JP3490184B2 - 新規Ｎ−アルキルグリシンオキシダーゼ、その製造方法、この酵素を用いたＮε−カルボキシメチルリジンの定量用試薬及びその定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酸素存在下でＮ−アル
キルグリシン類を酸化してアルキルアミン、グリオキシ
ル酸及び過酸化水素を生成する新規なＮ−アルキルグリ
シンオキシダーゼ、その製造方法、この酵素を用いた、
例えば糖尿病患者の血中や尿中などに含有されるＮε−
カルボキシメチルリジン（記号Ｎε−は、カルボキシメ
チルリジンを構成するリジン残基のε位の炭素に、カル
ボキシメチル化されたアミノ基のＮが結合されているこ
とを示す）の定量用試薬、及びその定量方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病患者の体内では、非酵素的に糖化
タンパク質が生産されており、この糖化タンパク質は、
いくつかの過程を経て、アドヴァンスド グリケーショ
ン エンド プロダクツ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃ
ａｔｉｏｎ Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（以下ＡＧＥ
ｓということがある）と呼ばれる物質に代謝される。そ
してこのＡＧＥｓの蓄積が糖尿病の合併症を引き起こす
原因であると考えられている。Ｎε−カルボキシメチル
リジン（以下ＣＭＬということがある）は、前記糖化タ
ンパク質が、ＡＧＥｓに代謝されずに酸化的開裂をうけ
て血中や尿中に排出されてくるものである。同じ血糖値
の糖尿病患者であれば糖化タンパク質は同程度生産され
ていると思われるが、ＣＭＬの血中や尿中への排出量が
多い患者の場合、合併症原因物質であるＡＧＥｓの量は
相対的に少なくなっており、合併症には進みにくいと考
えられる。したがって、そのＣＭＬを定量することで糖
尿病患者が合併症を引き起こす可能性、すなわち予後を
判断することが可能になると思われ、ＣＭＬの定量値
は、糖尿病の診断及び治療の面から、非常に重要な診断
基準となり得る。

【０００３】従来、ＣＭＬの定量方法として、例えば高
速液体クロマトグラフィーを利用したＷｅｎｉｎｇｅｒ
らの方法（Ｎｅｐｈｒｏｎ，１９９２，６２，８０−８
３）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）を使用す
るＫｎｅｃｈｔらの方法（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，１９９
１，４０，１９０−１９６）などがある。

【０００４】しかしながら、これらの方法はいずれも操
作が煩雑であったり、高価な機器を必要とするなどの欠
点を有し、また多数の検体を短時間で処理するには不向
きである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のＣＭＬの定量方法が有する欠点を克服し、該ＣＭ
Ｌを酵素法により、操作が簡単で、安価に、短時間でし
かも精度よく定量する新規な方法を提供すること、すな
わち、この酵素法に有効に用いられる新規な酵素、この
酵素を有効成分とするＮε−カルボキシメチルリジンの
定量用試薬及びこの試薬を用いるＮε−カルボキシメチ
ルリジンの新規な定量方法を提供することを目的として
なされたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、土壌より分離
した微生物が、酸素存在下でＮ−アルキルグリシン類を
酸化し、アルキルアミン、グリオキシル酸及び過酸化水
素を生成する新規な酵素を生産すること、そしてこの酵
素を用いれば、Ｎε−カルボキシメチルリジンを酵素法
により精度よく定量しうることを見出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、理化学的性質が、 （１）作用：酸素存在下でＮ−アルキルグリシン類を酸
化してアルキルアミン、グリオキシル酸及び過酸化水素
を生成する、一般式

【化３】 （式中のＲは、アルキル基又はその誘導体を意味する）
に示される反応を触媒する。 （２）基質特異性：ザルコシン、Ｎ−エチルグリシン、
Ｎ−カルボキシメチル−６−アミノカプロン酸、Ｎε−
カルボキシメチルリジンに特異的に作用する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨはｐＨ８．
０〜１０．０であり、安定ｐＨ範囲は、３０℃、１０分
間処理で、ｐＨ７．５〜９．５である。 （４）分子量：約４５，０００（ゲルろ過法）。である
新規なＮ−アルキルグリシンオキシダーゼであり、また
本発明は、クラドスポリウム属に属し、酸素存在下でＮ
−アルキルグリシン類を酸化してアルキルアミン、グリ
オキシル酸及び過酸化水素を生成する、一般式

