
  • RNA precipitate pellet After washing, the RNA precipitate pellet is left at 37 ° C for 10 minutes to evaporate the remaining solvent and dry. Transfer 210 / zL of RNase-free water to the dried RNA precipitate pellet, let stand for 10–20 minutes, re-dissolve, and prepare a total RNA sample solution.
  • a lysate (5 ⁇ L) was collected from 210 ⁇ of the prepared total RNA sample solution, and absorbance OD, OD, OD (background absorption) at wavelengths of 260 nm, 280 nm, and 320 nm. ). Based on the results, in accordance with a standard method, the absorbance OD was calculated as the RNA concentration.
  • Table 1 shows the evaluation results of the RNA-containing concentration for the obtained total RNA sample.
  • RNA content concentration 0.8872 g / L RNA content concentration 0.8872 g / L
  • poly (A) + RNA (mRNA) purification kit Oligotex — dT30 Separate and purify using SUPER> mRNA Purification Kit (TAKARA).
  • the precipitated fraction is dispersed in 350 L of the washing buffer attached to the kit, and transferred to a centrifugal ram tube. Centrifuge (15, OOOrpm) for 30 seconds to remove the supernatant. In addition, perform the same washing procedure using the same amount of washing buffer.
  • a sample for evaluation (0.5 L) was taken from 11 ⁇ l of the purified mRNA sample solution, and the RNA concentration was evaluated.
  • Table 2 shows the evaluation results of the RNA concentration of the purified mRNA sample obtained.
  • cDNA is synthesized using reverse transcriptase reaction with purified mRNA as a saddle.
  • a purified mRNA sample solution having a composition shown in Table 3 below, and 5 'CDS (cDNA synthesis) primer ⁇ SMART II oligo attached to the kit, 5, CDS primer-added mRNA Solution (RNAZ5, Ready Primer mix), purified mRNA sample solution, and 3 'CDS (cDNA synthesis) primer attached to the kit, 3, CDS primer-added mRNA solution (RNAZ3,- Prepare Ready Primer mix) in advance.
  • Ready cDNA synthesis and 3 Ready cDNA synthesis are prepared in advance 5 : CDS primer-added mRNA solution (RNAZ5, Ready Primer mix) or 3, C DS primer-added mRNA solution (RNAZ3 ,-Ready Primer mix), prepare a reverse transcription reaction solution with the composition shown in Table 4 below.
  • Reverse transcription reaction solution composition For cDNA synthesis, use the reverse transcriptase Superscript III attached to the kit, and incubate the reaction solution at 50 ° C for 1 hour, and then incubate at 70 ° C for 15 minutes. The DNA strand is extended from the primer that is hybridized with the type mRNA strand. After the reaction is complete, store the reaction mixture containing the synthesized cDNA at -20 ° C.
  • Table 6 shows the reaction solution composition and PCR amplification reaction conditions.
  • mRNAs derived from M. pacifica have a partial base sequence encoding a partial amino acid sequence similar to luciferase derived from M. longa, G. princep. Is done.
  • 3 'RACE anti] ⁇ production and product acquisition Prepared based on M. pacifica-derived mRNA, using 3 pairs of ready-made cDNA and 5'-ready cDNA as a saddle, and 2 primer pairs shown in Table 8 below. , As well as 5'RACE reaction products.
  • Table 9 shows the reaction solution composition and PCR amplification reaction conditions.
  • Nested 'PCR products are prepared using 3'RACE reaction products and 5'RACE reaction products as saddles, using each primer pair shown in Table 11 below.
  • Table 12 shows the composition of the reaction solution and the conditions for the PCR amplification reaction.
  • the prepared Nested 'PCR product is temporarily inserted into the cloning vector pCR2.1 TOPO, introduced into the Chemical competent cell TOP10 strain, and the transformed strain is introduced. select.
  • the plasmid 'vector was introduced into the host E. coli according to the following procedure.
  • the plasmid is separated and purified using a commercially available plasmid purification kit: QIAGEN plasmid purification kit (manufactured by QIAGEN).
  • QIAGEN plasmid purification kit manufactured by QIAGEN.
  • the soluble fraction (supernatant) containing the plasmid DNA is applied to the QIAprep column of the same purification kit. Centrifuge (15, OOOrpm) at 4 ° C to remove the liquid layer. Add 0.5 mL of Knife PB and wash, then add 0.75 mL of Buffer PE and wash. Finally, centrifuge for 1 minute at 4 ° C (15, OOOrpm) to remove the washing solution. Elute the plasmid adsorbed on QIAprep of the purification kit with 30 L of EBER EB and collect it. Take out of the solution containing this purified plasmid, and collect 99 / zL of distilled water to make a 100-fold dilution.
  • Table 13 shows the results of evaluating the DNA concentration contained in the solution containing the purified plasmid for each clone.
  • cDNA portion (Nested 'PCR product) that is inserted into the plasmid vector and retained by the above four clones, follow the procedure below for nucleic acid chain extension for base sequence analysis. Prepare the product.
  • the prepared sample for base sequence analysis is purified by the following procedure.
  • the purified DAN fragment for analysis is redispersed in Template suppressor Reagent (TSR). Vortex and mix, then centrifuge to liquidate. Heat to 95 ° C for 2 minutes, separate into single-stranded DNA, and cool on ice. -After vortexing, centrifuge again and collect the solution containing the extended single-stranded DNA. After that, the analysis sample DAN fragment (extended single-stranded DNA) was obtained from a commercially available sequence device: ABI PRISM 3100
  • 3 'Ready cDNA and 5' Ready cDNA are prepared again, and 5 and Ready cDNA are used as saddles.
  • the two downstream primers are: White luc LP 3, White luc Using LP4, prepare a new 5'RACE reaction product.
  • RNA RNA from 900 individuals of M. pacifica according to the procedure for collecting total RNA and purifying Polv (A) + RNA (mRNA) as described above. Prepare a sample.
  • Table 15 shows the results of quantifying the total RNA collected and the amount of RNA contained in the purified mRNA sample.
  • step (b) From the mRNA sample, the purified mRNA contained therein is used as a saddle and cDNA is synthesized using a reverse transcriptase reaction.
  • RNAZ5, -Ready Primer mix Prepare the 5 CDS primer-added mRNA solution (RNAZ5, -Ready Primer mix) and 3 'CDS primer-added mRNA solution (RNAZ3, 1 Ready Primer mix) as shown in Table 16 below.
  • RNA / 3 '-Re ady P r ime rmix Mix each component and hold at 65 ° C for 5 minutes. Cool the resulting mixture with ice for 1 minute. By the heating, any mRNA contained in the mixed solution is converted into a single-stranded RNA molecule.
  • Ready cDNA synthesis and 3 'Ready cDNA synthesis are prepared in advance with 5' CDS primer added mRNA solution (RNAZ 5, one Ready Primer mix) or 3, C DS primer supplemented mRNA solution (RNA / 3 '—Ready Primer mix) and prepare a reverse transcription reaction solution with the composition shown in Table 17 below.
  • cDNA synthesis For cDNA synthesis, use the reverse transcriptase Super Script III attached to the kit, incubate the reaction solution at 50 ° C for 1 hour, and then incubate at 70 ° C for 15 minutes. Then, the DNA strand is extended from the primer that is hybridized with the vertical mRNA strand. After the reaction is complete, store the reaction mixture containing the synthesized cDNA at -20 ° C.
  • Table 20 The RACE reaction product is inserted into the cloning vector pCR4Blunt—TOPO (manufactured by Invitrogen), the resulting vector is introduced into the Chemical competent cell TOPI 0 strain, and transformation is selected. The plasmid 'vector was introduced into the host E. coli according to the procedure described above.
  • the transformation contained in the culture broth was performed on the drug-supplemented medium using a selection marker (drug resistance gene) derived from the clawing vector pCR4Blunt—TOPO. select. From the selected transformants, use the colony PCR method to select the one that holds the cDNA insertion plasmid vector.
  • a selection marker drug resistance gene
  • the plasmid is separated and purified using a commercially available plasmid purification kit: QIAGEN plasmid purification kit (manufactured by QIAGEN).
  • QIAGEN plasmid purification kit manufactured by QIAGEN.
  • the soluble fraction (supernatant) containing the plasmid DNA is applied to the QIAprep column of the same purification kit. Centrifuge (15, OOOrpm) at 4 ° C to remove the liquid layer. Add 0.5 mL of Knife PB and wash, then add 0.75 mL of Buffer PE and wash. Finally, centrifuge for 1 minute at 4 ° C (15, OOOrpm) to remove the washing solution. Elute the plasmid adsorbed on QIAprep of the purification kit with 30 L of EBER EB and collect it. Take out of the solution containing this purified plasmid, and collect 99 / zL of distilled water to make a 100-fold dilution.
  • Table 23 shows the results of evaluating the DNA concentration contained in the solution containing the purified plasmid for each clone.
  • the concentration is adjusted so that the DNA concentration becomes 250 ngZL. Then, using a commercially available DNA sample for sequencing: BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready Reaction Kit with AmpliTaq polymerase — Two types of primers for the site derived from TOPO; M13 sense M4, M13 RV is used as a sequence primer and prepared from the region containing the cDNA inserted in the plasmid vector. Table 24 shows the temperature conditions of the DNA chain extension reaction used and the composition of the reaction solution.
  • the prepared sample for base sequence analysis is purified by the following procedure.
  • the purified DAN fragment for analysis is redispersed in Template suppressor Reagent (TSR). Vortex, mix and centrifuge to dissolve. Heat to 95 ° C for 2 minutes, separate into elongated single-stranded DNA, and cool on ice. -After vortexing, centrifuge again to collect the solution containing single-stranded DNA.
  • TSR Template suppressor Reagent
  • the reacquired 3 'RACE reaction product is inserted into the cloning vector pCR4Blunt—TO PO, the resulting vector is introduced into the Chemical competent cell TOP10 strain, and the transformant is selected.
  • the reacquired 3 'RACE reaction product is sub-cloned, and the plasmid vector is introduced into the host E. coli according to the procedure for preparation of a transformed clone that sub-clods the 5' RACE reaction product above. This was carried out using Chemical competent eel 1.
  • Each selected clone is retained and inserted into a plasmid vector.
  • a chain extension reaction product is prepared.
  • the prepared sample for base sequence analysis is purified by the following procedure.
  • the purified DAN fragment for analysis is redispersed in Template suppressor Reagent (TSR). Vortex, mix and centrifuge to dissolve. Heat to 95 ° C for 2 minutes, separate into single-stranded DNA, and cool on ice. -After vortexing, centrifuge again and collect the solution containing the extended single-stranded DNA.
  • TSR Template suppressor Reagent
  • GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 G K K L P L E V L I E M
  • CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA 781
  • the former contains an ORF encoding 210 amino acid residues
  • the latter contains an ORF encoding 189 amino acid residues.
  • the protein encoded by the former gene is named M. pacifica luciferase 1 and the protein encoded by the latter gene is named M. pacifica luciferase 2. From the base sequence part encoding this M. pacifica luciferase 1, the following downstream primer: White luclB LP1 was designed.
  • the White luclB LP1 is a base sequence complementary to the following part in the ORF.
  • upstream primer White lucl 5'— In the base sequence of the 3'RACE reaction product extended from UP1, the following two downstream primers based on the base sequence of the untranslated region at the 3 'end: White lucl 3, 1 LP 1 and White lucl 3, 1 LP2 were designed.
  • a 5′RACE reaction product in which a nucleic acid chain is extended from the downstream primer is prepared using the downstream primer; White luclB L PI.
  • the reacquired 5'RACE reaction product is inserted into the cloning 'vector pCR4Blunt—TO PO, introduced into TOP10 strain, and transformed. Using the 5'RACE reaction product portion that is sub-cloned, reanalyze the nucleotide sequence corresponding to the 5 'untranslated region of the M. pacifica luciferase 1 gene.
  • cloning vector pCR4Blunt Using a selection marker derived from TOPO, for the selected transformant, downstream primer; White luclB LP1 from the 3, end of M. pacifica luciferase 1 gene 5. Nucleic acid to untranslated region Analyzing the base sequence of the 5'RACE reaction product held by the subclone group of White lucl 5'RACE LP1B—UPMZ ⁇ CR4Blunt—TOPO, including the 5'RACE reaction product that has undergone chain extension, and its 5 'untranslated region , As well as the base sequence of the ORF N-terminal part.
  • Plasmids held by each of the selected clones 'A part containing a 5' RACE reaction product to be recaptured that has been inserted into the vector is used as a cage for nucleotide sequence analysis by the following procedure.
  • a nucleic acid chain extension reaction product is prepared.
  • Table 28 shows the used sequencing primers, the temperature conditions for the DNA strand extension reaction, and the composition of the reaction solution.
  • the purified DAN fragment for analysis is redispersed in Template suppressor Reagent (TSR). Vortex, mix and centrifuge to dissolve. Heat to 95 ° C for 2 minutes, separate into single-stranded DNA, and cool on ice. -After vortexing, re-centrifuge to collect the solution containing the extended single-stranded DNA. After that, DAN disconnection for analysis sample
  • TSR Template suppressor Reagent
  • Upstream primers and downstream primers for PCR amplification of the translation region up to the stop codon were designed as follows. At that time, the PCR amplification produced by using these upstream primer pair and downstream primer pair should be incorporated into the expression vector ⁇ TOPO.
  • the base sequence is complementary to the coding sequence of the C-terminal part of M. pacifica luciferase 1 below.
  • the base sequence is complementary to the coding sequence of the C-terminal part of M. pacifica luciferase 2 below.
  • Plasmid OETIO I ZD A luciferase protein gene derived from M. pacifica into TOPO
  • the prepared PCR amplification product was purified by the following procedure.
  • the product DNA is concentrated from the reaction solution with MinElute (manufactured by QIAGEN).
  • MinElute manufactured by QIAGEN
  • 5 volumes of kaffer was added, subjected to vortexing, and transferred to a Min Elute column. Centrifuge for 30 seconds to separate the column with adsorbed DNA and remove the supernatant. Leave. Wash the column with adsorbed DNA with 0.7 mL of buffer PE, centrifuge for 1 minute (15, OOOrpm) to separate the column, and completely remove the stopper PE. Then add 10 L of elution buffer EB to the column and let stand at room temperature for 1 minute. After this elution treatment, centrifuge (15, OOOrpm) for 1 minute, and collect the supernatant containing the column-eluting DNA in a 1.5 mL eppen tube.
  • 10 X loading dye solution 2 / zL was added to the recovered DNA solution, and then 12 L of each lane DNA solution was run on a 1.0% T AE agarose gel. Cut out a band of the desired molecular weight from the gel. 1. Place the gel slice in a 5mL eppen tube and collect the DNA.
  • the purified double-stranded DNA is inserted into a commercially available plasmid ⁇ —TOPO (manufactured by Invitrogen), and the gene (coding sequence portion) of the luciferase protein derived from M. pacifica is cloned into the vector.
  • a commercially available plasmid ⁇ —TOPO manufactured by Invitrogen
  • the gene (coding sequence portion) of the luciferase protein derived from M. pacifica is cloned into the vector.
  • the constructed vector it is introduced into the Chemical camppet cell TOP10 strain, and a transformant is selected.
  • the plasmid 'vector was introduced into the host E. coli using Chemical competent eel 1 according to the procedure described above.
  • colony RCR Use the colony PCR method to confirm the presence or absence of cDNA fragment insertion in the plasmid vector collected from the transformants that form each colony.
  • Colonies were randomly selected from the colonies on the petri dish, and the cells of each colony were suspended in 70; zL of water (DDW). This cell suspension was treated at 95 ° C. for 5 minutes. A solution containing the vector collected from the cells was used as a colony solution in the reaction solution.
  • Each selected clone is retained and inserted into a plasmid vector, and the portion containing the gene for the luciferase protein is used as a cage. To prepare.
  • Table 31 shows the sequence primers used, the temperature conditions for the DNA strand extension reaction, and the composition of the reaction solution.
  • the purified DAN fragment for analysis is redispersed in Template suppressor Reagent (TSR). Vortex, mix and centrifuge to dissolve. Heat to 95 ° C for 2 minutes, separate into single-stranded DNA, and cool on ice. -After vortexing, re-centrifuge to collect the solution containing the extended single-stranded DNA. Thereafter, the sample DAN fragment for analysis is subjected to nucleotide sequence analysis by applying it to a commercially available sequence device: ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.
