JP5224457B2 - 変異型ルシフェラーゼ - Google Patents

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Description

本発明は、例えば発光スペクトルが変化したルシフェラーゼ活性を有する変異型ルシフェラーゼに関する。
レポーターアッセイとは、転写制御配列の転写活性を定量する手段の一つである。レポーターアッセイでは、調べたい転写制御配列（プロモーター、エンハンサー等）の制御下に、レポータータンパク質をコードする遺伝子（以下、「レポーター遺伝子」という）を連結し、宿主細胞に導入し、発現させる。このとき、例えばプロモーターの転写活性と、転写・翻訳されることで生じるレポータータンパク質量との間に正の相関がある。そこで、レポータータンパク質量を定量することで、プロモーターの相対的な転写活性の大小を評価することが可能である。
レポーターアッセイでは、レポータータンパク質として様々なタンパク質を用いて行うことができる。例えば、蛍光タンパク質をレポータータンパク質とした場合には、発現した蛍光タンパク質に励起光を照射し、発生する蛍光の強度を計測することで、レポータータンパク質の相対量を定量することができる(蛍光法と呼ばれる)。
また、例えば、β-ガラクトシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素をレポータータンパク質として使用し、レポーターアッセイを行うことができる。酵素をレポータータンパク質とした場合には、当該酵素の作用により分解され、呈色物質を生じる基質を用いることで、レポータータンパク質の相対量を比色により定量できる(比色法と呼ばれる)。あるいは、呈色物質を生ずる基質の代わりに、発光する物質を生じる基質を用いる方法もある。この場合には、発光量を測定することで、レポータータンパク質の相対量を定量することができる(発光法と呼ばれる)。
発光法には、以下のような優れた特徴がある。先ず、蛍光法のように励起光を必要としないので、バックグラウンドが小さく、高いシグナル/ノイズ比が得られる。また、高感度であり、広いダイナミックレンジが得られる。さらに、定量性が優れている。
発光法で、一般的に用いられる酵素反応系としては、ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応系が挙げられる。
ルシフェラーゼには、一次構造上大きく異なる様々な種類のものが知られている。例えば、ルシフェラーゼには、ホタル及びウミシイタケを初めとして、様々な生物に由来するものが存在する。
一方、基質であるルシフェリンも、化学構造上、大きく異なる様々な種類のものが存在する。
それぞれのルシフェラーゼは、基質として認識するルシフェリンの種類がある程度限定されている。一般にデュアルレポーターアッセイと呼ばれる技術では、ホタル由来のルシフェラーゼ(以下、「ホタルルシフェラーゼ」という)とウミシイタケ由来のルシフェラーゼ(以下、「ウミシイタケルシフェラーゼ」という)とが混在するサンプル溶液に、ホタル由来のルシフェリン(以下、「ホタルルシフェリン」という)とウミシイタケ由来のルシフェリン(以下、「ウミシイタケルシフェリン」という)(セレンテラジン)を順番に加えることにより、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼのそれぞれの活性を別々に測定する。
ウミホタルには、ヴァルグラ・ヒルゲンドルフィー(Vargula hilgendorfii)及びシプリディナ・ノクティルカ(Cypridina noctiluca)等の種が含まれる。これらウミホタルにおいて、ルシフェラーゼは、体外(すなわち、海水中)に放出され、ルシフェラーゼの触媒作用によりルシフェリンが海水中の酸素と反応し、発光する。
ヴァルグラ・ヒルゲンドルフィー由来のルシフェラーゼ(以下、「VLuc」という)及びシプリディナ・ノクティルカ由来のルシフェラーゼ(以下、「CLuc」という)をコードする遺伝子がクローニングされている（非特許文献１及び２)。VLuc及びCLucは、双方とも培養細胞で発現し、細胞外に分泌させることができる（特許文献１及び国際公開第2006/132350号パンフレット）。すなわち、VLuc及びCLucは、分泌型ルシフェラーゼである。よって、該ルシフェラーゼをコードする遺伝子(以下、「ルシフェラーゼ遺伝子」という)をレポーター遺伝子として利用すると、細胞を破砕することなくプロモーター等の転写制御配列の転写活性を測定することが可能である(国際公開第2006/132350号パンフレット)。
分泌型ルシフェラーゼは、培養液をそのまま被検液とすることができるので、多数のサンプルを処理する、いわゆるハイスループットレポーターアッセイ系の構築に適している。一方、非分泌型ルシフェラーゼの場合には、遠心分離操作による細胞の回収と、超音波処理、界面活性剤処理、有機溶媒処理等による細胞の破砕(あるいは細胞浸透性の亢進操作)とが必須となる。これらの操作は、数多くのサンプルを処理するには適していない。また、分泌型ルシフェラーゼは、培養液を一部採取することによって、細胞を破砕することなく測定用サンプルを得ることができるため、同じ細胞について連続的にサンプリングを行うことが可能である。一方、非分泌型ルシフェラーゼの場合には、細胞破砕等によって必ず細胞にダメージが加わるため、同じ細胞を用いて連続的にサンプリングを行うことができず、測定ポイントの数だけ別々の細胞を用意する必要がある。
上述のCLucは、VLucと比べて、NIH3T3細胞で発現させた場合では320倍、HeLaS3細胞で発現させた場合では410倍、培養液中に分泌されることが報告されている(非特許文献２)。従って、VLucと比較して、CLucは、培養細胞を宿主とした高感度ハイスループットレポーターアッセイ系での使用に適している。
また、CLuc遺伝子を導入した出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)での、分泌型ハイスループットレポーターアッセイ系も考案されている(国際公開第2006/132350号パンフレット)。
ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応系の発光メカニズムは、一般に次のように考えられている。先ず、ルシフェリンが、ルシフェラーゼの触媒作用により、励起状態のオキシルシフェリンへと酸化される。次いで、励起状態のオキシルシフェリンは、直ちに基底状態に戻るが、その過程でエネルギーを光として放出(発光)する。このときの単位時間あたりの発光量は、系に存在するルシフェラーゼの量に比例すると考えられ、ルシフェラーゼの相対量を発光で定量できる。
上記の発光メカニズムにおいて、オキシルシフェリンの励起状態と基底状態とのエネルギー準位の差に応じた発光が得られる。このエネルギー準位の差が変化することは、発光スペクトルが変化することとなって現れる。すなわち、発光を呈する時の励起状態のエネルギー準位が何らかの理由で変化すると、通常とは異なった色の発光が得られることとなる。この効果は、ルシフェラーゼの一次構造の大きな違い又は局所的な違いによって起こることが知られている(非特許文献３)。
ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として、2種以上のプロモーター活性のレポーターアッセイを同時に行う方法(マルチレポーターアッセイと呼ばれる)としては、少なくとも次の2つの方法がある。
先ず、第1の方法として、異なる複数の化学種のルシフェリンと、それぞれのルシフェリンに対する基質特異性を有するルシフェラーゼとを使用する方法がある。この方法では、基質特異性の違いに起因して、対となるルシフェラーゼ/ルシフェリンの組み合わせ以外では反応は起こらない。また、それぞれのルシフェラーゼ/ルシフェリン反応系の反応に適した条件（反応液組成や水素イオン濃度等）も違う。この方法では、一つの試料に対してそれぞれのルシフェラーゼ/ルシフェリン反応について、反応条件を変えて順次又は並列で行う必要がある。それに伴い、発光測定も一つの試料に対して、それぞれ条件の違うルシフェラーゼ/ルシフェリン反応に適合させて、複数回行う必要がある。このように、この方法は、測定操作が煩雑となるといった問題がある。
第2の方法として、同一化学種のルシフェリンを基質とする方法がある。この場合には、同一化学種のルシフェリンを基質とする複数種のルシフェラーゼをそれぞれレポータータンパク質とする。ただし、これらルシフェラーゼのアミノ酸配列は一部異なっており、それぞれのルシフェラーゼから異なった発光スペクトルを生じることを特徴とする。それぞれのルシフェラーゼに由来する発光の強度はスペクトルの違いによって識別定量される必要がある。
上記第2の方法を使用したマルチレポーターアッセイは、一種類のみの基質を用い、且つ発光反応と測定とをそれぞれ一度で行うことができ、簡便であるという利点がある。
発光色の違うルシフェラーゼからそれぞれ同時に発せられる光は、それらのスペクトルに重なりがある場合もある。しかしながら、このような状況にあってもそれぞれのルシフェラーゼ由来の発光の強度を見積もる方法が考案されている(特許文献２)。
上記第2の方法の原理を用いたマルチレポーターアッセイとして、発光甲虫由来のルシフェラーゼ遺伝子とその変異型遺伝子とを用いたものが存在する(非特許文献４)。しかし、該発光甲虫由来ルシフェラーゼは非分泌型である。従って、先に述べたような理由により、ハイスループット化には適していない。
このように、上記第2の方法の原理を用いたハイスループットマルチレポーターアッセイは、現在のところ知られていない。さらに、ウミホタルルシフェラーゼについて、発光色を変化させるような変異型ルシフェラーゼの存在は知られていない。
一方、BRET(Bioluminescence resonance energy transfer）と呼ばれる現象が、例えば生化学的レベル又は細胞レベルでのタンパク質の構造的変化を検出する方法として利用されている(非特許文献５)。
BRETでは、発光体と発蛍光体がペアを形成する。発光体としては例えば、ルシフェラーゼ/ルシフェリンのような生物発光が利用される。一方、発蛍光体としては、例えば蛍光を発する化学物質や緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光タンパク質が利用される。発光体と発蛍光体とが、距離的に、且つ位相的にエネルギーを転移できる配置にあった場合に、発光体が励起し、基底状態に戻るときのエネルギーが発蛍光体に転移する。次いで発蛍光体が励起して、それが基底状態に戻るときに光を発する。発蛍光体には、それぞれ特有の励起スペクトルが存在し、励起効率は発光体の発光スペクトルと発蛍光体の励起スペクトルに依存することが知られている。効率的なBRETペアを構成するために、発蛍光体を効率的に励起する波長の光を発する発光体が最も好ましい。
そこで、ルシフェラーゼ/ルシフェリンを発光体として利用するBRET解析では、使用するルシフェラーゼは、ペアとして用いる発蛍光体の励起スペクトルを参考に、発蛍光体を効率的に励起する波長の光を発するものが好ましい。従って、発する光の波長が異なる変異型ルシフェラーゼが存在することにより、様々な発蛍光体に対して適切なBRETペアを形成することが可能となる。
特開平3-30678号公報 特開2004-333457号公報 Thompson, E.M., Nagata S., Tsuji F.I.,「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」, 1989年, 第86巻, p.6567-6571 Nakajima, Y., Kobayashi, K., Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y.,「Bioscience and Biotechnology and Biochemistry」, 2004年, 第68巻, p.565-570 Viviani, V., Uchida, A., Suenaga, N., Ryufuku, M., Ohmiya, Y., 「Biochemistry and Biophysics Research Communication」, 2001年、第280巻, p.1286-1291 中島芳浩, 近江谷克裕, 「バイオテクノロジージャーナル」, 2006年, 第6巻, 第2号, p.230-232 Otsuji, T., Okuda-Ashitaka, E., Kojima, S., Akiyama, H., Ito, S., Ohmiya, Y., 「Analytical Biochemistry」, 2004年, 第329巻, p.230-237
本発明は、上述した実情に鑑み、発光スペクトルが変化したルシフェラーゼ活性を有する変異型ルシフェラーゼを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、シプリディナ・ノクティルカ(Cypridina noctiluca)由来のルシフェラーゼ(CLuc)において、特定のアミノ酸残基を置換することで、野生型ルシフェラーゼとは異なる発光スペクトルを付与するルシフェラーゼ活性を有する変異型ルシフェラーゼを得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）上記第375番目のリジンが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択されるアミノ酸に置換されていることを特徴とする、（１）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（３）上記発光スペクトルピークが457nm〜490nmであることを特徴とする、（１）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（４）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（５）上記第178番目のメチオニンがリジンに置換されていることを特徴とする、（４）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（６）上記発光スペクトルピークが420nm〜449nmであることを特徴とする、（４）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（７）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（８）上記第167番目のトレオニンがリジンに置換されていることを特徴とする、（７）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（９）上記発光スペクトルピークが458nm〜490nmであることを特徴とする、（７）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１０）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（１１）上記第404番目のアスパラギンがグリシン又はセリンに置換されていることを特徴とする、（１０）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１２）上記発光スペクトルピークが458nm〜490nmであることを特徴とする、（１０）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１３）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（１４）上記第405番目のトレオニンがイソロイシン又はメチオニンに置換されていることを特徴とする、（１３）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１５）上記発光スペクトルピークが457nm〜490nmであることを特徴とする、（１３）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１６）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（１７）上記第406番目のセリンがロイシンに置換されていることを特徴とする、（１６）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１８）上記発光スペクトルピークが460nm〜490nmであることを特徴とする、（１６）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（１９）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２０）上記第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されていることを特徴とする、（１９）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（２１）上記発光スペクトルピークが460nm〜490nmであることを特徴とする、（１９）記載の変異型ルシフェラーゼ。
(２２)以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２３）以下の(A)〜(G)のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、（２２）記載の変異型ルシフェラーゼ。
(A)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換
(B)上記第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
（２４）上記発光スペクトルピークが466nm〜490nmであることを特徴とする、（２２）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（２５）以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２６）以下の(A)〜(G)のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、（２５）記載の変異型ルシフェラーゼ。
(A)上記第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換
(B)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
（２７）上記発光スペクトルピークが420nm〜435nmであることを特徴とする、（２５）記載の変異型ルシフェラーゼ。
（２８）外来タンパク質又はペプチドと（１）〜（２７）のいずれか１記載の変異型ルシフェラーゼとが連結された融合タンパク質。
（２９）（１）〜（２７）のいずれか１記載の変異型ルシフェラーゼ又は（２８）記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
（３０）（２９）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（３１）（３０）記載の組換えベクターを有する形質転換体。
（３２）（２９）記載の遺伝子、並びに以下の(a)〜(c)のタンパク質から成るルシフェラーゼ又は融合タンパク質をコードする遺伝子から成る群より選択される2以上の遺伝子がそれぞれ異なるプロモーターの制御下に配置されていることを特徴とする、（３１）記載の形質転換体。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質
(b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質
(c)外来タンパク質又はペプチドと上記(a)又は(b)のタンパク質とが連結された融合タンパク質
（３３）（３２）記載の形質転換体の培養物又は培養上清をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と各ルシフェラーゼ活性に基づく発光スペクトルの発光強度を測定する工程とを含み、2以上のプロモーターの転写活性を評価することを特徴とする、プロモーター転写活性評価方法。
（３４）（１）〜（２７）のいずれか１記載の変異型ルシフェラーゼ又は（２８）記載の融合タンパク質をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と励起状態のオキシルシフェリン又はその誘導体を化学物質に作用させる工程とを含み、前記化学物質の励起に基づき発光させるか又はエネルギーを放出させることを特徴する、発光又はエネルギー放出方法。
本発明により、野生型ルシフェラーゼとは異なる発光スペクトルを付与するルシフェラーゼ活性を有する変異型ルシフェラーゼが提供される。また、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを用いれば、簡便で、且つ高感度なマルチレポーターアッセイ系を提供することができる。さらに、BRET解析をする際において、本発明に係る変異型ルシフェラーゼは優れたエネルギー供与体となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006-162662号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
図１は、各ルシフェラーゼについての波長に対する相対発光強度を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る第１の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第１変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質は、シプリディナ・ノクティルカ由来のルシフェラーゼ(CLuc)である。また、配列番号１に示される塩基配列は、CLucをコードする遺伝子(cDNA)である。
第１変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第375番目のリジンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、457nm以上、特に457nm〜490nm(例えば、457nm〜463nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、リジン以外のいずれのアミノ酸であってもよい。
一方、第１変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第375番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第375番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第167番目のトレオニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン、第405番目のトレオニン、第406番目のセリン、第407番目のイソロイシンが挙げられる。
また、第１変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチド(配列番号２に示されるアミノ酸配列の第1番目〜第18番目のアミノ酸配列から成る)を除いた成熟タンパク質である。一般的に、CLucを含めた分泌タンパク質は、N末端に分泌シグナルペプチドを有する前駆体の形態で合成される。この前駆体は、膜貫通の過程でシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質となる。本発明において、成熟タンパク質とは、細胞膜外又は細胞壁外に分泌されたタンパク質のことを意味する。
さらに、第１変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第２の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第２変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第２変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、449nm以下、特に420nm〜449nm(例えば、447nm〜449nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、メチオニン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、特にリジンが望ましい。
一方、第２変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第178番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ449nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第178番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第197番目のロイシンが挙げられる。
また、第２変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第２変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第３の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第３変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第３変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、458nm以上、特に458nm〜490nm(例えば、458nm〜460nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、トレオニン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、例えば、イソロイシン、ロイシン、リジンが挙げられ、特にイソロイシン又はリジンが望ましい。
一方、第３変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第167番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第167番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第375番目のリジン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン、第405番目のトレオニン、第406番目のセリン、第407番目のイソロイシンが挙げられる。
また、第３変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第３変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第４の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第４変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第４変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第404番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、458nm以上、特に458nm〜490nm(例えば、458nm〜460nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、アスパラギン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニンが挙げられ、特にグリシン又はセリンが望ましい。
一方、第４変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第404番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ458nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第404番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第38番目のリジン、第45番目のセリン、第75番目のバリン、第79番目のアルギニン、第87番目のアルギニン、第112番目のアスパラギン酸、第126番目のリジン、第167番目のトレオニン、第170番目のグルタミン酸、第191番目のロイシン、第223番目のメチオニン、第235番目のグルタミン、第258番目のバリン、第276番目のイソロイシン、第280番目のチロシン、第291番目のメチオニン、第313番目のトレオニン、第372番目のアルギニン、第375番目のリジン、第403番目のグルタミン、第405番目のトレオニン、第406番目のセリン、第407番目のイソロイシン、第479番目のグルタミン酸が挙げられる。
また、第４変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第４変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第５の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第５変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第５変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、457nm以上、特に457nm〜490nm(例えば、457nm〜460nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、トレオニン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、例えば、イソロイシン、メチオニン、ロイシンが挙げられ、特にイソロイシン又はメチオニンが望ましい。
一方、第５変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第405番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ457nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第405番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第38番目のリジン、第45番目のセリン、第75番目のバリン、第79番目のアルギニン、第87番目のアルギニン、第112番目のアスパラギン酸、第126番目のリジン、第167番目のトレオニン、第170番目のグルタミン酸、第191番目のロイシン、第223番目のメチオニン、第235番目のグルタミン、第258番目のバリン、第276番目のイソロイシン、第280番目のチロシン、第291番目のメチオニン、第313番目のトレオニン、第372番目のアルギニン、第375番目のリジン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン、第406番目のセリン、第407番目のイソロイシン、第479番目のグルタミン酸が挙げられる。
