FR2545504A1 - Procede de titrage utilisant la nad-synthetase et procede de production de l'enzyme - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE DE TITRAGE UTILISANT LA NAD-SYNTHETASE ET LA PRODUCTION DE CETTE ENZYME. DANS UN STADE PRINCIPAL, ON INCUBE UN ECHANTILLON CONTENANT ATP, DESAMIDE-NAD OU UN DONNEUR D'AMIDES TEL QUE NH POUR OBTENIR NAD; DANS UN STADE DE CYCLAGE DE LA COENZYME, ON ETABLIT UNE REACTION EN COMBINANT LE SYSTEME DE REACTION D'OXYDATION-REDUCTION AVEC LA COENZYME NAD ET ON COMBINE LE SYSTEME DE REACTION D'OXYDATION ET DE REDUCTION AVEC NAD REDUITE PAR LA COENZYME; ET ON MESURE LE COMPOSANT CONSOMME OU ENGENDRE DANS LA REACTION DE CYCLAGE. TITRAGE ET PRODUCTION D'ENZYMES POUR USAGE MEDICAL ET AUTRES.

Description

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La présente invention concerne un procédé de titrage utilisant la NADsynthétase et un procédé de production de ladite enzyme Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de titrage d'un composant dans un échantillon contenant ATP, désamide-NAD et/ou un donneur d'amides, qui consiste, à titre

du stade principal de la réaction, à incuber l'échantillon conte-

nant ATP, désaiide-NAD ou un donneur d'amides tel que NH 3, L-glutamine (qu'on désignera ci-après L CN) ou L-asparagine

(qu'on désignera ci-après L- AN), avec la NAD-synthétase en pré-

sence de ATP, désamide-NAD, le donneur d'amides et Mg++ pour

engendrer NAD, à constituer la réaction de cyclage de la co-

enzyme en combinant le système de réaction d'oxydation-réduction

avec la coenzyme NAD et le système de réaction d'oxydationoré-

duction avec la NAD réduite par la coenzyme et à mesurer un compo-

sant consommé ou engendré dans ladite réaction de cyclage.

Jusqu'à présent, la NAD-synthétase était connue en présence de foie de rat (J Biol Chem 2, 493-500 l 1958 l), foie de porc (ibid,,_ 525-530 l 1961 l), levure (ibid, 24, 4794-4802 l 1972 l) et E coli (ibid, 26 _, 1494-1497 l 1961 l et

242, 385-392 l 1967 l).

La NAD-synthétase est classée en NAD-synthétase (EC 6 3 1 5) qui catalyse la réaction Mg++ ATP + désamide-NAD + NH 3 ? AMP +P Pl + NAD et la NADsynthétase (EC 6 3 5 1) qui catalyse la réaction: Mg++ ATP + désamide NAD + GLN + H 20 C AMP +P Pl + NAD + L-gluta- mate Ces NAD-synthétase utilisent NH 3 ou un amide de GLN

et sont différenciées par l'action inhibitrice d'azasérine.

Dans les procédés de titrage de NAD-synthétases, on a

indiqué que la NAD engendrée est réduite par l'alcool-déshydro-

génase (EC 1 1 1) et le pouvoir absorbant de la NAD réduite en-

gendrée (qu'on appellera ci-après NADH) est mesuré par voie spectrophotométrique à 340 nm ou la NAD engendrée est mesurée par fluorométrie Toutefois, ATP, désamide-NAD, NH 3 ou GLN ne peut pas être mesurée par le procédé connu en raison de la faible

sensibilité de l'activité de l'enzyme.

La Demanderesse a trouvé qu'on peut mesurer le composant

consommé ou engendré par un système de réaction amplifié compre-

nant la réaction de cyclage de la coenzyme par combinaison avec la réaction d'oxydation-réduction provoquée par NAD à titre de coenzymeprovenant de la réaction de synthétase ci-dessus et la

réaction d'oxydation réduction avec NADH à titre de coenzyme.

La présente invention a été élaborée sur la base des constatations indiquées et elle concerne un procédé de titrage d'un composant dans un échantillon contenant ATP, désamide-NAD et/ou un donneur d'amides, qui consiste à incuber l'échantillon avec la NAD-synthétase en présence de ATP, -désamide NAD, le donneur a'arideset Mg++ pour engendrer NAD 9 à constituer la réaction de cyclage de coenzyme en combinant le système de réaction d' oxydation-réduction avec la coenzyme NAD et le système de réaction

d'oxydation-réduction avec la coenzyme NADH et à mesurer le compo-

sant consommé ou engendré dans ladite réaction de cyclage.

Le procédé de réaction de la présente invention peut

être résumé comme suit.

