WO2019168062A1 - 新規酵素及びそれを用いたペントシジンの測定方法 - Google Patents

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pentosidine
gene
protein
seq
amino acid
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和也 丸島
齋藤　由佳
有紀 塚田
佐藤　拓也
康子 荒木
敦 一柳
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キッコーマン株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Definitions

  • the present invention relates to pentosidine oxidase as a novel enzyme, a method for measuring pentosidine using pentosidine oxidase, and the like.
  • Pentosidine ((2S) -2-amino-6- [2-[[(4S) -4-amino-4-carboxylicbutyl] amino] imidazo [4,5-b] pyridin-4-yl] hexanoic acid) It is known that pentose, equimolar lysine and arginine are cross-linked and accumulate in human skin in correlation with aging and the onset of diabetes, especially in the onset of diabetes and end-stage nephropathy. ing.
  • Pentosidine can be quantified by HPLC using its fluorescence (Ex: 335 nm, Em: 385 nm) as an index after acid hydrolysis, and an immunochemical method (for example, ELISA method) using a monoclonal antibody against pentosidine. It is known that it can be quantified.
  • Pentosidine is known to be associated with schizophrenia in addition to aging and diabetes, and for example, a method for examining schizophrenia having a step of measuring the amount of pentosidine for a biological sample is disclosed (for example, see Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel enzyme and a simple and inexpensive method for quantifying pentosidine as compared with an immunochemical method or an instrumental analysis method using the novel enzyme.
  • the present inventors have identified a novel enzyme from a filamentous fungus and examined its activity. As a result, the novel enzyme was found to be useful for quantifying pentosidine, and the present invention was completed.
  • the outline of the present invention is as follows. [1] A protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine. [2] The following physicochemical properties: (1) action: activity to oxidatively degrade pentosidine; and (2) molecular weight by SDS-PAGE: 75,000-85,000.
  • [4] The protein according to any one of [1] to [3], wherein the activity is a detomination product of pentosidine, an activity of generating hydrogen peroxide and ammonia, or an activity of consuming oxygen.
  • [5] The protein according to any one of [1] to [4], which is derived from a filamentous fungus.
  • [6] The protein according to any one of [1] to [5], wherein the optimum pH is about 6.5 to 8.0.
  • [8] The protein according to any one of [1] to [7], wherein the activity is maintained at 90% or more after storage at 30 ° C. for 10 minutes.
  • a kit comprising the protein according to any one of [1] to [10] or the gene according to [11] or [12].
  • a recombinant vector comprising the gene according to [11] or [12].
  • a transformant comprising the vector according to [14].
  • a method for measuring pentosidine comprising a step of bringing the protein according to any one of [1] to [10] into contact with a specimen; and a step of detecting a change caused by the contact.
  • the method according to [17] wherein a change in the amount of oxygen, hydrogen peroxide or ammonia is detected.
  • a method for producing a reaction product of pentosidine comprising a step of bringing the protein according to any one of [1] to [10] into contact with pentosidine.
  • the reaction product is hydrogen peroxide or ammonia.
  • the novel enzyme pentosidine oxidase identified by the inventors oxidatively degrades pentosidine, thereby producing hydrogen peroxide and ammonia. Is considered to generate. Since detection and quantification of hydrogen peroxide can be easily performed by a colorimetric method, a fluorescence method, a chemiluminescence method, an electrode method, or the like through a peroxidase reaction or the like, according to the present invention, pentosidine can be easily and rapidly performed by an enzymatic method. Detection and quantification are possible.
  • FIG. 1 shows the results of a substrate concentration dependency test of a crude enzyme purified solution (Elution 1) fractionated from Sarocladium sp. Using anion exchange chromatography. ⁇ OD (vertical axis) is plotted against pentosidine final concentration (horizontal axis). Data 20 minutes after the start of the reaction was used.
  • FIG. 2 shows the result of the heat inactivation test of the crude enzyme purified solution (Elution 1). The result is an analysis of the deactivation of enzyme activity due to heat treatment, and corresponds to data 20 minutes after the start of the reaction.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the concentration of hydrogen peroxide produced by reacting pentosidine and pentosidine oxidase.
  • FIG. 4 shows the relationship between the final concentration of pentosidine and the A 658 increase ( ⁇ A) resulting from the oxidation of pentosidine.
  • FIG. 5 shows an estimated mechanism of a reaction in which pentosidine oxidase decomposes pentosidine. The figure shows a state in which each amino group of lysine and arginine constituting pentosidine is oxidatively deaminated to generate hydrogen peroxide and ammonia.
  • FIG. 6A shows the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • FIG. 6B shows the sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • FIG. 6C shows the sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • FIG. 6D shows the sequences of SEQ ID NOs: 7-11.
  • FIG. 6E shows the sequences of SEQ ID NOs: 12-14.
  • FIG. 7 shows the range of optimum pH for PenOX2.
  • FIG. 8 shows the optimum temperature range of PenOX2.
  • FIG. 9 shows the range of thermal stability of PenOX2.
  • FIG. 10 shows the range of stable pH of PenOX2.
  • FIG. 11 shows the Km value of PenOX2 for pentosidine.
  • FIG. 12 shows the molecular weight of PenOX2.
  • the details of the protein which is one embodiment of the present invention, the gene encoding the same, the transformant, the production method, and the like will be described.
  • the present invention can take various forms as long as the object is achieved.
  • the present invention provides a protein having pentosidine oxidase activity, a gene encoding the same, and the like.
  • Pentosidine oxidase is a novel enzyme and its enzyme activity has not been fully elucidated.
  • pentosidine oxidase activity refers to the activity of oxidatively degrading pentosidine, more specifically Means the activity of oxidizing pentosidine to produce its deamination product, hydrogen peroxide, ammonia, or consuming oxygen.
  • pentosidine oxidase activity refers to the activity of oxidatively degrading pentosidine, more specifically Means the activity of oxidizing pentosidine to produce its deamination product, hydrogen peroxide, ammonia, or consuming oxygen.
  • it has such an enzymatic activity, it is not limited to a specific sequence, and any protein and a gene encoding the same are intended to be included in the scope of the present invention.
  • the gene of the present invention includes a base sequence encoding the amino acid sequence of pentosidine oxidase.
  • Pentosidine oxidase is not particularly limited as long as it has the enzyme activity described above.
  • one embodiment of the enzyme having the above-described pentosidine oxidase activity is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • the proteins having the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 may be referred to as pentosidine oxidase 1 (or PenOX1) and pentosidine oxidase 2 (or PenOX2), respectively.
  • pentosidine oxidase 1 (g4462) is predicted to be composed of 6 exons and 5 introns, while the gene encoding pentosidine oxidase 2 (g10122) is composed of 2 exons and 1 intron. It is expected that. Both enzymes are common in that they have high substrate specificity for pentosidine and arginine, but their reactivity with other L-amino acids is different.
  • the pentosidine oxidase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 is derived from a genus Salocladium .
  • the base sequences of the genes encoding these enzymes are the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • FIG. 6 shows the amino acid sequence and base sequence of the enzyme.
  • the amino acid sequence of pentosidine oxidase has the enzyme activity of pentosidine oxidase as described above
  • the amino acid sequence of the wild-type enzyme such as SEQ ID NO: 2 or 4, for example, the number of amino acids in the amino acid sequence If 100 units are taken as one unit, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, per unit. It may consist of an amino acid sequence having 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25, preferably several amino acid deletions, substitutions, additions and the like.
  • the range of “1 to several” in the “deletion, substitution and addition of one to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but is preferably 1, 2, 3, 4 per unit.
  • amino acid deletion means deletion or disappearance of an amino acid residue in the sequence
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence is replaced with another amino acid residue.
  • Additional of amino acid means that a new amino acid residue is added to the sequence.
  • amino acid deletion, substitution, addition there is a mode in which an amino acid is replaced with another chemically similar amino acid as long as pentosidine oxidase is maintained.
  • a case where a certain hydrophobic amino acid is substituted with another hydrophobic amino acid, a case where a certain polar amino acid is substituted with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • non-polar amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • the basic amino acid having a positive charge include arginine, histidine, and lysine.
  • acidic amino acids having a negative charge include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequence of pentosidine oxidase examples include amino acid sequences having a certain degree of sequence identity with the amino acid sequences of wild-type enzymes such as SEQ ID NOs: 2 and 4, for example, the amino acid sequence of pentosidine oxidase enzyme and 75 % Or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more amino acid sequences.
  • pentosidine oxidase gene The gene encoding pentosidine oxidase (hereinafter sometimes referred to as “pentosidine oxidase gene”) is not particularly limited as long as it includes a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme having the above-mentioned pentosidine oxidase activity.
  • the pentosidine oxidase gene is produced by expressing the pentosidine oxidase gene in the transformant.
  • gene expression means that an enzyme encoded by a gene is produced in a form having an original catalytic activity through transcription or translation.
  • gene expression includes high expression of a gene, that is, insertion of a gene causes production of an enzyme encoded by the gene in excess of the amount originally expressed by the host organism. To do.
  • pentosidine oxidase gene When a pentosidine oxidase gene is introduced into a host organism, even if it is a gene that can generate pentosidine oxidase via splicing after transcription of the gene, pentosidine oxidase gene can be converted without passing through splicing after transcription of the gene. Either gene that can be generated may be used.
  • the pentosidine oxidase gene may not be completely the same as the gene originally possessed by an organism derived from a genus Salocladium (ie, a wild-type gene), as long as it is a gene encoding the enzyme having the above-mentioned pentosidine oxidase activity.
  • it may be DNA having a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene under stringent conditions.
  • the “base sequence hybridizing under stringent conditions” means colony hybridization using a DNA corresponding to a part of the base sequence of a wild-type gene such as SEQ ID NO: 1 or 3 as a probe. It means the base sequence of DNA obtained by using the method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method and the like.
  • stringent conditions in the present specification is a condition in which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal.
  • the hybridization system used, the type of probe, and the sequence It depends on the length. Such conditions can be determined by changing the hybridization temperature, washing temperature and salt concentration.
  • the specificity when a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the hybridization and washing temperature and, if necessary, lowering the washing salt concentration. If no specific hybrid signal is detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and washing temperatures and, if necessary, raising the washing salt concentration.
  • specific examples of stringent conditions include: For example, using a DNA probe as a probe, hybridization is 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v) blocking reagent for nucleic acid hybridization (manufactured by Boehringer Mannheim), 0.1% (w / v) N -Lauroyl sarcosine, 0.02% (w / v) SDS is used overnight (about 8 to 16 hours). Washing is performed using 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, twice for 15 minutes. Do. The temperature for performing hybridization and washing is 65 ° C or higher, preferably 68 ° C or higher.