また、第５変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第５変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第６の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第６変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第６変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第406番目のセリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、460nm以上、特に460nm〜490nm(例えば、460nm〜462nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、セリン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、例えば、ロイシン、イソロイシンが挙げられ、特にロイシンが望ましい。
一方、第６変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第406番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第406番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第167番目のトレオニン、第375番目のリジン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン、第405番目のトレオニン、第407番目のイソロイシンが挙げられる。
また、第６変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第６変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
一方、本発明に係る第７の変異型ルシフェラーゼは、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質である(以下、「第７変異型ルシフェラーゼ」という)。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第７変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第407番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、このアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、460nm以上、特に460nm〜490nm(例えば、460nm〜462nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、他のアミノ酸としては、イソロイシン以外のいずれのアミノ酸であってよいが、例えば、グリシン、アラニンが挙げられ、特にアラニンが望ましい。
一方、第７変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上記第407番目のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ460nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。第407番目のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第167番目のトレオニン、第375番目のリジン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン、第405番目のトレオニン、第406番目のセリンが挙げられる。
また、第７変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第７変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
上記第１及び第３〜７変異型ルシフェラーゼにおける所定の各アミノ酸置換及び配列番号２に示されるアミノ酸配列の他の位置におけるアミノ酸置換のいずれか2以上(例えば、2〜10個、好ましくは2個〜8個、特に好ましくは2〜6個)を組み合わせた多重アミノ酸置換を含み、且つ458nm以上、特に458nm〜490nm(例えば、458nm〜475nm)の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質も本発明に係る変異型ルシフェラーゼに含まれる。このような多重アミノ酸置換を含む変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質で表される第８の変異型ルシフェラーゼ(以下、「第８変異型ルシフェラーゼ」という)が挙げられる：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第８変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第４変異型ルシフェラーゼのアミノ酸置換の位置に相当する第404番目のアスパラギン及び第５変異型ルシフェラーゼのアミノ酸置換の位置に相当する第405番目のトレオニンと共に、第191番目のロイシン、第235番目のグルタミン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン及び第403番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、これらアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、466nm以上、特に466nm〜490nm(例えば、466nm〜475nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、各アミノ酸位置におけるアミノ酸置換の例としては、以下の(A)〜(G)の組合せが挙げられる：
(A)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換；
(B)上記第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換；
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換；
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換；
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換；
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換；
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換。
一方、第８変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上述した所定のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ466nm以上の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。上述した所定のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第112番目のアスパラギン酸、第291番目のメチオニン、第313番目のトレオニンが挙げられる。
また、第８変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第８変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
また、上記第２変異型ルシフェラーゼにおけるアミノ酸置換及び配列番号２に示されるアミノ酸配列の他の位置におけるアミノ酸置換のいずれか2以上(例えば、2〜10個、好ましくは2個〜8個、特に好ましくは2〜6個)を組み合わせた多重アミノ酸置換を含み、且つ449nm以下、特に420nm〜449nm(例えば、425nm〜449nm)の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質も本発明に係る変異型ルシフェラーゼに含まれる。このような多重アミノ酸置換を含む変異型ルシフェラーゼとしては、例えば、以下の(a)〜(d)のいずれか1つのタンパク質で表される第９の変異型ルシフェラーゼ(以下、「第９変異型ルシフェラーゼ」という)が挙げられる：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(b)上記(a)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質；
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第178番目のメチオニン、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質；
(d)上記(c)のアミノ酸配列において、上記アミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質。
第９変異型ルシフェラーゼにおける上記(a)記載の変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列において、第２変異型ルシフェラーゼのアミノ酸置換の位置に相当する第178番目のメチオニンと共に、第191番目のロイシン、第280番目のチロシン、第372番目のアルギニン、第403番目のグルタミン、第404番目のアスパラギン及び第405番目のトレオニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質である。該タンパク質は、CLucと同様にルシフェラーゼ活性を示す。ところが、これらアミノ酸置換により、該タンパク質は、ルシフェラーゼ活性によるルシフェリン酸化の際の発光において、CLucによる発光スペクトルピークが454nmであるのに対して、435nm以下、特に420nm〜435nm(例えば、425nm〜435nm)の発光スペクトルピークとなる。ここで、各アミノ酸位置におけるアミノ酸置換の例としては、以下の(A)〜(G)の組合せが挙げられる：
(A)上記第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換；
(B)上記第191番目のロイシンからグルタミンへの置換；
(C)上記第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換；
(D)上記第372番目のアルギニンからロイシンへの置換；
(E)上記第403番目のグルタミンからプロリンへの置換；
(F)上記第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換；
(G)上記第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換。
一方、第９変異型ルシフェラーゼにおける上記(b)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼにおいて、上述した所定のアミノ酸以外の位置で、さらに1又は数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ435nm以下の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するものである。上述した所定のアミノ酸以外の位置としては、例えば、第291番目のメチオニン、第313番目のトレオニンが挙げられる。
また、第９変異型ルシフェラーゼにおける上記(c)記載の変異型ルシフェラーゼは、(a)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
さらに、第９変異型ルシフェラーゼにおける上記(d)記載の変異型ルシフェラーゼは、(b)記載の変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列からCLucの分泌シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質である。
なお、上述した第１〜第９変異型ルシフェラーゼの各(a)又は(c)記載のタンパク質のアミノ酸配列に対して、各所定のアミノ酸置換を維持し、80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つ所定の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有するタンパク質も本発明に係る変異型ルシフェラーゼに含まれる。
また、ルシフェラーゼの発光スペクトルピークについては、測定方法やスペクトル補正方法、スムージング処理などにより誤差が生じる場合がある。そこで、野生型ルシフェラーゼ(CLuc)に対して上述によって示された相対的な発光スペクトルピークの移動を伴う限り、上述した発光スペクトルピーク値の±数nmの誤差範囲内(例えば±5nm、好ましくは±4nm、特に好ましくは±2nm)の発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を有する変異型ルシフェラーゼも、本発明に係る変異型ルシフェラーゼに含まれる。
以下では、第１〜第９変異型ルシフェラーゼを合わせて、「本発明に係る変異型ルシフェラーゼ」という。
上述の本発明に係る変異型ルシフェラーゼは、外来タンパク質又はペプチドと連結された融合タンパク質とすることができる。ここで、外来タンパク質又はペプチドとは、本発明に係る変異型ルシフェラーゼに対して外因的なタンパク質又はペプチドを意味する。外来タンパク質又はペプチドとしては、例えば、タンパク質精製に使用されるタンパク質又はペプチド(グルタチオンS-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ストレプトアビジン結合ペプチド、ヒスチジンタグなど)、細胞外分泌又は細胞内器官への移行のためのシグナルペプチド(出芽酵母のαファクターの分泌シグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号３）、出芽酵母のインベルターゼのシグナルペプチド(アミノ酸配列：配列番号４)、出芽酵母の膜タンパク質Ste6pのシグナルペプチド(アミノ酸配列：配列番号５)等)が挙げられる。例えば、形質転換対象の宿主に適した分泌シグナルペプチドと本発明に係る変異型ルシフェラーゼの成熟タンパク質とを連結した融合タンパク質をコードする遺伝子を、宿主に形質転換することで、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを細胞外に分泌発現させることができる。本発明に係る変異型ルシフェラーゼに対して外来タンパク質又はペプチドを連結する位置は、本発明に係る変異型ルシフェラーゼと外来タンパク質又はペプチドとがそれぞれの機能又は活性を有するように適宜選択することができる。例えば、分泌シグナルペプチドと本発明に係る変異型ルシフェラーゼの成熟タンパク質とを連結した融合タンパク質においては、分泌シグナルペプチドを当該成熟タンパク質のN末端側(すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第19番目のアミノ酸のN末端側)に連結することができる。
本発明に係る遺伝子は、本発明に係る変異型ルシフェラーゼ又は上述の融合タンパク質をコードする遺伝子である。これら遺伝子を宿主に導入することで、本発明に係る変異型ルシフェラーゼ又は融合タンパク質を発現させることができる。
宿主としては、特に限定されるものではないが、酵母、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属等に属する細菌、COS細胞等の動物細胞、Sf9等の昆虫細胞、あるいはアブラナ科等に属する植物が挙げられる。また酵母としては、いずれの酵母であってもよいが、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）が挙げられ、特にサッカロミセス・セレビシエが好ましい。
先ず本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子又は外来タンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子を準備する。これら遺伝子は、例えば、これら遺伝子が由来する生物(例えば、シプリディナ・ノクティルカ)のゲノムDNA等を鋳型として、該領域の両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いたPCRによって容易に得ることができる。ただし、本発明に係る変異型ルシフェラーゼは、CLucのアミノ酸配列においてアミノ酸置換を有するものであるので、上述のように得られたPCR産物に、部位特異的突然変異誘発法等によって変異をさらに導入することによって、本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子を得ることができる。
一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子又は外来タンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子又は外来タンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子の変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。
なお、本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子又は外来タンパク質若しくはペプチドをコードする遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製)）などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子と外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子とを連結し、融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する場合には、本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子に外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を連結したDNAを準備する。このようなDNAは、連結したDNA自体であってもよく、当該DNAを含むベクターなどであってよい。
本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子に外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を連結する方法は、それぞれ精製された本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子及び外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を適当な制限酵素で切断し、連結する方法が採用される。また、本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子と外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子のそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、PCR等を用いたin vitro法又は酵母等を用いたin vivo法によって両者を連結する方法であってもよい。
本発明に係る遺伝子を含む組換えベクターは、適当なベクターに本発明に係る遺伝子を挿入することにより得ることができる。使用するベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド等が挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入すること等によって複製可能となるDNA断片であってもよい。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13等のYEp系、YCp50等のYCp系等)等が挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルスやバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明に係る遺伝子を挿入する方法は、上述した本発明に係る変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子に外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を連結する方法に準じて行うことができる。
さらに、本発明に係る遺伝子又は本発明に係る遺伝子を含む組換えベクター(以下、「本発明に係る組換えベクター等」という)を宿主中に導入することにより形質転換体を作製する。
酵母への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えば電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。また、YIp系等のベクターあるいは染色体中の任意の領域と相同なDNA配列を用いた染色体への置換・挿入型の酵母の形質転換法であっても良い。さらに酵母への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、一般的実験書または学術論文などに記載されたいかなる方法によってもよい。
細菌への本発明に係る組換えベクター等の導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞等が用いられる。動物細胞への本発明に係る組換えベクター等の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞等が用いられる。昆虫細胞への本発明に係る組換えベクター等の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
植物を宿主とする場合は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞等が用いられる。植物への本発明に係る組換えベクター等の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等が挙げられる。
本発明に係る組換えベクター等が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光、酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
次いで、得られた形質転換体を生育可能な条件下で培養する。形質転換体の培養物や培養上清をそのまま酵素活性の測定に供する場合には、本発明に係る変異型ルシフェラーゼが失活しない条件下で培養することとなる。例えば、本発明に係る組換えベクター等を導入した形質転換酵母の培養において、酵母が生育し且つ本発明に係る変異型ルシフェラーゼが失活しないように、温度は、例えば4〜37℃、好ましくは20〜30℃に設定する。また培地のpHは、例えば3.5〜6.5、好ましくは5.5〜6.0に設定すればよい。培養時間は、例えば1〜120時間、好ましくは対数増殖期である1〜24時間である。
以上のようにして、本発明に係る変異型ルシフェラーゼ又は本発明に係る変異型ルシフェラーゼと外来タンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質を上述の形質転換体より得ることができる。
本発明に係る変異型ルシフェラーゼの活性の測定では、例えば、上述の形質転換体の培養後、得られる培養物又は培養上清を、本発明に係る変異型ルシフェラーゼの酵素反応が生じうる条件下で、基質であるルシフェリン(例えば、ウミホタルルシフェリン)又はその誘導体と接触させる。ここで、ルシフェリン誘導体としては、例えば、ルシフェリンのイミダゾピラジノン骨格におけるC2位、C6位又はC8位側鎖の化学構造を、例えば芳香族、脂肪族、あるいはカルボン酸やアミノ基などの水溶液中で電離するような官能基等に置換したものが挙げられる。ウミホタルルシフェラーゼによって発光する限り、官能基の構造や位置は限定されない。このような置換により、発光強度増強、自己分解抑制等の改善が期待できる。
また、酵素反応が生じる条件とは、本発明に係る変異型ルシフェラーゼの活性中心にルシフェリンが特異的に結合して複合体が生成され、酵素反応が進む条件を意味する。また、接触とは、培養物又は培養上清中の本発明に係る変異型ルシフェラーゼとルシフェリンとが近接し、酵素反応が生じる状態を意味する。また、培養物とは、形質転換体を含む培養液や培地を意味する。本発明に係る変異型ルシフェラーゼが、例えば、宿主に適した分泌シグナルペプチドと連結されている場合には、培地中に分泌されるため、形質転換体を含む培養液や培地をそのまま使用することができる。あるいは、形質転換体を遠心分離等によって分離した培養上清を使用してもよい。培養上清は、例えば、希釈、濃縮、透析、精製等に供することもできる。
接触させる条件として、温度は、例えば0〜40℃、好ましくは15〜30℃に設定する。またpHは、例えば4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0に設定すればよい。接触時間(反応時間)は、例えば1秒〜30分間、好ましくは1秒〜30秒間である。特に種々の緩衝液で希釈したルシフェリン又はその誘導体の溶液を培養物又は培養上清に添加することで、培養物又は培養上清のpHを本発明に係る変異型ルシフェラーゼの酵素活性が高いpHにシフトすることができる。例えば、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを含む培養物又は培養上清に対して、2M以下(好ましくは50mM〜200mM)で、且つpH3.5〜9.0(好ましくはpH7.0〜8.0)のトリス塩酸緩衝液(Tris-HCl)等の緩衝液で希釈したルシフェリン又はその誘導体の溶液を添加することで、上述した接触時のpHを設定することができる。
培養物又は培養上清に対する基質であるルシフェリン又はその誘導体の濃度は、例えば本発明に係る変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体の培養物又は培養上清の濁度（例えば600 nmにおける吸光度)0.05以上に対して、ルシフェリン又はその誘導体を0.1μM以上、好ましくは1.25〜2.5μMの終濃度となるように添加する。
次いで、本発明に係る変異型ルシフェラーゼの酵素活性を測定する。測定方法は、例えば、形質転換体の培養物又は培養上清とルシフェリン又はその誘導体との混合物を、ルミノメーターを用いた発光測定に供し、相対発光強度(RLU)として酵素活性を測定する。また、活性測定時に酵素活性を補正して測定値を標準化するために、培養液又は培養上清の濁度（例えば600 nmにおける吸光度）を測定し、相対発光強度を濁度で除することによって補正した値(RLU/OD)を、酵素活性値とすることができる。あるいは、相対発光強度を標準化するために、形質転換体に含まれるATP量を測定し、この値で相対発光強度を除する方法も好ましい。さらに、形質転換体において、同時に別の酵素やタンパク質を発現させて、その酵素又はタンパク質量を測定し、その値で相対発光強度を除して補正する方法でもよい。本発明に係る変異型ルシフェラーゼは、CLucとは異なる発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を示す。この発光スペクトルが異なる性質を利用して、発光を見分けることができ、CLucを発現させて、そのCLuc由来の発光で除して補正する方法でもよい。
また、例えば、宿主がサッカロミセス・セレビシエ等の微生物である場合、形質転換体は寒天培地において生育し、コロニーを形成する。そこで、例えば、形質転換体を含む寒天培地にルシフェリン又はその誘導体を添加した後、コロニーの発光強度を、例えばCCDカメラなどを有する発光検出器を用いて測定することによって酵素活性を測定することができる。
さらに、本発明に係る変異型ルシフェラーゼは、CLucとは異なる発光スペクトルピークのルシフェラーゼ活性を示す。そこで、上述したルシフェラーゼ活性の測定に加えて、例えば、透過特性の異なる複数の光学フィルターとCCDカメラとを有する発光検出器を用いて、本発明に係る変異型ルシフェラーゼが上述した範囲の発光スペクトルピークを有するか否かを測定する。
このようなルシフェラーゼ活性及び発光スペクトルピークの測定によって、有意なルシフェラーゼ活性と意図した発光スペクトルピークが示された場合に、本発明に係る変異型ルシフェラーゼが得られたと判断することができる。
また、以上に説明した発光スペクトルピークの測定に準じて、CLuc並びに本発明に係る変異型ルシフェラーゼをレポータータンパク質として用いて、複数のプロモーターの転写活性を同時に評価することができる。
本発明に係るプロモーター転写活性評価方法では、野生型CLuc、本発明に係る変異型ルシフェラーゼ並びに野生型CLuc又は本発明に係る変異型ルシフェラーゼと外来タンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質のうち、2以上のルシフェラーゼを使用する。ここで、野生型CLucとは、以下のタンパク質を意味する。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るCLuc；
(b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、分泌シグナルペプチドを欠失したアミノ酸配列から成る成熟タンパク質。
また、野生型CLucと外来タンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質とは、外来タンパク質又はペプチドと上記(a)又は(b)のタンパク質とが連結された融合タンパク質を意味する。
先ず、これら2以上のルシフェラーゼ遺伝子のそれぞれ5'上流側に評価対象のそれぞれ異なるプロモーターを連結したDNAを宿主に導入する。ルシフェラーゼ遺伝子の5'上流側にプロモーターを連結させることで、当該プロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子が配置されることとなる。次いで、得られた形質転換体を培養し、培養物又は培養上清を得る。さらに、培養物又は培養上清をルシフェリン又はその誘導体と接触させる。次いで、導入した複数のルシフェラーゼの活性による発光スペクトルピークの違いによるそれぞれの発光強度を測定することで、複数のプロモーターの転写活性を同時に、且つ定量的に評価することができる。この際、複数のプロモーターのうち1つのプロモーターの転写活性を基準とし、他のプロモーターの転写活性を補正することもできる。複数の発光スペクトルピークの違いに基づく発光強度は、例えば、特開2004-187652号公報に記載の原理を応用した機器であるアトー株式会社のマルチレポーターアッセイ対応ルミノメーター「AB-2250ルミネッセンサーMCA」に適当なフィルターセットを装着すること等で測定することができる。