【化４】 （式中のＲは、アルキル基又はその誘導体を意味する）
に示される反応を触媒する作用を有するＮ−アルキルグ
リシンオキシダーゼを生産する能力を有する菌株を培地
に培養し、その培養物から該Ｎ−アルキルグリシンオキ
シダーゼを採取することを特徴とするＮ−アルキルグリ
シンオキシダーゼの製造方法であり、さらに本発明は、
（ア）前記（１）〜（４）の理化学的性質を有するＮ−
アルキルグリシンオキシダーゼ、及び（イ）酸化反応に
より消費される酸素量又は生成する過酸化水素量を測定
するための試薬を含むＮε−カルボキシメチルリジンの
定量用試薬であり、さらにまた本発明は、Ｎε−カルボ
キシメチルリジン含有試料に、前記（１）〜（４）の理
化学的性質を有するＮ−アルキルグリシンオキシダーゼ
を作用させ、酸化反応により消費される酸素量又は生成
する過酸化水素量を測定することを特徴とするＮε−カ
ルボキシメチルリジンの定量方法である。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。ま
ず、本発明の新規な酵素、Ｎ−アルキルグリシンオキシ
ダーゼ（以下「本酵素」ということもある）の理化学的
性質は下記のとおりである。 （１） 作用：Ｎ−アルキルグリシン類の一種であるザ
ルコシン（Ｒが、−ＣＨ₃）１．２５μｍｏｌ及び本酵
素０．５単位（Ｕ）を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．０）０．２５ｍｌを反応系として用い、１２
０単位のカタラーゼ存在下で５℃で２４時間反応を行
い、反応後におけるザルコシン含有量及びメチルアミン
含有量をアミノ酸分析にて、またグリオキシル酸を高速
液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果、ザル
コシンは反応後に完全に消失し、メチルアミン１．１７
μｍｏｌとグリオキシル酸１．０７μｍｏｌが検出され
た。また前記ザルコシンの代わりに、Ｎ−アルキルグリ
シン類の一種であるＣＭＬ（Ｒが、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ
Ｈ₂−ＣＨ₂−ＣＨ（ＮＨ₂）−ＣＯＯＨ）０．９６μｍ
ｏｌを基質として用いた以外は前記と同様に反応させて
分析したところ、ＣＭＬ０．１９μｍｏｌが反応せずに
残り、（ＣＭＬ ０．７７μｍｏｌに対して）リジンが
０．７５μｍｏｌ、グリオキシル酸が０．７２μｍｏｌ
検出された。同様にして、本酵素は、酸素存在下で、Ｎ
−アルキルグリシン類の一種であるＮ−エチルグリシ
ン、Ｎ−カルボキシメチル−６−アミノカプロン酸（Ｒ
が、それぞれ−ＣＨ₂−ＣＨ₃、 −ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂
−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）を酸化してそれぞれのアル
キルアミン（Ｒ−ＮＨ₂のＲは、前記と同じ）、グリオ
キシル酸及び過酸化水素を生成する反応を触媒するもの
である。すなわち、本酵素は、一般式

【化５】 （式中のＲは、アルキル基又はその誘導体を意味する）
で示される反応を触媒するものである。

【０００９】（２）基質特異性：本酵素の各種基質に対
する相対活性を調べた結果の一例を表１に示す。表１か
ら、ザルコシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−カルボキシ
メチル−６−アミノカプロン酸、Ｎε−カルボキシメチ
ルリジン（ＣＭＬ）に特異的に作用し、グリシン、グリ
シルグリシン、イミノ二酢酸、フルクトシルグリシンに
は作用しないことがわかる。

【００１０】

【表１】

【００１１】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐ
Ｈは、図１に示すごとく、１００ｍＭ ＭＥＳ−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）（□の記
号）、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．５〜８．０）（●の記号）、１００ｍＭ
ＴＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７〜９．
０）（×の記号）、１００ｍＭグリシルグリシン−水酸
化ナトリウム（ｐＨ７．５〜１０．０）（▲の記号）及
び１００ｍＭ ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．
５〜１１．０）（△の記号）を用いて各ｐＨにおける本
酵素の活性測定を行って求めた。その結果は図１に示す
とおりであり、本酵素の至適ｐＨは８．０〜１０．０、
特にｐＨ９．０近辺である。また、安定ｐＨ範囲は、図
２に示すごとく、１００ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５．５〜６．０）（○の記号）、１００
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
５〜７．５）（●の記号）、１００ｍＭ ＴＡＰＳ−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜９．０）（×の記
号）、１００ｍＭグリシルグリシン−水酸化ナトリウム
（７．５〜１０．０）（▲の記号）及び１００ｍＭ Ｃ
ＡＰＳ−水酸化ナトリウム（１０．０〜１１．０）（□
の記号）を用いてｐＨ５．５〜１１．０において３０℃
で１０分間それぞれ処理したのち、本酵素の残存活性を
測定して求めた。その結果は図２に示すとおりであり、
本酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ７．５〜９．５である。

【００１２】（４）分子量：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２
００（ファルマシア社製）によるゲルろ過法で、分子量
は約４５，０００である。なお、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による分子量は約５２，０００で
ある。

【００１３】（５）力価の測定方法： １）酵素反応により生成する過酸化水素の測定法 酵素の力価の測定は下記の方法で行い、１分間に１μｍ
ｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕとする。 Ａ．試薬の調製； 基質溶液 Ｎ−アルキルグリシン２．０ｍｍｏｌを１００ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶解して調製する。 発色試薬 ペルオキシダーゼ７０Ｕ、２．４−ジクロロフェノール
サルフォネート１．０ｍｍｏｌ及び４−アミノアンチピ
リン５．０ｍｇを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１００ｍｌに溶解して調製する。 Ｂ．測定法；発色試薬１．０ｍｌを小試験管に分注し、
基質溶液０．１ｍｌを加え、３０℃で３分間保温した
後、酵素溶液０．１５ｍｌを添加し（基質・酵素混合
液）、３０℃で３０分反応させた後５１０ｎｍにおける
吸光度を測定する。なお、対照液は、酵素液０．１５ｍ
ｌの代わりに水０．１５ｍｌを添加する以外は、前記と
同様にしたものである。このようにして前記酵素反応液
と対照液との吸光度の差より、生成した過酸化水素を測
定する。 ２）酵素反応により消費される酸素の測定方法 酵素の力価の測定は下記の方法で行い、１分間に１μｍ
ｏｌの酸素吸収を引き起こす酵素量を１Ｕとする。１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．７ｍｌをＹＳＩ
社製オキシゲンモニターの測定容器にとり、０．２Ｍ
ＣＭＬ０．３ｍｌを加え３０℃で３分間攪拌し、溶存酸
素と温度を平衡化し、これに酸素電極を差込み密閉した
後、酵素溶液１０μｌを注入し、酸素の変化量をモニタ
ーに接続した記録計で連続的に計測し、その初速度を測
定する。あらかじめ同様にして容器内の酸素濃度と計測
値の間で標準曲線を作成し、これを用いて前記の初速度
測定値から酸素濃度を求める。 ３）酵素反応により生ずるグリオキシル酸の測定方法 酵素反応により生ずるグリオキシル酸を測定することに
より、酵素力価を測定することもできる。グリオキシル
酸の測定方法としては、例えばグリオキシル酸の還元性
を利用してフェリシアン塩をフェロシアンイオンに還元
させた後、第二鉄と反応させ、生じる青色（プルシアン
青）を比色定量するパーク−ジョンソン法（多糖生化学
Ｉ化学編、１９６９、共立出版株式会社）などが挙げら
れる。