  • Examples of the DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions include, for example, a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter on which a fragment of the DNA is immobilized, as described above. After hybridization at 40 to 75 ° C. in the presence of DNA obtained by hybridization under a gentle condition or 0.5 to 2.0 M NaCl, preferably 0.7 to 1.0 M After hybridization at 65 ° C. in the presence of NaCl, the filter was used at 65 ° C. using 0.1 to 1 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). Examples thereof include DNA that can be identified by washing.
  • Probe preparation and hybridization methods are described in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd-Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereinafter, these documents are also referred to as “reference technical documents”). it can.
  • Conditions for obtaining a DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary base sequence can be appropriately set.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain sequence identity with a base sequence of a DNA having a base sequence of a wild-type gene used as a probe.
  • the base sequence of the wild-type gene As a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene, for example, if the number of bases in the base sequence is 500 units, the base sequence of the wild-type gene 1 to several per unit, for example 1 to 125, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to several, For example, it includes a base sequence having 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 base deletions, substitutions, additions, and the like.
  • base deletion means that there is a deletion or disappearance in the base in the sequence
  • base replacement means that the base in the sequence is replaced with another base
  • Additional of a base means that a new base is added to be inserted.
  • the enzyme encoded by the base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene is one to a plurality of amino acid sequences that the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene has. It is likely that the enzyme has an amino acid sequence having deletions, substitutions, additions, etc., preferably several amino acids, but has the same enzyme activity as the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene .
  • the gene encoding the enzyme is a base sequence encoding an amino acid sequence that is the same as or similar to the amino acid sequence of the enzyme encoded by the wild-type gene, utilizing the fact that there are several types of codons corresponding to one amino acid.
  • it may contain a nucleotide sequence different from the wild type gene.
  • Examples of the base sequence in which the codon modification is applied to the base sequence of such a wild type gene include, for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 5 (penox1) obtained by modifying the codon of g4462, and the sequence obtained by modifying the codon of g10122 No. 6 (penox2) and the like (FIG. 6C).
  • the base sequence subjected to codon modification is preferably, for example, a base sequence subjected to codon modification so as to be easily expressed in a host organism.
  • the method for determining the sequence identity of the base sequence or amino acid sequence is not particularly limited.
  • the target is the amino acid sequence of the wild type gene or the enzyme encoded by the wild type gene. It is obtained by aligning the base sequence and amino acid sequence and using a program for calculating the coincidence rate of both sequences.
  • a person skilled in the art can search, for example, a sequence showing high sequence identity from a database using a program described above. These can be used, for example, on the website of the US National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • Each of the above methods can be generally used for searching a sequence showing sequence identity from a database.
  • Genetyx network version version 12.0 As a means for determining the sequence identity of individual sequences, Genetyx network version version 12.0. A homology analysis of 1 (Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985).
  • CDS or ORF regions encoding a protein
  • the gene encoding the enzyme is derived from a biological species capable of producing pentosidine oxidase.
  • examples of the organism derived from the gene encoding the enzyme include microorganisms such as filamentous fungi.
  • microorganisms having the ability to produce pentosidine oxidase include the genus Salocladium .
  • the origin of the gene encoding the enzyme is not particularly limited, but the enzyme expressed in the transformant is preferably inactivated without being inactivated by the growth conditions of the host organism. Therefore, the organism derived from the gene encoding the enzyme is preferably a microorganism whose growth conditions approximate the host organism to be transformed by inserting the gene encoding the enzyme.
  • Optimum pH pH of about 6.5 to 8.0
  • the optimum pH is the pH at which the enzyme works most favorably, and the pentosidine oxidase can act at a pH outside the above range.
  • ⁇ Optimum temperature about 37-50 °C
  • the optimum temperature is the temperature at which the enzyme works most favorably, and the pentosidine oxidase can act at a temperature outside the above temperature range.
  • -Temperature stability When stored at 30 ° C for 10 minutes, the pentosidine oxidase activity is maintained at 90% or more.
  • the pentosidine oxidase activity When stored at 40 ° C. for 10 minutes, the pentosidine oxidase activity is retained by 50% or more.
  • PH stability Pentosidine oxidase activity is maintained at 60% or more in the pH range of 4.0 to 9.0.
  • -Km value Km value with respect to pentosidine is 1 mM or less.
  • the Km value is a Michaelis constant, and its specific calculation method is not particularly limited, and can be calculated by freely selecting a known method. For example, the Km value can be calculated according to the Michaelis-Menten equation drawn by the method based on the Line Weber-Burk plot as in the method described in Example 9 described later.
  • the gene encoding the enzyme can be inserted into various appropriate known vectors. Furthermore, by introducing this vector into a suitable known host organism, a transformant into which a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding the enzyme has been introduced can be produced.
  • a method for obtaining a gene encoding an enzyme, a base sequence of a gene encoding the enzyme, a method for obtaining amino acid sequence information of the enzyme, a method for producing various vectors, a method for producing a transformant, and the like are appropriately selected by those skilled in the art. Can do.
  • transformation and transformants include transduction and transductants, respectively.
  • An example of the cloning of the gene encoding the enzyme is described below without limitation.
  • chromosomal DNA and mRNA can be extracted from microorganisms and various cells having the ability to produce enzymes by conventional methods, for example, the methods described in the reference technical literature (listed above).
  • CDNA can be synthesized using the extracted mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • the gene encoding the enzyme can be obtained by cloning using a chromosomal DNA or cDNA of a derived organism having the gene as a template.
  • the organism from which the gene encoding the enzyme is derived is not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned Sarocladium sp .
  • Sarocladium sp for example, by culturing Sarocladium sp. , Removing moisture from the obtained cells, and physically pulverizing them using a mortar or the like while cooling in liquid nitrogen, fine powdered cells A chromosomal DNA fraction is extracted from the bacterial cell piece by a conventional method.
  • a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen) can be used for the chromosomal DNA extraction operation.
  • DNA is amplified by performing polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using the chromosomal DNA as a template and a primer complementary to the 5 ′ end sequence and the 3 ′ end sequence.
  • the primer is not particularly limited as long as a DNA fragment containing the gene can be amplified.
  • DNA containing the target gene fragment can be amplified by appropriate PCR such as 5'RACE method or 3'RACE method, and these can be ligated to obtain DNA containing the full length target gene.
  • the method for obtaining the gene encoding the enzyme is not particularly limited, and it is possible to construct a gene encoding the enzyme using, for example, a chemical synthesis method without using a genetic engineering technique.
  • Confirmation of the base sequence in the amplification product amplified by PCR or the chemically synthesized gene can be performed, for example, as follows. First, a DNA whose sequence is to be confirmed is inserted into an appropriate vector according to a normal method to produce a recombinant DNA.
  • kits such as TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen); pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBluescript SK + (Stratagene)
  • plasmid vector DNA such as pYES2 / CT (manufactured by Invitrogen); commercially available bacteriophage vector DNA such as ⁇ EMBL3 (manufactured by Stratagene).
  • the recombinant DNA is used to transform a host organism, such as Escherichia coli , preferably E. coli JM109 strain (Takara Bio) or E. coli DH5 ⁇ strain (Takara Bio). To do.
  • the recombinant DNA contained in the obtained transformant may be purified using QIAGEN Plasmid Mini Kit (manufactured by Qiagen).
  • the base sequence of each gene inserted into the recombinant DNA can be determined by the dideoxy method (Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983).
  • the sequence analysis apparatus used for determining the base sequence is not particularly limited. For example, Li-COR MODEL 4200L sequencer (manufactured by Aroka), 370 DNA sequence system (manufactured by PerkinElmer), CEQ2000XL DNA analysis system (manufactured by Beckman) ) And the like. Based on the determined base sequence, the translated protein, that is, the amino acid sequence of the enzyme can be known.
  • a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding an enzyme combines a PCR amplification product containing any of the genes encoding the enzyme and various vectors in a form that allows expression of the gene encoding the enzyme.
  • a DNA fragment containing the gene having a sequence homologous to the plasmid added to both ends and a plasmid-derived DNA fragment amplified by inverse PCR are commercially available, such as In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). It can be obtained by ligation using a recombinant vector preparation kit.
  • a method for producing a transformant is not particularly limited, and examples thereof include a method of inserting into a host organism in such a manner that a gene encoding an enzyme is expressed according to a conventional method.
  • a method for producing a transformant by creating a DNA construct in which any of the genes encoding the enzyme is inserted between an expression-inducing promoter and a terminator, and then transforming the host organism with the DNA construct comprising the gene encoding the enzyme.
  • a transformant overexpressing the gene encoding the enzyme can be obtained.
  • a DNA fragment composed of an expression-inducing promoter-enzyme encoding a gene-terminator and a recombinant vector containing the DNA fragment, which are prepared for transforming a host organism, are collectively referred to as a DNA construct.
  • the method of inserting the enzyme-encoding gene into the host organism in such a manner that it is expressed is not particularly limited. Examples thereof include a method of introducing the product into a host organism by ligation onto a plasmid vector.
  • a DNA construct can be ligated between sequences homologous to the upstream region and downstream region of the recombination site on the chromosome and inserted into the genome of the host organism.
  • the homologous sequence can be inserted into the genome of the host organism even when it is not linked to a DNA construct.
  • the high expression promoter is not particularly limited.
  • the promoter region of the translation elongation factor TEF1 gene (tef1)
  • the promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy)
  • the alkaline protease gene (alp) promoter region
  • gpd glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase
  • a DNA construct in a method using a vector, can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of a host organism by a conventional method, and the corresponding host organism can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing an enzyme in a host organism.
  • a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing an enzyme in a host organism.
  • pUC19 and a filamentous fungal system pSTA14 (Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989) and filamentous fungi systems.
  • the DNA construct is preferably used after being introduced into the chromosome of the host organism.
  • the DNA construct is used in an autonomously replicating vector (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)). By incorporating it, it can be used in a form not introduced into the chromosome.
  • the DNA construct may contain a marker gene that makes it possible to select transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include genes that complement the auxotrophy of host organisms such as pyrG, niaD, and adeA; drug resistance genes for drugs such as pyrithiamine, hygromycin B, and oligomycin.
  • the DNA construct preferably contains a promoter, terminator and other control sequences (for example, an enhancer, a polyadenylation sequence, etc.) that allow overexpression of the gene encoding the enzyme in the host organism.
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter and a constitutive promoter.
  • Examples thereof include a tef1 promoter, an alp promoter, an amy promoter, and a gpd promoter.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, and a tef1 terminator.
  • the expression control sequence of the gene encoding the enzyme is not necessarily required when the DNA fragment containing the gene encoding the enzyme to be inserted includes a sequence having an expression control function. Further, when transformation is performed by the co-transformation method, the DNA construct may not have a marker gene.
  • the DNA construct can be tagged for purification.
  • purification using a nickel column can be made possible by appropriately connecting a linker sequence upstream or downstream of a gene encoding an enzyme and connecting 6 or more codons of a base sequence encoding histidine.
  • the DNA construct may contain a homologous sequence necessary for marker recycling.