さらに、本発明に係る変異型ルシフェラーゼあるいは本発明に係る変異型ルシフェラーゼと外来タンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質を、BRET(Bioluminescence resonance energy transfer）等に用いて発光又はエネルギーを放出させることができる。
本発明に係る発光又はエネルギー放出方法では、先ず、本発明に係る変異型ルシフェラーゼあるいは本発明に係る変異型ルシフェラーゼと外来タンパク質若しくはペプチドとの融合タンパク質を、ルシフェリン又はその誘導体と接触させる。この接触により、ルシフェリンは励起状態のオキシルシフェリンへと酸化される。次いで、この励起状態のオキシルシフェリンと化学物質とを作用させる。ここで、化学物質とは、発光体の励起エネルギーをエネルギー共鳴によって受け取り、そのエネルギーによって蛍光を発することができる物質を意味する。化学物質としては、例えば、フルオロセイン、FITC、TRITC、TAMRA、並びにGFP（オワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質）及びその変異体(CFP、YFP等)並びにDsRed(カイメン由来赤色蛍光タンパク質)等の蛍光タンパク質が挙げられる。また、作用とは、オキシルシフェリンと化学物質とを距離的に、且つ位相的にエネルギーを転移できる位置に配置することを意味する。
次いで、作用させることで、オキシルシフェリンが基底状態に戻る際の発光又は発光に関与するエネルギーが化学物質に移行し、励起し、その励起エネルギーに依存して発光させるか又はエネルギーを放出させることができる。
以上に説明したように、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを用いることで、一種類の基質と一度の発光測定による複数の異なるプロモーターの転写活性の測定(マルチレポーターアッセイ)が可能である。また、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを用いることで、特定の化学物質の励起スペクトルに合った発光スペクトルが提供され、より高いBRET効率を示し、強いシグナルが得られる。さらに、本発明に係る変異型ルシフェラーゼを用いることで、複数のBRETを利用した複数のタンパク質の構造変化の同時解析が可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明に係る複数の変異型ルシフェラーゼとそれらが由来するルシフェラーゼをサッカロミセス・セレビシエで発現させ、それぞれの発光スペクトルを比較した。
〔実施例１〕サッカロミセス・セレビシエにおけるCLucの分泌発現
サッカロミセス・セレビシエにおいて、CLucを分泌発現させる発現ベクターとして、国際公開第2006/132350号パンフレットに開示のプラスミドpCLuRA-TDH3を用いた。
このプラスミドpCLuRA-TDH3は、出芽酵母のαファクターの分泌シグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号３）とCLucの成熟タンパク質（配列番号２に示すCLucのアミノ酸配列において、1-18番目のアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列）との融合タンパク質（以下、「αCLuc」という）をコードする遺伝子（以下、「αCLuc遺伝子」という）を含んでいる。配列番号６に示すアミノ酸配列は、αCLucのアミノ配列である。αファクター由来の分泌シグナルペプチドとの融合タンパク質とすることで、CLucが菌体外へ分泌される。
さらに、このプラスミドpCLuRA-TDH3においては、αCLuc遺伝子の上流（5'側）に、サッカロミセス・セレビシエのTDH3（系統的遺伝子名：YGR192C）遺伝子のプロモーターが組み込まれている。このプロモーターによって、αCLuc遺伝子の発現が制御される。配列番号７に示す塩基配列は、プラスミドpCLuRA-TDH3の部分塩基配列であり、TDH3プロモーター配列を含むαCLucの開始コドン5'上流700bp、αCLucのコード領域、及びCYC1ターミネーター配列を含むαCLucの終止コドン3'下流300bpまでを含む配列である。
このプラスミドpCLuRA-TDH3を用いて、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。形質転換には、EZ-transformation kit(BIO101)を用いた。
得られた形質転換体を、ウラシルを含まない合成寒天培地(0.67％ Yeast nitrogen base without amino acids(ベクトンディッキンソン)、40μg/ml アデニン、20μg/ml L-アルギニン一塩酸塩、100μg/ml L-アスパラギン酸、100μg/ml L-グルタミン酸ナトリウム一水和物、20μg/ml L-ヒスチジン、60μg/ml L-ロイシン、30μg/ml L-リジン塩酸塩、20μg/ml L-メチオニン、50μg/ml L-フェニルアラニン、375μg/ml L-セリン、200μg/ml L-トレオニン、40μg/ml L-トリプトファン、30μg/ml L-チロシン、150μg/ml L-バリン、2％グルコース及び2.0％寒天：以下では単に「SD-ura寒天培地」という)に塗布し、30℃で3日間培養した。その結果、プラスミドpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を得た。
上記のように得られたプラスミドpCLuRA-TDH3を保有する形質転換体を、緩衝作用を有し、且つウラシルを含まない合成液体培地（0.67％ Yeast nitrogen base without amino acids(ベクトンディッキンソン)、40μg/mlアデニン、20μg/ml L-アルギニン一塩酸塩、100μg/ml L-アスパラギン酸、100μg/ml L-グルタミン酸ナトリウム一水和物、20μg/ml L-ヒスチジン, 60μg/ml L-ロイシン、30μg/ml L-リジン塩酸塩、20μg/ml L-メチオニン、50μg/ml L-フェニルアラニン、375μg/ml L-セリン、200μg/ml L-トレオニン、40μg/ml L-トリプトファン、30μg/ml L-チロシン、150μg/ml L-バリン、2％グルコース及び200mMリン酸カリウム, pH6.0：以下では単に「buffered SD-ura培地」という)に接種して30℃で24時間振盪培養した。
振盪培養後、培養液を遠心分離し、培養上清を単離した。単離した20μlの培養上清に対し、80μlのルシフェリン溶液（1μMルシフェリン、100mM Tris-HCl, pH7.4)を加え、ベルトールドLB960ルミノメーターで発光を測定した。その結果、4x105RLU/秒の発光が観察された。つまり、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株で、CLucが分泌発現されていることが確認された。
〔実施例２〕ランダム変異導入による変異型ルシフェラーゼの単離
2-1．変異型CLuc遺伝子ライブラリー(N領域変異型ライブラリー)の作製
プラスミドpCLuRA-TDH3のαCLucコード領域にError Prone PCR (誤りがちPCR)を用いてランダム点突然変異を導入した。
変異を導入する対象領域は、αCLucコード領域の前半部分（配列番号７に示す塩基配列において第900番目〜第1813番目の塩基配列、以下「N領域」と称する）とした。範囲を限定した理由は、Error Prone PCRにおいて、長い領域の増幅が困難である場合が多いためである。また、配列番号７に示す塩基配列において第701番目〜第899番目の塩基配列を対象領域としなかった理由は、この部分が大部分αファクターの分泌シグナルペプチドをコードする領域であったためである。
N領域のError Prone PCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した。
mut-CLuc-F: ATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAG（配列番号８）
mut-CLuc-NR2: CACGTGTGAGGCTCGCTCGTCTCCACCCAT（配列番号９）
N領域を対象としたError Prone PCRの反応液の組成は以下の通りであった：Taq DNA polymerase(ロッシュ、1 unit/μl)5μl; 10xPCR buffer without magnesium ion 10μl; Error Prone PCR用デオキシヌクレオチド混合溶液10μl; 25mM塩化マグネシウム28μl; 5mM塩化マンガン2.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(150ng/μl)1μl; mut-Cluc-F(配列番号８)(10pmol/μl)3μl; mut-CLuc-NR2(配列番号９)(10pmol/μl)3μl; 滅菌水37.3μl。
上述のError Prone PCR用デオキシヌクレオチド混合溶液の組成は以下の通りであった：100mM dCTP 100μl; 100mM dTTP 100μl; 100mM dGTP 20μl; 100mM dATP 20μl; 滅菌水760μl。
Error Prone PCR反応は、94℃で1分(変性)、45℃で1分(アニーリング)及び72℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
Error Prone PCR反応によって得られたPCR産物を、1％アガロースで電気泳動した結果、約900bpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSで精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA,pH8.0)に溶解し、DNA溶液とした。
次いで、サッカロミセス・セレビシエに導入するのに十分な量のDNAを確保するために、上記DNA溶液を鋳型としてさらにPCRを行った(以下、「2nd PCR」と称する）。
2nd PCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績)1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; mut-Cluc-F(配列番号８)(10pmol/μl)1.5μl; mut-CLuc-NR2（配列番号９）(10pmol/μl)1.5μl; 上記DNA溶液1μl; 滅菌水33μl。
2nd PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
2nd PCR反応によって得られたPCR産物を、1％アガロースで電気泳動した結果、約900bpのDNA断片を確認した。以下、このDNA断片を「N領域断片」と称する。
N領域断片を、アガロースゲルからシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSを用いて精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液に溶解した（以下、「N領域断片溶液」と呼ぶ）。
サッカロミセス・セレビシエは、一般に細胞内で高い確率で相同組換えを起こす。そこで、プラスミドpCLuRA-TDH3の塩基配列のうち、配列番号７に示す塩基配列において967番目から1703番目の塩基配列を欠いた直鎖状DNA断片（以下、「補N領域断片」と称する）を、上述のように変異を導入した「N領域断片」と同時にサッカロミセス・セレビシエに導入すれば、サッカロミセス・セレビシエ内で環状DNA（N領域に変異が導入された変異型プラスミドpCLuRA-THD3）が相同組換えにより再構成され、サッカロミセス・セレビシエはこの再構成されたプラスミドで形質転換され得る。
「補N領域断片」を、以下のようにしてPCRにより作製した。PCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを用いた。
vec-CLuc-R: GCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAG(配列番号１０）
SQ-CLuc-NF2: TTCTCGAGCCGTACAAGGACAGCTGCCGCA(配列番号１１）
PCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績)1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; vec-CLuc-R(配列番号１０)(10pmol/μl)1.5μl; SQ-CLuc-NF2（配列番号１１)(10pmol/μl)1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(150ng/μl)1μl; 滅菌水33μl。
PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)及び68℃で8分(アニーリング及び伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
得られたPCR産物を、1％アガロースで電気泳動した結果、約7kbpのDNA断片を確認した。このDNA断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSで精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液に溶解した（以下、「補N領域断片溶液」と呼ぶ）。
N領域断片と補N領域断片との間でオーバーラップする部分は、配列番号７に示す塩基配列において、第900番目〜第966番目の塩基配列及び第1704番目〜第1813番目の塩基配列であった。
N領域断片溶液と補N領域断片溶液とを、それぞれ5μlずつ混合し、酢酸リチウム法で、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。形質転換に供したサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を、SD-ura寒天培地に塗沫し、30℃で48時間保温した。出現した多数のコロニーを、N領域変異型ライブラリーとした。
2-2．変異型CLuc遺伝子ライブラリー(C領域変異型ライブラリー)の作製
上述のN領域変異型ライブラリーの作製と同様に、αCLucコード領域の後半部分を変異を導入する対象領域としたC領域変異型ライブラリーを作製した。
変異を導入する対象領域は、αCLucコード領域の後半部分とαCLucコード領域の3'側非コード領域の約60bp（配列番号７に示す塩基配列において第1554番目〜第2663番目の塩基配列、以下「C領域」と称する）とした。C領域にαCLucコード領域の3'側非コード領域を含めた理由は、変異を導入すべきαCLucコード領域の外で細胞内相同組換えを起こすようにし、αCLucコード領域のC末端コード領域に対する変異導入の効率に影響を与えないようにするためである。
上述のN領域変異型ライブラリーのN領域断片に相当するC領域断片を、以下のオリゴDNAプライマーを用いた以外は上記Error Prone PCR及び2nd PCRと同様の方法でPCRを行い、作製した。
mut-CLuc-CF1: TCTCTGGCCTCTGTGGAGATCTTAAAATGA(配列番号１２）
mut-CLuc-R: AACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGT(配列番号１３）
得られたPCR産物を、1％アガロースで電気泳動した結果、約1,100bpのDNA断片を確認した。次いで、このDNA断片(C領域断片)を、アガロースゲルからシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSを用いて精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液に溶解し、C領域断片溶液を得た。
上述のN領域変異型ライブラリーの補N領域断片に相当する補C領域断片を作製した。補C領域断片の作製は、補N領域断片の作製方法に準じて行った。相違点は、用いたオリゴDNAプライマーと、PCR反応条件であった。
用いたオリゴDNAプライマーは以下の通りであった。
vec-CLuc-F: TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTA(配列番号１４）
SQ-CLuc-CR1: TGGACAACCGTCAAACTCCTGGTTGATCTT(配列番号１５）
PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒（変性）、55℃で30秒（アニーリング）及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
得られたPCR産物を、1％アガロースで電気泳動した結果、約6.5kbpのDNA断片を確認した。このDNA断片(補C領域断片)を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSで精製し、エタノール沈殿を行った後、20μlのTE緩衝液に溶解し、補C領域断片溶液を得た。
C領域断片と補C領域断片との間でオーバーラップする部分は、配列番号７に示す塩基配列において、第1554番目〜第1663番目の塩基配列及び第2576番目〜第2663番目の塩基配列であった。
C領域断片溶液と補C領域断片溶液とを、それぞれ5μlずつ混合し、酢酸リチウム法で、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。形質転換に供したサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を、SD-ura寒天培地に塗沫し、30℃で48時間保温した。出現した多数のコロニーを、C領域変異型ライブラリーとした。
2-3．変異型ルシフェラーゼのスクリーニング
発光スペクトルがシフトした変異型ルシフェラーゼのスクリーニングは、その発光を、透過特性が異なる2種類の光学フィルターを使って、CCDカメラで順次撮影することによって行った。使用した光学フィルターは、SCHOTT社のGG495とBG28である。前者は、495nm付近を境とするロングパスフィルターである。後者は、450nm付近を透過極大とするバンドパスフィルターである。同一試料（ルシフェラーゼが含まれる培養上清）を、それぞれのフィルターを順次使用してCCDカメラで撮影し、その記録された信号強度を比較した。その比率が野生型CLucと異なっていれば、発光スペクトルのシフトが起きていることになる。
96穴ディープウェルプレート（2ml/ウェル）に、1mlずつbuffered SD-ura培地を分注し、N領域変異型ライブラリー又はC領域変異型ライブラリーのコロニーを、コロニーピッカーでそれぞれのウェルに1コロニーずつ植菌した。なお、対照として、6ウェルには、変異が導入されていない野生型CLucを分泌発現するサッカロミセス・セレビシエ(プラスミドpCLuRA-TDH3で形質転換されたBY4743ΔPRB1株）を植菌した。
次いで、植菌したプレートを、30℃において約48時間培養した後、1,800rpmで遠心分離して、各ウェルから培養上清20μlを黒色96穴プレートに移した。
それぞれのウェルに、ルシフェリン溶液（1μM ルシフェリン、100mM Tris-HCl, pH7.4)を加え、GG495を装着したATTO社Light Captureにプレートをセットし、30秒〜2分間撮影した。次いで、直ちに光学ガラスフィルターをBG28に換装し、再び30秒〜2分間撮影した。撮影画像は、TIFFファイルとしてコンピューターに保存した。
それぞれのフィルターで撮影した画像を、画像処理ソフトウェア（例えば、Adobe Photoshop）で処理し、GG495とBG28とで撮影した画像の信号強度の比を疑似色化し、野生型CLucのものと目視比較することによって、発光スペクトルシフトが起きていると思われるクローンを選び出した。
このように、N領域変異型ライブラリー及びC領域変異型ライブラリーのそれぞれ千数百クローンをスクリーニングすることによって、N領域変異型ライブラリーからは、短波長側にシフトしたと思われるM178K変異体(配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンがリジンに置換されたM178K変異型CLucを有するクローン；第２変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する)を、一方、C領域変異型ライブラリーからは長波長側にシフトしたと思われるK375R変異体及びK375E変異体(配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第375番目のリジンがそれぞれアルギニン及びグルタミン酸に置換されたK375R変異型及びK375E変異型CLucを有するクローン；第１変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する)を得た。
ここで、例えば、「K375R変異型CLuc」とは、配列番号２において第375番目の位置に相当するリジンがアルギニンに置換された変異型CLucを表す。アミノ酸のアルファベット記号は国際純正・応用化学連合-国際生化学連合（IUPAC-IUB）勧告によるアミノ酸を表す一文字記号である。また、「K375R変異体」とは、K375R変異型CLucを有するクローンを表す。さらに、K375R変異体が保持するプラスミドを「pCLuRA-TDH3[K375R]」と称する。以下では、変異型CLuc、変異型CLucを有する変異体(クローン)、及び変異体が保持するプラスミドを同様の様式で称する。
2-4．変異型ルシフェラーゼの発光スペクトル測定
以下の(a)〜(d)の形質転換酵母を、それぞれbuffered SD-ura培地で振盪培養した後、遠心分離によって、その培養上清を回収した。回収した培養上清を、それぞれVivaSpin(分画分子量10,000、ザルトリウス社）で10倍程度に濃縮した。
(a)野生型CLucを分泌発現するサッカロミセス・セレビシエ(プラスミドpCLuRA-TDH3で形質転換されたBY4743ΔPRB1株）
(b)M178K変異体
(c)K375R変異体
(d)K375E変異体
次いで、得られた各培養上清の濃縮液を、ATTO社AB-1850発光分光光度計に供し、発光スペクトルを測定した。
反応液の組成は以下の通りであった：1μMルシフェリン、100mM Tris-HCl, pH7.5、及び上記濃縮液1〜3μl程度。
測定した発光スペクトルを図１に示す。図１は、各ルシフェラーゼについての波長に対する相対発光強度を示す。「野生型」は野生型CLuc、「M178K」はM178K変異型CLuc、「K375R」はK375R変異型CLuc、「K375E」はK375E変異型CLucの測定結果である。
図１から判るように、目測では、野生型CLucの発光スペクトルピークは453nmであったのに対して、K375R変異型CLucの発光スペクトルピークは461nmで、8nm長波長側にシフトしていた。また、K375E変異型CLucの発光スペクトルピークは460nmで、7nm長波長側にシフトしていた。一方、M178K変異型CLucの発光スペクトルピークは447nmで、6nm短波長側にシフトしていた。
このように、K375R変異型CLucとM178K変異型CLucとの発光スペクトルピーク差は14nm、またK375E変異型CLucとM178K変異型CLucとの発光スペクトルピーク差は13nmであり、デュアルレポーターアッセイに使用可能であると思われた。
2-5．変異型ルシフェラーゼの発光スペクトルからのスペクトルピーク波長の決定
ATTO社AB-1850発光分光光度計にて測定したスペクトルについては、以下のように、さらにデータを処理して、スペクトルピークを求めた。
まず、同機器に付属の制御プログラムを利用して、測定波長及び発光強度から成るデータをファイルに書き出した。次いで、同機器に付属の補正用マクロファイル（Microsoft社Excelのファイル）にこの書き出したデータを読み込ませ、波長に依存した検出器感度の補正を行うと共に、バックグラウンド（容器のみで発光スペクトルを測定したもの）を差し引いたデータを得た。次に、このデータについて、第一列を波長、第二列を（正規化された）発光強度とするcsv形式（カンマ区切りのテキスト形式）ファイルとして書き出した。
さらに、得られたファイルを、デジタルデータ分析ソフトOriginLab社製OriginPro v7.5に読み込ませ、発光強度のノイズを取り除く処理を行った。ノイズ処理には、FFT（高速フーリエ変換）解析を用いた。先ず、FFT解析を行い、波長分布（なお、OriginPro上では、横軸を周波数と見なすため、内部処理はHzで行っている）を求めた。この波長分布から、高調波波長成分をノイズとみなし、LPF（ロー・パス・フィルター）処理を行い、データのフィルタリングを行った。フィルタリング周期波長については、ノイズを含んだ原データと処理後のデータの一致性の観点から、全てのデータについて0.05を採用した。全てのデータは一律にOriginPro上でLPF処理により0.05以上の周期波長成分をカットし、同プログラムの機能により逆フーリエ変換を行った後、ファイルに出力した。本処理によってスペクトルのアウトライン及びピーク位置を変えることなく、ノイズの少なく、なめらかなスペクトル曲線に変換することが可能となった。
最後に、このファイルを、Microsoft社製Microsoft Excel 2003で読み込み、発光強度が最大値となる波長を自動判別し、その波長をピーク波長とした。
上記2-4に示す野生型CLuc及び各変異型CLucを用いたスペクトル測定については基本的に2回の測定を行い、それぞれ別々に上記のスペクトルピーク波長決定の処理を行った。複数回の測定を行った場合には、得られたスペクトルピーク波長の平均を求め、その値を採用した。同じサンプルについて2回以上測定した場合において、個々のスペクトルピーク波長の値とその平均値とのずれはおよそ1nm以内であった。
このようなスペクトルピーク波長の決定方法によれば、上記2-4のM178K変異型CLucの発光スペクトルピークは、図１に基づく目測の447nmから449nmへとずれた。なお、野生型CLuc及び他の変異型CLucの発光スペクトルピークについてもそれぞれ、目測の453nmから454nmへ（野生型CLuc）、目測の461nmから463nmへ（K375R変異型CLuc）、目測の460nmから462nm（K375E変異型CLuc）へとずれた。目測によるスペクトルピーク波長の決定は誤差が大きいと考えられるので、以下上記のようなデータ処理を統一して施し、スペクトルピーク波長をデータ処理により自動的に決定する方法を用いた。
以下の実施例においては、当該スペクトルピーク波長の決定方法に基づいて、変異型CLucの発光スペクトルピークを決定した。
なお、以下の実施例において、特に断らない限り、アミノ酸の位置に関する説明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に関するものである。
〔実施例３〕T167飽和変異ライブラリーの構築と変異型CLucのスクリーニング
実施例２に記載のスクリーニングの結果、T167I変異体（配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンがイソロイシンに置換されたT167I変異型CLucを有するクローン；第３変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する）を得た。このクローンが保持するプラスミドを「pCLuRA-TDH3[T167I]」と称する。このT167I変異体が分泌する変異型CLucによる発光スペクトルピークは、実施例２の2-5に記載した方法で測定した結果、458nmであり、野生型CLucと比べて4nm長波長側にシフトしていた。
そこで、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第167番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリー（以降、「T167飽和変異ライブラリー」という）を以下のように構築し、さらに長波長側にシフトした変異体の取得を試みた。
T167飽和変異ライブラリーは以下のようにして構築した。
先ず、以下のPCR反応を行った。用いたオリゴDNAプライマーはFAR-F: AACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCT（配列番号１６）とT238-Rev: GTACGGGTTGGCGATGATAGG（配列番号１７）であった。このPCRによって得られるDNA断片は、配列番号７に示す塩基配列において第1番目〜第1411番目の塩基配列に相当する。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; FAR-F（配列番号１６）(10pmol/μl) 0.6μl; T238-Rev（配列番号１７）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(3.8ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で2分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約1.4kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNS及びエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液A」とした。
次に以下のPCR反応を行った。用いたオリゴDNAプライマーは、T238X-Fw: CCTATCATCGCCAACCCGTACNNNATCGGCGAGGTCACCATCGCT（配列番号１８）と3'-UTR: GTAATACGACTCACTATAGGGCGAA（配列番号１９）であった。配列中の「N」とはA,T,G,Cのいずれかであることを意味する。T238X-Fw（配列番号１８）中の「NNN」によって、配列番号２における第167番目のアミノ酸に飽和変異が導入される。このPCRによって得られるDNA断片は、配列番号７に示す塩基配列において第1391番目〜第2875番目の塩基配列であるが、T238X-Fw（配列番号１８）に由来する配列「NNN」によって、第1412番目から続く3塩基（配列番号２における第167番目のアミノ酸に対応するコドン）にランダム変異が導入されている。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; T238X-Fw（配列番号１８）(10pmol/μl) 0.6μl; 3'-UTR（配列番号１９）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(3.8ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、59℃で30秒(アニーリング)及び68℃で2分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約1.5kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNS及びエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液B」とした。