  • TSR Template suppressor Reagent
  • the coding sequence of M. pacifica luciferase 1 in the PCR amplification product is retained in White luc 1-4 / pET 101 / TOP 10 and White lucl-9ZpET10lZTOP10.
  • the sequence held in Whiteluc 1-10 ZpETlOlZTOPIO has a difference in the portion corresponding to the N-terminal region.
  • the sequence retained in White lucl—4 / pET101 / TOP10 and White lucl—9 / pE TlOlZTOPIO and the sequence retained in White lucl— ⁇ ⁇ ⁇ are mutually amino acid substituted into the portion corresponding to the terminal region. It is a coding sequence of a mutant protein having.
  • Luminescence characteristics of recombinant expression of M. pacifica derived luciferase protein Two selected clones; White lucl—10 / pET101 / TOP10 and White luc 2-7 / pET101 / TOP10, derived from the vector ⁇ — ⁇ Promote the expression of the inserted gene from the promoter using IPTG, and collect cultured cells after 4 hours. SDS-PAGE analysis of proteins contained in the soluble fraction (cytoplasmic component) and insoluble fraction (membrane component) separated by centrifugation (15,000 rpm; 18, 800 X g) after disruption of the cells Went. As a result, a new band corresponding to the target luciferase protein is found in the soluble fraction (cytoplasmic component) of transformed E. coli.
  • Fig. 2 shows a luminescent substrate obtained by reacting the recombinant expression product of the M. pacifica-derived luciferase protein according to the present invention with the action of the recombinant expression product of the luciferase protein at pH adjusted with the following various buffer solutions
  • the results of plotting the blue luminescence (luminescence intensity measured at a wavelength of 480 nm) generated by the coelenterazine power against pH values adjusted by various buffer solutions are shown.
  • ⁇ M. pacifica luciferase 1 and M. pacifica luciferase 2 thread-replacement expressing bodies may exhibit the desired level of luminescent properties. It is confirmed.
  • FIG. 3 shows a recombinant expression product of M. pacifica-derived luciferase protein according to the present invention at pH 7.5, an alkali metal cation (K +, Na +), an alkaline earth metal cation (Ca 2+ , Mg 2+ ).
  • 3 shows the result of comparing blue light emission (luminescence intensity measured at a wavelength of 480 nm) generated by coelenterazine as a luminescent substrate by using the recombinant luciferase protein expression product in the presence of.
  • pacifica luciferase 2 has an alkali metal cation (K +, Na +), alkaline earth metal cation (Ca It is confirmed that the presence of about 50 mM of ( 2+ , Mg 2+ ) force is required.
  • M. pacifica-derived luciferase protein expression vectors used for recombinant expression in E. coli as described above: Adjusted by PCR according to the production procedure for White lucl-10 / pET101, White luc2-7 / ⁇
  • the purified double-stranded DNA is inserted into a cloning site of the commercially available plasmid pcDNA3.2 / V5-GW / D-TOPO (manufactured by Invitrogen), and the luciferase protein derived from M. pacifica is expressed in human cells.
  • An expression vector is prepared.
  • the double-stranded DNA fragment inserted into the powerful expression vector for expression in human cells is inserted into the expression vectors: White lucl-10 / pETlOl, White luc2-7 / pET101. It has the same base sequence as the coding gene and has not been subjected to codon conversion suitable for codon selection in humans. That is, it is the same as the double-stranded DNA fragment inserted into the above expression vectors: White luc 1 10ZpET101, White luc2-7 ⁇ 101. -Introduce the expression vectors White lucl-10 / pcDNA3.2 and Wheatluc2-7 / pcDNA3.2 into the Chemical competent cell TOP10 strain and select for transformation. The plasmid 'vector was introduced into the host E. coli using chemical competent cells according to the procedure described above.
  • the plasmid prepared by culturing the selected clonal strain is collected and purified using a commercially available plasmid purification kit; QIAGEN Plasmid Maxi Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the purified expression vector for expression in human cells of the luciferase protein derived from M. pacifica is introduced into HeLa cells using PolyFect Transfection reagent (manufactured by QIAGEN).
  • PolyFect Transfection reagent manufactured by QIAGEN.
  • As the host HeLa cells cells cultured to 100% dish on a 100 mm dish using a serum-supplemented medium (DMEM + 10% FBS + lOO ⁇ g / ml Kanamycin) are used.
  • DMEM + 10% FBS + lOO ⁇ g / ml Kanamycin a serum-supplemented medium
  • PolyFect Transfection Reagent 50.0 ⁇ L3 ⁇ 4r was added to 6.0 L of the expression vector 'plasmid solution (DNA fi: 1 ⁇ g / L), and this mixture was stirred for 10 seconds, and then at room temperature for complex formation at room temperature. Incubate for minutes and use for transfection.
  • HeLa cells
  • Fig. 4 shows the expression vectors; White lucl-10ZpcDNA3.2 and White luc2-7 / pcD NA3.2.
  • recombinant expression When recombinant expression is induced, it shows an increase in luminescence activity by mature M. pacifi ca luciferase 1 secreted into the medium and an increase in luminescence activity by M. pacifica luciferase 2.
  • Luminescence activity by the luciferase protein in the culture medium and the luminescence activity by the luciferase protein remaining in the cultured cells after 24 hours and 48 hours with the recombinant expression induced in the culture. Are comparing. It is confirmed that the luminescence activity by the luciferase protein in the medium increases markedly with the passage of culture time.
  • the coding gene of the luciferase protein derived from M. pacifica is an in vitro culture system that sufficiently utilizes various human-derived cell systems without performing codon conversion adapted to codon selection in human cells. Therefore, it is verified that the gene can be used as a gene encoding a reporter protein that can be expressed in the host cell and secreted to the outside of the cell after expression.
  • Both of the genes encoding two luciferase proteins derived from M. pacifica according to the present invention can be expressed in the host cell in an in vitro culture system using mammalian cells, and After the expression of strong gene force, the recombinant luciferase protein can be used as a reporter protein that is secreted outside the host cell.

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Abstract

　本発明は、少なくとも、・セレンテラジンをその発光基質として、利用可能である； ・哺乳動物細胞を宿主として、組換え発現させ、その宿主細胞外に分泌生産が可能である；という特性を有する、新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子を提供し、すなわち、本発明にかかる新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子は、Ｍ．　ｐａｃｉｆｉｃａ由来のルシフェラーゼ　タンパク質二種；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　１およびｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　２の完全長アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ分子であり、例えば、該ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　１の完全長アミノ酸配列： MMEIQVLFAL ICFALVQANP TENKDDIDIV GVEGKFGTTD LETDLFTIVE DMNVISRDTN  60 LANSDADRGK MPGKKLPLEV LIEMEANARK AGCTRGCLIC LSKIKCTAKM KVYIPGRCHD 120 YGGDKKTGQA GIVGAIVDIP EISGFKELGP MEQFIAQVDL CADCTTGCLK GLANVKCSAL 180 LKKWLPDRCA SFADKIQSEV DNIKGLAGDR 210   をコードする遺伝子である。

Description

明 細 書
新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子に関する。具体的には、本発 明は、海洋プランクトンに由来する新規なルシフェラーゼの組換え発現に利用可能 なコード遺伝子に関する。
背景技術
[0002] ルシフェラーゼは、発光基質 (ルシフェリン）を酵素的に酸化し、バイオルミネッセン スを発する酵素タンパク質であり、種々のバイオ'アツセィ系において、レポータ一'タ ンパク質としての利用が従来から図られている。すなわち、 in vitroの細胞培養系に おいて、該宿主細胞内で組換え発現させる目的で、幾つかのルシフェラーゼをコ一 ドする遺伝子が採取され、また、その組換え発現系も確立されている。具体的には、 ルシフェラーゼの組換え発現系では、宿主細胞内において、異種のプロモーターの 制御下、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の転写を行い、転写された mRNAにより 、ペプチド鎖に翻訳し、 目的とするルシフェラーゼ 'タンパク質が産生される。
[0003] 宿主細胞内で組換え発現されるルシフ ラーゼ 'タンパク質力 その細胞外へ分泌 される、分泌型ルシフェラーゼを利用すると、培養されている宿主細胞をサンプリング することなぐ分泌された該レポーター 'タンパク質を含む培地をサンプリングすること で、該レポーター 'タンパク質の産生量を簡便にモニターすることが可能となる。例え ば、 in vitroの細胞培養系において、経時的にレポータ一'タンパク質の産生量変 化を観測する際、分泌型ルシフェラーゼを利用すると、各時刻において、所定量の 培地をサンプリングし、それに含まれる分泌型ルシフェラーゼの含有濃度をモニター する手法が利用可能となる。力かる用途に利用される、組換え発現可能な、分泌型 ルシフェラーゼとして、甲殻類（Ostracoda)に属するゥミホタル（Cypridina : Vargul a hilgendorfi)由来のノレシフェラーゼ (Thompson, E. M. , et al. , Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567—6571 (1989) )、十脚類（Decapo da)に属するヒォトシエビ（Oplophorus gracilorostris)由来のノレシフェラーゼ（Ino uye, S. , et al. , FEBS Lett. , 481, 19—25 (2000)；特開 2002—3 20482号公報）が報告されている。この二種の分泌型ルシフェラーゼに関して、動物 細胞を宿主として、組換え発現させ、分泌生産を行ったことも報告されている。
[0004] 更に、その他の起源において発見された分泌型ルシフェラーゼとして、ともに、 Met ridinidae (メトリディニダ工科)に属する、 Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼ( GenBank /EBI accession number AY015993)ご、 Metridia longa由来 のルシフェラーゼ（GenBank'M/EBI accession number AY364164 ;J. Bi ol. Chem. Vol. 279, No. 5 pp. 3212—3217 (2004) )力 ^報告されて!ヽる
[0005] これらの分泌型ルシフェラーゼは、それぞれの生物に固有の発光基質 (ルシフェリ ン）に作用して発光を起こしている力 種々のバイオ ·アツセィ系を構築する上では、 より汎用性に富む発光基質 (ルシフェリン）に対しても、作用可能であることが望まし い。例えば、より汎用性に富む発光基質 (ルシフェリン）として、下記のセレンテラジン
[0006] [化 1]
Figure imgf000005_0001
を利用する際、所望の発光を起こさせることが可能な分泌型ルシフェラーゼは、種々 のバイオ.アツセィ系を構築する上で望ましいものである。例えば、甲殻類 (Ostraco da)に属するゥミホタル（Cypridina： Vargula hilgendorfi)由来のルシフェラーゼ、 十脚類 (Decapoda)に属するヒォトシエビ（Oplophorus gracilorostris)由来のル シフェラーセ、 Gaussia princeps由来のノレシフェラーセ、 Metridia longa由来の ルシフェラーゼは、前記セレンテラジンをその発光基質 (ルシフェリン）として、利用可 能であることが報告されて 、る。
発明の開示
[0007] 既に報告されて!、るルシフェラーゼの幾つかは、
'セレンテラジンをその発光基質 (ルシフェリン）として、利用可能である；
•例えば、哺乳動物細胞を宿主として、組換え発現させ、その宿主細胞外に分泌生 産が可能である；
という種々のノ ィォ'アツセィ系を構築する上で、望ましい特性を有している。但し、そ の種類は、極く限られており、多様なバイオ'アツセィ系を構築する上では、利用可能 な分泌型ルシフェラーゼの選択肢を、更に増やすことが望まれている。すなわち、前 記の特性を満足する、新規な分泌型ルシフェラーゼを探索し、かかる新規な分泌型 ルシフェラーゼの組換え発現に用いる、該分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子 の提供が更に望まれている。
[0008] 本発明は、カゝかる課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、
少なくとも、
'セレンテラジンをその発光基質 (ルシフェリン）として、利用可能である；
•例えば、哺乳動物細胞を宿主として、組換え発現させ、その宿主細胞外に分泌生 産が可能である；
t 、う特性を有する、新規なルシフェラーゼをコードする遺伝子を提供することにある
[0009] 本発明者らは、前記の課題を解決すべき、新規なルシフェラーゼの探索を進めた。
その結果、 Metridinidae (メトリディニダ工科）に属する海洋プランクトンの一種であ る、 Metridia pacifica力 セレンテラジンをその発光基質 (ルシフェリン）として、禾 IJ 用可能である、分泌型ルシフェラーゼを産生していることを見出した。その Metridia pacifica由来の分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子のクロー-ングを進めた 結果、実際には、 Metridia pacificaは、分泌型ルシフェラーゼを二種産生している ことを発見した。この Metridia pacifica由来の分泌型ルシフェラーゼ二種； Metrid ia pacinca mciferase 1、 Metridia pacifica luciferase 2 コ ~~ドする遺 izs 子をそれぞれクローユングし、ヒト由来の確立された細胞系統（cell line)において、 組換え発現を行うと、実際に、二種のルシフェラーゼは、該宿主細胞外へ分泌される ことを確認した。本発明者らは、これら一連の知見に基づき、本発明を完成するに至 つた o
[0010] すなわち、本発明の第一形態に力かる M. pacifica由来のルシフヱラーゼ タン ノ ク質をコードする遺伝子は、
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1をコードする遺伝子 であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 の完全長アミノ酸配列 (配列番号: 1)：
Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe 25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly 85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala 145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys 160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子である。
その際、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1の完 全長アミノ酸配列 (配列番号： 1)をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列 (配列番号： 2)：
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 36 Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu ulu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys 160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
であることが好まし 、。例えば、該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラー ゼ タンパク質 luciferase 1の完全長アミノ酸配列（配列番号： 1)をコードする塩基 配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列 (配列番号： 5)：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC
48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 84 Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 120 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 156 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35 GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 192 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 228 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 264 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 336 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 372 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 408 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 444 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 480 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 516 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 552 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 588 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 624 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 660 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 681
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA
731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA
781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG
831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG 867 を有する DNA分子であることもできる。
[0012] 加えて、本発明の第一形態は、下記の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タン ノ ク質変異体をコードする遺伝子をも同時に提供する。
[0013] すなわち、本発明の第一形態に力かる M. pacifica由来のルシフヱラーゼ タン パク質変異体をコードする遺伝子は、
•M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体をコードす る遺伝子であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号 : 7)：
Met Met Glu lie Lys Val Leu Phe Ala Leu lie Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコードす る遺伝子；例えば、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase
1変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号： 7)をコードする塩基配列は、 下記の塩基配列 (配列番号： 9)：
ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 36 2
Met Met Glu lie Lys Val Leu Phe Ala Leu lie Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35 GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
であることを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコ ードする遺伝子、
あるいは、
•M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体をコードす る遺伝子であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号 : 8)：
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe 25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly 85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala 145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコードす る遺伝子；例えば、 前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferas e 1変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号： 8)をコードする塩基配列は、 下記の塩基配列 (配列番号： 10)：
ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC ATT TGC 36
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコードす る遺 子、
を含んでいる。
一方、本発明の第一形態にかかる M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク 質をコードする遺伝子は、
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 2をコードする遺伝子 であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 の完全長アミノ酸配列 (配列番号: 3)：
Met Gly Val Lys Leu He Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45
Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50 55 60
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys 65 70
His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu
110 115 120
lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin
125 130
Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145 150 155
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
Thr lie Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg
185
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子である。
その際、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 2の完 全長アミノ酸配列 (配列番号: 3)をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列 (配列番号 : 4)：
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 36 Met Gly Val Lys Leu He Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 72 Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 108 Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 144 Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 180 Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50 55 60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 216 Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65 70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 252 His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 288 Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 324 Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 360 Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu 110 115 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 396 lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin
125 130
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 432 Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 468 Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145 150 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 504 Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 540 Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 570
Thr He Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
185
であることが好まし 、。例えば、該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラー ゼ タンパク質 lucif erase 2の完全長アミノ酸配列（配列番号： 2)をコードする塩基 配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列 (配列番号 : 6)：
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA 26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 62
Met Gly Val Lys Leu He Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 98 Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 134 Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 170 Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 206 Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50 55 60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 242 Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65 70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 278 His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 314 Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 350 Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 386 Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu
110 115 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 422 lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 458 Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 494 Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145 150 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 530 Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 566 Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 596
Thr He Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
185
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT
646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA
696
746
AAAAAAA 753
を有する DNA分子であることもできる。
さら〖こは、本発明は、上記の新規なルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝子 の用途の発明をも提供しており、
すなわち、本発明に力かる M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質をコード する遺伝子の用途の発明は、 哺乳動物細胞の in vitro培養系にお 、て、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号 ： 7、配列番号： 8の 、ずれかに記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とするルシ フ ラーゼ タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、該哺乳動物細胞 外へ分泌型ルシフェラーゼの形態で分泌生産されるリポーター ·タンパク質として利 用することを目的とする、該配列番号： 1、配列番号: 3、配列番号 : 7、配列番号 : 8の いずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、 配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号： 9、配列番号： 10のいずれかに記載に記載の 塩基配列を有する DNAの使用である。特に好ましくは、前記哺乳動物細胞は、 in V itro培養可能なヒト由来細胞系であることを特徴とする DNAの使用である。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、本発明に力かる新規なルシフェラーゼ タンパク質の起源である海洋プ ランクトン、 Metridia pacificaの外形を、紫外線照射下において、顕微鏡観察した 結果を示す。
[図 2]図 2は、本発明に力かる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 のコード遺伝子から組換え発現される、 Metridia pacifica luciferase 1の組換 え発現タンパク質、 Metridia pacifica luciferase 2の組換え発現タンパク質の 発光活性に対する pH依存性を示し、各種バッファー液により調整される pHにお 、て 、該ルシフェラーゼ タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテ ラジン力も発せられる青色発光 (波長 480nmで測定した発光強度)を、各種バッフ ァー液により調整される pH値に対して、プロットした結果を示す。
[図 3]図 3は、本発明に力かる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 のコード遺伝子から組換え発現される、 Metridia pacifica luciferase 1の組換 え発現タンパク質、 Metridia pacifica luciferase 2の組換え発現タンパク質の 発光活性の発揮に対する金属陽イオンの必要性を示し、ルシフェラーゼ タンパク質 の組換え発現体を、 pH7. 5において、アルカリ金属カチオン (K+、 Na+)、アルカリ 土類金属カチオン (Ca2+、 Mg2+)の存在下、該ルシフェラーゼ タンパク質組換え発 現体の作用によって、発光基質のセレンテラジン力 発せられる青色発光 (波長 48 Onmで測定した発光強度)を対比した結果を示す。 [図 4]図 4は、発現ベクター； White lucl-10/pcDNA3. 2を導入した後、細胞損 傷の回復処置を終えた HeLa細胞を、培地中で培養し、組換え発現を誘導した際、 培地中に分泌される、成熟型の M. pacifica luciferase 1による発光活性の増 加を示す。
[図 5]図 5は、本発明に力かる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 と、 Metridia longa由来のノレシフェラーゼまたは Gaussia princeps由来のノレシフ エラーゼとのアミノ酸配列の比較を示し、上段に、 Metridia pacifica luciferase 1と Metridia longa由来のルシフェラーゼとの対比、下段に、 Metridia pacifica luciferase 1と Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼとの対比を、それぞれ示 す。
[図 6]図 6は、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレ シフェラーゼのアミノ酸配列、それをコードする塩基配列を対比して示し、両者間で 同一の部分アミノ酸配列と、そのコード塩基配列に基づき、選択される、混合プライマ 一設計の基礎とした、 4種の領域を併せて示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子を用いることにより、該ルシフェラーゼ タンパク質を種々の宿主細胞内において、 その天然の発光特性を有する、適正な立体構造を有するタンパク質として組換え発 現可能である。また、該組換え発現された、 Metridia pacifica由来のルシフェラー ゼは、その発光特性の発揮に必要な金属陽イオン、例えば、アルカリ金属カチオン（ K+、 Na+)、アルカリ土類金属カチオン (Ca2+、 Mg2+)の存在下において、分子状 酸素を利用して発光基質のセレンテラジンを酸化し、極大波長 λ max=480nmの青 色発光を発することが可能である。特に、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を利用す る、 in vitroの細胞培養系において、該 Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝子を組換え発現させると、その完全長アミノ酸配列の N 末部分に存在するシグナル 'ペプチドを利用して、宿主の哺乳動物細胞外に分泌型 ルシフェラーゼとして産生される利点を有する。すなわち、本発明の Metridia pacif ica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝子を利用する、哺乳動物細 胞の組換え発現系を構築することで、 Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タ ンパク質を宿主細胞外へと分泌されるリポーター 'タンパク質として利用することが可 能となる。
以下に、本発明の Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコード する遺伝子と、それがコードする新規なルシフェラーゼ タンパク質に関して、より詳 しく説明する。
[0018] まず、本発明にかかる新規な分泌型ルシフェラーゼ タンパク質二種の起源である 動物性プランクトンは、 日本の近海で採取された海洋深層水中に見出された、甲殻 類プランクトンである。その形態は、白色光照射下において、顕微鏡観察すると白色 に見える、 White Copepoda (赤色の橈脚類)の一種であり、一方、紫外線照射下、 顕微鏡観察すると、図 1に示す外観を示す。更には、セレンテラジン (coelenterazin e)を発光基質とするルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンであり、特には、該 プランクトン体表の外骨格（甲皮）に存在する殻腺から、その体外へと分泌される、体 外分泌型ルシフェラーゼを産生する甲殻類プランクトンであることを発見した。
[0019] 該体外分泌型ルシフェラーゼの産生能を有する White Copepodaについて、詳 細な分類学上の同定を行い、 Metazoa (動物界）、 Arthropoda (節足動物門）、 Cr ustacea (甲殻亜門）、 Maxillopoda (ァゴァシ綱）、 Copepoda (カイァシ亜綱）、 Ne ocopepoda (カイァシ下網）、 Gymnoplea (前脚類）、 Calanoida (力ラヌス目 )、 Met ridinidae (メトリディ-ダ工科）、 Metridia (メトリディア属）に属する、 Metridia paci fica (メトリディア パシフィカ）であると結論された。
[0020] 次いで、 Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子クロー-ングに先立ち、そのクロー-ング過程に利用する混合プライマーの設計を 行った。
[0021] M. pacificaは、体外分泌型ルシフェラーゼを産生することが、確認されたので、 同じぐ Metridia (メトリディア属）に属する海洋プランクトンにおいて報告されている、 既知の体外分泌型ルシフェラーゼを検索したところ、 Metridia longa由来のルシフ エラーゼ（GenBank™/EBI accession number AY364164 ;J. Biol. Ch em. Vol. 279, No. 5 pp. 3212-3217 (2004) )力 S見出された。さらに、 Met ridinidae (メトリディニダ工科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼの 報告例を検索したところ、 Gaussia属に属する、 Gaussia princeps由来のルシフエ ラーゼ（GenBank /EBI accession number AY015993)と、 Pleuromam ma属に属する、 Pleuromamma sp. CSG— 2001由来のルシフェラーゼ（GenBa nk™/EBI accession number AY015993)力見出された。
[0022] 検索された Metridinidae (メトリディニダ工科）に属する甲殻類プランクトン由来の ルシフェラーゼ三種のアミノ酸配列間における対比を行った力 三種の間において、 高度に保存されている「共通的配列」は見出されな力つた。次に、 Metridia longa 由来のルシフェラーゼと他の二種のアミノ酸配列間で、個々に対比を行ったところ、 Metridia longa由来のノレシフェラー ITと Gaussia princeps由来のノレシフェラーセ との間において、相同性の高い領域が存在することを見出した。
[0023] この結果は、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaussia princeps由来の ルシフェラーゼ力 進化的に同じ起源を有する可能性を示唆している。 M. pacific a由来のルシフェラーゼカ 前記二種のルシフェラーゼと、進化的に同じ起源を有す るか否かは、確認できないものの、その可能性を仮定して、少なくとも、 Metridia lo nga由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼの遺伝子を 铸型として、 PCR産物を与えることが可能な混合プライマーの設計を試みた。