【００１４】本発明の酵素の主要な理化学的性質は前記
のとおりであるが、この酵素が新規なものである根拠を
次に示す。本酵素はザルコシンに作用することから、従
来のザルコシンオキシダーゼ（ＥＣ １．５．３．１）
との類似が考えられる。しかしながら、前記したごと
く、本発明の酵素は、特にその作用及び基質特異性にお
いて、前記ザルコシンオキシダーゼとは全く異なるもの
であり、両者を比較するために示した表２から、至適ｐ
Ｈ、至適温度、種々の基質に対する相対活性及びザルコ
シンを基質としたときの酵素反応生成物から見ても、両
者は全く異なるものであることがわかる。なお、表２に
おいて、ザルコシンオキシダーゼはキッコーマン社製を
使用した。また、相対活性は、本酵素の場合はｐＨ８．
０、３０℃で、そしてザルコシンオキシダーゼの場合は
ｐＨ８．０、３７℃で測定し、それぞれザルコシンを基
質としたときの活性を１００として表わした。

【００１５】

【表２】

【００１６】また、本発明者の一人が以前に提案したフ
ルクトシルアミンオキシダーゼ（特開平３−１５５７８
０号公報参照）及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（特開昭６１−２６８１７８号公報参照）も、Ｎ−アル
キルグリシン誘導体の一種であるフルクトシルグリシン
を酸化分解することができるが、これらの酵素は、その
反応によって、基質構造のグリシン部分をグリシンとし
て遊離させるものであり、グリオキシル酸として遊離さ
せる本酵素とは反応形式が異なるものである。さらに、
本酵素は、前記表１に示すごとく、フルクトシルグリシ
ンには全く作用しない。このようなことから、本酵素
は、フルクトシルアミンオキシダーゼ及びフルクトシル
アミノ酸オキシダーゼとも全く異なるものである。

【００１７】また、「酵素ハンドブック」（朝倉書店、
１９８２）によれば、Ｎε−メチルリジンを基質とする
Ｎε−メチルリジンオキシダーゼ（ＥＣ １．５．３．
４）が知られているが、本酵素は、前記表１に示すごと
く、Ｎε−メチルリジンに全く作用しないので、これと
も異なるものである。さらにまた、前記「酵素ハンドブ
ック」によれば、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ
１．４．３．２）がＮα−メチルアミノ酸（記号Ｎα−
は、メチルアミノ酸を構成するアミノ酸残基のα位の炭
素に、メチル化されたアミノ基のＮが結合されているこ
とを示す）に作用してメチルアミンとケト酸を生成する
反応を触媒するとの記載があり、本酵素の反応形式に類
似しているようにも見える。しかしながら、Ｌ−アミノ
酸オキシダーゼはＥＣ １．４番に分類されるものであ
り、その好適な基質であるＬ−ロイシンに対して、本酵
素は全く作用しないこと、さらに、Ｌ−アミノ酸オキシ
ダーゼがＮ−カルボキシメチル−６−アミノカプロン酸
のごとき長いアルキル基のものには全く作用しないのに
対して、本酵素は、前記表１に示すごとく、よく作用す
ることなどから、本酵素は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ
とも異なるものである。

【００１８】すなわち、本発明の酵素は、酸素存在下で
Ｎ−アルキルグリシン類に特異的に作用し、アルキルア
ミンとグリオキシル酸及び過酸化水素を生成するという
特徴を持った、ＥＣ １．５．３に分類されるのが相当
であるところの従来にない全く新規な酵素であり、この
基質特異性の特徴より、Ｎ−アルキルグリシンオキシダ
ーゼと命名した。

【００１９】次に、本酵素のその他の理化学的性質の１
例を示す。 （６）作用適温の範囲：前記力価の測定法におけると同
一の基質・酵素混合液を用い、種々の温度にて本酵素の
活性測定を行った。その結果は図３に示すとおりであ
り、本酵素の作用適温範囲は２５℃〜３５℃、特に３０
℃近辺である。

【００２０】（７）ｐＨ、温度などによる失活の条件：
本酵素は３０℃で１０分間の処理では、ｐＨ７．５〜
９．５で安定であり、図２からわかるように、それより
酸性側及びアルカリ性側では急速に失活し、ｐＨ６．０
以下及びｐＨ１１．０以上で完全に失活する。また、１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、本酵素
を各温度で１０分間処理した場合の熱安定性を調べた。
その結果は図４に示すとおりであり、本酵素は２０℃ま
で安定であり、それを越えると失活し始め、５０℃以上
で完全に失活する。