さらにDNA溶液AとDNA溶液Bの等量混合液を鋳型として以下のPCR反応を行った。このPCRによって増幅され得るDNA断片は、配列番号７に示す塩基配列において第900番目〜第1813番目の塩基配列であるが、DNA溶液B中のDNA分子に存在する配列「NNN」によって、第1412番目から続く3塩基（配列番号２における第167番目のアミノ酸に対応するコドン）にランダムに変異が導入されている。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; mut-CLuc-F（配列番号８）(10pmol/μl) 1.5μl; mut-CLuc-NR2（配列番号９）(10pmol/μl) 1.5μl; DNA溶液A 0.5μl; DNA溶液B 0.5μl; 滅菌水 33μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、53℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約900bpのDNA断片を確認した。残りのPCR反応溶液を、シグマ社GeneElute PCR Clean-Up Kitとエタノール沈殿で精製し、25μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液C」とした。
次いで、DNA溶液Cと「補N領域断片」DNA溶液の等量混合物を用いて、実施例２に記載の方法で、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換し、このようにしてT167飽和変異ライブラリーを構築した。
このT167飽和変異ライブラリーから実施例２に記載の方法でスクリーニングした結果、T167K変異体（配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第167番目のトレオニンがリジンに置換されたT167K変異型CLucを有するクローン；第３変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する）を得た。この変異体が保持するプラスミドを、以後「pCLuRA-TDH3[T167K]」と称する。
実施例２に記載の方法で発光スペクトルを測定した結果、T167K変異型CLucの発光スペクトルピークは459nmであり、野生型CLucと比較して、5nm長波長側にシフトしていた。
〔実施例４〕プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]の作製
プラスミドpCLuRA-TDH3[K375R]をもとにして、そのαCLuc遺伝子のうち、αファクターの分泌シグナルペプチド（アミノ酸配列：配列番号３）をコードする部分に変異を導入し、新たなプラスミド「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]」を作製した。このプラスミドでは、K375R変異に加えて、配列番号３と配列番号６に示される第21番目のプロリンがロイシンに置換されている（これを、以後「αP21L変異」と称する）。αP21L変異を有するαファクターの分泌シグナルペプチドは、そのC末端側に連結されている分泌されるべきタンパク質の分泌量を7倍以上に向上させる（特許文献３）。αP21L変異導入により、ルシフェラーゼの分泌量が増加し、結果として発光強度が増強される。当然、このプラスミドにコードされているCLucは、K375R変異型CLucである。なお、プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L]（特許文献３）とは、pCLuRA-TDH3のαCLuc遺伝子について、配列番号３と配列番号６に示される第21番目のプロリンがロイシンに置換されるべく、配列番号７において762番目の塩基シトシンがチミンに塩基置換されているプラスミドである。
pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]の作製方法は、以下の通りであった。
先ず、以下のPCR反応を行った。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; mut-CLuc-CF1（配列番号１２）(10pmol/μl) 0.6μl; mut-CLuc-R（配列番号１３）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[K375R]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、53℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分15秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約1kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液D」とした。この断片は、配列番号７に示す塩基配列において第1554番目〜第2663番目の塩基配列（ただし、K375Rアミノ酸置換に係わる塩基置換を含む）に相当する。
続いて、以下のPCR反応を行った。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; vec-CLuc-F（配列番号１４）(10pmol/μl) 0.6μl; SQ-CLuc-CR1（配列番号１５）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、53℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約6.5kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液E」とした。この断片は、プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L]の塩基配列のうち配列番号７に示す塩基配列において第1664番目から第2575番目の塩基の間の領域を欠いた塩基配列に相当する。
次いで、DNA溶液DとDNA溶液Eの等量混合物を用いて、実施例２に記載の方法でサッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換し、コロニーを形成させた。DNA溶液DとDNA溶液E中にそれぞれに含まれるDNA断片は、配列番号７に示す塩基配列において第1554番目〜第1663番目の間の塩基配列、及び第2576番目〜第2663番目の間の塩基配列を共有している。
得られたコロニーの一つを培養し、菌体からプラスミドを含むDNAを抽出精製した。このDNAを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーの一つを培養し、常法によりプラスミドDNAを抽出精製し、配列番号７に示す塩基配列において第1番目から第2875番目の間の塩基配列を調べ、所望の塩基置換が生じていることを確認し、pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]とした。
〔実施例５〕T405I変異型CLuc
実施例２に記載の方法で新たな変異型CLuc遺伝子ライブラリーを作製した。ただし、PCRの鋳型として、プラスミドpCLuRA-TDH3の代わりにpCLuRA-TDH3[αP21L]を用いた。実施例２に記載の方法でスクリーニングを行った結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第405番目のトレオニンがイソロイシンに置換されたT405I変異型CLucを有するクローン（第５変異型ルシフェラーゼを有する形質転換体に相当する）を得た。
実施例２に記載の方法で発光スペクトルを測定した結果、T405I変異型CLucの発光スペクトルピークは458nmであり、野生型CLucと比較して4nm長波長側にシフトしていた。このT405I変異体が保持するプラスミドを、以後「pCLuRA-TDH3[αP21L,T405I]」と称する。
〔実施例６〕ヒスチジンタグが付与されたCLuc
培養上清中に分泌されたCLucの精製を容易にするため、C末端にヒスチジンタグが付与され、且つαP21L変異を含むαCLuc（配列番号２０）を発現するプラスミド「pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]」を構築した。配列番号２３は、プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]の部分塩基配列である。
構築方法は、以下の通りである。
先ず、pCLuRA-TDH3を鋳型として以下のPCRを行った。用いたオリゴDNAプライマーは、CLuc(GS)3H6-F: CACCACCATCACCACCATTAGTCTAGAGGGCCGCATCATGTAATT（配列番号２１）とCLuc(GS)3H6-R: AGAACCAGAACCAGAACCTTTGCATTCATCTGGTACTTCTAGGGT（配列番号２２）であった。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; CLuc(GS)3H6-F（配列番号２１）(10pmol/μl) 1.5μl; CLuc(GS)3H6-R（配列番号２２）(10pmol/μl) 1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3溶液(10ng/μl) 0.1μl; 滅菌水 34μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、48℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約7.5kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。
次いで、得られたDNA断片の両5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。これをDNA基質としてT4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。環状化させたDNAを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換された大腸菌から常法によりプラスミドを抽出精製した。このプラスミドをEcoRIとXbaIで二重消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。次いで、ヒスチジンタグをコードする領域を含む約1.1kbpの断片をシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した（DNA断片G）。
一方、pCLuRA-TDH3[αP21L]をEcoRIとXbaIで二重消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。約6.5kbpの断片を同様に精製した（DNA断片H）。
次いで、DNA断片GとDNA断片HをDNA基質としてT4 DNAリガーゼで連結し、それを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換された大腸菌から常法によりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミドについて塩基配列（配列番号２３において、第1番目から第2875番目までの配列）を調べ、所望の塩基配列となっていることを確認し、pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]とした。
さらに、実施例２に記載した方法に従って、pCLuRA-TDH3及びpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]をそれぞれ用いて、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換し、野生型CLuc及びヒスチジンタグが付与されたCLucをそれぞれ分泌させ、実施例２に記載した方法に従って、それぞれの発光スペクトルを測定した結果、両者に発光スペクトルの違いは認められなかった。つまり、ヒスチジンタグの有無によって発光スペクトルに相違は生じないことが確認された。
〔実施例７〕配列番号２における第375番目に相当するリジンが他のアミノ酸に置換された一群の変異型CLuc
7-1．第375番目に相当するリジンが他のアミノ酸に置換された一群の変異型CLucを発現させるためのプラスミド
実施例２に示したとおり、配列番号２において第375番目に相当するリジンをアルギニン又はグルタミン酸に置換すると、発光スペクトルピークが長波長側にシフトする。そこで、第375番目のアミノ酸が、通常のタンパク質を構成する20種のアミノ酸のうちの1つとなっている一群の変異型（及び野生型）CLucを分泌発現させるための一群のプラスミドを、以下の7-2及び7-3に記述する方法で作製した。
7-2．発現プラスミドの構築１
以下のように4種のPCRと細胞内組換えによって、配列番号２において第375番目に相当するアミノ酸の飽和変異ライブラリーを構築した。
(1) PCR1
用いたオリゴDNAプライマーはK446X-F: TGAAGTAGAGAAAGTACGAATCAGGNNNCAATCGACTGTAGTAGTAGAACTCA（配列番号２４）とmut-CLuc-R（配列番号１３）であった。このPCRの反応液の組成は、以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; K446X-F（配列番号２４）(10pmol/μl) 0.6μl; mut-CLuc-R（配列番号１３）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、45℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約700bpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液J」とした。
(2) PCR2
用いたオリゴDNAプライマーはK446-R: CCTGATTCGTACTTTCTCTACTTCA（配列番号２５）とmut-CLuc-F（配列番号８）であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; K446-R（配列番号２５）(10pmol/μl) 0.6μl; mut-CLuc-F（配列番号８）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 14.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、45℃で30秒(アニーリング)及び68℃で1分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約1.1kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、10μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液K」とした。
(3) PCR3
用いたオリゴDNAプライマーはmut-CLuc-F（配列番号８）とmut-CLuc-R:（配列番号１３）であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; mut-CLuc-F（配列番号８）(10pmol/μl) 1.5μl; mut-CLuc-R（配列番号１３）(10pmol/μl) 1.5μl; DNA溶液J 1μl; DNA溶液K 1μl; 滅菌水 33μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で2分20秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約1.8kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、50μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液L」とした。
(4) PCR4
用いたオリゴDNAプライマーはvec-CLuc-F（配列番号１４）とvec-CLuc-R:（配列番号１０）であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 1μl; 10x KOD plus buffer 5μl; 2mM each dNTP mixture 5μl; 25mM硫酸マグネシウム 2μl; vec-CLuc-F（配列番号１４）(10pmol/μl) 1.5μl; vec-CLuc-R（配列番号１０）(10pmol/μl) 1.5μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 34μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、50℃で30秒(アニーリング)及び68℃で7分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約6kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製し、50μlのTE緩衝液に溶解し、「DNA溶液M」とした。
次いで、DNA溶液LとDNA溶液Mの等量混合物を用いて、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換し、コロニーを形成させた。得られた96コロニーを、それぞれbuffered SD-ura液体培地で培養し、それぞれからプラスミドを含むDNAを抽出精製した。これらDNA試料で大腸菌DH5αを形質転換し、得られた大腸菌の形質転換体から常法に従ってプラスミドDNAを抽出精製し、その塩基配列を調べた。
結果として、配列番号２において第375番目に相当するアミノ酸をコードするコドンが、以下のアミノ酸をコードするコドンになっているプラスミドを得た：アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシン。それぞれのプラスミドを順に、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375A,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375C,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375D,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375E,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375G,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375I,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375K,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375L,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375M,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375N,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375Q,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375S,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375T,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375V,-(GS)3H6]」、「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375W,-(GS)3H6]」及び「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375Y,-(GS)3H6]」と称する。
7-3．発現プラスミドの構築２
配列番号２において第375番目に相当するアミノ酸をコードするコドンが、フェニルアラニンをコードするコドンになっているプラスミドであるpCLuRA-TDH3[αP21L,K375F,-(GS)3H6]を以下のようにして作製した。
pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]を鋳型としてPCRを行った。用いたオリゴDNAプライマーは、K446F：TTTCAATCGACTGTAGTAGAACTCA（配列番号２６）とK446-R: CCTGATTCGTACTTTCTCTACTTCA（配列番号２５）であった。このPCRの反応液の組成は以下の通りであった：KOD plus DNA polymerase 0.4μl; 10x KOD plus buffer 2μl; 2mM each dNTP mixture 2μl; 25mM硫酸マグネシウム 0.8μl; K446F（配列番号２６）(10pmol/μl) 0.6μl; K446-R（配列番号２５）(10pmol/μl) 0.6μl; プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]溶液(1ng/μl) 1μl; 滅菌水 12.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、並びに94℃で15秒(変性)、48℃で30秒(アニーリング)及び68℃で8分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
このPCR反応によって得られたPCR反応溶液全量を1％アガロースで電気泳動した結果、約7.5kbpのDNA断片を確認した。この断片を、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した。
次いで、得られたDNA断片の両5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。これをDNA基質としてT4 DNAリガーゼにより連結し、環状化させた。環状化させたDNAを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換された大腸菌から常法によりプラスミドを抽出精製した。このプラスミドをBamHIとXbaIで二重消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。さらに、配列番号２において第375番目に相当するアミノ酸をコードするコドンが変更されたαCLucをコードする領域を含む約2.6kbpの断片をシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSとエタノール沈殿で精製した（DNA断片N）。
一方、pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]をBamHIとXbaIで二重消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。約5kbpの断片を同様に精製した（DNA断片P）。
次いで、DNA断片NとDNA断片PをDNA基質としてT4 DNAリガーゼで連結し、それを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換された大腸菌から常法によりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミドについて塩基配列（配列番号２３において、第1番目から第2875番目までの配列）を調べ、所望の塩基配列となっていることを確認し、pCLuRA-TDH3[αP21L,K375F,-(GS)3H6]とした。
また、配列番号２において第375番目に相当するアミノ酸をコードするコドンが、ヒスチジン又はプロリンをコードするコドンに置換されたプラスミド(それぞれ「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375H,-(GS)3H6]」及び「pCLuRA-TDH3[αP21L,K375P,-(GS)3H6]」と称する)を作製した。これらの作製方法は、PCRのためのオリゴDNAプライマーが異なる以外は、pCLuRA-TDH3[αP21L,K375F,-(GS)3H6]の作製方法と同じであった。pCLuRA-TDH3[αP21L,K375H,-(GS)3H6]の作製ために用いたオリゴDNAプライマーはK446H：CATCAATCGACTGTAGTAGAACTCA（配列番号２７）とK446-R（配列番号２５）であり、一方、pCLuRA-TDH3[αP21L,K375P,-(GS)3H6]の作製ために用いたオリゴDNAプライマーはK446P：CCACAATCGACTGTAGTAGAACTCA（配列番号２８）とK446-R（配列番号２５）であった。
7-4．配列番号２における第375番目に相当するリジンが他のアミノ酸に置換された一群の変異型CLucによる発光スペクトル
上記7-2及び7-3で得た20種の各プラスミドで、サッカロミセス・セレビシエBY4743ΔPRB1株を形質転換した。プラスミドpCLuRA-TDH3[αP21L,K375K,-(GS)3H6]で形質転換されたサッカロミセス・セレビシエが分泌するCLucは野生型CLucであり、それ以外の19種のプラスミドで形質転換されたサッカロミセス・セレビシエが分泌するCLucは変異型CLucである。それぞれ、実施例２に記載の方法で培養し、培養上清を用いて発光スペクトルを測定した。
野生型CLucとそれぞれの変異型CLucの発光スペクトル極大波長を表１に示す。
Figure 0005224457
表１に示すように、驚くべきことに、野生型CLucが与える発光スペクトル極大波長が454nmであったのに対し、他の変異型CLucでは、全て457nm以上の発光スペクトル極大波長であった。すなわち、表１に列挙する変異型CLucは、全て第１変異型ルシフェラーゼである(K375A変異型CLuc、K375C変異型CLuc、K375D変異型CLuc、K375E変異型CLuc、K375F変異型CLuc、K375G変異型CLuc、K375H変異型CLuc、K375I変異型CLuc、K375L変異型CLuc、K375M変異型CLuc、K375N変異型CLuc、K375P変異型CLuc、K375Q変異型CLuc、K375R変異型CLuc、K375S変異型CLuc、K375T変異型CLuc、K375V変異型CLuc、K375W変異型CLuc及びK375Y変異型CLuc)。
〔実施例８〕N404飽和変異ライブラリーの作製と変異型CLucのスクリーニング
8-1．N404飽和変異ライブラリーの作製
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第404番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。
配列番号７において、第1番目から第2122番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片a(475)」と称する。
断片a(475)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した。FAR-F(配列番号１６)及びN475-rev：ctgagagctgtacgggacgga (配列番号２９)。また、断片a(475)を増幅する際のPCRの反応液の組成は以下の通りである：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績) 0.4μl；pCLuRA-TDH3プラスミド溶液(3.8ng/μl) 1μl；10×KOD plus buffer 2μl；2mM each dNTP mixture 2μl；25mM 硫酸マグネシウム 0.8μl；FAR-F(配列番号１６) 0.6μl(10pmol/μl)；N475-rev(配列番号２９) 0.6μl(10pmol/μl)；滅菌水 13.6μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、94℃で15秒(変性)、49℃で30秒(アニーリング)、68℃で2分30秒(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
一方、配列番号７において第2102番目から第2875番目の塩基配列をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片b(475X)」と称する。
断片b(475X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：N475X-Fw：tccgtcccgtacagctctcagnnnacttccatctactggcaagat(配列番号３０)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(475X)を増幅する際のPCRの反応液の組成は、プライマー以外は断片a(475)を増幅した際の反応液組成と同じである。PCR反応条件は、断片a(475)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、アニーリング温度を50℃とした。
得られた断片a(475)、断片b(475X)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約2100bpの断片a(475)と約800bpの断片b(475X)が確認できた。これらを混合し、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(断片a(475),b(475X) mix溶液)。
次いで、上記断片a(475),b(475X) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の変異位置のコドンをNNNに置換した1本の長い断片（配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(475X)」と称する。
断片c(475X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを用いた：mut-CLuc-CF1(配列番号１２)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)。また、断片c(475X)を増幅する際のPCRの反応液の組成は以下の通りである：KOD plus DNA polymerase(東洋紡績) 1μl；断片a(475),b(475X) mix溶液 1μl；10×KOD plus buffer 5μl；2mM each dNTP mixture 5μl；25mM硫酸マグネシウム 2μl；mut-CLuc-CF1(配列番号１２) 1.5μl(10pmol/μl)；mut-CLuc-R(配列番号１３) 1.5μl(10pmol/μl)；滅菌水 33μl。PCR反応は、94℃で2分(抗ポリメラーゼ抗体の失活)を1サイクル、94℃で15秒(変性)、61℃で30秒(アニーリング)、68℃で1分(伸長)のサイクルを30サイクルで行った。