  • the pyrG marker adds a sequence homologous to the sequence upstream of the insertion site (5 ′ homologous recombination region) downstream of the pyrG marker, or downstream of the insertion site (3 ′ homologous recombination region) upstream of the pyrG marker.
  • a sequence homologous to this sequence it is possible to remove the pyrG marker on a medium containing 5-fluoroorotic acid (5FOA).
  • the length of the homologous sequence suitable for marker recycling is preferably 0.5 kb or more.
  • DNA construct is, for example, a DNA construct in which a tef1 gene promoter, an enzyme-coding gene, an alp gene terminator, and a pyrG marker gene are linked to an In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19.
  • a DNA construct in the case of inserting a gene by homologous recombination is a DNA in which a 5 ′ homologous recombination sequence, a tef1 gene promoter, an enzyme-encoding gene, an alp gene terminator and a pyrG marker gene, and a 3 ′ homologous recombination sequence are linked. It is a construct.
  • One embodiment of the DNA construct in the case of inserting a gene by homologous recombination and recycling the marker is 5 ′ homologous recombination sequence, tef1 gene promoter, gene encoding enzyme, alp gene terminator, homologous sequence for marker recycling, It is a DNA construct in which a pyrG marker gene and a 3 ′ homologous recombination sequence are linked.
  • the host organism is a filamentous fungus
  • a method known to those skilled in the art can be appropriately selected as a method for transformation into the filamentous fungus.
  • polyethylene glycol and calcium chloride are added.
  • the protoplast PEG method used see, for example, Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989 (supra), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-2222055, etc.
  • As a medium for regenerating the transformant an appropriate medium is used according to the host organism to be used and the transformation marker gene. For example, when Aspergillus oryzae ( A. oryzae ) or Aspergillus sojae ( A.
  • sojae is used as the host organism and the pyrG gene is used as the transformation marker gene, regeneration of the transformant is, for example, 0.5 Czapek-Dox minimal medium (manufactured by Difco) containing 1% agar and 1.2 M sorbitol.
  • the promoter of a gene encoding an enzyme that the host organism originally has on the chromosome may be replaced with a high expression promoter such as tef1 using homologous recombination.
  • a transformation marker gene such as pyrG
  • a transformation cassette comprising a part can be used.
  • the upstream region of the gene encoding the enzyme and all or part of the gene encoding the enzyme are used for homologous recombination.
  • the whole or part of the gene encoding the enzyme can be used including a region in the middle from the start codon.
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or more.
  • Confirmation that a transformant was produced can be performed by culturing the transformant under conditions where the enzyme activity of the enzyme is observed, and then detecting the target product in the culture obtained after the culture. .
  • confirmation that the transformant was produced was performed by extracting chromosomal DNA from the transformant, performing PCR using this as a template, and confirming that a PCR product that can be amplified is produced when transformation occurs. It may be done by doing. In this case, for example, PCR is performed with a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transformation marker gene to confirm that a product of the expected length is generated.
  • PCR is performed using a combination of a forward primer located upstream from the upstream homologous region used and a reverse primer located downstream from the used homologous region. It is preferable to confirm that a product of the expected length is produced when recombination occurs.
  • the host organism is not particularly limited as long as it is an organism that can produce an enzyme by transformation with a DNA construct containing a gene encoding the enzyme.
  • microorganisms or plants examples of the microorganisms, Aspergillus (Aspergillus) microorganisms belonging to the genus, Escherichia (Escherichia) microorganism belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces) microorganisms belonging to the genus Pichia (Pichia) sp microorganism, Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) a microorganism belonging to the genus , Gigot Saccharomyces Seth (Zygosaccharomyces) microorganism belonging to the genus Trichoderma (Trichoderuma) microorganism belonging to the genus, Penicillium (Penicillium) microorganism belonging to the genus,
  • Microorganism Fusariu Beam (Fusarium) a microorganism belonging to the genus, Neosartorya (Neosartorya) microorganism belonging to the genus, Bissokuramisu (Byssochlamys) microorganism belonging to the genus, Talaromyces (Talaromyces) microorganism belonging to the genus, Ajeromisesu (Ajellomyces) a microorganism belonging to the genus, para cock Sidi Oy death (Paracoccidioides) microorganism belonging to the genus, Anshinokarupusu (Uncinocarpus) a microorganism belonging to the genus, cock Sidi Oy death (Coccidioides) microorganism belonging to the genus, Arufuroderuma (Arthroderma) microorganism belonging to the genus, Trichophyton (Trichophyton) microorganism belonging to the genus
  • filamentous fungi Aspergillus oryzae, Aspergillus soya, Aspergillus niger ( A. niger), Aspergillus tamari ( A. tamarii ), Aspergillus awamori ( A. awamori), Aspergillus Usami (A.usami), Aspergillus kawachii (A.kawachii), such as Aspergillus microorganisms, such as Aspergillus saitoi (A.saitoi) is preferable.
  • the expression of the protein according to the present invention is not limited to the implementation using the host organism as described above.
  • an in vitro cell-free protein expression system can be suitably used particularly when mass production is not intended, such as production on a commercial scale.
  • the cell-free protein expression system does not require cell culture and has an advantage that protein purification can be easily performed.
  • a gene corresponding to a desired protein and a reaction solution containing molecular mechanisms of transcription and translation such as cell lysate are mainly used.
  • genes encoding enzymes include genes g4462 and g10122 having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.
  • the amino acid sequences of pentosidine oxidase 1 protein (PenOX1) and pentosidine oxidase 2 protein (PenOX2) are shown as SEQ ID NOs: 2 and 4, respectively.
  • a method for obtaining a gene encoding an enzyme from an organism other than the genus Salocladium and the genus Salocladium is not particularly limited.
  • the genomic DNA of the organism of interest is BLAST. It can be obtained by homology search and specifying a gene having a base sequence having high sequence identity with the base sequences of genes g4462 and g10122.
  • a protein having an amino acid sequence having a high sequence identity with the amino acid sequences of the pentosidine oxidase 1 and pentosidine oxidase 2 proteins (SEQ ID NOs: 2 and 4) is identified, and the gene encoding the protein Can be obtained by specifying.
  • a gene encoding an enzyme obtained from the genus Salocladium or a gene encoding an enzyme having sequence identity with the enzyme can be introduced into any host cell such as an Aspergillus microorganism as a host organism for transformation.
  • Transformant One aspect of the transformant is a transformant in which any one or a combination of genes is inserted using a microorganism or plant as a host organism, and the inserted gene is expressed. It is a conversion body.
  • transformant is a gene (including a promoter sequence other than the ORF) including all or part of the gene g4462 or g10122, using a microorganism, a plant, or the like as a host organism, and transcription of the gene.
  • a transformant in which a DNA construct designed to express high or low expression of a transcription factor that regulates is inserted and transformed to express the inserted gene.
  • the host organism is an organism that is capable of producing pentosidine oxidase, such as Salocladium
  • the inserted gene should be constitutively expressed higher than forced or endogenous expression, or after cell growth. It is desirable that the condition is expressed at the later stage of culture.
  • Such a transformant is not produced in the host organism by being cultured or grown under the conditions suitable for the host organism or transformant by the action of a transcription factor having an altered expression level, or even if produced, pentosidine oxidase Can be produced beyond detection.
  • a method for producing pentosidine oxidase by culturing a transformant under a culture condition suitable for the growth of the transformant using a medium suitable for the growth of the transformant.
  • the method of doing is mentioned.
  • the culture method is not particularly limited. For example, when the host organism is a filamentous fungus, a solid culture method or a liquid culture method performed under aerated or non-aerated conditions can be used.
  • the production method according to another aspect of the present invention is a method for producing pentosidine oxidase extracted from a transformant.
  • a host organism and a wild type organism are filamentous fungi
  • the manufacturing method of each aspect of this invention is not limited to the following description.
  • the medium is a normal medium for culturing host organisms and wild-type organisms (hereinafter collectively referred to as “host organisms”), that is, carbon sources, nitrogen sources, minerals, and other nutrients in appropriate proportions. Any of a synthetic medium and a natural medium can be used.
  • host organism is a microorganism belonging to the genus Aspergillus, a YMG medium, a PPY medium, or the like as described in Examples described later can be used, but is not particularly limited.
  • the culture condition of the transformant may be a culture condition of a host organism or the like commonly known by those skilled in the art.
  • the initial pH of the medium is adjusted to 5 to 10
  • the culture temperature can be appropriately set such that the culture temperature is 20 to 40 ° C.
  • the culture time is several hours to several days, preferably 1 to 7 days, more preferably 2 to 4 days.
  • the culture means is not particularly limited, and aeration and agitation deep culture, shaking culture, static culture, and the like can be adopted, but culture is preferably performed under conditions that provide sufficient dissolved oxygen.
  • a culture medium and culture conditions for culturing an Aspergillus microorganism shaking culture at 30 ° C. and 160 rpm for 3 to 5 days using a YMG medium or PPY medium described in Examples described later can be mentioned. It is done.
  • the method for extracting pentosidine oxidase from the culture after completion of the culture is not particularly limited.
  • the cells recovered from the culture by filtration, centrifugation, or the like may be used as they are, or the cells recovered after drying and further crushed cells may be used.
  • the method for drying the cells is not particularly limited, and examples thereof include freeze drying, sun drying, hot air drying, vacuum drying, aeration drying, and reduced pressure drying.
  • the method of destroying a microbial cell using destructive means such as an ultrasonic crusher, a French press, a dynomill, a mortar
  • the cells may be subjected to cell disruption treatment such as a method of dissolving cells using a surfactant such as SDS or Triton X-100. These methods can be used alone or in combination.
  • the obtained extract is centrifuged, filtered, ultrafiltered, gel filtered, separated by solubility difference, solvent extraction, chromatography (adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography).
  • the target product can be purified by subjecting it to purification treatment such as reverse phase chromatography, crystallization, activated carbon treatment, membrane treatment, etc.
  • the method for measuring pentosidine according to the present invention is: Contacting the specimen with pentosidine oxidase; and detecting a change caused by the contact.
  • specimen refers to a sample such as blood, body fluid or excreta derived from a subject, eg, a subject suffering from or suspected of having a disease related to pentosidine. means.
  • the specimen does not necessarily contain pentosidine, and even if it does not contain pentosidine, the measurement method according to the present invention can be used for analysis of the presence or absence of pentosidine (qualitative analysis).
  • change caused by contact refers to the presence or absence of a starting material such as pentosidine, a reaction product or reaction consumer with pentosidine oxidase, or the amount thereof. Means change over time.
  • the method for measuring pentosidine is: (A) a step of allowing pentosidine oxidase to act on a specimen in the presence of water and oxygen; and (B) a step of measuring at least one amount of a reaction product or a reaction product resulting from the action of the pentosidine oxidase.
  • the reaction product measured in the above step (B) there can be mentioned deamination products of hydrogen peroxide, ammonia and pentosidine.