【００２１】（８）阻害、活性化及び安定化：前記力価
の測定法におけると同一の基質・酵素混合液に、種々の
添加剤（金属塩及び金属キレート剤）を各２ｍＭの濃度
になるように添加して酵素活性を測定した。その結果は
表３に示すとおりであり、本酵素はＺｎＳＯ₄、ヨード
酢酸、ｐ−メルクリ安息香酸（ｐＣＭＢ）、ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）により強く阻害されるが、活性
化及び安定化に特別に寄与する添加物は見当らない。

【００２２】

【表３】

【００２３】（９）精製方法：本酵素の単離、精製は常
法にしたがって行うことができ、例えば硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法
などが単独又は適宜組み合わせて用いられる。

【００２４】（１０）Ｋｍ値：ラインウエーバー・バー
クのプロットから、Ｋｍ値は７．２６×１０^-4Ｍ（Ｎ−
エチルグリシンに対して）、１．４６×１０^-3Ｍ（ザル
コシンに対して）、２．１２×１０^-3Ｍ（Ｎ−カルボキ
シメチル−６−アミノカプロン酸に対して）、２．４０
×１０^-3Ｍ（ＣＭＬに対して）である。 （１１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：ア
クリルアミド４〜２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度勾配を有する
ポリアクリルアミドゲルを用い、常法によりＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、図５に示
すごとく単一のバンドが認められた。

【００２５】次に、本発明の新規Ｎ−アルキルグリシン
オキシダーゼの製造方法について説明する。まず、使用
される微生物は、クラドスポリウム属に属し、Ｎ−アル
キルグリシンオキシダーゼ生産能を有する菌株であっ
て、その具体例としては、クラドスポリウム（Ｃｌａｄ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｇ−１０が挙げられ、該菌株
の変種又は変異株も用いられる。このクラドスポリウム
ｓｐ．Ｇ−１０は、本発明者らが千葉県内の土壌中よ
り分離した菌株であり、その菌学的性質は以下に示すと
おりである。なお、菌学的性質の同定のための実験は、
主として長谷川武治編著、「微生物の分類と同定」、東
京大学出版会（１９７５年）によって行った。また、分
類同定の基準としてエリス（Ｍ．Ｂ．Ｅｌｉｓｓ）著の
「デマティアセウス・ハイフォミセテス（Ｄｅｍａｔｉ
ａｃｅｏｕｓ Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）」（１９７
１年）を参考にした。

【００２６】クラドスポリウム ｓｐ．Ｇ−１０ の菌
学的性質 （Ａ）各培地（ｐＨ６．０）における生育状態 （１）サブロー寒天培地（３０℃生育） 生育は遅く、８日目で直径３．６ｃｍに広がり、うすい
クリーム色の薄いコロニーを作った。中央部の直径１．
５ｃｍではやや黒味を帯びたクリーム色であった。色素
の生成は見られず、ひだも観察されない。１２日目で直
径５．５ｃｍで他には変化は現れない。菌糸は薄い茶色
で隔壁を持ち、幅は３〜５μｍで分岐性であり、所々で
コイル状に菌糸が巻き込み絡み合っている部分が観察さ
れる。また、剛毛や菌足は観察されない。分生子形成細
胞はシンポジオ型であり４〜５μｍ×３〜４μｍの亜球
型の連鎖する分生子を持つ。分生子の連鎖は１〜７個で
あり分岐するときもあるが、表面はほぼ平滑で１細胞で
構成されている。また、分生子のとれた後には分離痕が
残っている。しかし、サブロー寒天培地では他のオート
ミール寒天培地やＹｐＳｓ寒天培地に比べると分生子の
形成はかなり少ない。 （２）オートミール寒天培地 生育は遅く、８日目で直径３．３ｃｍに広がり、緑がか
った黒色の厚いコロニーを作る。菌糸はほとんどが潜在
性で寒天中にもぐっており寒天培地表面には薄く菌糸が
広がっている。中央部の直径１．５ｃｍではやや白っぽ
い気生菌糸が他のコロニーの部分より多く生えており、
周辺部では潜在菌糸のみで気生菌糸は観察されない。ま
た、色素の生成は見られず、ひだも観察されない。１２
日目で直径５．５ｃｍで他には変化は現れない。菌糸や
分生子の形状はサブロー培地と同様であるが、分生子形
成がほかの培地よりも多い。 （３）ＹｐＳｓ寒天培地 生育は遅く、８日目で３．７ｃｍに広がり、白い気生菌
糸が他の培地上よりも多く、薄茶色の密なコロニーを形
成する。菌糸はサブロー寒天培地上と同様に潜在菌糸が
かなり多く、寒天中によく生えている。色素の生成は見
られず、ひだも観察されない。１２日目で直径５．５ｃ
ｍに生育する。菌糸は、サブロー寒天培地と同様である
が、分生子の形成はサブロー寒天培地よりも多い傾向に
ある。