一方、pCLuRA-TDH3の配列のうち、配列番号７の第1664番目から第2575番目を欠いた直鎖状DNA断片をPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d」と称する。
断片dを増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：SQ-CLuc-CR1(配列番号１５)及びvec-CLuc-F(配列番号１４)。また、断片dを増幅する際のPCRの反応液の組成は、断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びオリゴDNAプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは、以下を使用した：pCLuRA-TDH3プラスミド溶液(3.8ng/μl) 1μl。PCR反応条件は、断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度を58℃、伸長時間を8分とした。
得られた断片c(475X)、断片dのPCR産物をそれぞれ0.7％アガロースで電気泳動した結果、約1100bpの断片c(475X)と約7000bpの断片dが確認できた。これらを混合し、シグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(断片c(475X),d mix溶液)。
次いで、断片c(475X),d mix溶液10μlを用い、酢酸リチウム法でサッカロミセス・セルビシエBY4743Δprb1株の形質転換を行い、SD-Ura寒天培地に塗抹し、30℃で約48時間保温した。出現した多数のコロニーを「N404飽和変異ライブラリー」とした。
8-2．発光スペクトルがシフトした配列番号２における第404番目のアミノ酸が変異したルシフェラーゼのスクリーニングと発光スペクトル測定
以下、実施例２の2.3及び2.4と同じ方法により発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜し、さらに発光スペクトルを測定した。
以下の表２に示すように、選抜されたN404G変異型CLuc及びN404S変異型CLuc（第４変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークはいずれも458nmであった。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第404番目のアミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[N404G]」と定義する。
〔実施例９〕T405飽和変異ライブラリーの作製と変異型CLucのスクリーニング
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第405番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例８と同様である。
配列番号７において、第1番目から第2125番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を、以後「断片a(476)」と称する。
断片a(476)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びT476-rev：gttctgagagctgtacgggac(配列番号３１)。また、断片a(476)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、59℃でアニーリングを行った。
一方、配列番号７において第2105番目から第2875番目の塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を、以後「断片b(476X)」と称する。
断片b(476X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：T476X-Fw：gtcccgtacagctctcagaacnnntccatctactggcaagatggt(配列番号３２)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(476X)を増幅する際の反応液組成は実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応条件と同じである。
以下、実施例８と同様にして、断片a(476),b(476X) mix溶液を作製した。
上記断片a(476),b(476X) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の変異位置のコドンをNNNに置換した1本の長い断片（配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(476X)」と称する。
断片c(476X)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(476),b(476X) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と同じである。
さらに、実施例８と同様にして、断片c(476X),d mix溶液を作製した。
次いで、断片c(476X),d（実施例８） mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜した。また、得られたクローンの発光スペクトルを測定した。
表２に示すように、選抜されたT405M変異型CLuc（第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは457nmであった。
〔実施例１０〕S406飽和変異ライブラリーの作製と変異型CLucのスクリーニング
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第406番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例８と同様である。
配列番号７において、第1番目から第2128番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片a(477)」と称する。
断片a(477)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びS477-rev：agtgttctgagagctgtacgg(配列番号３３)。また、断片a(477)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件と同じである。
一方、配列番号７において第2108番目から第2875番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。この断片を「断片b(477X)」と称する。
断片b(477X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：S477X-Fw：ccgtacagctctcagaacactnnnatctactggcaagatggtgac(配列番号３４)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(477X)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCT反応条件は、実施例８において、断片b(475X)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(477),b(477X) mix溶液を作製した。
さらに、上記断片a(477),b(477X) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の変異位置のコドンをNNNに置換した1本の長い断片（配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(477X)」と称する。
断片c(477X)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(477),b(477X) mix溶液1μl。PCR反応条件は実施例８と同じである。
また、実施例８と同様にして、断片c(477X),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(477X),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜した。次いで、得られたクローンの発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、選抜されたS406L変異型CLuc（第６変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例１１〕I407飽和変異ライブラリーの作製と変異型CLucのスクリーニング
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第407番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例８と同様である。
配列番号７において、第1番目から第2131番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片a(478)」と称する。
断片a(478)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びI478-rev：ggaagtgttctgagagctgta(配列番号３５)。また、断片a(478)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において、断片a(475)を増幅した際の反応液組成とアニーリング温度が異なり、55℃でアニーリングを行った。
一方、配列番号７において第2111番目から第2875番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片b(478X)」と称する。
断片b(478X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを用いた：I478X-Fw：tacagctctcagaacacttccnnntactggcaagatggtgacata (配列番号３６)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(478X)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度が異なり、58℃でアニーリングを行った。
得られた断片a(478)、断片b(478X)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約2100bpの断片a(478)と約800bpの断片b(478X)が確認できた。これらを混合し、プロメガ社Wizard(登録商標)SV Gel and PCR Clean-Up systemでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(断片a(478),b(478X) mix溶液)。
次いで、上記断片a(478),b(478X) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の変異位置のコドンをNNNに置換した1本の長い断片（配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(478X)」と称する。
断片c(478X)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(478),b(478X) mix溶液1μl。PCR反応条件は実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、60℃でアニーリングを行った。
得られた断片c(478X)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動した結果、約1100bpの断片c(478X)が確認できた。これと実施例８の断片dを混合し、プロメガ社Wizard(登録商標)SV Gel and PCR Clean-Up systemでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(断片c(478X),d mix溶液)。
次いで、断片c(478X),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜した。さらに、得られたクローンの発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、選抜されたI407A変異型CLuc（第７変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例１２〕T167K/K375R二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第167番目のアミノ酸がトレオニンからリジンに、さらに第375番目のアミノ酸がリジンからアルギニンに置換された二重変異型CLuc（第１及び第３変異型ルシフェラーゼ）をコードするDNAを以下のように作製した。
第167番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第1番目から第1663番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片a(238)」と称する。
この断片a(238)を増幅する際のPCRは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びSQ-CLuc-CR1(配列番号１５)。また、断片a(238)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応液組成と、滅菌水の量、鋳型とするDNA及びプライマーが異なる。滅菌水の量、鋳型とするDNAは以下を使用した：滅菌水12.6μl、pCLuRA-TDH3[T167K] 1μl(4.5ng/μl)。PCR反応条件は実施例８において、断片a(475)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は53℃、伸長時間は2分で行った。
一方、第375番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第1554番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(446)」と称する。
この断片b(446)を増幅する際のPCRは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-CF1(配列番号１２)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(446)を増幅する際のPCRの反応液組成は、断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは、以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R] 1μl(2.0ng/μl)。PCR反応条件は断片a(238)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(238)と断片b(446)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1700bpと約1300bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a(238),b(446) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(238),b(446) mix溶液を鋳型としてオーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第900番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(238,446)」と称する。
断片c(238,446)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-F(配列番号８)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)。また、断片c(238,446)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(238),b(446) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は60℃、伸長時間は2分で行った。
一方、pCLuRA-TDH3の配列のうち、配列番号７の第967番目から第2575番目を欠いた直鎖状DNA断片をPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を断片d(238,446)と称する。
この断片d(238,446)を増幅する際のPCRは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：vec-CLuc-R (配列番号１０)及びvec-CLuc-F(配列番号１４)。また、断片d(238,446)を増幅するPCRの反応液組成は、実施例８において断片dを増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(238,446)と断片d(238,446)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1700bpと約7000bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片c(238,446),d(238,446) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(238,446),d(238,446) mix溶液10μlを用い、ZYMO RESEARCH社Frozen-EZ Yeast Transformation IITMによりサッカロミセス・セレビシエBY4743 Δprb1株の形質転換を行った。
さらに、断片c(238,446),d(238,446) mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/K375R二重変異型CLuc（第１及び第３変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第167番目のアミノ酸がトレオニンからリジンに変異し、第375番目のアミノ酸がリジンからアルギニンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを「pCLuRA-TDH3[T167K,K375R]」と定義する。
〔実施例１３〕T167K/Q403P二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてT167KとQ403Pの二重変異型CLuc（第３変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第1554番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474)」と称する。
断片b(474)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[Q403P]（実施例２に記載のスクリーニングの結果として得られた、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目のアミノ酸がグルタミンからプロリンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミド） 1μl(2.56ng/μl)。PCR反応条件は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例１２と同様にして、断片a(238)（実施例１２）,b(474) mix溶液を作製した。
上記断片a(238), b(474) mix溶液を鋳型としてオーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第900番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(238,474)」と称する。
断片c(238,474)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(238),b(474) mix溶液 1μl。PCR反応条件は実施例１２と同じである。
得られた断片c(238,474)と実施例１２の断片d(238,446)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例１２と同様にして、断片c(238,474),d(238,446) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(238,474),d(238,446) mix溶液10μlを用い、実施例１２と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/Q403P二重変異型CLuc（第３変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは458nmであった。
〔実施例１４〕T167K/N404G二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてT167KとN404Gの二重変異型CLuc（第３及び第４変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第404番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第1554番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(475)」と称する。
断片b(475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[N404G]（実施例８） 1μl(2.70ng/μl)。PCR反応条件は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例１２と同様にして、断片a(238)（実施例１２）,b(475) mix溶液を作製した。
上記断片a(238),b(475) mix溶液を鋳型としてオーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第900番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(238,475)」と称する。
断片c(238,475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(238),b(475) mix溶液 1μl。PCR反応条件は実施例１２と同じである。
得られた断片c(238,475)と実施例１２の断片d(238,446)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例１２と同様にして、断片c(238,475),d(238,446) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(238,475),d(238,446) mix溶液10μlを用い、実施例１２と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/N404G二重変異型CLuc（第３及び第４変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例１５〕T167K/T405I二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてT167KとT405Iの二重変異型CLuc（第３及び第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第1554番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(476)」と称する。
断片b(476)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,T405I]（実施例５） 1μl(2.0ng/μl)。PCR反応条件は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例１２と同様にして、断片a(238)（実施例１２）,b(476) mix溶液を作製した。
上記断片a(238),b(476) mix溶液を鋳型としてオーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第900番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(238,476)」と称する。
断片c(238,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(238),b(476) mix溶液 1μl。PCR反応条件は実施例１２と同じである。
得られた断片c(238,476)と実施例１２の断片d(238,446)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例１２と同様にして、断片c(238,476),d(238,446) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(238,476),d(238,446) mix溶液10μlを用い、実施例１２と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/T405I二重変異型CLuc（第３及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例１６〕L197飽和変異ライブラリーの作製と変異型CLucのスクリーニング
16-1．L197飽和変異ライブラリーの作製
配列番号２に示されるアミノ酸配列において第197番目のアミノ酸が他のアミノ酸のいずれか1つに置換された変異体ライブラリーを作製した。作製方法は、実施例８と同様である。
配列番号７において第1番目から第1501番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片a(268)」と称する。
断片a(268)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びL268-rev：gatgtcgatcacgatcagttt(配列番号３７)。また、断片a(268)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件と同じである。
一方、配列番号７において第1481番目から第2875番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片b(268X)」と称する。
断片b(268X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：L268X-Fw：aaactgatcgtgatcgacatcnnnggaggaagatctgtaagaatc(配列番号３８)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(268X)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(268)、断片b(268X)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約1500bpの断片a(268)と約1400bpの断片b(268X)が確認できた。次いで、実施例８と同様にして、断片a(268),b(268X) mix溶液を作製した。
上記断片a(268),b(268X) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の変異位置のコドンをNNNに置換した1本の長い断片（配列番号７において第900番目から第1813番目までの塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(268X)」と称する。
断片c(268X)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-F(配列番号８)及びmut-CLuc-NR2(配列番号９)。また、断片c(268X)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(268),b(268X)mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、53℃でアニーリングを行った。
一方、pCLuRA-TDH3の配列のうち、配列番号７の第967番目から第1703番目までを欠いた直鎖状DNAをPCRにより増幅した。このDNA断片を「断片d(268)」と称する。
断片d(268)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：vec-CLuc-R(配列番号１０)及びSQ-CLuc-NF2(配列番号１１)。また、断片d(268)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片dを増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、62℃でアニーリングを行った。
得られた断片c(268X)、断片d(268)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動した結果、約900bpの断片c(268X)と約7000bpの断片d(268)が確認できた。
次いで、実施例８と同様にして、断片c(268X),d(268) mix溶液を作製した。
さらに、断片c(268X),d(268) mix溶液を用い、実施例８と同様にして、スペクトルピーク位置が変化した、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第197番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変異したクローンを得た。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第197番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[L197P]」と定義する。
16-2．M178K/L197P二重変異型CLuc遺伝子の作製