[0024] 図 6に示すように、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaussia princeps由 来のルシフェラーゼのアミノ酸配列間で、相互にァラインした際、アミノ酸残基数 8以 上にわたり、同一の部分アミノ酸配列を有する領域を探索すると、合計 4箇所が見出 された。この 4箇所の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を参照し、 Metridia lo nga由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼをコードする mRNAカゝら作製される cDNAを铸型として、それぞれ対応する PCR増幅産物が一 種ずつ得られるように、上流側混合プライマー二種と、下流側混合プライマー二種を 設計する。すなわち、各混合プライマーは、 cDNAの塩基配列上、その設計の基礎 となる領域とはハイブリツダイズ可能である力 それ以外の領域にミスフィット 'ハイプリ ッダイズした際、その混合プライマーの 3'末端カゝら DNA鎖の伸長が困難であるよう に、各混合プライマーの塩基配列を選択した。 [0025] 具体的には、以下に示す、上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二 種の塩基配列を選択した。
[0026] 上流側混合プライマー
White luc UP1 (26 mer: 16種の混合プライマー）
5，一 GGC TGC ACY AGG GGA TGY CTK ATM TC一 3'
(Y=T, C ;K=G, T;M=A, C)
White luc UP2 (23 mer: 16種の混合プライマー）
5，— GCT ATT GTT GAY ATY CCY GAR AT— 3'
(Y=T, C ;R=G, A)
下流側混合プライマー
White luc LP2 (26 mer: 16種の混合プライマー）
5，— TC AAG TTG WTC AAT RAA YTG YTC CAT— 3'
(W=A, T;R=G, A;Y=T, C)
White luc LP1 (23 mer: 12種の混合プライマー）
5 '-AC ATT GGC AAG ACC YTT VAG RCA— 3'
(Y=T, C ;V=A, G, C ;R=G, A)
後述する Metridia pacifica由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クローニン グ工程においては、 mRNAカゝら調製される cDNAを铸型として、前記上流側混合プ ライマー二種と下流側混合プライマー二種とを組み合わせた、計 4種の PCR用プライ マー対について PCR反応を行った際、全てのプライマー対に対して、 PCR増幅産物 を与えるものを選択した。すなわち、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gauss ia princeps由来のルシフェラーゼの遺伝子と、少なくとも、 4箇所において、極めて 高い相同的な塩基配列を有する、 Metridia pacifica由来のタンパク質をコードす る遺伝子を選択した。さら〖こ、改めて、 mRNAから cDNAを調製し、クローニングを進 めた結果、 Metridia longa由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシ フェラーゼの遺伝子と、少なくとも、 4箇所において、極めて高い相同的な塩基配列 を有する、 Metridia pacifica由来のタンパク質をコードする遺伝子として、二種が 選択された。その二種の遺伝子は、 Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ二種 をコードしていること、また、動物細胞中において、それら遺伝子から組換え発現され るタンパク質二種は、ともに、分泌型ルシフェラーゼであることを検証した。
[0027] 具体的には、 Metridia pacifica由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子由来の ルシフェラーゼをコードする遺伝子として、下記の二種がクローユングされた。
[0028] Metridia pacifica由来 lucif erase 1の mRNAに対応する cDNAの塩基配列：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC
48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 84 M M E I Q V L F A L I C
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 120 F A L V Q A N P T E N K
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 156 D D I D I V G V E G K F
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 192 G T T D L E T D L F T I
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 228 V E D M N V I S R D T N
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 264 L A N S D A D R G K M P
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 G K K L P L E V L I E M
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 336 E A N A R K A G C T R G
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 372 C L I C L S K I K C T A
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 408 K M K V Y I P G R C H D
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 444 Y G G D K K T G Q A G I
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 480
V G A I V D I P E I S G
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 516 F K E L G P M E Q F I A
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 552 Q V D L C A D C T T G C
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 588 L K G L A N V K C S A L
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 624 L K K W L P D R C A S F
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 660
A D K I Q S E V D N I K GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 681
G L A G D R *
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA
731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA
781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG
831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG 867
Metridia pacifica由来 lucif erase 2の mRNAに対応する cDNAの塩基配列： GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA 26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 62
M G V K L I F A V V C V
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 98 A A A Q A A T I N E N F GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 134 E D I D L V A I G G S F
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 170 A L D V D A N R G G H G
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 206 G H P G K K M P K E V L
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 242 V E M E A N A K R A G C
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 278 H R G C L I C L S H I K
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 314 C T K K M K K F I P G R
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 350 C H S Y E G D K D S A Q
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 386 G G I G E E I V D M P E
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 422 I P G F K D K E P M D Q
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 458 F I A Q V D L C V D C T
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 494 T G C L K G L A N V H C
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 530 S D L L K K W L P S R C
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 566 K T F A S K I Q S Q V D
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 596 T I K G L A G D R * GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT 646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA
696
746
AAAAAAA 753
上に示す塩基配列中には、一次選択に利用した、上流側混合プライマー; White luc UP1と White luc UP2、下流側混合プライマー； White luc LP2と White luc LP1がそれぞれハイブリッドする部位力 下線により示されている。
本発明にかかる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質二種； lucif erase 1と luciferase 2と、 Metridinidae (メトリディニダ工科)に属する、 Metridia longa由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼとの間で、 その遺伝子上にコードされている完全長のアミノ酸配列を対比すると、図 5に示され る通り、 luciferase 1と Metridia longa由来のノレシフェラーゼ、 luciferase 2と Ga ussia princeps由来のルシフェラーゼの間で、同一性を示すアミノ酸残基、相同的 なアミノ酸残基を含めると、相当に高い相同性が見出されている。特には、 luciferas e 1の 65番目の Asp以降と Metridia longa由来ルシフェラーゼの 74番目の Asp 以降、また、 luciferase 2の 番目の Asp以降と Gaussia princeps由来ルシフエ ラーゼの 40番目の Asp以降は、極めて高い相同性を示している。すなわち、本発明 にかかる Metridia pacifica由来のノレシフェラーゼ二種は、 Metridia longa由来 のルシフェラーゼと Gaussia princeps由来のルシフェラーゼと同種の起源を有する が、進化に伴い、部分的にアミノ酸配列の相違を有する二系統のルシフェラーゼカ Metridia pacifica中では、共存的に発現されていることが推定される。加えて、 luc iferase 1の 22番目の Gluより N末側と Metridia longa由来ルシフェラーゼの 21 番目の Gluより N末側、また、 luciferase 2の 23番目の Asnより N末側と Gaussia p rinceps由来ルシフェラーゼの 23番目の Asnより N末側は、高い相同性を示している 。この N末端側は、分泌に際して、利用されるシグナル 'ペプチドを含む領域であり、 Metridia longa由来ルシフェラーゼにお!/、ては、 VQA-KSにシグナルぺプチダ ーゼによる切断部位が推定されており、 luciferase 1においては、対応する部位は 、 VQA— NPであり、また、 Gaussia princeps由来ルシフェラーゼにおいては、 AE A— KP、 luciferase 1においては、 AQA— ATが相当する可能性がある。相同性を 考慮すると、本発明に力かる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ二種も、哺乳 動物細胞内において、組換え発現した際、疎水性アミノ酸に富む N末端のシグナル- ペプチドを利用することで、高 、効率で宿主細胞外へ分泌されて 、る。
なお、本発明にかかる Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質二種 ； luciferase 1と luciferase 2をそれぞれコードする遺伝子（cDNA)を、プラスミド' ベクター： pcDNA3. 2ZV5— GWZD— TOPO中のマルチ ·クロー-ング ·サイト中 に挿入した組換え発現用ベクター二種について、ブタペスト条約に基づき、独立行 政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6、郵便番号 305— 8566)に、 luciferase 1の組換え発現用 ベクター： pMpLucl— 10は、受託番号 FERM BP— 10179として、また、 luciferas e 2の組換え発現用ベクター： pMpLuc2— 7は、受託番号 FERM BP— 10178とし て、それぞれ、国際寄託 (平成 16年 12月 6日付け）がなされている。
本発明にかかる M. pacifica由来ルシフェラーゼを、レポータ一'タンパク質として 、哺乳動物細胞内で組換え発現する際には、甲殻類 (Ostmcoda)に属するゥミホタ ル (Cypridina： Vargula hilgendorfi)由来のルシフェラーゼゃ、十脚類 (Decapo da)に属するヒォトシエビ（Oplophorus gracilorostris)由来のルシフェラーゼに適 用された発現系を利用し、そのコード領域を置換する手法が利用可能である。また、 哺乳動物細胞以外に、従来のルシフェラーゼの組換え発現が可能な、ノ クテリア、酵 母、真菌、昆虫細胞などの宿主において、同様に M. pacifica由来ルシフヱラーゼ を組換え発現することが可能である。これら組換え発現に利用する際、 M. pacific a由来ルシフェラーゼをコードする遺伝子は、必要に応じて、宿主において使用頻度 の高いコドンへと変換した上で発現ベクターに挿入することが好ましい。勿論、コドン 変換に伴い、その遺伝子によりコードされるアミノ酸配列自体には、変異が導入され ない。発現ベクターへの挿入に際し、予めコドン変換された、コード遺伝子は、両端 の非コード領域において制限酵素消化し、断片化する。この制限酵素消化を行う際 、適当な制限酵素サイトが存在しない場合には、部位特異的変異導入法によって、 非コード領域の塩基配列に変異導入して、所望の制限酵素サイトを導入することもで きる。
実施例
[0029] 以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。ここに示す具体例は、本 発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限 定されるものではない。
(甲殻類プランクトン由来の新規なルシフェラーゼの採取）
本発明者らは、 日本の近海力 採取される、多数種の動物性プランクトンの内から、 セレンテラジン（coelenterazine)を発光基質とするルシフェラーゼを産生する甲殻 類プランクトンを探索した。特には、該プランクトン体表の外骨格（甲皮）に存在する 殻腺から、その体外へと分泌される、体外分泌型ルシフェラーゼを産生する甲殻類 プランクトンを探索した。
[0030] その探索過程において、 日本海、富山湾沖合い約 2, 600m,水深 321m (海面下 321m、海底面上約 5m)で採取された海洋深層水中に存在する動物性プランクトン 多数種を詳細に調査したところ、白色光照射下において顕微鏡観察すると、白色に 見える Copepoda (橈脚類)の一種が、紫外線照射下、顕微鏡観察すると、図 1に示 す外観を示し、その殻腺から体外へと分泌される、体外分泌型ルシフェラーゼを産生 することを見出した。該体外分泌型ルシフェラーゼの産生能を有する Copepodaにつ いて、詳細な分類学上の同定を行い、 Metazoa (動物界）、 Arthropoda (節足動物 門）、 Crustacea (甲殻亜門）、 Maxillopoda (ァゴァシ綱）、 Copepoda (カイァシ亜 綱）、 Neocopepoda (カイァシ下網）、 Gymnoplea (前脚類）、 Calanoida (力ラヌス 目 )、 Metridinidae (メトリディニダ工科）、 Metridia (メトリディア属）に属する、 Metri dia pacifica (メトリディア パシフィカ）であると結論された。
(Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝子クロー ユング用の混合プライマーの設計）
Metridia pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝子クロー- ングに先立ち、そのクローユング過程に利用する混合プライマーの設計を行う。
[0031] M. pacificaは、体外分泌型ルシフェラーゼを産生することが、確認されたので、 同じぐ Metridia (メトリディア属）に属する海洋プランクトンにおいて報告されている、 既知の体外分泌型ルシフェラーゼを検索したところ、 Metridia longa由来のルシフ エラーゼ（GenBankTM/EBI accession number AY364164 ;J. Biol. Ch em. Vol. 279, No. 5 pp. 3212-3217 (2004) )力 S見出された。さらに、 Met ridinidae (メトリディニダ工科）に属する甲殻類プランクトン由来のルシフェラーゼの 報告例を検索したところ、 Gaussia属に属する、 Gaussia princeps由来のルシフエ ラーゼ（GenBank /EBI accession number AY015993)と、 Pleuromam ma属に属する、 Pleuromamma sp. CSG— 2001由来のルシフェラーゼ（GenBa nk™/EBI accession number AY015993)力見出された。
[0032] 検索された Metridinidae (メトリディニダ工科）に属する甲殻類プランクトン由来の ルシフェラーゼ三種のアミノ酸配列間における対比を行った力 三種の間において、 高度に保存されている「共通的配列」は見出されな力つた。次に、 Metridia longa 由来のルシフェラーゼと他の二種のアミノ酸配列間で、個々に対比を行ったところ、 Metridia longa由来のノレシフェラー ITと Gaussia princeps由来のノレシフェラーセ との間において、相同性の高い領域が存在することを見出した。
[0033] この結果は、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaussia princeps由来の ルシフェラーゼ力 進化的に同じ起源を有する可能性を示唆している。 M. pacific a由来のルシフェラーゼカ 前記二種のルシフェラーゼと、進化的に同じ起源を有す るか否かは、確認できないものの、その可能性を仮定して、少なくとも、 Metridia lo nga由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼの遺伝子を 铸型として、 PCR産物を与えることが可能な混合プライマーの設計を試みた。
[0034] 図 6に示すように、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaussia princeps由 来のルシフェラーゼのアミノ酸配列間で、相互にァラインした際、アミノ酸残基数 8以 上にわたり、同一の部分アミノ酸配列を有する領域を探索すると、合計 4箇所が見出 された。この 4箇所の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を参照し、 Metridia lo nga由来のノレシフェラーゼと Gaussia princeps由来のノレシフェラーゼをコードする mRNAカゝら作製される cDNAを铸型として、それぞれ対応する PCR増幅産物が一 種ずつ得られるように、上流側混合プライマー二種と、下流側混合プライマー二種を 設計する。すなわち、各混合プライマーは、 cDNAの塩基配列上、その設計の基礎 となる領域とはハイブリツダイズ可能である力 それ以外の領域にミスフィット 'ハイプリ ッダイズした際、その混合プライマーの 3'末端カゝら DNA鎖の伸長が困難であるよう に、各混合プライマーの塩基配列を選択した。
[0035] 具体的には、以下に示す、上流側混合プライマー二種と下流側混合プライマー二 種の塩基配列を選択した。
[0036] 上流側混合プライマー
White luc UP1 (26 mer: 16種の混合プライマー）
5，一 GGC TGC ACY AGG GGA TGY CTK ATM TC一 3'
(Y=T, C ;K=G, T;M=A, C)
White luc UP2 (23 mer: 16種の混合プライマー）
5，— GCT ATT GTT GAY ATY CCY GAR AT— 3'
(Y=T, C ;R=G, A)
下流側混合プライマー
White luc LP2 (26 mer: 16種の混合プライマー）
5，— TC AAG TTG WTC AAT RAA YTG YTC CAT— 3'
(W=A, T;R=G, A;Y=T, C)
White luc LP1 (23 mer: 12種の混合プライマー）
5 '-AC ATT GGC AAG ACC YTT VAG RCA— 3'
(Y=T, C ;V=A, G, C ;R=G, A)
下記の Metridia pacifica由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クロー-ング 工程においては、 mRNAから調製される cDNAを铸型として、前記上流側混合ブラ イマ一二種と下流側混合プライマー二種とを組み合わせた、計 4種の PCR用プライ マー対について PCR反応を行った際、全てのプライマー対に対して、 PCR増幅産物 を与えるものを選択する。すなわち、 Metridia longa由来のルシフェラーゼと Gaus sia princeps由来のルシフェラーゼの遺伝子と、少なくとも、 4箇所において、極め て高い相同的な塩基配列を有する、 Metridia pacifica由来のタンパク質をコード する遺伝子を選択する。
(Metridia pacifica由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子クロー-ング） total RNAの採取
サンプリングされた海洋水より、回収された Copepoda (M. pacifica)の 400個体 について、水きりした後、合計 4mLの TRIZOL試薬中に懸濁し、 80°Cで凍結、保 存する。
[0037] 凍結保存した Copepoda個体を室温で解凍し、この懸濁液を、 15mL容テフロン製 ホモジナイザー用容器に移し、 10度破砕機にかけ、外殻ならびに体内細胞の破砕を 行う。次いで、 5mL容シリンジと 22G注射針とを利用し、 10回、圧送して、前記細胞 破砕物を該注射針内を通過させる処理を施し、細胞破砕物の均一化を行う。
[0038] 得られた均一破砕物を 15mL容ファルコン.チューブに移し、 TRIZOL試薬 4mL当 たり、 0. 8mLのクロロフオルムをカ卩えて、 15秒間よくシェイクする。その後、室温で、 2 一 3分間静置して、相分離を行う。更に、 2— 8°Cにおいて、 15分間、遠心（12, 000 X g)する。上清（水相）約 4mLを、別の 15mL容ファルコン 'チューブに回収する。
[0039] 回収される水相に対して、 TRIZOL試薬 4mL当たり、 2mLのイソプロパノールを添 加し、よく混合する。室温で、 10分間保持して、アルコール沈澱を行う。その後、 2— 8°Cにおいて、 10分間、遠心（12, OOO X g)する。上清を除去し、ペレット（アルコー ル沈澱画分)を回収する。
[0040] ペレット（アルコール沈澱画分）に対して、 TRIZOL試薬 4mL当たり、 75%エタノー ル 4mLをカ卩え、ヴオルテックスにかけ、分散'混合する。分散'混合液を、 2— 8°Cに おいて、 10分間、遠心（11, OOOrpm)する。上清を除き、ペレット（アルコール沈澱 画分)を回収する。この洗浄を二度繰り返す。