  • the amount of hydrogen peroxide as a reaction product can be measured by, for example, a peroxidase reaction.
  • the amount of ammonia as a reaction product is determined by, for example, the indophenol method or a method using a Nessler reagent, or a method of measuring the amount of NADH using an enzyme that uses ammonia as a substrate, such as glutamate dehydrogenase or NAD synthase. It can be measured.
  • deaminated product means, for example, that one or both of the amino groups of lysine and arginine constituting pentosidine are removed and replaced with oxygen, and at least one terminal is converted to keto acid. Means the product.
  • An example of such a deaminated product is shown in FIG.
  • An example of the reaction consumable to be measured in the step (B) is oxygen.
  • the amount of oxygen that decreases due to the enzyme reaction can be measured, for example, with an oxygen electrode, or colorimetrically determined by oxidizing manganese ions with oxygen based on the Winkler technique.
  • the present invention provides a kit comprising pentosidine oxidase.
  • the kit according to the present invention can be used to detect a reaction product or a reaction product of pentosidine and pentosidine oxidase.
  • the kit according to the present invention further comprises a reaction buffer and a reagent for detecting a reaction product, such as a reagent for detecting hydrogen peroxide, a reagent for detecting a deamination product of ammonia detection reagent and pentosidine, or a reagent for detecting a reaction product. It may contain at least one reagent such as a reagent for detecting oxygen.
  • the kit of the present invention can also be used as an in-vitro diagnostic agent, and can be suitably used, for example, for the diagnosis of pentosidine or a disease associated with the reaction product of pentosidine and pentosidine oxidase, such as diabetes and nephropathy.
  • Reagents for detecting hydrogen peroxide include 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -phenocyanazine (DA-67) and N- (carboxymethylamino) which can detect hydrogen peroxide with high sensitivity.
  • a known color reagent such as a tender reagent may be used.
  • the ammonia detection reagent include a combination of phenol / nitroplusacid sodium and an oxidizing agent such as sodium hypochlorite (Indophenol method), Nessler's reagent, and the like.
  • the oxygen detection reagent include a combination of manganese ion, sodium hydroxide and sulfuric acid.
  • reaction products using a color reaction is extremely simple and inexpensive compared to immunochemical and instrumental analytical methods.
  • detection of reaction products or reaction consumables does not exclude other known quantitative / qualitative methods other than detection reagents, and may be employed as appropriate.
  • the detection instead of the hydrogen peroxide or ammonia detection reagent, the detection can be performed using an apparatus such as an enzyme sensor having a dedicated detection electrode.
  • the method for detecting a reaction product or reaction consumable can be used as a detection method for a disease that is directly or indirectly related to pentosidine or each reaction product or reaction consumable, and further to a diagnostic method. .
  • Example 1 Cultivation of Salocladium sp. And method for preparing enzyme solution and medium used MEA medium: Malt extract agar (manufactured by Oxoid) was dissolved in distilled water to a concentration of 50 g / L.
  • YMG medium Yeast extract 0.4%, Malt extract 1%, glucose 0.4%, pH 5.5
  • YMG medium in which the cells were cultured was filtered using Miracloth (Merck Millipore) to remove the cells and obtain a culture supernatant. Concentrate the culture supernatant using an ultrafiltration membrane (Vivaspin 20-3k, manufactured by GE Healthcare) and dilute with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) multiple times to remove low molecules. At the same time, the YMG medium was replaced with a potassium phosphate buffer.
  • the buffer-substituted crude enzyme solution was fractionated using an ion exchange chromatography column (HiTrap Q Sepharose Fast Flow 1 mL, manufactured by GE Healthcare). The specific procedure is as follows.
  • the crude enzyme solution was loaded onto a column equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), the enzyme was adsorbed onto the column, and then the column was washed with 5 mL of potassium phosphate buffer to remove unadsorbed protein. Was eluted.
  • the protein adsorbed on the column was eluted by sequentially passing 5 mL each of a buffer in which 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, and 1.0 M sodium chloride was dissolved in the potassium phosphate buffer.
  • the solution eluted from the column when the crude enzyme solution was loaded is “Flow through”, the solution eluted at the time of washing with the buffer is “Start buffer”, and the solutions eluted with the buffer containing sodium chloride are “Election 1” and “Elution 2”, respectively. , “Elution 3” and “Elution 4”, which were collected in different containers.
  • Example 2 Method for Measuring Pentosidine Oxidase Activity / Activity Measurement of Crude Enzyme Purified Solution The activity was measured using a solution eluted from a column for ion exchange chromatography as a sample. 50 ⁇ L of a sample, 25 ⁇ L of 4 mM pentosidine (manufactured by Peptide Laboratories) dissolved in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), oxidase coloring reagent (4 U / mL peroxidase (manufactured by TOYOBO), 1.8 mM 4-aminoantipyrine ( (Fluka), 2 mM TOOS (Dojindo)) 25 ⁇ L and mixed at room temperature.
  • pentosidine manufactured by Peptide Laboratories
  • oxidase coloring reagent 4 U / mL peroxidase (manufactured by TOYOBO)
  • TOYOBO oxidase coloring reagent
  • a 96-well microwell plate manufactured by Nunc
  • the blank was prepared by adding 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) instead of the substrate solution.
  • the absorbance at 555 nm of the reaction solution and the blank solution was measured, and the strength of the enzyme activity was evaluated based on the difference in absorbance ( ⁇ OD).
  • the transition of the activity with respect to the substrate concentration was evaluated by measuring the pentosidine oxidase activity of the crude enzyme purified solution using various concentrations of the substrate.
  • the concentration of the substrate solution used is 0.13 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM and 4.0 mM.
  • Example 4 Sequencing of Pentosidine Oxidase Derived from Sarocladium sp. Based on the above results and whole genome sequence information of Sarocladium sp. , It is estimated to be pentosidine oxidase 2 Kinds of genes (SEQ ID NOs: 1 and 3) and their amino acid sequences (SEQ ID NOs: 2 and 4) were identified.
  • Ptef upstream 748 bp of the tef1 gene, SEQ ID NO: 7 of the promoter of the translation elongation factor gene tef1 is used as a promoter.
  • Talp 800 bp downstream of the alp gene, SEQ ID NO: 8
  • a transformation marker gene pyrG3 (1,487 bp including upstream 56 bp, coding region 896 bp and downstream 535 bp, SEQ ID NO: 9) that complements uracil / uridine requirement and enables introduction of multiple copies of the gene is used. Used (see JP-A-2018-068292). These Ptef, Talp, and pyrG3 were obtained by a PCR reaction using the genomic DNA of Aspergillus sojae NRRC4239 as a template.
  • In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) was used to link each DNA.
  • a DNA fragment is amplified by a PCR reaction using a reverse primer of SEQ ID NO: 10 for Ptef and a forward primer of SEQ ID NO: 11 for Talp.
  • the reverse primer for Ptef amplification of SEQ ID NO: 10 is added with 15 bp of a sequence complementary to the 5 ′ end of the penox1 gene (SEQ ID NO: 5) at the 5 ′ end.
  • the pyrG gene disruption strain of Aspergillus sojae (48 bp upstream of the pyrG gene, coding region 896 bp, The downstream 240 bp-deficient strain) was transformed by protoplast PEG method, 9 Aspergillus soja transformants As-penox1 strains into which the expression cassettes of penox1 and penox2 were inserted in multiple copies, and 6 As-penox2 strains I got it.
  • a control experiment was performed by adding 20 ⁇ L of ion-exchanged water instead of 20 ⁇ L of 60 mM L-arginine solution.
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C. was defined as 1 unit (U), and was calculated according to the following formula.
  • the L-arginine oxidation activity of the crude enzyme solutions of As-penox1 and As-penox2 strains was 0.009 U / mL (As-penox1-15 strain) and 5.1 U / mL (As-penox2-16), respectively. Stock).
  • Example 6 Purification of mycelium-extracted recombinant penox2 After replacing the crude enzyme solution of As-penox2-16 strain with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), anion exchange chromatography column (HiScreen CaptoQ) And GE Healthcare). First, a crude enzyme solution was loaded onto a column equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and the column was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) after adsorbing the enzyme to the column. Unadsorbed protein was eluted.
  • the sodium chloride concentration contained in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) was linearly increased from 0 mM to 40 mM, and the protein adsorbed on the column was eluted.
  • the fraction showing L-arginine oxidation activity was analyzed by SDS-PAGE, and the fraction containing no contaminating protein was recovered as purified PenOX2.
  • the collected purified PenOX2 solution was concentrated using Amicon Ultra-15 Ultracel-30k (manufactured by Millipore) until the L-arginine oxidation activity reached 24 U / mL, and used for the pentosidine quantitative test.
  • Example 7 Pentosidine Quantitative Test The following reagents were prepared and pentosidine was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.). (Sample: Pentosidine solution) 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M, 0.6 ⁇ M, 1.0 ⁇ M, 2.0 ⁇ M or 4.0 ⁇ M pentosidine solution
  • FIG. 3 shows the relationship between the elapsed time after mixing the sample (4.0 ⁇ M pentosidine solution) and the first reagent and the absorbance (A 658 ). An increase in A 658 was confirmed immediately after the addition of the second reagent containing PenOX2.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after the addition of the second reagent)
  • ⁇ (absorbance immediately before the addition of the second reagent ⁇ 0.75)
  • concentration of the composition in the reaction solution becomes 0.75 times (75/100 times).
  • a value obtained by multiplying the absorbance immediately before the addition of the second reagent by 0.75 was regarded as the absorbance immediately after the addition of the second reagent.
  • PenOX2 showed pentosidine oxidation activity, indicating that it can be used for quantification of pentosidine. Although the results are not shown, PenOX1 similarly showed pentosidine oxidation activity.
  • Example 8 Purification of mycelial secretory recombinant penox2
  • the mycelial culture solution of As-penox2 strain was filtered using Miracloth (manufactured by Merck Millipore), and the mycelial culture supernatant was collected.
  • 75 mL of the obtained mycelial culture supernatant was filtered with a syringe filter having a pore size of 0.2 ⁇ m, and then concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 15-30 kD, manufactured by Merck & Co., Inc.).
  • the collected supernatant was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 0.5-30 kD, manufactured by Merck).
  • the crude enzyme solution was loaded onto a column equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2M ammonium sulfate, and the enzyme was adsorbed to the column, and then 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.7 containing 2M ammonium sulfate). 5) The column was washed with 10 mL to elute unadsorbed protein.
  • the solution eluted from the column was “Flow through 1”, the solution eluted at the time of washing with a buffer containing 2 M ammonium sulfate was “Election 1”, ammonium sulfate 1.5 M, 1.3 M, 1.15 M, 1 M.
  • the solutions eluted with the buffer containing “Elution 2”, “Elution 3”, “Elution 4”, “Elution 5”, and the solutions eluted with the buffer not containing ammonium sulfate were designated as “Elution 6” and collected in different containers.