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてM178KとL197Pの二重変異型CLuc（第２変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
配列番号２に示されるアミノ酸番号178の位置の変異を含む、配列番号７における第1番目から第1492番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片a(249)」と称する。
断片a(249)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びSQ-CLuc-F001-rev：cacgatcagtttgaagaattctatgacggt(配列番号３９)。また、断片a(249)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[M178K]（実施例２） 1μl(2.85ng/μl)。PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、58℃でアニーリングを行った。
一方、配列番号２に示されるアミノ酸番号197の位置の変異を含む、配列番号７における第1463番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片b(268)」と称する。
この断片b(268)を増幅する際のPCRは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-CF0：accgtcatagaattcttcaaactgatcgtg(配列番号４０)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(268)を増幅する際のPCRの反応液組成は、断片a(249)を増幅した際のPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは、以下を使用した：pCLuRA-TDH3[L197P]（上記16-1） 1μl(3.53ng/μl)。PCR反応条件は断片a(249)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(249)、断片b(268)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1500bpと約1400bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a(249),b(268) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(249),b(268) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第900番目から第1813番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(249,268)」と称する。
断片c(249,268)を増幅する際のPCRの反応液組成は上記16-1において断片c(268X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(249),b(268) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、上記16-1において断片c(268X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は60℃、伸長時間は1分30秒で行った。
得られた断片c(249,268)と上記16-1の断片d(268)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約800bpと約7000bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片c(249,268),d(268) mix溶液を作製した。
次いで、実施例８と同様にして、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第178番目のアミノ酸がメチオニンからリジンに変異、第197番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変異したクローンを得た。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第178番目のアミノ酸がメチオニンからリジンに変異、第197番目のアミノ酸がロイシンからプロリンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[M178K,L197P]」と定義する。
16-3．αCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸の変異導入
配列番号６に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において第21番目の位置に相当する変異を含むDNA断片と、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第178番目及び第197番目のアミノ酸の位置の2つの変異を含むDNA断片をPCRにより増幅し、この2つのDNA断片を用いたオーバーラップPCRにより作製した。
配列番号６に示されるアミノ酸番号21の位置の変異を含む、配列番号７における第1番目から第966番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片a(21)」と称する。
断片a(21)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L]（特許文献３） 1μl(4.25ng/μl)、FAR-F(配列番号１６)及びvec-CLuc-R(配列番号１０)。PCR反応条件は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、53℃でアニーリングを行った。
一方、配列番号２におけるアミノ酸番号第178番目及び第197番目の変異を含む、配列番号７における第900番目から第2875番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片b(249,268)」と称する。
断片b(249,268)を増幅する際のPCRの反応液組成は、断片a(21)を増幅した際のPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[M178K,L197P]（上記16-2） 1μl(1.56ng/μl)、mut-CLuc-F(配列番号８)及び3'-UTR(配列番号１９)。PCR反応条件は断片a(21)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(21)、断片b(249,268)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1000bpと約1900bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a(21),b(249,268) mix溶液を作製した。
次いで、断片a(21),b(249,268) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片（配列番号７において第461番目から第1813番目の塩基配列）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(21,249,268)」と称する。
断片c(21,249,268)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを用いた：SQ-GPD1-F0：ATGTATCTATCTCATTTTCTTACA(配列番号４１)及びmut-CLuc-NR2(配列番号９)。また、断片c(21,249,268)を増幅する際のPCRの反応液組成は実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(21),b(249,268) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、アニーリング温度は51℃で行った。
一方、pCLuRA-TDH3の配列のうち、配列番号７において第526番目から第1703番目までを欠いた直鎖状DNA断片をPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d(21,249,268)」と称する。
断片d(21,249,268)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：SQ-GPD1-R0：CAGCTTTTTCCAAATCAGAGAGAGCAG(配列番号４２)及びSQ-CLuc-NF2(配列番号１１)。また、断片d(21,249,268)を増幅するPCRの反応液組成は、実施例１２において断片d(238,446)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例１２において断片d(238,446)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(21,249,268)、断片d(21,249,268)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1300bpと約7000bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片c(21,249,268),d(21,249,268) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(21,249,268),d(21,249,268) mix溶液を用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したM178K/L197P二重変異型CLuc（第２変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは447nmであった。
〔実施例１７〕K375R/Q403P二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてK375RとQ403Pの二重変異型CLuc（第１変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第375番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第900番目から第2087番目の塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片a(446)」と称する。
断片a(446)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-F(配列番号８)及びSQ-CLuc-F002-rev：caaccagaatctgttttccatcaa(配列番号４３)。また、断片a(446)を増幅するPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]（実施例４） 1μl(2.0ng/μl)。PCR反応条件は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応条件と同じである。
一方、第403番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第2064番目から第2875番目の塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b’(474)」と称する。
この断片b’(474)を増幅する際のPCRは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：SQ-CLuc-F002：ttgatggaaaacagattctggttg (配列番号４４)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b’(474)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１３において断片b(474)を増幅した際の反応液組成と、プライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(446)、断片b’(474)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1100bpと約800bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a(446),b’(474) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(446),b’(474) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(446,474)」と称する。
断片c(446,474)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(446),b’(474) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(446,474)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様に断片c(446,474),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(446,474),d mix溶液10μlを用い、実施例１２と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したK375R/Q403P二重変異型CLuc（第１変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例１８〕K375R/N404G二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてK375RとN404Gの二重変異型CLuc（第１及び第４変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第404番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第2064番目から第2875番目の塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b’(475)」と称する。
断片b’(475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１７において断片b’(474)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[N404G]（実施例８） 1μl(2.70ng/μl)。PCR反応条件は実施例１２と同じである。
実施例１７の断片a(446)と断片b’(475)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、実施例１２と同様に断片a(446),b’(475) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(446),b’(475) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(446,475)」と称する。
断片c(446,475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(446),b’(475) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(446,475)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(446,475),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(446,475),d mix溶液10μlを用い、実施例１２と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したK375R/N404G二重変異型CLuc（第１及び第４変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは461nmであった。
〔実施例１９〕K375R/T405I二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてK375RとT405Iの二重変異型CLuc（第１及び第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第2064番目から第2875番目の塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b’(476)」と称する。
断片b’(476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１７において断片b’(474)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,T405I]（実施例５） 1μl(2.0ng /μl)。PCR反応条件は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応条件と同じである。
実施例１７の断片a(446)と断片b’(476)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、実施例１７と同様にして、断片a(446),b’(476) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(446),b’(476) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(446,476)」と称する。
断片c(446,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８のPCRの反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(446),b’(476) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例１２において断片c(238,446)を増幅した際の反応条件と同じである。
断片c(446,476)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(446,476),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(446,476),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したK375R/T405I二重変異型CLuc（第１及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは463nmであった。
〔実施例２０〕Q403P/N404G二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404Gの二重変異型CLuc（第４変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
配列番号７において、第1番目から第2119番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片a(474)」と称する。
この断片a(474)を増幅する際のPCRでは以下のオリゴDNAプライマーを使用した：FAR-F(配列番号１６)及びQ474-rev：agagctgtacgggacggacac(配列番号４５)。また、断片a(474)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８における断片a(475)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、55℃でアニーリングを行った。
一方、第403番目及び第404番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,475)」と称する。
この断片b(474,475)を増幅する際のPCRは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/N475G-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccgggacttccatctactggcaagat(配列番号４６)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、58℃でアニーリングを行った。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474),b(474,475) mix溶液を作製した。
上記断片a(474),b(474,475) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,475)」と称する。
断片c(474,475)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,475) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は60℃、伸長時間は1分30秒で行った。
得られた断片c(474,475)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,475),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,475),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/N404G二重変異型CLuc（第４変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは462nmであった。
〔実施例２１〕Q403P/T405I二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとT405Iの二重変異型CLuc（第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目及び第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,476)」と称する。
この断片b(474,476)を増幅する際のPCRは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/T476I-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccaacatctccatctactggcaagatggt(配列番号４７)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例２０において断片b(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474),b(474,476) mix溶液を作製した。
上記断片a(474)（実施例２０）,b(474,476) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,476)」と称する。
断片c(474,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,476) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例２０において断片c(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
断片c(474,476)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,476),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,476),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/T405I二重変異型CLuc（第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは459nmであった。
〔実施例２２〕N404G/T405I二重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてN404GとT405Iの二重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第404番目及び第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2102番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(475,476)」と称する。
この断片b(475,476)を増幅する際のPCRは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：N475G/T476I-Fw：tccgtcccgtacagctctcaggggatctccatctactggcaagatggt(配列番号４８)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(475,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８における断片b(475X)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例２０において断片b(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(475)（実施例８）,b(475,476) mix溶液を作製した。
上記断片a(475),b(475,476) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(475,476)」と称する。
断片c(475,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(475),b(475,476) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例２０において断片c(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(475,476)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様に実験を進め、断片c(475,476),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(475,476),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したN404G/T405I二重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは461nmであった。
〔実施例２３〕Q403P/N404G/T405I三重変異型CLuc及びQ403P/N404G/T405M三重変異型CLuc
23-1．第403番目、第404番目及び第405番目の位置における三重変異型CLuc遺伝子の作製（１）
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Iの三重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目、第404番目及び第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,475,476I)」と称する。
この断片b(474,475,476I)を増幅する際のPCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/N475G/T476I-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccgggatctccatctactggcaagatggt(配列番号４９)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,475,476I)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例２０において断片b(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474)（実施例２０）,b(474,475,476I) mix溶液を作製した。
上記断片a(474),b(474,475,476I) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,475,476I)」と称する。
断片c(474,475,476I)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,475,476I) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例２０において断片c(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(474,475,476I)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,475,476I),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,475,476I),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/N404G/T405I三重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは462nmであった。
23-2．第403番目、第404番目及び第405番目の位置における三重変異型CLuc遺伝子の作製(２)
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Mの三重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目、第404番目及び第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,475,476M)」と称する。
この断片b(474,475,476M)を増幅する際のPCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/N475G/T476M-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccgggatgtccatctactggcaagatggt(配列番号５０)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,475,476M)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例２０において断片b(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474)（実施例２０）,b(474,475,476M) mix溶液を作製した。