[0041] 洗浄後、該 RNA沈澱ペレットを、 37°Cに、 10分間放置して、残留する溶媒を蒸散 させ、乾燥する。乾燥済み RNA沈澱ペレットに、 RNaseの混入のない水 210 /z Lを カロえて、 10— 20分間静置して、再溶解し、 total RNA試料液を調製する。
[0042] 調製された total RNA試料液 210 μ から、一部溶解液 (5 μ L)を採取して、波 長 260nm、 280nm、 320nmの吸光度 OD 、 OD 、 OD (バックグラウンド吸収 )を測定する。その結果に基づき、定法に従って、吸光度 OD から RNA含有濃度
260
を算定する。
[0043] 表 1に、得られた total RNA試料に関する、 RNA含有濃度の評価結果を示す。
[0044] [表 1] 表 1
Figure imgf000040_0001
polv (A) +RNA (mRNA)の精製
上で調製した、精製済みの total RNA溶液 (RNA含有濃度 0. 872 g/ L) 2 05 μ L力 、含まれている poly (A) + RNA (mRNA)を市販の精製キット； Oligotex — dT30 く SUPER > mRNA Purification Kit (TAKARA製）を用いて分離、 精製する。
[0045] 前記 total RNA溶液 200 Lに、同キットに添付のバイブリダィゼーシヨン'バッフ ァー： 2 X Binding buffer 200 μ Lをカロえ、合計 400 μ Lの液を均一化する。この R NA溶液に、 Oligotex— dT30の分散液 20 Lを添カ卩し、よく混合する。チューブ中 の液を 70°Cに加熱し、 3分間保持し、引き続き、室温で 10分間放冷して、 poly (A) +RNA (mRNA)の poly (A)末端と、 Oligotex— dT30の Oligo— dTプローブ部との バイブリダィゼーシヨンを行う。 5分間、遠心（15, OOOrpm)して、 Oligotex— dT30を 沈澱画分として分離する。 Oligotex— dT30とバイブリダィゼーシヨンして!/、な!/ヽ RN A成分を含む、上清を除去する。
[0046] 沈澱画分を、同キットに添付の洗浄用バッファー 350 L中に分散し、遠心力ラム 用チューブに移す。 30秒間、遠心（15, OOOrpm)して、上清を除去する。さらに、同 量の洗浄用バッファーを用いて、同じ洗浄操作を行う。
[0047] 二度の洗浄を終えた、沈澱画分に、予め 70°Cに加熱した、同キットに添付の DEP C water (水溶液） 50 μ Lを加えて、この混合物を別の遠心力ラム用チューブに移 す。 30秒間、遠心（15, OOOrpm)して、 Oligotex— dT30のプローブ上から遊離され た poly (A) +RNA (mRNA)を含む上清を回収する。沈澱画分に、再度、予め 70°C に加熱した、 DEPC— water (水溶液） 50 μ Lをカ卩えて、プローブ上からの遊離操作 を行い、上清を回収する。回収された上清を合わせ、合計 100 /z Lの精製済み mRN Aを含む溶液とする。
[0048] この精製済み mRNAを含む溶液に、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 10 Lと、 100 %イソプロパノール 100 Lを添加し、よく混合する。その後、 20°C、 10分間放置 し、含有される mRNAをアルコール沈澱させる。 30分間、遠心（14, OOOrpm)して、 析出した mRNAを沈澱画分に集め、上清を除去する。更に、析出した mRNAの沈 澱画分に、 75%エタノール lmLをカ卩え、よく混合する。 5分間、遠心（14, OOOrpm) して、析出した mRNAの沈澱画分を分離し、上清を除去する。得られる精製済みの mRNA析出物は、 DEPC— water (水溶液） 11 μ L中に再溶解する。
[0049] 精製済みの mRNA試料溶液 11 μ から、一部評価用サンプル (0. 5 L)を取り、 RNA含有濃度を評価した。表 2に、得られた精製済み mRNA試料に関する、 RNA 含有濃度の評価結果を示す。
[0050] [表 2] 表 2
Figure imgf000041_0001
mRNAを鏡型 した cDNAの合成
市販の cDNA合成キットを用いて、精製済み mRNAを铸型として、逆転写酵素反 応を利用して、 cDNAを合成する。
[0051] 先ず、下記表 3に組成を示す、精製済みの mRNA試料溶液と、同キット添付の 5' CDS (cDNA synthesis) primerゝ SMART II oligoを含有する、 5，CDS pri mer添カ卩 mRNA溶液（RNAZ5，一 Ready Primer mix)、ならびに、精製済みの mRNA試料溶液と、同キット添付の 3' CDS (cDNA synthesis) primerを含有す る、 3， CDS primer添カ卩 mRNA溶液（RNAZ3， -Ready Primer mix)を予め 調製する。
[0052] [表 3] 表 3
RNA/ 5 ' -R e a d y P r i me r m i xの組成
Figure imgf000042_0001
RNA/3 ' -R e a d y P r i me r m i xの組成
Figure imgf000042_0002
各成分を混合し、 65°Cに 5分間保持した後、得られる混合液を 1分間、氷冷する。 前記加熱により、混合液中含有される mRNAは、いずれも一本鎖 RNA分子に変換 される。
[0053] なお、前記 3 'CDS primer (3 '-Ready Primer)の塩基配列は、
3—Ready Primer (5 cmer)
TTTTTTTTTT TTTTTVN-3'
(なお、前記配列中、 V:A, G, C、 N:A, C, G, T を意味する）
であり、 mRNAの poly (A)末端と dT30部分において、ハイブリダィズする。
5， Ready cDNA合成、ならびに 3， Ready cDNA合成は、予め調製される 5: CDS primer添カ卩 mRNA溶液（RNAZ5，— Ready Primer mix)、または、 3， C DS primer添カ卩 mRNA溶液（RNAZ3，— Ready Primer mix)を利用し、下記 表 4に組成を示す逆転写反応液を調製して行う。
[0054] [表 4] 表 4
逆転写反応液の組成
Figure imgf000043_0001
cDNA合成は、同キット添付の逆転写酵素： Superscript III を利用し、同反応 液を、 50°Cで、 1時間インキュベーションし、その後、 70°Cで、 15分間インキュベーシ ヨンすることにより、铸型の mRNA鎖とハイブリダィズしている、プライマーから DNA 鎖の伸長反応を行う。反応終了後、合成された cDNAを含む反応液は、 - 20°Cで保 存する。
RT— PCR反]^による、 cDNA断片の取得
M. pacifica由来の mRNAを铸型として、調製される 3， Ready cDNAから、 下記表 5に示す 4組のプライマー対を利用して、 PCR増幅産物を調製する。
[0055] [表 5]
表 5
R T— P C R反応用のプライマー対
Figure imgf000043_0002
反応液組成と、 PCR増幅反応の条件を、表 6に示す。
[0056] [表 6] 表 6
PCR反応の温度条件：
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
PCR反応液の組成
DNA p o l yme r a s e : Adv an t a ge 2
Figure imgf000044_0003
各 20 /zLの反応液量で PCR反応を実施した後、 5 Lの反応液を採取し、 1%ァガ ロース ·ゲル上で泳動し、 PCR増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。 各プライマー対を使用した際、確認された PCR増幅産物の塩基数を表 7に示す。
[表 7]
表 7
RT-PC R反応用のプライマー対と、 その PCR増幅産物
Figure imgf000044_0004
以上の結果から、 M. pacifica由来の mRNA中に、 M. longa, G. princep 由来のルシフェラーゼと類似する部分アミノ酸配列をコードする部分的な塩基配列を 有するものが存在して 、ることが確認される。
3 'RACE反]^産 、ならびに 産物の取得 M. pacifica由来の mRNAに基づき調製される、 3， Ready cDNA、ならびに 5' Ready cDNAを铸型として、下記表 8に示す各 2組のプライマー対を利用して 、それぞれ、 3' RACE反応産物、ならびに 5 'RACE反応産物を調製する。
[表 8] 表 8
3 ' RAC E反応用のプライマー対
Figure imgf000045_0001
反応液組成と、 PCR増幅反応の条件を、表 9に示す。
[表 9]
表 9
PCR反応の温度条件：
使用 fe置： M a s t e r c y c l e r G r a d i e n t te p p e n d o r f )
Figure imgf000045_0002
PCR反応液の組成
D A p o l yme r a s e : Ad v a n t a g e 2
組成 原液の濃度 配合量 L 最終濃度
H20 9.6
lOXAdvan 2 Buffer 10X 2.0 1 X
dNTP 2 mM 2.0 0.2 mM
Advan 2 Pol 50 U//iL 0.4 1 U//iL
GS Primer 10 M 2.0 1 M
Upstream Primer 10 μ 2.0 1 /xM
cDNA 10 dil 2.0 1 dil
Total 20.0 各 20 /zLの反応液量で PCR反応を実施した後、 5 Lの反応液を採取し、 1%ァガ ロース ·ゲル上で泳動し、 PCR増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。 各プライマー対を使用した際、確認された増幅産物の塩基数を表 10に示す。
[0060] [表 10] 表 10
PCR反応用のプライマー対と、 その 3' RACE反応産物、 5' RACE反応産物
Figure imgf000046_0001
3 ' RACE反応産物、ならびに 5 ' RACE反]^産物を儘型とする Nested' PCR産物 の B ^晷
3 'RACE反応産物、ならびに 5 'RACE反応産物を铸型として、下記表 11に示す 各プライマー対を利用して、それぞれ、 Nested 'PCR産物を調製する。
[表 11] 表 1 1
3 ' RACE反応産物に対する、 Ne s t e d · PCR反応用のプライマー対 銹型 c DNA : 3 ' RACE反応産物 （プライマー対： Setl UP卜 3' Readyの産物)
Figure imgf000046_0002
反応液組成と、 PCR増幅反応の条件を、表 12に示す。
[0062] [表 12] 表 12
PCR反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r
Figure imgf000047_0001
PCR反応液の組成
DNA po l yme r a s e : Adv an t a ge 2
Figure imgf000047_0002
各 20 /zLの反応液量で PCR反応を実施した後、 5 Lの反応液を採取し、 1%ァガ ロース ·ゲル上で泳動し、 PCR増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。 前記 3 'RACE反応産物を铸型として、調製される Nested 'PCR産物を一旦、クロ 一-ング.ベクター pCR2.1 TOPO中に挿入し、 Chemical competent cell T OP10株へ導入し、形質転換株を選択する。プラスミド 'ベクターの宿主大腸菌へ導 入は、以下の手順で実施した。
宿主大腸菌に利用する、 TOP10株は、凍結保存されている Competent Cellを、 氷温で解凍する。 cDNA挿入プラスミド 'ベクター溶液 3 μ Lを、解凍された宿主大 腸菌の Competent Cell懸濁液 50 μ Lに加える。次いで、氷上で 10分間保持し た後、 42°C、 30秒加温し、再び、氷上に戻す。ベクター注入処理後、宿主大腸菌を 懸濁した液 53/zLに、 SOC培地 100 Lを加えて、 37°C、 10分間振盪培養する その後、培養液に含まれる形質転 ·を、クローユング 'ベクター PCR2.1 TOP Oに由来する選択マーカーを利用して、選択する。選択される形質転換株中から、 c
DNA挿入プラスミド 'ベクターを保持するものを選択する。
撰別クローン中に導入されて 、るプラスミド ·ベクターの複製、精製
選別された 4つのクローンから、以下の手順で、導入されているプラスミド 'ベクター の複製、精製を行う。
[0064] 宿主大腸菌 TOP10株を用いて、 cDNAを導入した系において、選別された 4つ のコロニー（クローン）を、それぞれ 10mLの培地 LBZCarbenicillin中に懸濁し、 37°C、 16時間培養を行った。培養液を、 10分間、遠心（5000 X g)して、細胞を分 取した。
[0065] 分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット： QIAGEN plasmid purificatio n kit (QIAGEN製)を利用して、プラスミドを分離、精製する。分取した細胞に、同 精製キットに添付の P1液 0. 25mLを添加し、ヴオルテックスにかけて、よく分散させ る。この細胞分散液に、添付の P2液 0. 25mLを添カ卩し、混和する。室温（20°C)に 、 5分間静置する。次いで、添付の N3液 0. 35mLを添カ卩し、混和する。溶菌処理 後、 15分間、 4°Cで遠心（11, OOOrpm)し、プラスミド DNAを可溶性画分 (上清）を 分離、回収する。
[0066] プラスミド DNAを含む可溶性画分 (上清）を、同精製キットの QIAprepカラムにかけ る。 4°Cで遠心（15, OOOrpm)し、液層を除去する。ノ ッファー PB 0. 5mLをカ卩えて 、洗浄し、引き続き、バッファー PE 0. 75mLをカ卩えて、洗浄する。最終的に、 1分間 、 4°Cで遠心（15, OOOrpm)し、洗浄液を除去する。精製キットの QIAprepに吸着さ れている、プラスミドは、ノ ッファー EB 30 Lにより、溶出させ、回収する。この精製 済みプラスミドを含む液 のうち、 をとり、蒸留水 99 /z Lをカロえて、 100 倍希釈液とする。
[0067] 表 13に、各クローンについて、精製済みプラスミドを含む液中に含まれる DNA濃 度を評価した結果を示す。
[0068] [表 13] 表 1 3
Figure imgf000049_0001
撰 クローン中の cDNA断片（Nested 'PCR産物）の塩某配列解析
前記 4種のクローンが保持してレ、るプラスミド ·ベクター中に揷入されてレ、る、 cDNA 部分 (Nested 'PCR産物）について、以下の手順に従って、その塩基配列解析用の 核酸鎖伸長反応産物を調製する。
[0069] 選別クローンから回収、精製したプラスミド ·ベクターを含む液につ!/、て、その DNA 濃度を 250ngZ Lとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークェンス用 D NA試料調製キット： BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready Reactio n Kit with AmpliTaq polymeraseにより、この精製済みプラスミド 'ベクターを 铸型として、塩基配列解析用の試料を、クローユング 'ベクター PCR2. 1 TOPOに 由来する部位に対する二種プライマー； M13 sense M4, M13 RVをシークェン ス ·プライマーとして利用し、プラスミド ·ベクター中に揷入されてレ、る cDNAを含む領 域から調製する。表 14に、用いた DNA鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液 組成を示す。
[0070] [表 14]
表 14
反応液組成
Figure imgf000050_0001
DNA鎖伸長反応の温度条件：
用装 li： Ma s t e r c y c l e r G r ad i e n t
Figure imgf000050_0002
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の 0. 5mL容チューブに移す。試 料溶液 5 当たり、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 0. 5 ^L、 95%エタノーノレ 12. 5 Lの比率で混合した液を、別途、 1. 5mL容チューブに予め用意する。この 1. 5 mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷 下に、 10分間静置し、含まれる DNA断片をエタノール沈澱 (析出）させる。 20分間、 遠心（14, OOOrpm)し、析出した DNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、 125 μ Lの 70%エタノールをカ卩え、析出 DNA断片をリンスする。再び、 5分間、遠心 (14, OOOrpm)し、析出 DNA断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出 D NA断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料 DAN断片は、 Template suppressor Reagent (TSR)中 に再分散する。ヴオルテックスにかけて、混合した後、遠心して液雄める。 95°C、 2 分間加熱し、一本鎖 DNAに分離し、氷冷する。ー且、ヴオルテックスにかけた後、再 度遠心して、伸長された一本鎖 DNAを含む液を集める。その後、解析用試料 DAN 断片（伸長された一本鎖 DNA)は、市販のシークェンス装置: ABI PRISM 3100
Genetic Analyzerに力け、塩基配列解析を行う。 [0071] 5'末端側からの配列解析結果と、 3'末端側からの配列解析結果とを総合し、挿入 されて 、る cDNA断片（Nested 'PCR産物）の塩基配列を決定する。
3， RACE反応産物を铸型として調製される、前記 Nested · PCR産物の解析された 塩基配列に基づき、下記の塩基配列を有する二種の下流側プライマー: White luc LP3, White luc LP4を設計した。
[0072] White luc LP3 : (30mer)
5， -AACGATCTCCAGCCAAGCCCTTGATGTTGT-3 '
White luc LP4 : (30mer)
5， -TCAGCGCAAAGATCAACTTGAGCAATGAAC-3 '
5 ' RACE ]^産物の再取得
M. pacifica由来の mRNAに基づき、 3' Ready cDNA、ならびに 5' Ready cDNAを再度調製した上で、 5， Ready cDNAを铸型として、前記二種の下流 側プライマー： White luc LP 3， White luc LP4を利用して、新たに 5 'RACE反 応産物を調製する。
まず、 ト.記の total RNAの樑取、 Polv(A) +RN A (mRNA)の精製の丰順に従 つて、別途、 M. pacificaの 900個体から、 total RNAを採取し、精製済み mRN A試料を調製する。採取された total RNA、ならびに、精製済み mRNA試料中に 含有される RNA量を定量した結果を、表 15に示す。
[0073] [表 15]
¾ 1 5
t o t a l R N A試料
Figure imgf000051_0001
次いで、 ト.記の mRNA 錄¾ ^した cDNAの合成の丰順に従って、前記精製済み mRNA試料から、含有される精製済み mRNAを铸型として、逆転写酵素反応を利 用して、 cDNAを合成する。
下記表 16に組成を示す、 5， CDS primer添加 mRNA溶液 (RNAZ5， -Ready Primer mix)、ならびに、 3' CDS primer添カ卩 mRNA溶液 (RNAZ3，一 Ready Primer mix)を予め調 する。
[表 16] 表 1 6
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
RNA/3 ' -Re ady P r ime r m i xの組成
Figure imgf000052_0003
各成分を混合し、 65°Cに 5分間保持した後、得られる混合液を 1分間、氷冷する。 前記加熱により、混合液中含有される mRNAは、いずれも一本鎖 RNA分子に変換 される。
5， Ready cDNA合成、ならびに 3' Ready cDNA合成は、予め調製される 5' CDS primer添加 mRN A溶液（RNAZ 5，一 Ready Primer mix)、または、 3， C DS primer添カ卩 mRNA溶液（RNA/3 '—Ready Primer mix)を利用し、下記 表 17に組成を示す逆転写反応液を調製して行う。
[表 17] 表 1 Ί
逆転写反応液の組成
Figure imgf000053_0001
cDNA合成は、同キット添付の逆転写酵素： Super Script III を利用し、同反応 液を、 50°Cで、 1時間インキュベーションし、さらに、 70°Cで、 15分間インキュベーシ ヨンする処理を行って、铸型の mRNA鎖とハイブリダィズしている、プライマーから D NA鎖の伸長反応を行う。反応終了後、合成された cDNAを含む反応液は、 -20°C で保存する。
M. pacifica由来の mRNAに基づき、新たに調製される 5' Ready cDNAを铸 型として、下記表 18に示す各 2組のプライマー対を利用して、それぞれ、 5 'RACE 反応産物を調製する。
[表 18]
表 18
5 ' RACE反応用のプライマー対
铸型 cDNA : 5 ' Re ady cDNA
Figure imgf000053_0002
反応液組成と、 PCR増幅反応の条件を、表 19に示す。
[表 19] 表 1 9
PCR反応の温度条件：
fe用装 ： Ma s t e r c y c l e r G r a d i e n t (e p p e n d o r f)
Figure imgf000054_0001
PCR反応液の組成
DNA p o 1 yme
Figure imgf000054_0002
各 25 μ Lの反応液量で PCR反応を実施した後、 5 μ Lの反応液を採取し、 1%ァガ ロース.ゲル上で泳動し、 PCR増幅産物の有無、ならびに、その分子量を確認する。 各プライマー対を使用した際、確認された増幅産物の塩基数を表 20に示す。
[表 20] 表 20
Figure imgf000054_0003
前記 5， RACE反応産物をー且、クロー-ング ·ベクター pCR4Blunt— TOPO (Invi trogen 製）中に挿入し、得られるベクターを Chemical competent cell TOPI 0株へ導入し、形質転 ·を選択する。プラスミド 'ベクターの宿主大腸菌へ導入は、 上で述べた手順に準じて実施した。
その後、培養液に含まれる形質転 ·は、クローユング 'ベクター pCR4Blunt— T OPOに由来する選択マーカー (薬剤耐性遺伝子)を利用して、薬剤添加培地上で 選択する。選択される形質転換株中から、コロニー PCR法を利用して、 cDNA挿入 プラスミド ·ベクターを保持するものを選択する。
コロニー PCR法による、 cDNA揷入プラスミド 'ベクター保持クローンの撰別 コロニー PCR法を利用して、各コロニーを形成する形質転換株中から採取される、 プラスミド ·ベクター中における cDNA断片挿入の有無を以下の手順で確認する。 colony RCRは、
フォワード 'プライマーとして、 White luc UP 1 (mixed primer)、リバース 'プライ マーとして、 White luc LP2 (mixed primer)を利用して、市販の DNA合成酵素 ： KOD Dash DNA polymeraseを用いて、クローン中に含まれるベクター DNA を铸型として、 PCR増幅を行う。その際、上述するように、プライマー対; White luc UP1と White luc LP2による PCR産物として、 159bpの DNA断片が与えるクロ ーンを選択する。表 21に、用いた PCR反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示 す。
[表 21] 表 2 1
PCR反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c y c l e r (e pp e ndo r f)
Figure imgf000055_0001
反応液組成
DNA p o l yme r a s e : KOD Da s h
成分 原液の濃度 配合量 L 最終濃度
H20 5. 8
Dash Buf fer 10 x 1. 0 1 X
dNTP 2mM 1. 0 0. 2mM
KOD Da s h 2. 5 υ/ L 0. 2 0. 050U/ L
UP 1 p r ime r 10 Μ 0. 5 0. 5 M
L P 2 p r ime r 1 0 Μ 0. 5 0. 5 /iM
Colony soln. 1. 0
To t a l 1 0. 0 シャーレ上のコロニーから、無作為に 48個のコロニーを選択し、各コロニーの菌体 を の水（DDW)に懸濁した。この菌体懸濁液を 95°C、 5分間処理した。この菌 体から回収されたベクターを含む液を、反応液において、コロニー溶液として利用し た。