( 1) Procédé de réaction principal: utilisant NH 3 comme donneur d'amides: Mg++ ATP + désamide-NAD+ NH 3 AMP + P Pl + NAD Nadsynthétase utilisant GLN ou ASN comme donneur d'amides ATP + désamide NAD + L-GLN (L- ASN)+ H 20 Mg++ N Mg_ > AMP + P Pl + Glu (Asp) + NAD NAD synthétase ( 2) Procédé de réaction de cyclage de coenzyme: a) procédé de réaction d'oxydation-réduction avec coenzyme NAD:

NAD + 51 > NADH + P

E 1 b) procédé de réaction de transfert avec la coenzyme NADH:

NADH + 52 NAD + P 2

E 2 formules dans lesquelles: NH 3: contenant l'ion ammonium monovalent d'ammoniac E 1: déshydrogénase qui catalyse une réaction consommant les substrats NAD et 51, et qui engendre NADH et Pl, E 2: substance active qui catalyse une réaction consommant NADH et 52 et engendre NAD et P 2 ' 51: substrat réduit dans-E 1, 52: substrat oxydé dans E 2, Pl: produit d'oxydation de 51,

P 2: produit de réduction de 52.

Une réaction utilisant NH 3 est illustrée comme suit: dèsar-ide _ N A D + N H 3 ATP M g NA D synthétase p p i +AMP '

SI,N A D R P 2

P 2 S 2 Un exemple de l'échantillon est un échantillon qui contient au moins le substrat du système de réaction principal décrit plus haut, c'est à dire ATP, désamide-NAD ou donneur d' amide, par exemple un échantillon avant précédemment contenu ledit composant du substrat ou un échantillon contenant le sub-

strat qui est engendré ou consommé par un autre système de réac-

tion d'enzyme.

L'exemple préféré du système de réaction d'enzyme ci-

dessus est un système de réaction qui consomme ou engendre ATP, NH 3 ou un donneur d'amide de L-GLN ou L-ASN sans faire coopérer 1 o les coenzymes NAD et NADH, par exemple comme suit mais de façon

non limitative.

I Système de réaction enzymatique qui engendre ATP: 1) créatine-kinase (EC 2 7 3 2): agent réducteur _____ ____ ____ créatine + ATP phosphate de créatine + ADP créatine ATP Mg++ agent réducteur: P-mercapto éthanol ou un composé réduit: glutathione, cystéine, N-acétylcystéine, dithiothréitol etc. 2) pyruvate-kinase (EC 2 7 1 404 ++ Mg ou Mn pyruvate de phosphénol + ADP > pyruvate + ATP ou Mg++, K 3) acétate-kynase (EC 2 7 2 1): Mg++ ou Mn++ phophae'actye +AD actae +AT iphosphate d'acétyle + ADP acétate + ATP 4) carbamate-kinase (EC 2 e 7 2 2): Mg phosphate de carbamoyle + ADP >NH 3 + CO+ ATP 3 2 ) aspartate-kinase (EC 2 7 2 4): Mg + + 4-phospho-L-as Partat:e + ADP >L-aspartate + ATP

6) phospho-glycérate-kinase (EC 2 7 2 3):-

1,3-diphospho-D-glycérate +ADPM u n)3-phospho-D-glycérate + ATP 7) arginine-kinase (EC 2 7 3 3): Mg++ O Mn++ phosphate d'arginine + ADP Mg o Mn>L-arginine + ATP II Système de réaction enzymatique qui utilise un sel d'ammonium soluble dans l'eau engendrant l'ammonium ou NH 3: 1) parmi les sels hydrosolubles d'ammxonium on peut citer les sels minéraux ou organiques qui engendrent l'ion ammonium, comme par exemple le chlorure d'ammonium, l'ammonium aqueux, le sulfate, nitrate, acétate, citrate dfammonium etc.

2) nicotine-amidase (EC 3 5 1 19):-

amide de nicotine + H O -> nicotinate + Nil + l 3) glutamyl-peptideglutaminase (EC 35 51 44)X L-glutamyl-pe:btide + H 20-,>L-glutlamylpeptide + Nil 4) arginine-désaminase (Ec 353 6): L-arginine + H 20-> citruline + Nil + H 3

2 3

) guanidine-désaminase (EC 3 5 * 4 3): guanine +H O,>xanthine + Ni 13 + H 6) adénosine-désaminase (EC 3 5 4 4):* adénosine + H 20 ->inosine + Nil + É 7)créatinine-désaminase (EC 3 5 4 21) créatinine + Ha O_>,Nméthylhydanto ne + NH 3 + le 8) thréonine-désydratase (EC 4 2 1 16) Lthréonine + H 0- YZ-oxobutyrate + CO 2 + NH 5 + H 9) aspartate anmmoniumliase (EC 4 5 1 11): L-aspartate -> fugerat + NH + I ) L-méthionine-1 liase (EC 4 4,1 11) L-méthionine + H 120 -> 2-oxobutyrate + rrethanethiol + NH +

2 3

11) méthylamiinoglutamate-méthyl-trans 'érase (EC 2,1 1 21)

N-méthylglutamate + NH 3 + H+ -> glutamate + méthylamine.