上記断片a(474),b(474,475,476M) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,475,476M)」と称する。
断片c(474,475,476M)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,475,476M) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例２０において断片c(474,475)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(474,475,476M)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,475,476M),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,475,476M),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/N404G/T405M三重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは462nmであった。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目のアミノ酸がグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸がトレオニンからメチオニンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[Q403P,N404G,T405M]」と定義する。
〔実施例２４〕Q403P/N404G/T405M/S406L四重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405MとS406Lの四重変異型CLuc（第４〜第６変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目、第404番目、第405番目及び第406番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,475,476,477)」と称する。
この断片b(474,475,476,477)を増幅する際のPCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/N475G/T476M/S477L-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccgggatgctcatctactggcaagatggtgac (配列番号５１)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,475,476,477)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際のPCRの反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、55℃でアニーリングを行った。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474)（実施例２０）,b(474,475,476,477) mix溶液を作製した。
上記断片a(474),b(474,475,476,477) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,475,476,477)」と称する。
断片c(474,475,476,477)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,475,476,477) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、61℃でアニーリングを行った。
得られた断片c(474,475,476,477)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,475,476,477),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,475,476,477),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/N404G/T405M/S406L四重変異型CLuc（第４〜第６変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは461nmであった。
〔実施例２５〕Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A五重変異型CLuc遺伝子の作製
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの五重変異型CLuc（第４〜第７変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第403番目、第404番目、第405番目、第406番目及び第407番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第2099番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b(474,475,476,477,478)」と称する。
この断片b(474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRでは、以下のオリゴDNAプライマーを使用した：Q474P/N475G/T476M/S477L/I478A-Fw：gtgtccgtcccgtacagctctcccgggatgctcgcctactggcaagatggtgacata(配列番号５２)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、断片b(474,475,476,477,478)を増幅するPCRの反応液組成は、実施例８において断片b(475X)を増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。PCR反応条件は、実施例１６の16-2において断片b(268)を増幅した際の反応条件と同じである。
次いで、実施例８と同様にして、断片a(474),b(474,475,476,477,478) mix溶液を作製した。
上記断片a(474),b(474,475,476,477,478) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第1554番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(474,475,476,477,478)」と称する。
断片c(474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(474),b(474,475,476,477,478) mix溶液 1μl。PCR反応条件は、実施例１６の16-2において断片c(249,268)を増幅した際の反応条件と同じである。
断片c(474,475,476,477,478)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例８と同様にして、断片c(474,475,476,477,478),d（実施例８） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(474,475,476,477,478),d mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したQ403P/N404G/T405M/S406L/I407A五重変異型CLuc（第４〜第７変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目のアミノ酸がグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸がトレオニンからメチオニンに変異、第406番目のアミノ酸がセリンからロイシンに変異、第407番目のアミノ酸がイソロイシンからアラニンに変異したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[Q403P,N404G,T405M,S406L,I407A]」と定義する。
〔実施例２６〕T167K/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A六重変異型CLuc遺伝子の作製
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてT167KとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの六重変異型CLuc（第３〜第７変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
第167番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第1番目から第1813番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片a’(238)」と称する。
断片a’(238)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、プライマーのみが異なる。オリゴDNAプライマーは以下を使用した：FAR-F(配列番号１６)及びmut-CLuc-NR2(配列番号９)。また、PCR反応条件は、実施例８において断片a(475)を増幅した際の反応条件とアニーリング温度のみが異なり、アニーリング温度は53℃で行った。
一方、第403番目、第404番目、第405番目、第406番目及び第407番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第1704番目から第2875番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片b’(474,475,476,477,478)」と称する。
断片b’(474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片b(446)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[Q403P,N404G,T405M,S406L,I407A]（実施例２５） 1μl(1.45ng/μl)、SQ-CLuc-NF2(配列番号１１)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、PCR反応条件は、断片a’(238)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a’(238)、断片b’(474,475,476,477,478)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1800bpと約1200bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a’(238),b’(474,475,476,477,478) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a’(238),b’(474,475,476,477,478) mix溶液を鋳型としてオーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片(配列番号７において第461番目から第2663番目までの塩基配列)を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(238,474,475,476,477,478)」と称する。
断片c(238,474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：断片a’(238),b’(474,475,476,477,478) mix溶液 1μl、SQ-GPD1-F0(配列番号４１)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)。また、PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は51℃、伸長時間は2分30秒で行った。
一方、pCLuRA-TDH3の配列のうち、配列番号７の第526番目から第2575番目を欠いた直鎖状DNA断片をPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d(238,474,475,476,477,478)」と称する。
断片d(238,474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片dを増幅した際の反応液組成とプライマーのみが異なる。このPCRにおいてオリゴDNAプライマーは以下を使用した：SQ-GPD1-R0(配列番号４２)及びvec-CLuc-F(配列番号１４)。また、PCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件と同じである。
断片c(238,474,475,476,477,478)、断片d(238,474,475,476,477,478)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約2200bpと約7000bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片c(238,474,475,476,477,478),d(238,474,475,476,477,478) mix溶液を作製した。
次いで、断片c(238,474,475,476,477,478),d(238,474,475,476,477,478) mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A六重変異型CLuc（第３〜第７変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは461nmであった。
〔実施例２７〕K375R/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A六重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてK375RとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの六重変異型CLuc（第１及び第４〜第７変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。また、配列番号６に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
配列番号６において第21番目のアミノ酸及び配列番号２において第375番目の位置の変異を含む、配列番号７における第1番目から第2087番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片a(21,446)」と称する。
断片a(21,446)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,K375R]（実施例４） 1μl(2.0ng/μl)、FAR-F(配列番号１６)及びSQ-CLuc-F002-rev(配列番号４３)。また、PCR反応条件は、実施例１６の16-3において断片a(21)を増幅した際の反応条件と同じである。
一方、第403番目、第404番目、第405番目、第406番目及び第407番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７における第2064番目から第2875番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片b”(474,475,476,477,478)」と称する。
断片b”(474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際のPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[Q403P,N404G,T405M,S406L,I407A]（実施例２５） 1μl(1.45ng/μl)、SQ-CLuc-F002(配列番号４４)及び3'-UTR(配列番号１９)。また、PCR反応条件は、実施例１６の16-3において断片a(21)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a(21,446)、断片b”(474,475,476,477,478)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約2100bpと約800bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片a(21,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液を作製した。
次いで、上記断片a(21,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片（配列番号７における第461番目から第2663番目の塩基配列から成る）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(21,446,474,475,476,477,478)」と称する。
断片c(21,446,474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例２６において、断片c(238,474,475,476,477,478)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(21,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液 1μl。また、PCR反応条件は、実施例１６の16-3において断片c(21,249,268)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(21,446,474,475,476,477,478)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例２６と同様にして、断片c(21,446,474,475,476,477,478),d(238,474,475,476,477,478)（実施例２６） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(21,446,474,475,476,477,478),d(238,474,475,476,477,478) mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したK375R/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A六重変異型CLuc（第１及び第４〜第７変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは460nmであった。
〔実施例２８〕T167K/K375R/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A七重変異型CLuc
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてT167KとK375RとQ403PとN404GとT405MとS406LとI407Aの七重変異型CLuc（第１及び第３〜第７変異型ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子を作製した。また、配列番号６に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。変異の導入方法は実施例１２と同様である。
アミノ酸番号167及び375の位置の変異を含む、配列番号７における第900番目から第2087番目の塩基配列から成るDNA断片をPCRにより増幅した。以後、このDNA断片を「断片a’(238,446)」と称する。
断片a’(238,446)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例１２において断片a(238)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[T167K,K375R]（実施例１２） 1μl(3.42ng/μl)、mut-CLuc-F(配列番号８)及びSQ-CLuc-F002-rev(配列番号４３)。また、PCR反応条件は実施例１６の16-3において断片a(21)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片a’(238,446)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、約1100bpのDNA断片であることを確認した。断片a’(238,446)、断片a(21) （実施例１６の16-1）及び断片b”(474,475,476,477,478) （実施例２７）を混合し、実施例８と同様にして、断片a(21),a’(238,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液を作製した。
上記断片a(21),a’(238,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液を鋳型として、オーバーラップPCRを行い、目的の位置のアミノ酸を置換した1本の長い断片（配列番号７における第461番目から第2663番目の塩基配列から成る）を作製した。以後、このDNA断片を「断片c(21,238,446,474,475,476,477,478)」と称する。
断片c(21,238,446,474,475,476,477,478)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例２６において断片c(238,474,475,476,477,478)を増幅した際のPCRの反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片a(21),a’(238,446),b”(474,475,476,477,478) mix溶液 1μl。また、PCR反応条件は、実施例１６の16-3において断片c(21,249,268)を増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c(21,238,446,474,475,476,477,478)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、実施例２６と同様に実験を進め、断片c(21,238,446,474,475,476,477,478),d(238,446,474,475,476,477,478)（実施例２６） mix溶液を作製した。
次いで、断片c(21,238,446,474,475,476,477,478),d(238,446,474,475,476,477,478) mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、得られたクローンについて発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、作製したT167K/K375R/Q403P/N404G/T405M/S406L/I407A七重変異型CLuc（第１及び第３〜第７変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークは461nmであった。
〔実施例２９〕Q403P/N404G/T405M三重変異型CLucに対するランダム変異導入による変異型CLucの作製
29-1．Q403P/N404G/T405M三重変異型CLucのC末端におけるHis-tagの導入
配列番号２に示されるアミノ酸配列においてQ403PとN404GとT405Mの三重変異型CLuc（第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）について、CLuc遺伝子の下流にHis-tag遺伝子を連結したCLuc-(GS)3H6遺伝子を作製した。また、配列番号６に示したαCLucのシグナル配列内における第21番目のアミノ酸をロイシンに置換した。
第403番目、第404番目、第405番目のアミノ酸の変異を含む、配列番号７において第900番目から第2552番目までの塩基配列から成るDNA断片を、以後「断片c’(474,475,476)」と称する。
この断片c’(474,475,476)を増幅する際のPCRは、以下のオリコDNAプライマーを使用した：mut-CLuc-F(配列番号８)及びc-trm-r：ctagggtgtctccatgctttatgta(配列番号５３)。また、断片c’(474,475,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[Q403P,N404G,T405M]（実施例２３の23-2） 1μl(1.82ng/μl)。PCR反応条件は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度は57℃、伸長時間は2分で行った。
一方、pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]（実施例６）の配列のうち、配列番号７の第967番目から第2363番目を欠いた直鎖状DNA断片をPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d(474,475,476)」と称する。
断片d(474,475,476)を増幅する際のPCRは以下のプライマーを使用した：vec-CLuc-R(配列番号１０)及びSQ-CLuc-F003：aagctgaacgactctgcaatagtc(配列番号５４)。また、断片d(474,475,476)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片dを増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]（実施例６）1μl(1.0ng/μl)。PCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片c’(474,475,476)、断片d(474,475,476)のPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動を行い、それぞれ約1700bpと約7000bpのDNA断片であることを確認した。これらを混合し、実施例８と同様にして、断片c’(474,475,476),d(474,475,476) mix溶液を作製した。
次いで、断片c’(474,475,476),d(474,475,476) mix溶液10μlを用い、実施例８と同様にして、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目のアミノ酸をグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸をアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸をトレオニンからメチオニンに変異し、且つ配列番号６に示されるアミノ酸配列において第21番目のアミノ酸をプロリンからロイシンに変異し、さらに変異型CLuc遺伝子の下流にHis-tag遺伝子を導入したクローンを得た。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目のアミノ酸をグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸をアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸をトレオニンからメチオニンに変異し、且つ配列番号６に示されるアミノ酸配列において第21番目のアミノ酸をプロリンからロイシンに変異し、さらに変異型CLuc遺伝子の下流にHis-tag遺伝子を導入したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]」と定義する。
29-2．pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]におけるランダム変異の導入
pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。なお、ここでは、配列番号２３の塩基番号を用いて説明する。変異の導入方法としては、CLucを配列番号２３において第900番目から第1813番目までのN末端側と第1554番目から第2699番目までのC末端側に分け、それぞれPCRで増幅する際にヌクレオチドの濃度を不均一にした。
配列番号２３において、第900番目から第1813番目までの塩基配列をError Prone PCRにより増幅した。このDNA断片を「断片c(474,475,476)-N」と称する。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第403番目、第404番目及び第405番目のアミノ酸の位置を変異を含む、第1554番目から第2699番目までの塩基配列をError Prone PCRで増幅した。このDNA断片を「断片c(474,475,476)-C」と称する。
断片c(474,475,476)-Nを増幅する際のError Prone PCRの反応液組成は、以下の通りである：Taq DNA polymerase(Roche) 1μl(5U/μl)；pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]（実施例６）プラスミド溶液(150ng/μl) 1μl；10×PCR buffer w/o Mg2+; for Taq(Roche) 10μl；10×dNTP mixture for Error Prone PCR 10μl；25mM 塩化マグネシウム 28μl；5mM 塩化マンガン 2.5μl；mut-CLuc-F(配列番号８) 3μl；mut-CLuc-NR2(配列番号９) 3μl；滅菌水 41.5μl。また、10×dNTP mixture for Error Prone PCRの組成は以下の通りである：100mM dCTP 100μl、100mM dTTP 100μl、100mM dGTP 100μl、100mM dATP 100μl、滅菌水760μl。PCR反応は94℃で1分(変性)、45℃で1分(アニーリング)、72℃で1分(伸長)を30サイクルで行った。