【００２７】（Ｂ）生理的、生態的性質 ｐＨ５．０−９．０（至適ｐＨ６．０付近） 生育温度１５℃−３５℃（至適３０℃付近）

【００２８】（Ｃ）本菌株の分類学上の位置について 前記のごとき菌学的性質を有し、新規Ｎ−アルキルグリ
シンオキシダーゼ生産能を有する本菌株は、生育が遅
く、菌糸が潜在性であり、分生子形成細胞がシンポジオ
型であり、小さい分生子が連鎖しまた分離痕を持つこと
より、前述のエリス（Ｍ．Ｂ．Ｅｌｉｓｓ）著の「デマ
ティアセウス・ハイフォミセテス（Ｄｅｍａｔｉａｃｅ
ｏｕｓ Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）」（１９７１年）
に記述のクラドスポリウム属に属する糸状菌であると判
定される。さらに本菌はコイル状の菌糸が特徴的である
ことよりクラドスポリウム属の一種であるクラドスポリ
ウム・ヴァリアビル（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｖａ
ｒｉａｂｉｌｅ）に近縁の菌株であると思われる。しか
し本菌株はクラドスポリウム・ヴァリアビルの特徴であ
るほうれんそうへの寄生性が認められないことよりクラ
ドスポリウム・ヴァリアビルとは異なる菌と認められ
る。以上の理由から、本菌株はクラドスポリウム（Ｃｌ
ａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）に属する新種と認められ、Ｃｌ
ａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．Ｇ−１０と命名した。な
お、クラドスポリウム ｓｐ．Ｇ−１０は、工業技術院
生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４８８７
として寄託されている。

【００２９】なお、本発明におけるＮ−アルキルグリシ
ンオキシダーゼとしては、前記した作用、基質特異性な
どの主要な理化学的性質を有するものであればよく、そ
の他の理化学的性質が多少の相違を示すものであって
も、本発明の酵素として包含される。そして前記の微生
物は、このようなＮ−アルキルグリシンオキシダーゼを
得るための使用菌の一例であって、本発明においてはク
ラドスポリウム属に属し、Ｎ−アルキルグリシンオキシ
ダーゼ生産能を有するものであればすべて使用できる。

【００３０】次に、Ｎ−アルキルグリシンオキシダーゼ
生産能を有する微生物を用いて、Ｎ−アルキルグリシン
オキシダーゼを製造するには、通常の固体培養法でもよ
いが、液体培養法が好ましい。そしてその培地として
は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を程よく
含有するものであれば、合成培地又は天然培地のいずれ
でも使用できる。炭素源としては、資化可能な炭素化合
物であればよく、例えばマルトース、グルコース、デン
プン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜など
が使用され、これらの糖類に、ＣＭＬ、ザルコシン、エ
チルグリシン、Ｎ−カルボキシメチル−６−アミノカプ
ロン酸を適量添加したものなどが挙げられる。また窒素
源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリ
カー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウムなど
が使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化亜鉛、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン
酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、炭酸ナトリウム
などの種々の塩類、ビタミン類、消泡剤などが使用され
る。これらの栄養源はそれぞれ単独で用いることもで
き、また組み合わせて用いることもできる。

【００３１】このようにして調製した液体培地を用いて
本酵素を製造するには、通気攪拌培養または振盪培養な
どにより好気的に培養するのが好ましい。その際に、培
地の初発ｐＨを６程度に調整し、２５〜３５℃、好まし
くは３０℃前後の温度で３６〜９６時間培養する。こう
することによって、培養物中に本酵素が生成蓄積する。
この培養物から本酵素を採取するには、通常の酵素採取
手段を用いることができる。

【００３２】本酵素は、主に菌体内に存在する酵素であ
るため、培養物から、例えばろ過、遠心分離などの操作
により菌体を分離し、この菌体から本酵素を採取するの
が好ましい。この場合、常法、例えば超音波破砕機、フ
レンチプレス、ダイナミルなどの種々の破壊手段を用い
て菌体を破壊する方法、リゾチーム、ザイモリエイスな
どの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方
法、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体
から酵素を抽出する方法などを単独又は組み合わせて採
用することができる。次いで、ろ過又は遠心分離などに
より不溶物を除き、本酵素の粗酵素液を得る。このよう
にして得られた粗酵素液から本酵素を必要により単離す
るには、前記精製方法が適用できる。

【００３３】このようにして得られた本酵素はＣＭＬの
定量に極めて有用であり、これを用いることによりＣＭ
Ｌを酵素的に定量することができる。ＣＭＬを定量する
ための有利な系としては、例えば反応試薬として、０．
５〜２０Ｕ／ｍｌの本酵素及び１０〜２００ｍＭの緩衝
剤を含有するｐＨ８〜１０の系、そして生成する過酸化
水素を測定するための試薬（後記に例示）及び１０〜２
００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系、又は
０．５〜２０Ｕ／ｍｌの本酵素及び１０〜２００ｍＭの
緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系、そして消費される
酸素を定量するための試薬及び１０〜２００ｍＭの緩衝
剤を含有するｐＨ８〜１０の系などが挙げられる。そし
てこれらの系に用いられる緩衝剤としては、例えばリン
酸塩、ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム、グリシルグリシ
ン−水酸化ナトリウム、ＴＡＰＳ−水酸化ナトリウム、
ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウムどが挙げられる。

【００３４】このような系に、前記成分以外に、本発明
の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用
の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤などと
して、界面活性剤（トリトンＸ−１００、ブリッジ３
５、ツイーン８０、コール酸塩など）、牛血清アルブミ
ン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロースなど）、
キレート剤（ＥＤＴＡなど）などを添加することもでき
る。これらの添加成分は１種用いてもよいし、２種以上
を組み合わせて用いてもよく、また前記系調製の適当な
段階で加えることができる。