  • the solution eluted from the column when the crude enzyme solution was loaded is “Flow through 2”, the solution eluted at the time of washing with the buffer is “Elution 7”, and the solutions eluted with the buffer containing sodium chloride are “Elution 8-1” and “Elution 8”, respectively.
  • Example 9 Physicochemical properties of PenOX2 produced by Aspergillus soja transformed strain As-penox2 strain
  • the following method for measuring enzyme activity was used. Incubate 600 ⁇ L of any buffer, 3.99 U / mL peroxidase dissolved in deionized water, 1.8 ⁇ M 4-aminoantipyrine, 400 ⁇ L of 2 mM TOOS solution, 150 ⁇ L of deionized water for 10 minutes at any temperature, and store on ice.
  • the physicochemical properties of penox2 were as follows.
  • (A) Optimal pH range Final concentration 50 mM citrate-100 mM potassium phosphate buffer (pH 4.0-7.5), final concentration 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5-8.0), final concentration 100 mM glycine
  • Each buffer was prepared so as to be a buffer (pH 8.0 to 11.0), and an enzyme reaction was performed at 37 ° C. at each pH using each buffer.
  • the results are shown in FIG.
  • PenOX2 showed the highest activity at pH 7.5.
  • pH 6.5-8.0 showed 70% or more of the activity value in the vicinity of potassium phosphate buffer pH 7.5
  • the optimum pH of PenOX2 was pH 6.5-8.0, which is the most preferable value.
  • the Km value for pentosidine was found to be 0.14 mM.
  • G Molecular weight The molecular weight was determined by SDS-PAGE performed according to the Laemmli method. Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels 4-20% (manufactured by Bio-rad) was used as the electrophoresis gel, and Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards were used as the molecular weight marker. The results are shown in FIG. The molecular weight of PenOX2 was about 80,000.
  • PenOX1 and PenOX2 had pentosidine oxidase activity.
  • the amino acid sequence homology between the two was 38.2%.
  • pentosidine oxidase activity was examined at 37 ° C. in a final concentration of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) in the above-described activity measurement method.
  • the amino acid sequence homology with PenOX1 and PenOX2 and pentosidine oxidase activity were as follows.
  • Amino acid oxidase Type VI (manufactured by Merck) derived from Crotalus adamanteus (SEQ ID NO: 12) Molecular weight: 130,000 The amino acid sequence homologies of the enzyme with PenOX1 and PenOX2 were 26.8% and 23.5%, respectively.
  • the enzyme concentration was diluted with deionized water to 1 mg / mL (Bullet method) and used for activity measurement.
  • the enzyme had a pentosidine oxidase activity of 0.555 (U / mL) and a specific activity of 0.555 (U / mg).

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Abstract

本発明は、ペントシジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、及び、当該タンパク質と検体とを接触させる工程；及び　当該接触により生じた変化を検出する工程、を含む、ペントシジンの測定方法、等を提供する。

Description

新規酵素及びそれを用いたペントシジンの測定方法
　本発明は、新規酵素としてのペントシジンオキシダーゼ及びペントシジンオキシダーゼを用いたペントシジンの測定方法等に関する。
　ペントシジン（（２Ｓ）－２－ａｍｉｎｏ－６－［２－［［（４Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－４－ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）は、ペントースと等モルのリジンとアルギニンが架橋した構造を有し、加齢や糖尿病の発症に相関してヒトの皮膚に蓄積すること、特に糖尿病の発症や末期の腎症において増加することが知られている。
　ペントシジンは、酸加水分解後にその蛍光性（Ｅｘ：３３５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ）を指標としてＨＰＬＣで定量ができること、また、ペントシジンに対するモノクローナル抗体を用いた免疫化学的な方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を用いて定量できることが知られている。
　ペントシジンは加齢や糖尿病以外にも統合失調症との関連が知られており、例えば、生体試料を対象として、ペントシジンの量を測定する工程を有する統合失調症の検査方法が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。
特許第５７３８３４６号
　免疫化学的な方法や機器分析的手法によるペントシジンの定量は煩雑で費用がかかる場合がある。本発明は、新規酵素と、新規酵素を用いた、免疫化学的な方法や機器分析的手法と比べ安価で簡易的なペントシジンの定量法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、糸状菌から新規酵素を同定し、その活性を検討した。その結果、新規酵素がペントシジンの定量に有用であることを見出し、本発明が完成するに至った。
　本発明の概要は、以下の通りである。
［１］ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質。
［２］以下の理化学的性質：
（１）作用：ペントシジンを酸化的に分解する活性；及び
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
を有するタンパク質。
［３］前記タンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）から成る群から選ばれるいずれかのタンパク質である、［１］又は［２］に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｂ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｃ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質；
（ｄ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質；あるいは
（ｆ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質。
［４］前記活性が、ペントシジンの脱アミノ化生成物、過酸化水素及びアンモニアを生成する活性、又は酸素を消費する活性である、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質。
［５］糸状菌に由来する、［１］～［４］のいずれか１項に記載のタンパク質。
［６］至適ｐＨがｐＨ約６．５～８．０である、［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［７］至適温度が約３７～５０℃である、［１］～［６］のいずれかに記載のタンパク質。
［８］３０℃で１０分間保存した後に前記活性が９０％以上保持される、［１］～［７］のいずれかに記載のタンパク質。
［９］ｐＨ４．０～９．０の範囲で前記活性が６０％以上保持される、［１］～［８］のいずれかに記載のタンパク質。
［１０］ペントシジンに対するＫｍ値が１ｍＭ以下である、［１］～［９］のいずれかに記載のタンパク質。
［１１］［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質をコードする、遺伝子。
［１２］前記遺伝子が以下の（ａ）～（ｆ）から成る群から選ばれるいずれかの遺伝子である、［１１］に記載の遺伝子：
（ａ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列から成る遺伝子；
（ｂ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子；
（ｄ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
（ｅ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；あるいは
（ｆ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列から成る遺伝子。
［１３］［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質、あるいは、［１１］又は［１２］に記載の遺伝子を含む、キット。
［１４］［１１］又は［１２］に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
［１５］［１４］に記載のベクターを含む、形質転換体。
［１６］［１５］に記載の形質転換体を用いて、［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質を製造する方法。
［１７］［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質と検体とを接触させる工程；及び
　当該接触により生じた変化を検出する工程、を含む、ペントシジンの測定方法。
［１８］酸素、過酸化水素又はアンモニアの量の変化が検出される、［１７］に記載の方法。
［１９］［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質とペントシジンとを接触させる工程を含む、ペントシジンの反応生成物の製造方法。
［２０］反応生成物が過酸化水素又はアンモニアである、［１９］に記載の方法。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明者らが同定した新規酵素ペントシジンオキシダーゼは、図５に示すように、ペントシジンを酸化的に分解し、それにより、過酸化水素やアンモニアを生成すると考えられる。過酸化水素の検出や定量はペルオキシダーゼ反応等を通じて比色法、蛍光法、化学発光法、電極法などにより簡便に行うことができることから、本発明によれば、ペントシジンを酵素法による簡便・迅速な検出及び定量が可能となる。
図１は、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）から、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した酵素粗精製液（Ｅｌｕｔｉｏｎ　１）の基質濃度依存性試験の結果を示す。ペントシジン終濃度（横軸）に対するΔＯＤ（縦軸）がプロットされている。反応開始から２０分後のデータを使用した。 図２は、酵素粗精製液（Ｅｌｕｔｉｏｎ　１）の熱失活試験の結果を示す。当該結果は加熱処理による酵素活性の失活を解析したものであり、反応開始から２０分後のデータに相当する。 図３は、ペントシジンとペントシジンオキシダーゼとを反応して生成した過酸化水素の濃度を測定した結果を示す。過酸化水素の濃度は６５８ｎｍの吸光度で測定した。 図４は、ペントシジンの終濃度とペントシジンの酸化に起因するＡ658上昇量（ΔＡ）との関係を示す。 図５は、ペントシジンオキシダーゼがペントシジンを分解する反応の推定機構を示す。図では、ペントシジンを構成するリジンとアルギニンの各アミノ基が酸化的脱アミノ化され、過酸化水素とアンモニアが生成される様子が記載されている。 図６Ａは、配列番号１及び２の配列を示す。 図６Ｂは、配列番号３及び４の配列を示す。 図６Ｃは、配列番号５及び６の配列を示す。 図６Ｄは、配列番号７～１１の配列を示す。 図６Ｅは、配列番号１２～１４の配列を示す。 図７は、ＰｅｎＯＸ２の至適ｐＨの範囲を示す。 図８は、ＰｅｎＯＸ２の至適温度の範囲を示す。 図９は、ＰｅｎＯＸ２の熱安定性の範囲を示す。 図１０は、ＰｅｎＯＸ２の安定ｐＨの範囲を示す。 図１１は、ＰｅｎＯＸ２のペントシジンに対するＫｍ値を示す。 図１２は、ＰｅｎＯＸ２の分子量を示す。
　以下、本発明の一態様であるタンパク質及びそれをコードする遺伝子、形質転換体及び製造方法等の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
　本発明は、ペントシジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びそれをコードする遺伝子等を提供する。ペントシジンオキシダーゼは新規酵素であり、その酵素活性は完全には解明されていないが、本明細書で使用する場合、「ペントシジンオキシダーゼ活性」とは、ペントシジンを酸化的に分解する活性、より具体的には、ペントシジンを酸化して、その脱アミノ化生成物や、過酸化水素、アンモニアを生成する活性、又は酸素を消費する活性を意味する。このような酵素活性を有する限り、特定の配列に限定されず、あらゆるタンパク質及びそれをコードする遺伝子が本発明の範囲に含まれるものとして意図される。しかしながら、ペントシジンオキシダーゼの塩基配列とアミノ酸配列について、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）糸状菌に由来する酵素を例に以下に説明する。
（ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列）
　本発明の遺伝子は、ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。ペントシジンオキシダーゼは、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。例えば、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素の一態様として配列番号２、配列番号４に示すアミノ酸配列がある。以降、配列番号２及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をそれぞれペントシジンオキシダーゼ１（又はＰｅｎＯＸ１）及びペントシジンオキシダーゼ２（又はＰｅｎＯＸ２）という場合がある。ペントシジンオキシダーゼ１をコードする遺伝子（ｇ４４６２）は６つのエキソン及び５つのイントロンで構成されると予想され、一方、ペントシジンオキシダーゼ２をコードする遺伝子（ｇ１０１２２）は２つのエキソン及び１つのイントロンで構成されることが予想される。両酵素ともペントシジン及びアルギニンに対して高い基質特異性を有する点で共通しているが、その他のＬ－アミノ酸に対する反応性は異なる。
　配列番号２、４に示すアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼは、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）糸状菌に由来する。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３に示す塩基配列である。図６に当該酵素のアミノ酸配列及び塩基配列を示す。
　ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列は、それぞれ上記したペントシジンオキシダーゼの酵素活性を有するものであれば、配列番号２や４のような野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から複数個、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、上記一単位あたり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、ペントシジンオキシダーゼを維持する限度でアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　また、ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号２や４のような野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、ペントシジンオキシダーゼ酵素が有するアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
（ペントシジンオキシダーゼをコードする遺伝子）
　ペントシジンオキシダーゼをコードする遺伝子（以下、「ペントシジンオキシダーゼ遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものでれば特に限定されない。一部の態様において、ペントシジンオキシダーゼ遺伝子が形質転換体内で発現することによりペントシジンオキシダーゼが生産される。
　本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の触媒活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされる酵素が生産されることを包含する。
　ペントシジンオキシダーゼ遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由してペントシジンオキシダーゼを生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずにペントシジンオキシダーゼを生成し得る遺伝子であっても、どちらでもよい。
　ペントシジンオキシダーゼ遺伝子は、サロクラディウム属糸状菌のような由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