PCR反応の終了後、増幅産物を含む反応液 10 から、 3 Lを採取して、 2%ゲ ル上で泳動して、 cDNA断片に相当する PCR増幅産物の有無、そのサイズ範囲を 調べる。無作為に選択した 48個のコロニー中、一次スクリーングにおいて、 No.4-7 、 10、 18、 22、 24、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 36、 38の 16偶のコロニー【こお!ヽて 、予定される 189bpの PCR増幅産物が見出された。
[0080] 引き続き、一次スクリーングで選別された 16個のコロニーについて、下記表 22に示 す条件で colony RCRを行い、二次スクリーングを行う。
[0081] [表 22] 表 22
PCR反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c y c l e r (e p p e n d o r f )
Figure imgf000056_0001
反応液組成
DNA p o l yme r a s e : OD D a s h
Figure imgf000056_0002
PCR反応の終了後、増幅産物を含む反応液 10 から、 3 Lを採取して、 2%ゲ ル上で泳動して、 cDNA断片に相当する PCR増幅産物の有無、そのサイズ範囲を 調べる。一次スクリーングにおいて選別された 16個のコロニー中、 No. 4、 5、 7、 10 、 27、 29、 31、 33の 8個のコロニーにおいて、当該クローユング 'サイトに cDNA断 片が挿入されたもの相当するサイズの PCR増幅産物が明確に見出された。
撰別クローンが保持する 5 ' RACE反応産物が揷入されて 、るプラスミド ·ベクター の複製、 m
選別された 8つのクローンから、以下の手順で、 5 'RACE反応産物が挿入されてい るプラスミド 'ベクターの複製、精製を行う。
[0082] 選別された 8つのコロニー（クローン）を、それぞれ 10mLの培地 LBZCarbenicil iin中に懸濁し、 37°C、 15. 6時間培養を行った。培養液を、 10分間、遠心（5000 X g)して、細胞を分取した。
[0083] 分取した細胞から、市販のプラスミド精製キット： QIAGEN plasmid purificatio n kit (QIAGEN製)を利用して、プラスミドを分離、精製する。分取した細胞に、同 精製キットに添付の P1液 0. 25mLを添加し、ヴオルテックスにかけて、よく分散させ る。この細胞分散液に、添付の P2液 0. 25mLを添カ卩し、混和する。室温（20°C)に 、 5分間静置する。次いで、添付の N3液 0. 35mLを添カ卩し、混和する。破菌処理 後、 15分間、 4°Cで遠心（11, OOOrpm)し、プラスミド DNAを可溶性画分 (上清）を 分離、回収する。
[0084] プラスミド DNAを含む可溶性画分 (上清）を、同精製キットの QIAprepカラムにかけ る。 4°Cで遠心（15, OOOrpm)し、液層を除去する。ノ ッファー PB 0. 5mLをカ卩えて 、洗浄し、引き続き、バッファー PE 0. 75mLをカ卩えて、洗浄する。最終的に、 1分間 、 4°Cで遠心（15, OOOrpm)し、洗浄液を除去する。精製キットの QIAprepに吸着さ れている、プラスミドは、ノ ッファー EB 30 Lにより、溶出させ、回収する。この精製 済みプラスミドを含む液 のうち、 をとり、蒸留水 99 /z Lをカロえて、 100 倍希釈液とする。
[0085] 表 23に、各クローンについて、精製済みプラスミドを含む液中に含まれる DNA濃 度を評価した結果を示す。
[0086] [表 23] 表 2 3
Figure imgf000058_0001
撰別クローン中の cDNA断片（5 'RACE反応産物）の塩某配列解析
前記 8種のクローンが保持して!/ヽるプラスミド ·ベクター中に挿入されて ヽる、 cDNA 部分 (5 'RACE反応産物）について、以下の手順により、塩基配列解析用の核酸鎖 伸長反応産物を調製する。
[0087] 選別クローンから回収、精製したプラスミド ·ベクターを含む液にっ 、て、その DNA 濃度を 250ngZ Lとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークェンス用 D NA試料 製やット： BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready Reactio n Kit with AmpliTaq polymeraseにより、この精製済みプラスミド 'ベクターを 铸型として、塩基配列解析用の試料を、クローユング 'ベクター pCR4Blunt— TOPO に由来する部位に対する二種プライマー； M13 sense M4, M13 RVをシークェ ンス ·プライマーとして利用し、プラスミド ·ベクター中に挿入されて ヽる cDNAを含む 領域から調製する。表 24に、用いた DNA鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応 液組成を示す。
[0088] [表 24]
表 24
反応液組成
Figure imgf000059_0001
DNA鎖伸長反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c y c l e r G r a d i e n t
Figure imgf000059_0002
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の 0.5mL容チューブに移す。試 料溶液 5 L当たり、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 0.5 L、 95%エタノール 12. 5 /zLの比率で混合した液を、別途、 1.5mL容チューブに予め用意する。この 1.5 mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷 下に、 10分間静置し、含まれる DNA断片をエタノール沈澱 (析出）させる。 20分間、 遠心（14, OOOrpm)し、析出した DNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、 125 Lの 70%エタノールをカ卩え、析出 DNA断片をリンスする。再び、 5分間、遠心 (14, OOOrpm)し、析出 DNA断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出 D NA断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料 DAN断片は、 Template suppressor Reagent (TSR)中 に再分散する。ヴオルテックスにかけて、混合した後、遠心して液^^める。 95°C、 2 分間加熱し、伸長された一本鎖 DNAに分離し、氷冷する。ー且、ヴオルテックスにか けた後、再度遠心して、一本鎖 DNAを含む液を集める。その後、解析用試料 DAN 断片（伸長された一本鎖 DNA)は、市販のシークェンス装置： ABI PRISM 3100
Genetic Analyzerにかけ、塩基配列解析を行う。
5，末端側からの配列解析結果と、 3，末端側力ゝらの配列解析結果とを総合し、挿入 されて ヽる cDNA断片（5 ' RACE反応産物）の塩基配列を決定する。
8種のクローンについて、決定された 5 'RACE反応産物の塩基配列を相互に比較 したところ、その ORF部分にコードされる N末側アミノ酸配列が相違する二種の 5' R ACE反応産物が見出された。二種の 5 'RACE反応産物の塩基配列に基づき、それ ぞれ 5' -側の非翻訳領域部分から、下記の三種の上流側プライマー; White lucl 5，一 UP1と White lucl 5，一 UP2、および White luc2 5，一 UP1を設計した。 White lucl 5，— UP1 : (39 mer)
5， -GGAGACAACTGGATCCAAAAGGAAAGGAGCTAAATCTAC-3 '
White lucl 5，— UP2 : (29 mer)
5 ' -AAAAGGAAAGGAGCTAAATCTACAGTCTA-3 '
White luc2 5，— UP1 : (37 mer)
5， -GAGTCCAAACTGAAAGGTACTCAAAAATGGGAGTCAA-3 '
3 'RACE反]^産物の再取得
M. pacifica由来の mRNAに基づき再度調製された、 3， Ready cDNAを铸 型として、前記三種の上流側プライマー： White lucl 5'— UP1と White lucl 5 ，一 UP2、および White luc2 5'— UP 1を利用して、それぞれの上流側プライマー 力 核酸鎖の伸長がなされた、 3 'RACE反応産物を新たに調製する。
M. pacifica由来の mRNAに基づき、新たに調製される 3， Ready cDNAを铸 型として、下記表 25に示す各 2組のプライマー対を利用して、それぞれ、 3 'RACE 反応産物を調製する。
[0090] [表 25] 表 2 5
5 ' R A C E反応用のプライマー対
銬型 c D N A : 5 ' R e a d y c D N A
Figure imgf000060_0001
反応液組成と、 PCR増幅反応の条件を、表 26に示す。
[0091] [表 26] 表 26
PCR反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c yc 1 e r Gr ad i e n t (e p p e ndo r f)
Figure imgf000061_0001
PCR反応液の組成
D A po l yme r a s e : Py r ob e s t DN A p o l yme r a s e
Figure imgf000061_0002
各 25 μ Lの反応液量で PCR反応を実施した後、 5 μ Lの反応液を採取し、 1%ァガ ロース ·ゲル上で泳動し、 PCR増幅産物（3 ' RACE反応産物）の分子量を確認する。 再取得される 3 ' RACE反応産物をー且、クローニング ·ベクター pCR4Blunt— TO PO中に挿入し、得られるベクターを Chemical competent cell TOP10株へ導 入し、形質転換株を選択する。再取得される 3 'RACE反応産物がサブ'クローユング されて 、るプラスミド ·ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上記 5 ' RACE反応産物をサ ブ.クロー-ングした形質転^ ¾の作製手順に準じて、 Chemical competent eel 1を利用して実施した。
；巽 クローン巾の cDNAi^(3，RACE ]^ )の 西 R歹 II解析
選別された各クローンが保持して 、るプラスミド ·ベクター中に挿入されて 、る、再取 得される 3'RACE反応産物を含む部分を铸型として、以下の手順で塩基配列解析 用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。
選別クローンから回収、精製したプラスミド ·ベクターを含む液にっ 、て、その DNA 濃度を 70— lOOngZ Lとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークェン ス用 DNA試料調製キット： BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready R eaction Kit with AmpliTaq polymeraseにより、この精製済みプラスミド'ベタ ターを铸型として、塩基配列解析用の試料を、クローユング 'ベクター pCR4Blunt— TOPOに由来する部位に対する二種プライマー； M13 sense M4, M13 RVのう ち、 M13 RVのみをシークェンス 'プライマーとして利用し、プラスミド 'ベクター中に 挿入されている 3 'RACE反応産物を含む領域から調製する。表 27に、用いた DNA 鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す。
[表 27] 表 2 7
反応液組成
Figure imgf000062_0001
D N A鎖伸長反応の温度条件：
使用装置： M a s t e r c y c
Figure imgf000062_0002
調製された塩基配列解析用の試料の精製は、以下の手順で行う。
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の 0. 5mL容チューブに移す。試 料溶液 5 L当たり、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 0. 5 L、 95%エタノール 12. 5 /z Lの比率で混合した液を、別途、 1. 5mL容チューブに予め用意する。この 1. 5 mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷 下に、 10分間静置し、含まれる DNA断片をエタノール沈澱 (析出）させる。 20分間、 遠心（14, OOOrpm)し、析出した DNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、 125 Lの 70%エタノールをカ卩え、析出 DNA断片をリンスする。再び、 5分間、遠心 (14, OOOrpm)し、析出 DNA断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出 D NA断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料 DAN断片は、 Template suppressor Reagent (TSR)中 に再分散する。ヴオルテックスにかけて、混合した後、遠心して液^^める。 95°C、 2 分間加熱し、一本鎖 DNAに分離し、氷冷する。ー且、ヴオルテックスにかけた後、再 度遠心して、伸長された一本鎖 DNAを含む液を集める。その後、解析用試料 DAN 断片（伸長された一本鎖 DNA)は、市販のシークェンス装置： ABI PRISM 3100
Genetic Analyzerにかけ、塩基配列解析を行う。
各 10コロニーの形質転換株を選択し、前記三種の上流側プライマー: White luc 1 5，一 UP1と White lucl 5，一 UP2、および White luc 2 5，一 UP1を利用して、 それぞれの上流側プライマーから核酸鎖の伸長がなされた、 3 ' RACE反応産物に ついて、新たに解析された塩基配列を比較する。一つのクローン: White lucl 3， RACE UP l-UPM/pCR4Blunt No.10中に保持されている、上流側プライマ 一： White lucl 5'— UP1から伸長される 3 'RACE反応産物の塩基配列は、下記 のものであることが判明した。
White lucl 3 'RACE No.10 塩某配列
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC
48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 84
M M E I Q V L F A L I C
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 120 F A L V Q A N P T E N K
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 156 D D I D I V G V E G K F
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 192 G T T D L E T D L F T I
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 228 V E D M N V I S R D T N
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 264 L A N S D A D R G K M P
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 G K K L P L E V L I E M
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 336 E A N A R K A G C T R G
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 372 C L I C L S K I K C T A
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 408 K M K V Y I P G R C H D
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 444 Y G G D K K T G Q A G I
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 480 V G A I V D I P E I S G
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 516 F K E L G P M E Q F I A
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 552 Q V D L C A D C T T G C
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 588 L K G L A N V K C S A L
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 624 L K K W L P D R C A S F
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 660
A D K I Q S E V D N I K GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 681
G L A G D R *
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA
731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA 781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG
831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG 867 一つのクローン： White luc2 3 'RACE UPl— UPM/pCR4Blunt No.7中 に保持されている、上流側プライマー： White luc2 5'-UPlから伸長される 3'R ACE反応産物の塩基配列は、下記のものであることが判明した。
White luc2 3 'RACE No.7 塩某配列
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA 26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 62 M G V K L I F A V V C V
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 98 A A A Q A A T I N E N F
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 134 E D I D L V A I G G S F
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 170 A L D V D A N R G G H G
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 206 G H P G K K M P K E V L
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 242 V E M E A N A K R A G C
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 278 H R G C L I C L S H I K
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 314 C T K K M K K F I P G R
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 350 C H S Y E G D K D S A Q
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 386 G G I G E E I V D M P E
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 422 I P G F K D K E P M D Q
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 458 F I A Q V D L C V D C T
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 494 T G C L K G L A N V H C
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 530 S D L L K K W L P S R C
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 566 K T F A S K I Q S Q V D
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 596
T I K G L A G D R *
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT
646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA
696
746
AAAAAAA 753
これら二種の塩基配列を対比すると、前者は、 210アミノ酸残基をコードする ORF を含み、後者は、 189アミノ酸残基をコードする ORFを含んでいる。前者の遺伝子に よりコードされているタンパク質を、 M. pacifica luciferase 1と、後者の遺伝子 によりコードされているタンパク質を、 M. pacifica luciferase 2と命名する。 この M. pacifica luciferase 1をコードする塩基配列部分から、下記の下流側 プライマー； White luclB LP1を設計した。
White luclB LP1: (37 mer)
5，一 ACTGTTGACTAGATTGGTGTCTCTACTGATGACATTC— 3 ' 該 White luclB LP1は、 ORF中の下記の部分に相補的な塩基配列である。 G AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT CTA GTC AAC ACT N V I S R D T N L A N S
加えて、上流側プライマー： White lucl 5 '— UP1から伸長される 3 'RACE反応 産物の塩基配列中、 3'末端側非翻訳領域の塩基配列に基づき、下記二種の下流 側プライマー； White lucl 3，一 LP 1と White lucl 3，一 LP2を設計した。また、 上流側プライマー： White luc2 5'— UP1から伸長される 3 'RACE反応産物の塩 基配列中、 3'末端側非翻訳領域の塩基配列に基づき、下記二種の下流側プライマ 一； White luc2 3，一 LP1と White luc2 3，一 LP2を設計した。
White lucl 3，— LP1： (27mer)
5 ' -GGATTACATAGAATATATTTATAGGAA-3 '
White lucl 3，— LP2 : (29mer)
5，— CATGATCCAGTTATCTCTTGTTCTGTTCT— 3 '
White luc2 3，— LP1 : (28mer)
5， -ATTTTTACATAGTTATGGTTTAATACGA-3 '
White luc2 3，— LP2 : (29mer)
5 ' -TAACATCATTGGGCTAAAGTATCATCATC-3 '
5 'RACE反]^産物の再取得
M. pacifica由来の mRNAに基づき、前記下流側プライマー； White luclB L PIを利用し、該下流側プライマーから核酸鎖の伸長がなされた、 5'RACE反応産物 を新たに調製する。
[0094] 再取得される 5 'RACE反応産物をー且、クローニング'ベクター pCR4Blunt— TO PO中に挿入し、 TOP10株へ導入し、形質転^ を選択する。サブ'クロー-ングさ れている 5'RACE反応産物部分を利用して、 M. pacifica luciferase 1の遺伝 子の 5 '未翻訳領域に相当する部分の塩基配列を再度解析する。
[0095] すなわち、クローニング.ベクター pCR4Blunt— TOPO由来の選択マーカーを利 用して、選別された形質転^ について、下流側プライマー; White luclB LP1 の 3，末端から、 M. pacifica luciferase 1の遺伝子の 5，未翻訳領域へと、核酸 鎖の伸長がなされた 5 'RACE反応産物を含む、 White lucl 5'RACE LP1B— UPMZρCR4Blunt—TOPOのサブクローン群が保持する5'RACE反応産物の塩 基配列を解析し、その 5'未翻訳領域、ならびに ORFの N末部分をコードする部分の 塩基配列の再確認を行う。