【００３５】本発明の試薬は、乾燥物又は溶解した状態
で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート含浸性
の紙などに含浸させて用いてもよい。また使用酵素は、
常法により固定化させて反復使用してもよい。このよう
な本発明の試薬を用いることにより、各種の試料に含有
されるＣＭＬを簡単な操作で精度よく定量することがで
きる。

【００３６】次に、本発明におけるＣＭＬの定量は、前
記のごとく、ＣＭＬ含有試料に本酵素を添加、作用させ
て消費する酸素又は生成する過酸化水素を測定すること
により行うのであるが、ＣＭＬ含有試料としては、ＣＭ
Ｌを含有するものであれば、いかなるものでもよく、例
えば血液、尿のような液体あるいは粉末試料、その他Ｃ
ＭＬを定量すべき診断用試料などが挙げられる。そし
て、該試料は、そのままかあるいはろ過して定量に供し
てもよく、また例えば水、緩衝液などでＣＭＬが適当な
濃度になるように抽出（濃縮）や希釈して定量に供して
もよい。また、正確な定量を妨害するアスコルビン酸、
ザルコシンあるいはエチルグリシンなどを、定量に際し
てあらかじめ又は同時にアスコルビン酸オキシダーゼ、
ザルコシンオキシダーゼなどで消去処理するのが好まし
い。そして、定量に際しては、これらの試料のｐＨは無
調整でもよいが、適当なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫
酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどによ
り、ｐＨ８〜１０に調整するのが望ましい。またＣＭＬ
含有試料に作用させる本酵素の添加量は、該試料に含ま
れるＣＭＬ含有量、酵素反応条件などにより適宜選択さ
れる。

【００３７】次に、前記酵素反応により消費する酸素ま
たは生成する過酸化水素の含有量の測定方法は、特に制
限されず、いかなる方法を用いてもよい。過酸化水素の
測定方法としては、例えば生成した過酸化水素を酵素的
に比色定量する方法（堀内、Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ５３（２），３６１−３６８，１９８
９）、２４０ｎｍにおける吸光度を測定する方法（Ｂｅ
ｒｇｍｅｙｅｒ、メソッヅオブエンザイマティックアナ
リシス第３版（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｍｚｙｍａｔ
ｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖ
ｏｌ．ＩＩＩ，２７３−，１９８４））などが挙げられ
る。また、酸素消費量に基づく定量法としては、反応開
始時の酸素量より反応終了時の酸素量を差し引いた値
（酸素消費量）を測定し、あらかじめ別に用意した酸素
消費量とＣＭＬとの標準曲線よりＣＭＬを定量するもの
で、酸素量の測定は常法、例えばワールブルグ検圧法
（実験化学講座（日本化学会編）第２４巻（生物化学Ｉ
Ｉ）、丸善、１９５９）、酸素電極法（堀内ら、Ａｇｒ
ｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３（１），１０
３−１１０，１９８９）などの方法が挙げられる。なお
酸素電極法により酸素消費量を測定する場合には、例え
ば前記の「力価の測定法」に記載した測定法と同様に操
作する。さらにまた、グリオキシル酸の測定方法として
は、例えばグリオキシル酸の還元性を利用してフェリシ
アン塩をフェロシアンイオンに還元させた後、第二鉄と
反応させ、生じる青色（プルシアン青）を比色定量する
パーク−ジョンソン法（多糖生化学Ｉ化学編、１９６
９、共立出版株式会社）などが挙げられる。

【００３８】次に、本発明のＣＭＬの定量方法の好適な
１例を示す。まず、ＣＭＬを含有する試料に、本酵素を
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ，好ましくは０．５〜２０Ｕ／ｍ
ｌ及び緩衝剤を１０〜２００ｍＭとなるように加え、ｐ
Ｈ８．０〜９．５、温度２５〜３５℃で酵素反応させ
る。このときの反応時間は、ＣＭＬを酸化分解するに十
分な時間であればよく、１〜６０分間、好ましくは２〜
４０分間である。次いで、生成する過酸化水素を前記の
方法、例えばパーオキシダーゼを用いて２．４−ジクロ
ロフェノールスルフォネートと４−アミノアンチピリン
より生じる色素を測定する方法によって定量し、予め同
方法で定量して作成したＣＭＬの検量線を用いて、試料
中のＣＭＬの定量値を算出する。

【００３９】

【発明の効果】本酵素は、Ｎε−カルボキシメチルリジ
ンに特異的に作用する新規な酵素であり、該酵素を用い
る本発明のＮε−カルボキシメチルリジンの定量方法に
よれば、従来のＮε−カルボキシメチルリジンの定量方
法に比較して操作が極めて簡便であり、１試料当りの測
定時間も著しく短縮され、また精度も極めて優れ、さら
に多数の試料を同時に測定できるので極めて有意義であ
る。