　本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、配列番号１又は３のような野生型遺伝子の塩基配列の一部に相当するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
　本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。
　例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
　一部の態様において、ストリンジェントな条件の具体例としては以下のものを含む。例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。
　なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数５００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から複数個、例えば、１から１２５個、１から１００個、１から７５個、１から５０個、１から３０個、１から２０個、好ましくは１から数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。
　ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ酵素活性を有するものである。
　また、酵素をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、ｇ４４６２のコドンを改変した配列番号５（ｐｅｎｏｘ１）に記載の塩基配列、ｇ１０１２２のコドンを改変した配列番号６（ｐｅｎｏｘ２）などが挙げられる（図６Ｃ）。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。
（配列同一性を算出するための手段）
　塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
　２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
　上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（酵素をコードする遺伝子の由来）
　酵素をコードする遺伝子は、ペントシジンオキシダーゼ生産能がある生物種に由来する。酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、糸状菌などの微生物などが挙げられる。ペントシジンオキシダーゼ生産能を有する微生物の具体例としては、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）などが挙げられる。
　上記のとおり、酵素をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、酵素をコードする遺伝子の由来生物は、酵素をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
　ペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素の理化学的特性質のうち、特徴的なものを以下に例示する。
・ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
・至適ｐＨ：ｐＨ約６．５～８．０
　なお、至適ｐＨは酵素が最も好適に作用するｐＨであって、ペントシジンオキシダーゼは上記範囲以外のｐＨでも作用し得る。
・至適温度：約３７～５０℃
　なお、至適温度は至適温度は酵素が最も好適に作用する温度であって、ペントシジンオキシダーゼは上記温度範囲以外の温度でも作用し得る。
・温度安定性：３０℃で１０分間保存した場合、ペントシジンオキシダーゼ活性が９０％以上保持される。４０℃で１０分間保存した場合、ペントシジンオキシダーゼ活性が５０％以上保持される。
・ｐＨ安定性：ｐＨ４．０～９．０の範囲でペントシジンオキシダーゼ活性が６０％以上保持される。
・Ｋｍ値：ペントシジンに対するＫｍ値が１ｍＭ以下である。
　Ｋｍ値とはミカエリス定数であって、その具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。例えば、後述する実施例９に記載の方法のように、ラインウェーバー・バークプロットによる方法で描かれるミカエリス?メンテンの式に従ってＫｍ値を算出することができる。
（遺伝子工学的手法による酵素をコードする遺伝子のクローニング）
　酵素をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素をコードする遺伝子の取得方法や、酵素をコードする遺伝子の塩基配列、酵素のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書で使用する場合、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体が包含される。酵素をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
　酵素をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献（上掲）に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　一部の態様において、酵素をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、上記したサロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）などを挙げることができる。例えば、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
　次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する。）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
　また、酵素をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素をコードする遺伝子を構築することが可能である。
　ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。一部の態様において、該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製してもよい。
　組換え体ＤＮＡに挿入された各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３）などにより行うことができる。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ　４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ　ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素のアミノ酸配列を知り得る。
（酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
　酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
（形質転換体の作製方法）
　形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。一部の態様において、酵素をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－酵素をコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
　酵素をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は、特に限定されないが、例えば、相同組換えや非相同組み換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
　相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。非相同組み換えを利用する方法では、該相同配列をＤＮＡコンストラクトと連結していない場合でも、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
　ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
　そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主生物中で酵素を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３　（１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
　ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
　ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
　ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えば、ｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５’相同組み換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３’相同組み換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。
　ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　相同組み換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　相同組み換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５’相同組み換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３’相同組み換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９（上掲）、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
　また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１号公報に記載の実施例を参照して、酵素をコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－酵素をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素をコードする遺伝子の上流領域及び酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。
　酵素をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
　形質転換体が作製されたことの確認は、酵素の酵素活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物が検出されることにより行うことができる。
　また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
　相同組み換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組み換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
（宿主生物）
　宿主生物としては、酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素を生産することができる生物であれば特に限定されない。例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微
生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。
　糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。
　本発明に係るタンパク質の発現は、上記のような宿主生物を用いた実施に限定されない。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける無細胞タンパク質発現系は、特に商業規模での生成のように大量生産を目的としない場合などに好適に用いることができる。無細胞タンパク質発現系は、細胞培養を必要とせず、また、タンパク質の精製も簡便に行うことができるという利点もある。無細胞タンパク質発現系においては、主に、所望とするタンパク質に対応する遺伝子と、セルライセートのような転写と翻訳の分子機構を含む反応液とが使用される。
（酵素をコードする遺伝子の具体例）
　サロクラディウム属由来の酵素をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１及び３に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２が挙げられる。なお、ペントシジンオキシダーゼ１タンパク質（ＰｅｎＯＸ１）及びペントシジンオキシダーゼ２タンパク質（ＰｅｎＯＸ２）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４として示す。
　サロクラディウム属及びサロクラディウム属以外の生物から酵素をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２の塩基配列（配列番号１及び３）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２の塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ペントシジンオキシダーゼ１及びペントシジンオキシダーゼ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２及び４）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。
　サロクラディウム属から得られた酵素をコードする遺伝子、又は酵素と配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。
（形質転換体）
　形質転換体の一態様は、微生物や植物などを宿主生物として、遺伝子のいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体である。
　形質転換体の別の一態様は、微生物や植物などを宿主生物として、遺伝子ｇ４４６２またはｇ１０１２２のすべて又は一部を含む、遺伝子（ＯＲＦ以外のプロモーター配列等も含む。）、及び、該遺伝子の転写を制御する転写因子を高発現又は低発現するように設計されたＤＮＡコンストラクトが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体である。
　宿主生物が、サロクラディウム属などのペントシジンオキシダーゼの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現量の変化した転写因子の作用によって、宿主生物又は形質転換体に適した条件で培養又は生育することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしてもペントシジンオキシダーゼを検出可能以上に生産することができる。
（製造方法）
　本発明の別の一態様の製造方法は、形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、ペントシジンオキシダーゼを製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
　本発明の別の一態様の製造方法は、形質転換体より抽出するペントシジンオキシダーゼの製造方法である。以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本発明の各態様の製造方法は下記記載に限定されない。
　培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＹＭＧ培地やＰＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。
　形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＹＭＧ培地やＰＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。
　培養終了後に培養物からペントシジンオキシダーゼを抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
　また、上記処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
　得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。
　本発明の各態様の製造方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の任意の工程や操作を加入することができる。
（測定方法）
　本発明に係るペントシジンの測定方法は：
　ペントシジンオキシダーゼを検体と接触させる工程；及び
　当該接触により生じた変化を検出する工程、を含む。
　本明細書で使用する場合、「検体」とは、被験者、例えば、ペントシジンに関連する疾患に罹患しているか、罹患していると疑われる対象に由来する血液、体液又は排泄物等の試料を意味する。検体はペントシジンを必ずしも含んでいなくてもよく、ペントシジンを含まない場合であっても、本発明に係る測定方法はペントシジン含有の有無の分析（定性分析）に使用することができる。本明細書で使用する場合、「接触により生じた変化」とは、検体中に含まれるペントシジンなどの出発物質や、ペントシジンオキシダーゼとの反応生成物又は反応消費物などの有無、又はそれらの量の経時的な変化を意味する。
　より具体的な態様において、ペントシジンの測定方法は：
　（Ａ）水と酸素の存在下、検体にペントシジンオキシダーゼを作用させる工程；及び
　（Ｂ）上記ペントシジンオキシダーゼの作用による反応生成物又は反応消費物の少なくとも一種の量を計測する工程
　を含み得る。
　上記工程（Ｂ）において測定する反応生成物としては、過酸化水素、アンモニア及びペントシジンの脱アミノ化生成物を挙げることができる。また、反応生成物である過酸化水素の量は、例えば、ペルオキシダーゼ反応により計測することができる。また、反応生成物であるアンモニアの量は、例えば、インドフェノール法やネスラー試薬を用いる方法、もしくは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやＮＡＤシンターゼ等のアンモニアを基質とする酵素を用いてＮＡＤＨ量を測定する方法等により計測することができる。本明細書で使用する場合、「脱アミノ化生成物」とは、例えば、ペントシジンを構成するリジンとアルギニンのアミノ基の一方又は両方が外れて酸素に置き換わり、少なくとも一方の末端がケト酸となっている生成物を意味する。このような脱アミノ化生成物の例を図５に示す。上記工程（Ｂ）において測定する反応消費物としては、酸素を挙げることができる。酵素反応により減少する酸素量は、例えば、酸素電極により測定することもできるし、または、Ｗｉｎｋｌｅｒ手法に基づいて、酸素によりマンガンイオンの酸化させることで、比色定量することもできる。
　別の態様において、本発明は、ペントシジンオキシダーゼを含むキットを提供する。本発明に係るキットは、ペントシジンとペントシジンオキシダーゼの反応生成物又は反応消費物を検出するために使用され得る。本発明に係るキットはさらに、反応用緩衝液、並びに反応生成物検出用試薬、例えば過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬及びペントシジンの脱アミノ化生成物検出用試薬、または反応消費物検出用試薬、例えば酸素検出用試薬の少なくとも一つを含むものであってもよい。本発明のキットは体外診断薬としても使用可能であり、例えば、ペントシジン又は、ペントシジンとペントシジンオキシダーゼとの反応生成物に関連している疾患、例えば糖尿病や腎症の診断に好適に使用され得る。
　過酸化水素検出用試薬としては、過酸化水素を高感度で検出できる１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン（ＤＡ-６７）やＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’ －ビス（ジメチルアミノ）-ジフェニルアミン（ＤＡ－６４）に加え、公知のトリンダー試薬などの呈色試薬が挙げられる。アンモニア検出用試薬としては、フェノール・ニトロプルシッドナトリウムと、次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤との組み合わせ（インドフェノール法）、ネスラー試薬等が挙げられる。酸素検出用試薬としては、例えば、マンガンイオン、水酸化ナトリウムおよび硫酸の組み合わせが挙げられる