一方、断片c(474,475,476)-Cを増幅する際のError Prone PCRの反応液組成は、断片c(474,475,476)-Nを増幅した際のError Prone PCRの反応液組成と、鋳型とするDNA、プライマー及び滅菌水の量が異なる。鋳型とするDNA、オリゴDNAプライマー及び滅菌水の量は以下の通りである：pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]（上記29-1）プラスミド溶液 0.5μl(288ng/μl)、mut-CLuc-CF1(配列番号１２)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)、並びに滅菌水 42μl。PCR反応条件は、断片c(474,475,476)-Nを増幅した際のError Prone PCRの反応条件と同じである。
得られた断片c(474,475,476)-N、断片c(474,475,476)-CのPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約900bpの断片c(474,475,476)-Nと約1100bpの断片c(474,475,476)-Cが確認できた。これらをそれぞれシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(それぞれ「断片c(474,475,476)-N溶液」、「断片c(474,475,476)-C溶液」)。
次いで、断片c(474,475,476)-N、断片c(474,475,476)-Cのそれぞれについて、PCRにより増幅した。増幅後の断片をそれぞれ「断片c(474,475,476)-N(2)」、「断片c(474,475,476)-C(2)」と定義する。
断片c(474,475,476)-N(2)を増幅するPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際に行ったPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：断片c(474,475,476)-N溶液 1μl、mut-CLuc-F(配列番号８)及びmut-CLuc-NR2(配列番号９)。
一方、断片c(474,475,476)-C(2)を増幅するPCRの反応液組成は、断片c(474,475,476)-N(2)を増幅した際のPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：断片c(474,475,476)-C溶液 1μl、mut-CLuc-CF1(配列番号１２)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)。
また、断片c(474,475,476)-N(2)及び断片c(474,475,476)-C(2)を増幅する際のPCR反応条件は、それぞれ実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応条件と、アニーリング温度及び伸長時間のみが異なり、アニーリング温度を60℃、伸長時間を1分30秒で行った。
得られた断片c(474,475,476)-N(2)、断片c(474,475,476)-C(2)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約900bpの断片c(474,475,476)-N(2)と約1100bpの断片c(474,475,476)-C(2)が確認できた。これらをそれぞれシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、20μlの滅菌水に溶解した(それぞれ「断片c(474,475,476)-N(2)溶液」、「断片c(474,475,476)-C(2)溶液」)。
一方、pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]（実施例６）の配列のうち、配列番号２３の第967番目から第1703番目までを欠いた直鎖状DNAをPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d(474,475,476)-N」と称する。また、配列番号２３の第1664番目から第2611番目までを欠いた直鎖状DNAをPCRによって増幅した。このDNA断片を、「断片d(474,475,476)-C」と称する。
断片d(474,475,476)-Nを増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片dを増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]（上記29-1） 1μl(288ng/μl)、vec-CLuc-R(配列番号１０)及びSQ-CLuc-NF2(配列番号１１)。
また、断片d(474,475,476)-Cを増幅する際のPCRの反応液組成は、断片d(474,475,476)-Nを増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,-(GS)3H6]（実施例６） 1μl(150ng/μl)、SQ-CLuc-CR1(配列番号１５)及びvec-CLuc-F(配列番号１４)。
断片d(474,475,476)-N及び断片d(474,475,476)-Cを増幅する際のPCRの反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件と同じである。
得られた断片d(474,475,476)-N、断片d(474,475,476)-CのPCR産物を0.7％アガロースで電気泳動した結果、それぞれ約7000bpの断片d(474,475,476)-N及び断片d(474,475,476)-Cが確認できた。これらをそれぞれシグマ社GeneElute MINUS EtBr SPIN COLUMNSでの精製、フェノール抽出、エタノール沈殿に供した後、10μlの滅菌水に溶解した(それぞれ「断片d(474,475,476)-N溶液」、「断片d(474,475,476)-C溶液」)。
次いで、断片c(474,475,476)-N(2)溶液10μlと断片d(474,475,476)-N溶液5μlを混合し、断片c(474,475,476)-N(2),d(474,475,476)-N mix溶液を作製した。同様に、断片c(474,475,476)-C(2),d(474,475,476)-C mix溶液を作製した。これらを用いて、実施例１２と同様に形質転換を行い、それぞれ「αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6変異体のN末側ライブラリー」と「αP21L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6変異体のC末側ライブラリー」とした。
以下、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜し、さらに発光スペクトルを測定した。
表２に示されるように、選抜されたY280D/R372L/Q403P/N404G/T405M五重変異型CLuc及びI276N/Q403P/N404G/T405M四重変異型CLuc（いずれも第４及び第５変異型ルシフェラーゼ）の発光スペクトルピークはいずれも462nmであった。
上記、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第280番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸に変異、第372番目のアミノ酸がアルギニンからロイシンに変異、第403番目のアミノ酸がグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸がトレオニンからメチオニンに変異し、且つ配列番号６に示されるアミノ酸配列において第21番目がプロリンからロイシンに変異し、さらにCLuc遺伝子の下流にHis-tag遺伝子を導入したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]」と定義する。
〔実施例３０〕Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M五重変異型CLucに対するランダム変異導入による変異型CLucの作製
pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。変異の導入方法は実施例２９の29-2と同様である。
本実施例では、配列番号２３の塩基番号を用いて説明する。配列番号２３において、第900番目から第1717番目までの塩基配列をError Prone PCRにより増幅した。このDNA断片を「断片c(351,443,474,475,476)-N」と称する。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第280番目、第372番目、第403番目、第404番目及び第405番目のアミノ酸の位置に変異を含む、第1554番目から第2699番目までの塩基配列をError Prone PCRで増幅した。このDNA断片を「断片c(351,443,474,475,476)-C」と称する。
断片c(351,443,474,475,476)-Nを増幅する際のError Prone PCRの反応液組成は、実施例２９の29-2において断片c(474,475,476)-Cを増幅した際のError Prone PCRと、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]（実施例２９の29-2） 0.5μl(329ng/μl)、mut-CLuc-F(配列番号８)及びK340-rev：gtacggctcgagaagaccttt(配列番号５５)。
また、断片c(351,443,474,475,476)-Cを増幅する際のError Prone PCRの反応液組成は、断片c(351,443,474,475,476)-Nを増幅した際のError Prone PCRとプライマーのみが異なる。オリゴDNAプライマーは以下を使用した：mut-CLuc-CF1(配列番号１２)及びmut-CLuc-R(配列番号１３)。
断片c(351,443,474,475,476)-N及び断片c(351,443,474,475,476)-Cを増幅する際のError Prone PCRの反応条件は、実施例２９の29-2においてそれぞれ断片c(474,475,476)-N、断片c(474,475,476)-Cを増幅した際の反応条件と同じである。
以下、実施例２９の29-2と同様にして、断片c(351,443,474,475,476)-N溶液及び断片c(351,443,474,475,476)-C溶液を作製した。
次いで、断片c(351,443,474,475,476)-N及び断片c(351,443,474,475,476)-Cのそれぞれについて、PCRにより増幅した。増幅後の断片を、それぞれ「断片c(351,443,474,475,476)-N(2)」、「断片c(351,443,474,475,476)-C(2)」と称する。
断片c(351,443,474,475,476)-N(2)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：断片c(351,443,474,475,476)-N溶液、mut-CLuc-F(配列番号８)及びK340-rev(配列番号５５)。
また、断片c(351,443,474,475,476)-C(2)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例２９の29-2において断片c(474,475,476)-C(2)を増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：断片c(351,443,474,475,476)-C溶液。
得られた断片c(351,443,474,475,476)-N(2)、断片c(351,443,474,475,476)-C(2)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動を行い、実施例２９の29-2と同様にして、断片c(474,475,476)-N(2)溶液、断片c(474,475,476)-C(2)溶液を作製した。
一方、pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]の配列のうち、配列番号２３の第967番目から第1703番目までを欠いた直鎖状DNAをPCRによって増幅した。以後、このDNA断片を「断片d(351,443,474,475,476)-N」と称する。
断片d(351,443,474,475,476)-Nを増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片dを増幅した際のPCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6]、vec-CLuc-R(配列番号１０)及びSQ-CLuc-NF2(配列番号１１)。また、PCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際のPCRの反応条件と同じである。
以下、実施例２９の29-2と同様にして、断片d(351,443,474,475,476)-N溶液を作製した。
次いで、断片c(351,443,474,475,476)-N(2)溶液10μlと断片d(351,443,474,475,476)-N溶液5μlを混合し、断片c(351,443,474,475,476)-N(2),d(351,443,474,475,476)-N mix溶液を作製した。同様に、断片c(351,443,474,475,476)-C(2)溶液10μlと断片d(474,475,476)-C溶液（実施例２９の29-2）5μlを混合し、断片c(351,443,474,475,476)-C(2),d(474,475,476)-C mix溶液を作製した。これらを用いて、実施例１２と同様に形質転換を行い、それぞれ「αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6変異体のN末側ライブラリー」と「αP21L,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M,-(GS)3H6変異体のC末側ライブラリー」とした。
以下、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜し、さらに発光スペクトルを測定した。
以下に選抜されたクローンが有する変異型CLucを示す。
(1) V258A/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M/E479V七重変異型CLuc(当該変異型CLucにおいてはCLucとヒスチジンタグの間に配置したリンカー配列（GSGSGS）内にもアミノ酸置換を含んでいたが、発光スペクトルピークに影響を与えないと考えられる)
(2) R87S/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(3) K38R/R79S/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc
(4) L191Q/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(5) V75E/K126E/M223I/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M八重変異型CLuc
(6) K38I/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLuc
(7) S45G/E170G/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc
これらは、いずれも第４及び第５変異型ルシフェラーゼに相当する。それぞれの変異型CLucの発光スペクトルピークを、以下の表２に示す。
Figure 0005224457
上記クローンのうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第191番目のアミノ酸がロイシンからグルタミンに変異、第280番目のアミノ酸がチロシンからアスパラギン酸に変異、第372番目のアミノ酸がアルギニンからロイシンに変異、第403番目のアミノ酸がグルタミンからプロリンに変異、第404番目のアミノ酸がアスパラギンからグリシンに変異、第405番目のアミノ酸がトレオニンからメチオニンに変異し、且つ配列番号６に示されるアミノ酸配列において第21番目のアミノ酸がプロリンからロイシンに変異し、さらに変異型CLuc遺伝子の下流にHis-Tag遺伝子を導入したpCLuRA-TDH3プラスミドを、「pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6]」と定義する。
〔実施例３１〕L191Q/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M六重変異型CLucに対するランダム変異導入による変異CLucの作製
pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6]について、ランダムに変異を加えた。変異の導入方法は実施例２９の29-2と同様である。
本実施例においては、配列番号２３の塩基番号を用いて説明する。配列番号２に示されるアミノ酸配列において第191番目及び第280番目の変異を含む、配列番号２３において、第900番目から第1813番目までの塩基配列をError Prone PCRにより増幅した。このDNA断片を「断片c(262,351,443,474,475,476)-N」と称する。
断片c(262,351,443,474,475,476)-Nを増幅する際のError Prone PCRの反応液組成は、実施例２９の29-2において断片c(474,475,476)-Nを増幅した際のError Prone PCRの反応液組成と、鋳型とするDNA及び滅菌水の量のみが異なる。鋳型とするDNAと滅菌水の量は以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6](実施例３０) 0.5μl(298ng/μl)及び滅菌水 42μl。また、断片c(262,351,443,474,475,476)-Nを増幅する際のError Prone PCRの反応条件は、実施例２９の29-2において断片c(474,475,476)-N、断片c(474,475,476)-Cを増幅した際の条件と同じである。
以下、実施例２９の29-2と同様にして、断片c(262,351,443,474,475,476)-N溶液を作製した。
一方、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第191番目の変異を含む、配列番号２３において、第900番目から第1663番目までの塩基配列をPCRにより増幅した。増幅後の断片を「断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)」と称する。
断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)を増幅する際のPCRの反応液組成は、実施例８において断片c(475X)を増幅した際の反応液組成と、鋳型とするDNA及びプライマーのみが異なる。鋳型とするDNAとオリゴDNAプライマーは以下を使用した：断片c(262,351,443,474,475,476)-N溶液、mut-CLuc-F(配列番号８)及びSQ-CLuc-CR1(配列番号１５)。
得られた断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)のPCR産物を1％アガロースで電気泳動した結果、約700bpの断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)が確認できた。以後、実施例２９の29-2と同様にして断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)溶液を作製した。
また、pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6]の配列のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第191番目の変異を含む、配列番号２３の第1664番目から第2611番目を欠いた直鎖状DNAをPCRによって増幅した。このDNA断片を「断片d(262,351,443,474,475,476)-C」と称する。
断片d(262,351,443,474,475,476)-Cを増幅する際の反応液組成は、実施例２９の29-2において断片d(474,475,476)-Cを増幅した際の反応液組成と鋳型とするDNAのみが異なる。鋳型とするDNAは以下を使用した：pCLuRA-TDH3[αP21L,L191Q,Y280D,R372L,Q403P,N404G,T405M-(GS)3H6]。また、断片d(262,351,443,474,475,476)-Cを増幅する際のPCR反応条件は、実施例８において断片dを増幅した際の反応条件と同じである。
以後、実施例２９の29-2と同様にして断片d(262,351,443,474,475,476)-C溶液を作製した。
次いで、断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2)溶液10μlと断片d(351,443,474,475,476)-N溶液(実施例３０) 5μlを混合し、断片c(262,351,443,474,475,476)-N(2),d(351,443,474,475,476)-N mix溶液を作製した。同様に、断片c(351,443,474,475,476)-N(2)溶液(実施例３０) 10μlと断片d(262,351,443,474,475,476)-C溶液5μlを混合し、断片c(351,443,474,475,476)-N(2),d(262,351,443,474,475,476) mix溶液を作製した。これらを実施例１２と同様に形質転換を行い、それぞれ「αP21L,L262Q,Y351D,R443L,Q474P,N475G,T476M,-(GS)3H6変異体のN末側ライブラリー」と「αP21L,L262Q,Y351D,R443L,Q474P,N475G,T476M,-(GS)3H6変異体のC末側ライブラリー」とした。
以下、実施例８と同様にして、発光スペクトルシフトが起こっていると考えられるクローンを選抜し、さらに発光スペクトルを測定した。
選抜されたL191Q/Q235R/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc(第８変異型ルシフェラーゼ)の発光スペクトルピークは466nmであった。また、M178R/L191Q/Y280D/R372L/Q403P/N404G/T405M七重変異型CLuc(第９変異型ルシフェラーゼ)の発光スペクトルピークは435nmであった。これら2つの変異型CLucのピーク波長の差は31nmであり、光学フィルターとプログラム解析によって十分分離可能な発光色の異なる2種の変異型ルシフェラーゼを得た。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、下記７つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
    (A)第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換、
    (B)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
    (C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
    (D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
    (E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
    (F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
    (G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ下記７つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
    (A)第178番目のメチオニンからアルギニンへの置換、
    (B)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
    (C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
    (D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
    (E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
    (F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
    (G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
  2. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、下記７つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
    (A)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
    (B)第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換、
    (C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
    (D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
    (E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
    (F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
    (G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ下記７つの置換を有するアミノ酸配列から成るタンパク質
    (A)第191番目のロイシンからグルタミンへの置換、
    (B)第235番目のグルタミンからアルギニンへの置換、
    (C)第280番目のチロシンからアスパラギン酸への置換、
    (D)第372番目のアルギニンからロイシンへの置換、
    (E)第403番目のグルタミンからプロリンへの置換、
    (F)第404番目のアスパラギンからグリシンへの置換、及び
    (G)第405番目のトレオニンからメチオニンへの置換
  3. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第178番目のメチオニンがリジン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、第178番目のメチオニンがリジン又はアルギニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
  4. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第406番目のセリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第406番目のセリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
  5. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第407番目のイソロイシンがアラニンに置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
  6. 以下の(a)又は(b)のタンパク質から成る変異型ルシフェラーゼ。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第375番目のリジンがアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択される１種のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失し、且つ第375番目のリジンがアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから成る群より選択される１種のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質
  7. 外来タンパク質又はペプチドと請求項１〜６のいずれか１項記載の変異型ルシフェラーゼとが連結された融合タンパク質。
  8. 請求項１〜６のいずれか１項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項７記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
  9. 請求項８記載の遺伝子を含む組換えベクター。
  10. 請求項９記載の組換えベクターを有する形質転換体。
  11. 請求項８記載の遺伝子、並びに以下の(a)〜(c)のタンパク質から成るルシフェラーゼ又は融合タンパク質をコードする遺伝子から成る群より選択される2以上の遺伝子がそれぞれ異なるプロモーターの制御下に配置されていることを特徴とする、請求項１０記載の形質転換体。
    (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質
    (b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、第1番目〜第18番目のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列から成るタンパク質
    (c)外来タンパク質又はペプチドと上記(a)又は(b)のタンパク質とが連結された融合タンパク質
  12. 請求項１１記載の形質転換体の培養物又は培養上清をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と、
    各ルシフェラーゼ活性に基づく発光スペクトルの発光強度を測定する工程と、
    を含み、2以上のプロモーターの転写活性を評価することを特徴とする、プロモーター転写活性評価方法。
  13. 請求項１〜６のいずれか１項記載の変異型ルシフェラーゼ又は請求項７記載の融合タンパク質をルシフェリン又はその誘導体と接触させる工程と、
    励起状態のオキシルシフェリン又はその誘導体を化学物質に作用させる工程と、
    を含み、前記化学物質の励起に基づき発光させるか又はエネルギーを放出させることを特徴する、発光又はエネルギー放出方法。
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