[0096] 選別された各クローンが保持しているプラスミド 'ベクター中に挿入されている、再取 得される 5'RACE反応産物を含む部分を铸型として、以下の手順で塩基配列解析 用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。
[0097] 選別クローンから回収、精製したプラスミド ·ベクターを含む液にっ 、て、その DNA 濃度を 70— lOOngZ Lとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークェン ス用 DNA試料!^製3 rット： BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready R eaction Kit with AmpliTaq polymeraseにより、この精製済みプラスミド'ベタ ターを铸型として、塩基配列解析用の試料を、クローユング 'ベクター pCR4Blunt— TOPOに由来する部位に対する二種プライマー； M13 sense M4, M13 RVのう ち、 M13 sense M4のみをシークェンス 'プライマーとして利用し、プラスミド'ベタ ター中に挿入されて ヽる 5 ' RACE反応産物を含む領域から調製する。
[0098] 同時に、上で選択される 3'RACE反応産物を保持する、サブクローン群: White 1 ucl 3'RACE UPl— UPM/pCR4Blunt No. 1、 4、 5、 6、 7、 9、 10、ならびに 、サブクローン群： White lucl 3'RACE UP2— UPM/pCR4Blunt No. 2、 3 、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10【こつ!ヽても、その 5，未翻訳領域、ならび【こ ORFの N末咅分 をコードする部分の塩基配列を解析する。
[0099] 表 28に、用いたシークェンス用プライマー、 DNA鎖伸長反応の温度条件、ならび に、反応液組成を示す。
[0100] [表 28] 表 28
- ~クエンス用プライマー
Figure imgf000069_0001
反応液組成
Figure imgf000069_0002
DNA鎖仲長反応の温度条件：
使用装 li： Ma s t e r c yc l e r G r ad i e n t
Figure imgf000069_0003
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の 0.5mL容チューブに移す。試 料溶液 5 L当たり、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 0.5 L、 95%エタノール 12. 5 /zLの比率で混合した液を、別途、 1.5mL容チューブに予め用意する。この 1.5 mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷 下に、 10分間静置し、含まれる DNA断片をエタノール沈澱 (析出）させる。 20分間、 遠心（14, OOOrpm)し、析出した DNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、 125 Lの 70%エタノールをカ卩え、析出 DNA断片をリンスする。再び、 5分間、遠心 (14, OOOrpm)し、析出 DNA断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出 D NA断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料 DAN断片は、 Template suppressor Reagent (TSR)中 に再分散する。ヴオルテックスにかけて、混合した後、遠心して液^^める。 95°C、 2 分間加熱し、一本鎖 DNAに分離し、氷冷する。ー且、ヴオルテックスにかけた後、再 遠心して、伸長された一本鎖 DNAを含む液を集める。その後、解析用試料 DAN断 片（伸長された一本鎖 DNA)は、市販のシークェンス装置： ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerにかけ、塩基配列解析を行う。
各サブクローンにおける、 5'未翻訳領域、ならびに ORFの N末部分をコードする部 分の塩基配列の解析結果に基づき、 ORFの 5'末端に位置する開始コドン (ATG) から、 3'末端の終止コドン (TGA)までの、翻訳領域の PCR増幅用の上流側プライ マー、下流側プライマーを以下のように設計した。その際、これらの上流側プライマー 、下流側プライマー対を利用して作製される PCR増幅は、発現用ベクター ρΕΤΙΟΙ TOPOへ組み込みが可能な形態とする。
M. pacifica luciferase 1のコード配列（ORF)増幅用
White lucl-4 pET— UP: (34mer)
CACC ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC
M M E I K V L F A L
White lucl-9 pET— UP: (34mer)
CACC ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC
M M E V K V V F A L
White lucl-10 pET— UP: (34mer)
CACC ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC
M M E I Q V L F A L
White lucl pET— LP: (29mer)
TCA ACG ATC TCC AGC CAA GCC CTT GAT GT
下記の M. pacifica luciferase 1における C末部分のコード配列と相補的は塩 基配列である。
AC ATC AAG GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA I K G L A G D R *
M. pacifica luciferase 2のコード配列（ORF)増幅用
White luc2 pET— UP: (30mer)
CACC ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GT M G V K L I F A White luc2 pET— LP : (28mer)
TCA ACG ATC TCC AGC TAA GCC CTT GAT G
下記の M. pacifica luciferase 2における C末部分のコード配列と相補的は塩 基配列である。
C ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA I K G L A G D R *
(M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現）
プラスミド OETIO I ZD— TOPO中への M. pacifica由来のルシフェラーゼ タン パク皙遺伝子の揷人
先ず、 M. pacifica luciferase 1のコード配列を内在する、 White lucl 3，R ACE UP1— UPMZpCR4Bluntのプラスミド 'ベクターを保持する単離クローン、 あるいは、 M. pacifica luciferase 1のコード配列を内在する、 White luc2 3， RACE UP1— UPM/pCR4Bluntのプラスミド 'ベクターを保持する単離クローン より回収したベクターを铸型として、上記 PCR用ファワード ·プライマーとリバース ·プ ライマーを利用し、以下の条件で PCR増幅産物を調製する。表 29に、铸型と PCR用 プライマー対の組み合わせ、 DNA鎖伸長反応の温度条件、ならびに、反応液組成 を示す。
[表 29]
表 2 9
P CR用プライマー
Figure imgf000072_0001
P C R反応の温度条件：
使用装置： M a s t e r
Figure imgf000072_0002
P C R反応液の組成
D A p o 1 y m e
Figure imgf000072_0003
調製された PCR増幅産物の精製は、以下の手順で行った。
[0103] 各 25 μ Lの反応液量で PCR反応を実施した後、合計 3回の反応液を合わせ、 2 μ Lの反応液を採取し、 1. 6%ァガロース 'ゲル上で泳動し、目的分子量の PCR増幅 産物を確認する。
[0104] 次 、で、反応液から、産物 DNAを、 MinElute (QIAGEN 製)で濃縮する。反応 液 1容（73 μ L)当たり、ノ ッファー ΡΒ 5容をカ卩え、ヴオルテックスにかけた後、 Min Eluteカラムに移した。 30秒間遠心し、 DNAを吸着させたカラムを分離し、上清を除 去する。 DNAを吸着させたカラムをバッファー PE 0. 7mLで洗浄し、さら〖こ 1分間、 遠心（15, OOOrpm)して、カラムを分離し、ノ ッファー PEを完全に除去する。その後 、カラムに溶出バッファー EB 10 Lを加えて、室温で、 1分間静置する。この溶出 処理後、 1分間、遠心（15, OOOrpm)し、カラム力 溶出された DNAを含む上清を、 1. 5mL容 eppenチューブに回収する。
[0105] 回収された DNA溶液に、 10 X loading dye 液 2 /z Lを添加した後、 1. 0% T AE ァガロース'ゲル上、各レーン DNA溶液 12 Lを泳動した。 目的分子量の バンドをゲルから切り出す。 1. 5mL容 eppenチューブ中に、ゲル切片を入れ、 DNA を回収する。
[0106] 精製済み二本鎖 DNAを、市販のプラスミド ρΕΤΙΟΙ— TOPO (Invitrogen 製）中 に挿入し、該 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質の遺伝子（コード配列 部分）をベクター中にクローユングする。構築されたベクターを用いて、 Chemical c ompetent cell TOP10株へ導入し、形質転^ ¾を選択する。プラスミド 'ベクター の宿主大腸菌へ導入は、上で説明した手順に従って、 Chemical competent eel 1を利用して実施した。
コロニー PCR法による、ルシフェラーゼ タンパク皙の遣伝早 (コード西 R列部分)揷 人プラスミド 'ベクター保持クローンの撰
コロニー PCR法を利用して、各コロニーを形成する形質転換株中から採取される、 プラスミド ·ベクター中における cDNA断片挿入の有無を以下の手順で確認する。 colony RCRは、
フォワード 'プライマーとして、プラスミド ρΕΤΙΟΙ— TOPOに由来する T7 プライマー 、リバース 'プライマーとして、 White lucl pET— LPまたは White luc2 pET— L Pを利用して、市販の DNA合成酵素： KOD Dash DNA polymeraseを用いて、 クローン中に含まれるベクター DNAを铸型として、 PCR増幅を行う。その際、使用す るプライマー対による PCR産物として、下記する分子量の DNA断片を与えるクロー ンを選択する。表 30に、用いた PCR反応の温度条件、ならびに、反応液組成を示す
[0107] [表 30] 表 30
c o l ony PCR用プライマー
Figure imgf000074_0001
P C R反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c y c 1 e r G r a d i e n t (e p p e n d o r f)
Figure imgf000074_0002
反応液組成
DNA p o l yme r a s e : OD D a s h
Figure imgf000074_0003
シャーレ上のコロニーから、無作為にコロニーを選択し、各コロニーの菌体を 70 ;zL の水（DDW)に懸濁した。この菌体懸濁液を 95°C、 5分間処理した。この菌体から回 収されたベクターを含む液を、反応液において、コロニー溶液として利用した。
PCR反応の終了後、増幅産物を含む反応液 10 L力ら、 3 μ Lを採取して、 2%ゲ ル上で泳動して、 cDNA断片に相当する PCR増幅産物の有無、そのサイズ範囲を 調べる。 [0109] colony RCR法を利用するスクリーングにおいて、一次選別されたコロニー中、 White lucl-4/pET101/TOP10 :No. 2, 3
White lucl-9/pET101/TOP10 :No. 2
White lucl-10/pET101/TOP10 :No. 3, 5
White luc2-6/pET101/TOP10 :No. 1
White luc 2-7/pET 101 /TOP 10 : No . 4, 6
White luc2-8/pET101/TOP10 :No. 2, 5
のコロニーにおいて、予定される PCR増幅産物が明確に見出された。
選別された各クローンが保持して 、るプラスミド ·ベクター中に挿入されて 、る、ルシ フィラーゼ タンパク質の遺伝子を含む部分を铸型として、以下の手順で塩基配列解 析用の核酸鎖伸長反応産物を調製する。
[0110] 選別クローンから回収、精製したプラスミド 'ベクターを含む液について、その DNA 濃度を 70— lOOngZ Lとなるように、濃度調整を行う。次いで、市販のシークェン ス用 DNA試料!^製3 rット： BigDye Terminator Cycle Sequecing Ready R eaction Kit with AmpliTaq polymeraseにより、この精製済みプラスミド'ベタ ターを铸型として、塩基配列解析用の試料を、クローユング 'ベクター ρΕΤΙΟΙ— TO POに由来する部位に対する二種プライマー； T7 primer, T7 terminatorをシー クエンス ·プライマーとして利用し、プラスミド ·ベクター中に挿入されて ヽる cDNAを 含む領域から調製する。
[0111] 表 31に、用いたシークェンス用プライマー、 DNA鎖伸長反応の温度条件、ならび に、反応液組成を示す。
[0112] [表 31] 表 3 1
シークェンス用プライマー
Figure imgf000076_0001
反応液組成
Figure imgf000076_0002
DNA鎖伸長反応の温度条件：
使用装置： Ma s t e r c y c 1 e r G r a d i e n t
Figure imgf000076_0003
各反応用チューブから、調製済み試料溶液を別の O.5mL容チューブに移す。試 料溶液 5/zL当たり、 3M 酢酸ナトリウム水溶液 0.5 L 95%エタノール 12. 5 ^uLの比率で混合した液を、別途、 1.5mL容チューブに予め用意する。この 1.5 mL容チューブ中に、予め集めた試料溶液を投入する。均一に混合した上で、氷冷 下に、 10分間静置し、含まれる DNA断片をエタノール沈澱 (析出）させる。 20分間、 遠心（14 OOOrpm)し、析出した DNA断片を沈積させ、上清を除去する。次いで、 125 μ Lの 70%エタノールをカ卩え、析出 DNA断片をリンスする。再び、 5分間、遠心 (14, OOOrpm)し、析出 DNA断片を沈積させ、上清を吸引除去する。残った析出 D NA断片のペレットを乾燥する。
精製した解析用試料 DAN断片は、 Template suppressor Reagent (TSR)中 に再分散する。ヴオルテックスにかけて、混合した後、遠心して液^^める。 95°C、 2 分間加熱し、一本鎖 DNAに分離し、氷冷する。ー且、ヴオルテックスにかけた後、再 遠心して、伸長された一本鎖 DNAを含む液を集める。その後、解析用試料 DAN断 片は、市販のシークェンス装置： ABI PRISM 3100 Genetic Analyzerにかけ 、塩基配列解析を行う。
[0113] 塩基配列解析の結果、前記の選別された各クローンでは、上記 PCR用ファワード' プライマーとリバース ·プライマーを利用し、調製される PCR増幅産物が、プラスミド p
ET101— TOPOのクローユング ·サイト中に挿入されて!、ることが確認される。
なお、使用された上流側プライマーの塩基配列の違いに伴い、 PCR増幅産物中の M. pacifica luciferase 1のコード配列は、 White luc 1-4/pET 101 /TOP 10と White lucl— 9ZpET10lZTOP10に保持される配列と、 White luc 1-10 ZpETlOlZTOPIOに保持される配列とは、その N末領域に相当する部分に相違 を有する。すなわち、 White lucl— 4/pET101/TOP10と White lucl— 9/pE TlOlZTOPIOに保持される配列と、 White lucl— ΙθΖρΕΤΙΟΐΖΤΟΡΙΟに保 持される配列とは、互いに、 Ν末領域に相当する部分にアミノ酸置換を有する変異体 タンパク質のコード配列となっている。
(M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現体の発光特性） 選別された二種のクローン； White lucl— 10/pET101/TOP10と White luc 2— 7/pET101/TOP10について、ベクター ρΕΤΙΟΙ—ΤΟΡΟ由来のプロモータ 一から、 IPTGを用いて、挿入された遺伝子の発現を誘導し、 4時間経過した時点で 培養菌体を回収する。菌体破砕後、遠心（15, 000rpm; 18, 800 X g)により分離し た、可溶性画分 (細胞質成分)ならびに不溶性画分 (膜成分）にそれぞれ含まれるタ ンパク質について、 SDS— PAGE分析を行った。その結果、形質転換大腸菌の可溶 性画分 (細胞質成分）中に、目的とするルシフェラーゼ タンパク質に相当する新たな バンドが見出される。
[0114] 形質転換大腸菌の可溶性画分 (細胞質成分）に対して、 lOOmMの CaClの存在 下、 pH7. 5において、発光基質のセレンテラジン（coelenterazine)をカ卩えたところ 、極大波長え max =480nmの青色発光が観測される。すなわち、宿主大腸菌内に お ヽて、 M. paciiica mciferase 1の遺 子、なりび【こ M. pacifica luciiera se 2の遺伝子から、それぞれルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現体が産生さ れていることが確認される。また、その発光活性の発揮には、 Ca等の二価の金属陽 イオンが必要であることが示唆される。
(M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現体の発光特性の pH 依存性）
選別された二種のクローン； White lucl— 10/pET101/TOP10と White luc 2— 7ZpET10lZTOP10について、前述するルシフェラーゼ タンパク質の組換え 発現体を含有する、形質転換大腸菌の可溶性画分 (細胞質成分)を用いて、各ルシ フェラーゼ タンパク質の組換え発現体の発光特性の pHに対する依存性を評価す る。
[0115] 50mMの MgClの存在下、ルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現体を含有す
2
る液の pHを種々に変化させ、その酵素活性に伴い、発光基質のセレンテラジンから 発せられる。
[0116] 図 2には、本発明にかかる M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質の組換え 発現体を、下記の各種バッファー液により調整される pHにおいて、該ルシフェラーゼ タンパク質組換え発現体の作用によって、発光基質のセレンテラジン力 発せられ る青色発光 (波長 480nmで測定した発光強度）を、各種バッファー液により調整さ れる pH値に対して、プロットした結果を示す。少なくとも、 pH 6. 5-9. 0の範囲に お ヽて ίま、 亥 M. pacifica luciferase 1、 M. pacifica luciferase 2の糸且換 え発現体は、所望の水準の発光特性を示すことが確認される。
pH調整用バッファー液：
pH5.0 Acetate
pH5.5 Acetate
pH6.0 Phosphate
pH7.0 HEPES pH8.0 Tris-HCl
pH8.5 Tris-HCl
pH8.9 Tris-HCl
pHlO.O Carbonate
(M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質の組換え発現体の発光特性発揮 に対する金属陽イオンの必要性）
選別された二種のクローン； White lucl— 10/pET101/TOP10と White luc 2— 7ZpET10lZTOP10について、前述するルシフェラーゼ タンパク質の組換え 発現体を含有する、形質転換大腸菌の可溶性画分 (細胞質成分)を用いて、各ルシ フェラーゼ タンパク質の組換え発現体の発光特性発揮に対する、金属陽イオンの 必要性を評価する。
図 3には、本発明にかかる M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質の組換え 発現体を、 pH7. 5において、アルカリ金属カチオン (K+、 Na+)、アルカリ土類金属 カチオン (Ca2+、 Mg2+)の存在下、該ルシフェラーゼ タンパク質組換え発現体の作 用によって、発光基質のセレンテラジン力 発せられる青色発光 (波長 480nmで測 定した発光強度）を対比した結果を示す。少なくとも、該 M. pacifica luciferase 1、M. pacifica luciferase 2の組換え発現体は、所望の水準の発光特性を発 揮する上では、アルカリ金属カチオン (K+、 Na+)、アルカリ土類金属カチオン (Ca2+ 、 Mg2+)力 50mM程度存在することが必要であることが確認される。
(M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質のヒト細胞内における糸且換え発現） プラスミド OCDNA3. 2ZV5— GWZD— TOPO中への M. pacifica luciferase 1の遣伝子、あるいは、 M. pacifica luciferase 2の遣伝子の揷入
上述する大腸菌中における組換え発現に利用する、 M. pacifica由来ルシフェラ ーゼ タンパク質の発現ベクター： White lucl— 10/pET101、 White luc2— 7/ ρΕΤΙΟΙの作製手順に準じて、 PCR法で調整される、精製済み二本鎖 DNAを、巿 販のプラスミド pcDNA3. 2/V5-GW/D-TOPO (Invitrogen 製）のクローニン グ.サイト中に挿入し、該 M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質のヒト細胞内 発現用発現ベクターを作製する。 [0118] なお、力かるヒト細胞内発現用発現ベクター中に挿入されている二本鎖 DNA断片 は、前記発現ベクター： White lucl-10/pETlOl , White luc2-7/pET101 中に挿入されているコード遺伝子と同じ塩基配列を有し、ヒトにおけるコドン選択に適 合するようなコドン変換は施されていない。すなわち、上記発現ベクター: White luc 1 10ZpET101、 White luc2— 7ΖρΕΤ101中に挿入される二本鎖 DNA断片と 同じものである。ー且作製される発現ベクター； White lucl— 10/pcDNA3. 2、 W hite luc2-7/pcDNA3. 2は、 Chemical competent cell TOP10株へ導入 し、形質転 ·を選択する。プラスミド 'ベクターの宿主大腸菌へ導入は、上で説明し た手順に従って、 Chemical competent cellを利用して実施した。
[0119] colony RCR法を利用するスクリーングによって、前記発現ベクター： White luc 1 10ZpET101、 White luc2—7/pET101中に挿入されているコード遺伝子と 同じ塩基配列を有する cDNA断片が挿入されているクローンを選択する。また、実際 に塩基配列解析を行 ヽ、その挿入部の塩基配列の確認を行う。
[0120] 該選択されたクローン株の培養により、作製されたプラスミドの回収、精製は、市販 のプラスミド精製キット； QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN 製）を用いて 行う。
M. Oacifica由夹ルシフ ラーゼ タンパク皙のヒト細朐内発現用発現ベクターの HeLa細胞への導人
精製済みの、該 M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質のヒト細胞内発現用 発現ベクターを、 HeLa細胞中に、 PolyFect Transfection reagent (QIAGEN 製）を利用して導入する。宿主の HeLa細胞は、血清添加培地（DMEM + 10%F BS + lOO ^ g/ml Kanamycin)を用いて、 100mm Dish上で、 70% conflue nt状態まで培養されたものを利用する。その際、発現ベクター 'プラスミド溶液 (DNA fi : 1 μ g/ L) 6. 0 Lに、 PolyFect Transfection Reagent50. 0 μ L¾r 加え、この混合液を 10秒間攪拌後、複合体形成のため室温で 10分間インキュベー シヨンし、 Transfection処理に使用する。 Transfection処理後、 HeLa細胞は、 5% CO下、 37°Cに保持し、 24— 48時間インキュベーションする。この間に、処置に伴う
2
細胞損傷の回復と、培養細胞内において、導入された遺伝子の発現を行う。 [0121] この発現ベクターを導入された HeLa細胞内における、該 M. pacifica由来ルシ フェラーゼ タンパク質の組換え発現を誘導したところ、培養細胞中で発現されるル シフェラーゼ タンパク質は、細胞外に分泌され、培地中に分泌型のルシフェラーゼ タンパク質として蓄積されることが観測された。すなわち、ヒト由来の HeLa細胞内に おいても、該 M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質のコード遺伝子に基づき 、完全長のアミノ酸配列を有するプレ'タンパク質型組換え体へと翻訳がなされる。そ の後、その N末に存在するシグナル 'ペプチド部を利用して、細胞外へ成熟型タンパ ク質として、分泌されることを明確に示している。