　呈色反応を利用した反応生成物の検出は免疫化学的な方法や機器分析的手法と比較して極めて簡便で安価に行うことができる。しかしながら、反応生成物又は反応消費物の検出は、検出試薬以外の他公知の定量・定性方法を排除するものではなく、適宜採用してもよい。例えば、過酸化水素やアンモニアの検出試薬に代えて、専用の検出電極を備えた酵素センサなどの装置を使用して検出を行うこともできる。
　上記反応生成物又は反応消費物の検出方法は、ペントシジン又は各反応生成物又は反応消費物と直接的又は間接的に関連している疾患の検出方法、延いては診断方法にも使用可能である。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
（実施例１）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の培養及び酵素液調製方法
・使用培地
　ＭＥＡ培地：Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ社製）を５０ｇ／Ｌとなるよう蒸留水に溶解した。
　ＹＭＧ培地：Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　０．４％、Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１％、グルコース　０．４％、ｐＨ５．５
・菌株の培養
　－８０℃で保存されたサロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）　Ｆ１００１２株をＭＥＡ培地に塗布し、２４℃で７～１０日間、十分量の菌糸が得られるまで静置培養した。得られた菌糸を１Ｌフラスコ中のＹＭＧ培地２５０ｍＬに摂取し、３０℃で３日間振とう培養した。
・粗酵素液の調製
　菌体を培養したＹＭＧ培地を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過することで菌体を取り除き、培養上清を取得した。培養上清を限外ろ過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３ｋ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で希釈する工程を複数回繰り返すことで低分子を除去するとともに、ＹＭＧ培地をリン酸カリウムバッファーに置換した。
・目的酵素の粗精製
　バッファー置換した粗酵素液を、イオン交換クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、５ｍＬのリン酸カリウムバッファーでカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、リン酸カリウムバッファーに０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍの塩化ナトリウムを溶解したバッファーを５ｍＬずつ順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ」、バッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｓｔａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ」、塩化ナトリウムを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ４」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
（実施例２）ペントシジンオキシダーゼ活性の測定方法
・酵素粗精製液の活性測定
　イオン交換クロマトグラフィー用のカラムより溶出した液をサンプルとし、活性を測定した。サンプル５０μＬを、１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解した４ｍＭ　ペントシジン（ペプチド研究所社製）２５μＬ及びオキシダーゼ発色試薬（４Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、１．８ｍＭ　４－アミノアンチピリン（Ｆｌｕｋａ社製）、２ｍＭ　ＴＯＯＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製））２５μＬと混合し、室温で反応させた。
　反応には、９６穴のマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。ブランクは、基質溶液のかわりに１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を加えたものとした。反応液及びブランク溶液の５５５ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の差（ΔＯＤ）をもとに酵素活性の強さを評価した。
・基質濃度依存性試験
　酵素粗精製液のペントシジンオキシダーゼ活性を、様々な濃度の基質を用いて測定することで、基質の濃度に対する活性の推移を評価した。用いた基質溶液の濃度は、０．１３ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ及び４．０ｍＭである。
・熱失活試験
　酵素粗精製液を８０℃で１時間熱処理をすることにより、タンパク質を変性させた。この加熱処理サンプルのペントシジンオキシダーゼ活性を上述の活性測定方法にのっとって測定し、未加熱のサンプルの活性と比較した。
（実施例３）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）酵素液のペントシジンオキシダーゼ活性解析
　サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の培養上清をイオン交換クロマトグラフィー用カラムで分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、０．２５Ｍ　塩化ナトリウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ１に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼが含まれていることが示唆された。このＥｌｕｔｉｏｎ１に対し、基質濃度依存性試験（図１）及び熱失活試験（図２）を行ったところ、酵素活性は基質濃度依存的に上昇し、さらに加熱処理により完全に失活することが明らかとなった。このことから、Ｅｌｕｔｉｏｎ１にみられるペントシジンオキシダーゼ活性は、酵素由来のものであることが示された。
（実施例４）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）由来のペントシジンオキシダーゼの配列決定
　上記結果と、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の全ゲノム配列情報に基づき、ペントシジンオキシダーゼであると推測される、２種類の遺伝子（配列番号１及び３）とそのアミノ酸配列（配列番号２及び４）が特定された。
（実施例５）麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）における、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）由来ペントシジンオキシダーゼの異種組換発現
　上記で特定された２種のペントシジンオキシダーゼについて、酵素活性を解析するために麹菌アスペルギルス・ソーヤを宿主として異種組換発現を行った。
・発現ベクターの作製
　配列番号２と配列番号４のアミノ酸配列を基に麹菌発現用にコドン改変した配列番号５と６の塩基配列を人工遺伝子合成によりそれぞれ取得した。
　配列番号５及び配列番号６のペントシジンオキシダーゼ遺伝子（ｐｅｎｏｘ１、ｐｅｎｏｘ２）を発現させるための発現カセットとしては、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号７）をプロモーターとして、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号８）をターミネーターとして用いた。
　また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補し、遺伝子の多コピー導入を可能とする形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ３（上流５６ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１，４８７ｂｐ、配列番号９）を用いた（特開２０１８－０６８２９２号公報参照）。これらのＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ、ｐｙｒＧ３は、麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ　ＮＲＲＣ４２３９株）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により取得した。
　次に、それぞれのＤＮＡを連結するためにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆとｐｅｎｏｘ１遺伝子及びＴａｌｐとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号１０のリバースプライマーを用いて、Ｔａｌｐは配列番号１１のフォワードプライマーを用いてＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を増幅させている。このとき、配列番号１０のＰｔｅｆ増幅用のリバースプライマーには、５’末端にｐｅｎｏｘ１遺伝子（配列番号５）の５’末端と相補的な配列が１５ｂｐ付加されており、配列番号１１のＴａｌｐ増幅用のフォワードプライマーには、５’末端にｐｅｎｏｘ１遺伝子（配列番号５）の３’末端と相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆ、ｐｅｎｏｘ１遺伝子及びＴａｌｐとの連結が可能となる。このようにして、Ｐｔｅｆ、ｐｅｎｏｘ１遺伝子又はｐｅｎｏｘ２遺伝子、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧ３が順に連結されたＰｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ１－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３、Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている発現ベクターｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ１及びｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を作製した。
・麹菌発現株の作製及び培養
　上記で取得した形質転換用プラスミドｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ１及びｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を用いて、アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、ｐｅｎｏｘ１及びｐｅｎｏｘ２の発現カセットが多コピーで挿入されたアスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株を９株、Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株を６株取得した。
　取得したアスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株及びＡｓ－ｐｅｎｏｘ２株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬのＰＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）パインデックス、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で４～５日間振とう培養を行った。
・菌糸抽出液の調製
　各Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株及びＡｓ－ｐｅｎｏｘ２株の培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過し、培養上清を取り除いて菌体を取得した。１５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に再懸濁した後、Ｍｉｃｒｏ　Ｓｍａｓｈ　ＭＳ－１００Ｒ（トミー精工社製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を粗酵素液として回収した。
・菌糸抽出液のＬ－アルギニン酸化活性の測定
　各粗酵素液２００μＬを、１５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ　７．０）に溶解した７．１Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、　０．７０ｍＭ　４－アミノアンチピリン、０．７９ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液３８０μＬと混合して３７℃で５分間インキュベートした後、６０ｍＭ　Ｌ－アルギニン溶液２０μＬを添加して撹拌し、３７℃で５分間反応させた。反応中のＡ555の経時変化を分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス社製）で測定した。対照実験は、２０μＬの６０　ｍＭ　Ｌ－アルギニン溶液の代わりに２０μＬのイオン交換水を添加して実施した。３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義し、下記の式に従って算出した。
　　活性　（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×０．６×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．２）
　　　ΔＡｓ：反応液の１分間あたりのＡ555変化量
　　　ΔＡ０：対照実験の１分間あたりのＡ555変化量
　　　３９．２：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数　（ｍＭ-1・ｃｍ-1）
　　　０．５：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
　　　０．６：反応液全体の容量（ｍＬ）
　　　ｄｆ：希釈係数
　　　０．２：酵素液の容量（ｍＬ）
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株、Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株の粗酵素液のＬ－アルギニン酸化活性は、最大で、それぞれ０．００９Ｕ／ｍＬ（Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１－１５株）、５．１Ｕ／ｍＬ（Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２－１６株）であった。
（実施例６）菌糸抽出型組換えｐｅｎｏｘ２の精製
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２－１６株の粗酵素液を、１０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）にバッファー置換した後、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎ　ＣａｐｔｏＱ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。まず、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。その後、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ　７．５）に含まれる塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから４０ｍＭまで直線的に上昇させ、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。Ｌ－アルギニン酸化活性を示す画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、夾雑タンパク質を含まない画分を精製ＰｅｎＯＸ２として回収した。回収した精製ＰｅｎＯＸ２溶液は、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０ｋ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、Ｌ－アルギニン酸化活性が２４Ｕ／ｍＬになるまで濃縮し、ペントシジン定量試験に用いた。
（実施例７）ペントシジン定量試験
　以下の試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子社製）を利用してペントシジンを測定した。
（試料：ペントシジン溶液）
　０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ又は４．０μＭペントシジン溶液
（第１試薬：Ｌｅｕｃｏ色素、ペルオキシダーゼ溶液）
　１２０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
　０．２ｍＭ　ＤＡ－６７（１０－（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）－３，７－ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ，　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）（和光純薬工業社製）
　３．０Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ
（第２試薬：ＰｅｎＯＸ２溶液）
　１２０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
　２４Ｕ／ｍＬ　ＰｅｎＯＸ２
　試料２５μＬを５０μＬの第１試薬に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２５μＬの第２試薬を添加して、ＰｅｎＯＸ２によるペントシジン酸化反応と、前記反応によって生成される過酸化水素の検出反応を３７℃で５分間進行させた。
　過酸化水素の検出反応では、ペルオキシダーゼが消費されると同時にＤＡ－６７が酸化されてメチレンブルーとなって呈色し、吸光度（Ａ658）が上昇する。一例として、試料（４．０μＭ　ペントシジン溶液）と第１試薬を混合してからの経過時間と吸光度（Ａ658）の関係を図３に示した。ＰｅｎＯＸ２を含む第２試薬の添加直後からＡ658の上昇が確認できた。
　続いて、ペントシジンの酸化に起因するＡ658上昇量（ΔＡ）を下記の式に従って算出した。
　ΔＡ＝（第２試薬添加５分後の吸光度）－（第２試薬添加直前の吸光度×０．７５）
　（第２試薬の添加により反応液中の組成物の濃度は０．７５倍（７５／１００倍）となるため、
　　第２試薬添加直前の吸光度を０．７５倍した値を第２試薬添加直後の吸光度とみなした。）
　ペントシジン終濃度とΔＡとの間には相関関係が成立した（図４）。したがって、ＰｅｎＯＸ２はペントシジン酸化活性を示し、ペントシジンの定量に利用できることが示された。結果は示さないが、ＰｅｎＯＸ１も同様にペントシジン酸化活性を示した。
（実施例８）菌糸分泌型組換えｐｅｎｏｘ２の精製
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株の菌糸培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過し、菌糸培養上清を回収した。得られた菌糸培養上清７５ｍＬを、ポアサイズ０．２μｍのシリンジフィルターでフィルターろ過したのち限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋＤ、メルク社製）で濃縮した。濃縮液に、硫酸アンモニウムを７０％飽和となるように徐々に添加し、２時間、４℃で放置後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分）し、余分なタンパク質を沈殿させ、上清を回収した。回収した上清を、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　０．５－３０ｋＤ、メルク社製）で濃縮した。