【００４０】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。

【００４１】実施例１（本酵素の製造方法） グルコース０．１％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプトン０．１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．２％（Ｗ／Ｖ）、ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄ ０．１５％（Ｗ／Ｖ）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ＫＣｌ ０．０５％（Ｗ／
Ｖ）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００２％（Ｗ／Ｖ）、
ＺｎＣｌ₂ ０．００２％、ザルコシン０．１％及び水
道水からなる培地（ｐＨ６．０）１０００ｍｌを５ｌ容
コルベンに入れて、１２０℃で１５分間殺菌した。クラ
ドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｓｐ．Ｇ−
１０（ＦＥＲＭＰ−１４８８７）の保存スラントより１
白金耳接種し、これを３０℃で約１２０時間静置培養し
た後、１２０ｒｐｍで２４時間振盪培養して種培養液と
した。次いで、前記と同様の培地２０ｌを含む３０ｌ容
タンクに前記種培養液１０００ｍｌ（５ｌ容コルベン１
本分）を接種し、回転数３００ｒｐｍ、通気量１５ｌ／
ｍｉｎ、３０℃で約９６時間通気攪拌培養した。培養終
了後、培養液２０ｌからブフナーロートを用いて菌体を
集め、２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．２）にて菌
体を洗浄したのち、菌体を同緩衝液約１ｌに懸濁した。
本酵素の精製は、以下に示す操作により行なった。

【００４２】ステップ１（粗酵素液の調製）：前記菌体
懸濁液に、ザイモリエイス１００Ｔ（生化学工業社製）
９ｍｇを添加、混合し、３５℃で２時間放置したのち、
上清液をブフナーロートによりろ過し、１２，０００ｒ
ｐｍで遠心を行い集めた。 ステップ２（硫安分画）：集めた前記上清液（約１００
０ｍｌ）に、５５％飽和になるように３５１．１ｇの硫
安を添加混合して、一晩５℃で放置した後、１２，００
０ｒｐｍで遠心して上清を集めた。上清には７０％飽和
になるように１２１ｇの硫安をさらに添加して一晩５℃
で放置した。これを１２，０００ｒｐｍで遠心処理して
沈澱物を集めた。 ステップ３（フェニル−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー）：硫安沈澱物は、０．５Ｍ硫安を含むＨＥＰ
ＥＳ緩衝液５ｍｌで沈澱を溶解させ、あらかじめ０．５
Ｍ硫安を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した
フェニル−セファロースＣＬ−４Ｂのカラム（２．５×
９ｃｍ）に本酵素を吸着させ、０．５Ｍ硫安を含むＨＥ
ＰＥＳ緩衝液にて洗浄し、次に、０．５Ｍ〜０．４Ｍ硫
安を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液の逆直線濃度勾配法によ
り溶出させ、０．４５Ｍ硫安を含有するＨＥＰＥＳ緩衝
液にて溶出された活性画分をＨＥＰＥＳ緩衝液に対して
透析した。 ステップ４（ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー）：前記透析液（５５ｍｌ）をあらかじめ０．
１Ｍ塩化ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースのカラム（２．５×１０ｃ
ｍ）に吸着させたのち、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有
するＨＥＰＥＳ緩衝液にて洗浄し、次に、０．１Ｍ〜
０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液の
直線濃度勾配法により溶出させ、約０．１５Ｍ塩化ナト
リウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液にて溶出された活性
画分を限外濃縮した。 ステップ５（セファデックスＧ−２００カラムクロマト
グラフィー）：濃縮液（約１ｍｌ）をセファデックスＧ
−２００のカラム（１．６×８０ｃｍ）を用いて０．２
Ｍ塩化ナトリウムを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液にてゲル
ろ過を行い、溶出された活性画分１０ｍｌを採取した。
該画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（図５）により均一と判断された本酵素の精製標品であ
り、全タンパク量が０．６６７ｍｇ、全活性が２．８４
Ｕ、比活性が４．１９８Ｕ／ｍｇのものであった。

【００４３】実施例２（生成する過酸化水素を測定して
ＣＭＬを定量する方法） （１）ＣＭＬの定量用試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度又は単位で溶解するこ
とにより、試薬Ａ及び試薬Ｂを調製した。 試薬Ａ 成 分 濃度又は単位 ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０） １００ｍＭ パーオキシダーゼ ０．７Ｕ／ｍｌ ２．４−ジクロロフェノールスルフォネート ０．０１５％ ４−アミノアンチピリン ５０ｍｇ／ｌ 試薬Ｂ 成 分 濃度又は単位 ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８） ５０ｍＭ 本酵素 ９．０Ｕ／ｍｌ

【００４４】（２）ＣＭＬの定量方法 Ｎε−カルボキシメチルリジンを、０．２Ｍになるよう
に溶解した水溶液を希釈して種々の濃度（０、０．１、
０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．５、
２．０、２．５及び３．０ｍＭ）に調製したＣＭＬ含有
試料各０．１ｍｌに、前記試薬Ａを１．０ｍｌ添加し、
３０℃で５分間保温した。次いで、それぞれの保温液に
前記試薬Ｂを０．１５ｍｌ添加し、３０℃で３０分間反
応させた。そして、日立社製分光光度計（Ｕ−２００
０）により、反応を開始して３０分間後の５１０ｎｍに
おける吸光度を測定し、該吸光度増加量（△ＯＤ）の値
（ｙ）を求めた。この値とＣＭＬ含有量（ｘ）との関係
から検量線を作成した。その検量線を図６に示す。該検
量線の式は、 ｙ＝４．４２×１０^-1ｘ＋５．５３×１０^-4（ｒ＝０．
９８９） となる。これから、△ＯＤとＮε−カルボキシメチルリ
ジン含有量との間には直線的な極めて高い相関があっ
て、検量線として有効であることがわかり、しかも試料
中のＮε−カルボキシメチルリジンを迅速かつ正確に定
量できた。なお、前記Ｎε−カルボキシメチルリジン
は、まず、無水酢酸を蟻酸中のＬ−リジン蟻酸塩（Ｌ−
リジン塩酸塩（シグマ社製）を陰イオン交換樹脂ダウエ
ックス１−Ｘ８（米国ダウケミカル社製）で蟻酸塩に変
換したもの）に徐々に加えて攪拌した後、濃縮結晶化す
るというＨｏｆｍａｎｎらの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．８２，３７２７−，１９６０参照）に従っ
てＮα−フォルミルリジン（記号Ｎα−は、フォルミル
リジンを構成するリジン残基のα位の炭素に、フォルミ
ル化されたアミノ基のＮが結合されていることを示す）
を得て、次に、該Ｎα−フォルミルリジンとヨード酢酸
（シグマ社製）を混合して室温で４０時間放置した後、
陰イオン交換樹脂ダウエックス１−Ｘ８を用いてＮα−
フォルミル−Ｎε−カルボキシメチル−Ｌ−リジンを分
離した後塩酸分解してＮα−フォルミル基を除き、さら
に陽イオン交換樹脂ダウエックス５０−Ｘ８（米国ダウ
ケミカル社製）でＮε−カルボキシメチルリジンを分離
するというＡｈｍｅｄらの方法（ＪＢＣ ２６１，４８
８９−，１９８６参照）に従って調製した。