[0122] 図 4は、発現ベクター； White lucl— 10ZpcDNA3. 2、 White luc2-7/pcD NA3. 2をそれぞれ導入した後、細胞損傷の回復処置を終えた HeLa細胞を、培地 中で培養し、組換え発現を誘導した際、培地中に分泌される、成熟型の M. pacifi ca luciferase 1による発光活性の増カロ、ならびに、 M. pacifica luciferase 2 による発光活性の増加を示す。培養中、組換え発現を誘導した状態で、 24時間経過 した時点と、 48時間経過した時点とで、培地中におけるルシフェラーゼ タンパク質 による発光活性と、培養細胞内に残余するルシフェラーゼ タンパク質による発光活 性とを比較している。培地中におけるルシフェラーゼ タンパク質による発光活性が、 培養時間の経過とともに、格段に増加していることが確認される。
[0123] 従って、該 M. pacifica由来ルシフェラーゼ タンパク質のコード遺伝子は、ヒト細 胞におけるコドン選択に適合させるコドン変換を施さなくとも、十分に、各種のヒト由来 の細胞系を利用する in vitro培養系において、該宿主細胞内で発現可能であり、か つ、発現後、細胞外へと分泌されるリポーター ·タンパク質のコード遺伝子として利用 することが可會であることが検証される。
産業上の利用可能性
[0124] 本発明にかかる M. pacifica由来の二種のルシフェラーゼ タンパク質をコードす る遺伝子は、いずれも、哺乳動物細胞を利用する in vitro培養系において、該宿主 細胞内で発現可能であり、かつ、力かる遺伝子力 発現後、組換え発現型ルシフェラ ーゼ タンパク質は、宿主細胞外へと分泌されるリポーター ·タンパク質として利用す ることが可能である。

Claims

請求の範囲
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1をコードする遺伝子 であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 の完全長アミノ酸配列 (配列番号: 1)：
Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly 135 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子。
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 2をコードする遺伝子 であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 の完全長アミノ酸配列 (配列番号: 3)：
Met Gly Val Lys Leu lie Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45 Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50 55 60
Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65 70
His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu
110 115 120
lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin
125 130
Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145 150 155
Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
Thr lie Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg
185
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質をコードする遺伝 子。
前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1の完全長ァミノ 酸配列 (配列番号： 1)をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列 (配列番号： 2)：
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 36 Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala 100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210 である
ことを特徴とする請求項 1に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 をコードする遺伝子。
前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 2の完全長ァミノ 酸配列 (配列番号: 3)をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列 (配列番号 : 4)：
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 36
Met Gly Val Lys Leu He Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 72 Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 108 Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 144 Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 180 Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys ulu Val Leu
50 55 60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 216 Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65 70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 252 His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 288 Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 324 Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 360 Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu
110 115 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 396 lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin
125 130
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 432 Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 468 Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys
145 150 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 504 Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 540 Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 570
Thr He Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
185
である
ことを特徴とする請求項 2に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 をコードする遺伝子。
前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1の完全長ァミノ 酸配列 (配列番号： 1)をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列 (配列番号： 5)：
GGAGACAACG GATCCAAAAG GAAAGGAGCT AAATCTACAG TCTAGAAC
48
ATG ATG GAA ATA CAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 84 Met Met Glu lie Gin Val Leu Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 120 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 156 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 192 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 228 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 264 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 300 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 336 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 372 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 408 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 444 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 480 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 516 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 552 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 588 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 624 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 660 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys 195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 681
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
ATAAACCTGA CAGAACAGAA CAAGAGATAA CTGGATCATG ATATGCTTGA
731
CTCATGCTAA AAAAGTGGCC ATTTTTTTGT CAAACAGAAT GAAATTAAAA
781
TATTGAATTG TTTATTAATA TGAATGGAAT TCCTATAAAT ATATTCTATG
831
TAATCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAG 867 を有する DNA分子である
ことを特徴とする請求項 1に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 をコードする遺伝子。
前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 2の完全長ァミノ 酸配列 (配列番号: 2)をコードする塩基配列を含む塩基配列として、
下記の塩基配列 (配列番号 : 6)：
GAGTCCAAAC TGAAAGGTAC TCAAAA 26
ATG GGA GTC AAA CTT ATC TTT GCT GTT GTT TGT GTT 62
Met Gly Val Lys Leu He Phe Ala Val Val Cys Val
1 5 10
GCC GCG GCC CAG GCT GCC ACA ATC AAT GAA AAC TTT 98 Ala Ala Ala Gin Ala Ala Thr He Asn Glu Asn Phe
15 20
GAA GAC ATT GAT CTT GTA GCT ATA GGT GGC AGC TTT 134 Glu Asp He Asp Leu Val Ala He Gly Gly Ser Phe
25 30 35
GCT CTG GAT GTT GAT GCT AAC AGA GGT GGA CAT GGT 170 Ala Leu Asp Val Asp Ala Asn Arg Gly Gly His Gly
40 45
GGA CAT CCT GGC AAG AAG ATG CCA AAA GAA GTA CCT 206 Gly His Pro Gly Lys Lys Met Pro Lys Glu Val Leu
50 55 60
GTT GAA ATG GAA GCT AAT GCT AAA AGG GCT GGG TGC 242 Val Glu Met Glu Ala Asn Ala Lys Arg Ala Gly Cys
65 70
CAC AGA GGA TGT CTG ATT TGT CTT TCC CAC ATC AAG 278 His Arg Gly Cys Leu lie Cys Leu Ser His lie Lys
75 80
TGC ACC AAG AAA ATG AAG AAG TTT ATC CCA GGA AGA 314 Cys Thr Lys Lys Met Lys Lys Phe lie Pro Gly Arg
85 90 95
TGC CAC AGT TAT GAA GGA GAC AAG GAT TCT GCA CAG 350 Cys His Ser Tyr Glu Gly Asp Lys Asp Ser Ala Gin
100 105
GGA GGC ATT GGA GAA GAA ATT GTT GAC ATG CCT GAA 386 Gly Gly lie Gly Glu Glu lie Val Asp Met Pro Glu
110 115 120
ATT CCC GGA TTC AAA GAC AAG GAA CCA ATG GAC CAA 422 lie Pro Gly Phe Lys Asp Lys Glu Pro Met Asp Gin
125 130
TTC ATC GCT CAA GTT GAT CTC TGC GTA GAT TGC ACA 458 Phe He Ala Gin Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr
135 140
ACT GGA TGC CTC AAG GGT CTT GCC AAT GTC CAT TGC 494 Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val His Cys 145 150 155
TCT GAT CTC CTG AAG AAA TGG CTT CCT TCA AGA TGC 530 Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Ser Arg Cys
160 165
AAG ACA TTT GCT TCC AAA ATT CAA TCT CAA GTG GAT 566 Lys Thr Phe Ala Ser Lys He Gin Ser Gin Val Asp
170 175 180
ACC ATC AAG GGA TTA GCT GGA GAT CGT TGA 596
Thr He Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
185
GGGATAAAAA AATGGATAAT TTGATGATGA TACTTTAGCC CAATGATGTT
646
AAAAATGGCC ATTTTCGTAT TAAACCATAA CTATGTAAAA ATGTAATGTA
696
746
AAAAAAA 753
を有する DNA分子である
ことを特徴とする請求項 2に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 をコードする遺伝子。
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体をコードする 遺伝子であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号 : 7)：
Met Met Glu lie Lys Val Leu Phe Ala Leu lie Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe 25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly 85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala 145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコードす る遺 子。
M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体をコードする 遺伝子であって、
該遺伝子は、前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1 変異体の完全長アミノ酸配列 (配列番号 : 8)：
Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala 100 105
Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
Gly Leu Ala Gly Asp Arg
205 210
をコードする塩基配列を含む塩基配列を有する DNA分子である
ことを特徴とする M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質変異体をコードす る遺 子。
前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体の完全 長アミノ酸配列 (配列番号: 7)をコードする塩基配列は、
下記の塩基配列 (配列番号： 9)：
ATG ATG GAA ATA AAA GTT CTT TTT GCT CTC ATT TGC 36 Met Met Glu lie Lys Val Leu Phe Ala Leu lie Cys
1 5 10 TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie Glu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105
AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
である
ことを特徴とする請求項 7に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 変異体をコードする遺伝子。
[10] 前記 M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 luciferase 1変異体の完全 長アミノ酸配列 (配列番号: 8)をコードする塩基配列は、 下記の塩基配列 (配列番号： 10)：
ATG ATG GAA GTA AAA GTT GTT TTT GCT CTC ATT TGC 36 Met Met Glu Val Lys Val Val Phe Ala Leu He Cys
1 5 10
TTT GCA TTG GTG CAG GCC AAT CCA ACT GAA AAC AAA 72 Phe Ala Leu Val Gin Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys
15 20
GAT GAC ATT GAC ATT GTT GGT GTA GAA GGA AAA TTT 108 Asp Asp lie Asp He Val Gly Val Glu Gly Lys Phe
25 30 35
GGT ACA ACA GAC CTT GAG ACA GAC TTA TTC ACC ATC 144 Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr He
40 45
GTG GAG GAT ATG AAT GTC ATC AGT AGA GAC ACC AAT 180 Val Glu Asp Met Asn Val lie Ser Arg Asp Thr Asn
50 55 60
CTA GCC AAC AGT GAT GCT GAC CGC GGT AAA ATG CCT 216 Leu Ala Asn Ser Asp Ala Asp Arg Gly Lys Met Pro
65 70
GGT AAA AAA CTG CCA CTG GAG GTA CTC ATA GAG ATG 252 Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu lie ulu Met
75 80
GAA GCC AAT GCT CGT AAA GCT GGC TGC ACC AGG GGA 288 Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly
85 90 95
TGT CTC ATC TGT CTT TCA AAG ATC AAG TGT ACA GCA 324 Cys Leu lie Cys Leu Ser Lys lie Lys Cys Thr Ala
100 105 AAA ATG AAG GTG TAC ATT CCA GGA AGA TGT CAT GAT 360 Lys Met Lys Val Tyr He Pro Gly Arg Cys His Asp
110 115 120
TAT GGC GGT GAC AAG AAA ACT GGA CAG GCA GGA ATA 396 Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gin Ala Gly He
125 130
GTT GGT GCC ATT GTT GAC ATT CCC GAA ATT TCT GGA 432 Val Gly Ala He Val Asp He Pro Glu He Ser Gly
135 140
TTC AAG GAG TTG GGA CCC ATG GAG CAG TTT ATT GCT 468 Phe Lys Glu Leu Gly Pro Met Glu Gin Phe He Ala
145 150 155
CAA GTT GAT CTT TGC GCT GAC TGC ACA ACT GGC TGC 504 Gin Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys
160 165
CTC AAA GGT CTT GCC AAT GTC AAG TGC TCC GCA CTC 540 Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Ala Leu
170 175 180
CTG AAG AAA TGG CTT CCA GAC AGA TGT GCA AGT TTT 576 Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe
185 190
GCT GAC AAA ATC CAG AGT GAA GTA GAC AAC ATC AAG 612 Ala Asp Lys He Gin Ser Glu Val Asp Asn He Lys
195 200
GGC TTG GCT GGA GAT CGT TGA 633
Gly Leu Ala Gly Asp Arg *
205 210
である ことを特徴とする請求項 8に記載の M. pacifica由来のルシフェラーゼ タンパク質 変異体をコードする遺伝子。
[11] 哺乳動物細胞の in vitro培養系にお 、て、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号 ： 7、配列番号： 8の 、ずれかに記載のアミノ酸配列を完全長アミノ酸配列とするルシ フ ラーゼ タンパク質を前記哺乳動物細胞中で組換え発現させ、該哺乳動物細胞 外へ分泌型ルシフェラーゼの形態で分泌生産されるリポーター ·タンパク質として利 用することを目的とする、該配列番号： 1、配列番号: 3、配列番号 : 7、配列番号 : 8の いずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列としての、 配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号： 9、配列番号： 10のいずれかに記載に記載の 塩基配列を有する DNAの使用。
[12] 前記哺乳動物細胞は、 in vitro培養可能なヒト由来細胞系である
ことを特徴とする請求項 12に記載の DNAの使用。
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