　これに、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）および硫酸アンモニウムをそれぞれの終濃度が５０ｍＭおよび２Ｍになるように添加した後、疎水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｂｕｔｙｌ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、２Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、２Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）　１０ｍＬでカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、１．５Ｍ、１．３Ｍ、１．１５Ｍ　硫酸アンモニウムをそれぞれ含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５ｍＬずつ、さらに１Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を１０ｍＬ、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５ｍＬ、順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ１」、硫酸アンモニウム２Ｍを含むバッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」、硫酸アンモニウム１．５Ｍ、１．３Ｍ、１．１５Ｍ、１Ｍを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ５」、硫酸アンモニウムを含まないバッファーで溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ６」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
　分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、１Ｍ　硫酸アンモニウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ５に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼ（ＰｅｎＯＸ２）が含まれていることが示唆された。このＥｌｕｔｉｏｎ５を、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋＤ、メルク社製）で濃縮し、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）にバッファー置換したのち再度限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋＤ、メルク社製）で濃縮した。これを、イオン交換クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、５ｍＬの５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に０．１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を１ｍＬ　５回、同バッファーに０．１７５Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を１ｍＬ　５回、同バッファーに１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を５ｍＬ　１回、順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ２」、バッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ７」、塩化ナトリウムを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－５」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－５」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ１０」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
　分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、０．１７５Ｍ　塩化ナトリウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ９－１およびＥｌｕｔｉｏｎ９－２に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼが含まれていることが示唆された。活性画分Ｅｌｕｔｉｏｎ９－１およびＥｌｕｔｉｏｎ９－２を等量ずつ混合したものをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、ほぼ単一のバンドが得られた（分子量約８０，０００）。得られたこの活性画分を、以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
（実施例９）アスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株により生産されたＰｅｎＯＸ２の理化学的性質
　ＰｅｎＯＸ２の理化学的性質を決定するために、以下の酵素活性の測定方法を用いた。
　任意のバッファー６００μＬ、脱イオン水に溶解した３．９９Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、１．８ｍＭ　４－アミノアンチピリン、２ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液４００μＬ、脱イオン水１５０μＬを任意の温度で１０分間インキュベートした後、氷上で保存していた酵素液５０μＬ、任意の温度で１０分間インキュベートした１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解させた４ｍＭ　ペントシジン溶液４００μＬを添加して撹拌し、任意の温度で３分間反応させた。反応中のＡ555の経時変化を分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス社製）で測定した。２０秒から６０秒までの測定開始後経過時間－Ａ555変化量を活性値とみなした。
　さらに、３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義し、下記の式に従って算出した。
　　活性　（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×１．６×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．０５）
　　　ΔＡｓ：反応液の１分間あたりのＡ555変化量
　　　ΔＡ０：対照実験の１分間あたりのＡ555変化量
　　　１．６：反応液全体の容量（ｍＬ）
　　　ｄｆ：希釈係数
　　　３９．２：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数　（ｍＭ-1・ｃｍ-1）
　　　０．５：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
　　　０．０５：酵素液の容量（ｍＬ）
　ｐｅｎｏｘ２の理化学的性質は、以下の通りであった。
（ａ）至適ｐＨの範囲
　終濃度５０ｍＭ　クエン酸－１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ４．０－７．５）、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５－８．０）、終濃度１００ｍＭ　グリシンバッファー（ｐＨ８．０－１１．０）となるように夫々のバッファーを調製し、これらを用いて、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行なった。結果を図７に示す。ＰｅｎＯＸ２は、ｐＨ７．５において最も高い活性を示した。また、ｐＨ６．５－８．０でもリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５付近における活性値の７０％以上を示したことから、ＰｅｎＯＸ２の至適ｐＨはｐＨ６．５－８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．５であると判断した。
（ｂ）至適温度の範囲
　終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて、種々の温度にてＰｅｎＯＸ２の活性測定を行なった。結果を図８に示す。最も高い活性を示した温度である、５０℃付近での活性に対して、８０％以上の活性を示す温度範囲は３７℃～５０℃であった。以上から、ＰｅｎＯＸ２の至適温度の範囲は３７℃～５０℃であると判断した。
（ｃ）熱安定性
　酵素液を各温度で１０分間処理した時の残存活性を、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（活性測定時最終ｐＨ７．５）を用い温度３７℃にて前記活性測定を行なうことで評価した。熱安定性の結果は、図９に示す通りであり、ＰｅｎＯＸ２は、３０℃付近まで安定であった。
（ｄ）安定ｐＨの範囲
　緩衝液として、１００ｍＭ　クエン酸－２００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ３．０－６．５）、２００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５－８．０）、２００ｍＭ　グリシンバッファー（ｐＨ８．０－１０．０）を用いて、夫々のｐＨにおいて２５℃で２０時間処理した後、ＰｅｎＯＸ２の残存活性を測定した。結果を図１０に示す。４℃で保存しておいたＰｅｎＯＸ２の活性に対して９０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ４．５－７．５、６０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ４．０－９．０であった。
（ｅ）ペントシジンに対する活性値
　前記活性測定方法において、終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（活性測定時最終ｐＨ７．５）、３７℃で活性測定を行ない、上記の計算式を用いて活性値（Ｕ／ｍＬ）を求めた。活性値は７．８Ｕ／ｍＬ、比活性は２９．１Ｕ／ｍｇ（ブラッドフォード法）であることが判った。
（ｆ）ペントシジンに対するＫｍ値
　前記活性測定方法において、終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、３７℃で、基質ペントシジンの濃度を変化させて活性測定を行ない、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。結果を図１１に示す。ペントシジンに対するＫｍ値は０．１４ｍＭであることが判った。
（ｇ）分子量
　Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って行なったＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。電気泳動ゲルとしてはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ　Ｐｒｅｃａｓｔ　Ｇｅｌｓ　４－２０％（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用い、分子量マーカーとしてはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｌｌ　Ｂｌｕｅ　Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓを用いた。結果を図１２に示す。ＰｅｎＯＸ２の分子量は、約８０，０００であった。
（実施例１０）ＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２と配列相同性を持つ酵素のペントシジンオキシダーゼ活性測定
　前述の通りＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２はいずれもペントシジンオキシダーゼ活性を有していた。ＢＬＡＳＴプログラムを用いてアミノ酸配列の一致率を調べると、両者のアミノ酸配列相同性は３８．２％であった。続いて以下の３酵素を購入し、前記活性測定方法において、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、３７℃で、ペントシジンオキシダーゼ活性を調べた。夫々のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性、並びにペントシジンオキシダーゼ活性は以下の通りであった。
（ａ）Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ由来アミノ酸オキシダーゼＴｙｐｅ　ＶＩ（メルク社製）（配列番号１２）
分子量：１３０，０００
　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２６．８％および２３．５％であった。酵素濃度が１ｍｇ／ｍＬ（ビュレット法）になるよう脱イオン水で希釈して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．５５５（Ｕ／ｍＬ）、比活性は０．５５５（Ｕ／ｍｇ）であった。
（ｂ）Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒｏｘ由来アミノ酸オキシダーゼＴｙｐｅ　Ｉ（メルク社製）（配列番号１３）
分子量：５９，０００（アミノ酸配列に基づく計算値）
　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２６．３％および２３．４％であった。酵素粉末１ｍｇを１ｍＬの脱イオン水で溶解して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．０２２（Ｕ／ｍＬ）、比活性は参考値として０．０２２（Ｕ／ｍｇ）であった。
（ｃ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ由来リジンオキシダーゼ（メルク社製）（配列番号１４）
分子量：１１６，０００

　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２４．０％および２３．３％であった。酵素粉末１ｍｇを１ｍＬの脱イオン水で溶解して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．０６３（Ｕ／ｍＬ）、比活性は参考値として０．０６３（Ｕ／ｍｇ）であった。本実施例で使用した酵素間の配列相同性を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (20)

  1. 　ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質。
  2. 　以下の理化学的性質：
    （１）作用：ペントシジンを酸化的に分解する活性；及び
    （２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
    を有するタンパク質。
  3. 　前記タンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）から成る群から選ばれるいずれかのタンパク質である、請求項１又は２に記載のタンパク質：
    （ａ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質；
    （ｂ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｃ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質；
    （ｄ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基酸配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｅ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質；あるいは
    （ｆ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質。
  4. 　前記活性が、ペントシジンの脱アミノ化生成物、過酸化水素及びアンモニアを生成する活性、又は酸素を消費する活性である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 　糸状菌に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 　至適ｐＨが約６．５～８．０である、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. 　至適温度が３７～５０℃である、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 　３０℃で１０分間保存した後に前記活性が９０％以上保持される、請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  9. 　ｐＨ４．０～９．０の範囲で前記活性が６０％以上保持される、請求項１～８のいずれか１項に記載のタンパク質。
  10. 　ペントシジンに対するＫｍ値が１ｍＭ以下である、請求項１～９のいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、遺伝子。
  12. 　前記遺伝子が以下の（ａ）～（ｆ）から成る群から選ばれるいずれかの遺伝子である、請求項１１に記載の遺伝子：
    （ａ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列から成る遺伝子；
    （ｂ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
    （ｃ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列から成る遺伝子；
    （ｄ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
    （ｅ）配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；あるいは
    （ｆ）配列番号１、３、５又は６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列から成る遺伝子。
  13. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質、あるいは、請求項１１又は１２に記載の遺伝子を含む、キット。
  14. 　請求項１１又は１２に記載の遺伝子を含む、組換えベクター。
  15. 　請求項１４に記載のベクターを含む、形質転換体。
  16. 　請求項１５に記載の形質転換体を用いて、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法。
  17. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質と検体とを接触させる工程；及び
    　当該接触により生じた変化を検出する工程、を含む、ペントシジンの測定方法。
  18. 　酸素、過酸化水素又はアンモニアの量の変化が検出される、請求項１７に記載の方法。
  19. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質とペントシジンとを接触させる工程を含む、ペントシジンの反応生成物の製造方法。
  20. 　反応生成物が過酸化水素又はアンモニアである、請求項１９に記載の方法。
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