【００４５】実施例３（消費する酸素を測定してＣＭＬ
を定量する方法） （１）ＣＭＬの定量用試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度又は単位で溶解するこ
とにより、試薬Ｃ及び試薬Ｄを調製した。 試薬Ｃ 成 分 濃度又は単位 ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 試薬Ｄ 成 分 濃度又は単位 ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８） ５０ｍＭ 本酵素 ４５Ｕ／ｍｌ

【００４６】（２）ＣＭＬの定量方法 実施例２に記載したと同様にして得たＮε−カルボキシ
メチルリジンを、０．２Ｍになるように溶解した水溶液
を希釈して種々の濃度（０、０．４、０．６、１．０、
１．５、２．０、２．５及び３．０ｍＭ）に調製したＣ
ＭＬ含有試料各０．３ｍｌに、前記試薬Ｃ ２．７ｍｌ
をオキシゲンモニター（ＹＳＩ社製）の酸素測定容器に
添加し、３０℃で５分間攪拌を続け溶存酸素量を平衡化
させた。酸素電極を差し込んで密閉した後、試薬Ｄ５０
μｌを加えて反応させた。反応経過はモニターに接続し
た記録計で全て記録し、１０分後に酸素濃度の減少量
（ｙ）を読み取った。この値とＣＭＬ含有量（ｘ）との
関係から検量線を作成した。その検量線を図７に示す。
該検量線の式は、 ｙ＝３．２９ｘ＋８．８３×１０^-2（ｒ＝０．９９９） となる。これから、酸素濃度変化量とＮε−カルボキシ
メチルリジン含有量との間には直線的な極めて高い相関
があって、検量線として有効であることがわかり、しか
も試料中のＮε−カルボキシメチルリジンを迅速かつ正
確に定量できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。

【図２】 本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。

【図３】 本酵素の作用適温の範囲を示すグラフ。

【図４】 本酵素の熱安定性を示すグラフ。

【図５】 本酵素の電気泳動図。

【図６】 実施例２における検量線を示すグラフ。

【図７】 実施例３における検量線を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12Q 1/26 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＪＳＴＰｌｕｓファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するＮ−アルキ
   ルグリシンオキシダーゼ。 （１）作用：酸素存在下でＮ−アルキルグリシン類を酸
   化してアルキルアミン、グリオキシル酸及び過酸化水素
   を生成する、一般式 【化１】 （式中のＲは、アルキル基又はその誘導体を意味する）
   に示される反応を触媒する。 （２）基質特異性：ザルコシン、Ｎ−エチルグリシン、
   Ｎ−カルボキシメチル−６−アミノカプロン酸、Ｎε−
   カルボキシメチルリジンに特異的に作用する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨはｐＨ８．
   ０〜１０．０であり、安定ｐＨ範囲は、３０℃、１０分
   間処理で、ｐＨ７．５〜９．５である。 （４）分子量：約４５，０００（ゲルろ過法）。
2. 【請求項２】 クラドスポリウム属に属し、酸素存在下
   でＮ−アルキルグリシン類を酸化してアルキルアミン、
   グリオキシル酸及び過酸化水素を生成する、一般式 【化２】 （式中のＲは、アルキル基又はその誘導体を意味する）
   に示される反応を触媒する作用を有するＮ−アルキルグ
   リシンオキシダーゼを生産する能力を有する菌株を培地
   に培養し、その培養物から該Ｎ−アルキルグリシンオキ
   シダーゼを採取することを特徴とするＮ−アルキルグリ
   シンオキシダーゼの製造方法。
3. 【請求項３】 （ア）請求項１記載のＮ−アルキルグリ
   シンオキシダーゼ、及び（イ）酸化反応により消費され
   る酸素量又は生成する過酸化水素量を測定するための試
   薬を含むＮε−カルボキシメチルリジンの定量用試薬。
4. 【請求項４】 Ｎε−カルボキシメチルリジン含有試料
   に、請求項１記載のＮ−アルキルグリシンオキシダーゼ
   を作用させ、酸化反応により消費される酸素量又は生成
   する過酸化水素量を測定することを特徴とするＮε−カ
   ルボキシメチルリジンの定量方法。