III* Système de réaction enzymatique utilisant L-GLN 1) glutaminetransaminasè (EC 2 6 1 15) L-GLN + 2-oxy acide -> 2-oxoglutamate + Lamino aoide 2) carbamoylphosphate-synthétase (EC 6 3 5 5)_ L-GLN + HC O + 2 ATP + H 120 ->carbamoylphosphate + 2 ADP + Pl + L-glutamate 3) hexosephosphate-aminotransférase (EC 5 3 1 19)

D-fructose-6-phosplhate + L-GLN -> 2-amino-2-désoxy-D-glucose-6-

phosphate + L-glutamate 4) glutamine-scy Jllo-inosose-aminotransférase (EC 2- 6 1-50) 2-oxoglutaramate + I 1-amino- 11,3 ésoxy-scyllo-inositol -> L-GLN + 2,4,6/3,5-pentahydroxycyclohexanone IV Système de réaction enzymatique utilisant IL-ASN: 1) asparagine-transaminase (EC 2 6 1 14) LASN + 2-oxy-acide,:f 2-oxosuccinate + L-amino acide 2) 3-cyanoalaninehydratase (EC 4 2 1 65)

3-cyanoalanine + H -0-,>L-ASN.

Comme précédemment expliqué, dans la présente invention on peut utiliser comme échantillon à titrer non seulement le mélange de réaction contenant ATP, NH 3, L-GLN ou L-ASN qui est consommé ou engendré dans la réaction enzymatique représentée, mais aussi le mélange de réaction pour mesurer l'activité enzyma- tique qu'on utilise dans le système de réaction enzymatique,

le substrat consommé ou le produit engendré.

Dans ces système S enzymatiques de réaction, on titre ATP, NH 3, GLN ou ASN afin de déterminer 1 ' activité enzymatique dans

ladite réaction enzymatique ou-pour en mesurer l'un des composants.

On ajoute une substance autre que le composant à titrer en une proportion constante à titre de réactif On peut faire varier la

quantité de l'échantillon ou du réactif selon l'objectif recher-

ché et les conditions En général, la réaction se déroule à 370 C pendant un minimum de plus d'une minutes

De préférence, la NAD-synthénase utilisée dans l'inven-

tion est une enzyme dérivée de microorganismes tels que

Escherichia coli ou Bacillus licheniformis en raison de sa stabi-

lité comme enzyme pour diagnostique Luenzyme particulièrement préférée est l'enzvnm de Bacillus licheniformis B 0844 îU la demanreresse

a découverte.

La NAD synthétase ci-dessus catalyse la réaction: Mg + ATP + désamide-NAD + NH 3 SAMP +P Pl + NAD ou Mg ATP + désamide-NAD + L-GLN (ou L-ASN)X AMP + P Pl + slu (ou Asp) + NAD

dans laquelle, Glu = L-glutamate et Asp = L-aspartate.

Dans la réaction principale, l'échantillon contenant l'un des composants ATP, désamide-NAD, NH 3 ou donneur d'amide tel que GLN ou ASN et les substrats restants qui n'ont pas été titrés, est tiaitê en présence de Mg avec NAD-synthétase. Cette réaction enzymatique se déroule normalement en un

volume de 10 microlitres à 3 ml par test La quantité de NAD-

synthétase utilisée varie selon la durée de la réaction et est en général comprise entre 0,5 et 100 unités par test La

1 O quantité des substrats doit au moins dépasser celle du compo-

sant à titrer NAD est engendrée par ladite réaction principale selon la quantité de ATP, désamide-NAD ou du donneur d'amide dans l'échantillon. Pour anticiper une détermination correcte et exacte, on applique une réaction amplifiée par cyclage de coenzyme Dans la présente inventions on soumet NAD qu'on convertit et engendre, selon la quantité de AT Pp désamide-NAD ou du donneur d'amide dans l'échantillon, à une réaction de cyclage avec combinaison d'un système de réaction d'oxydation-réduction pour la coenzyme

NAD et pour NADH et on mesure avantageusement le composant consom-

mé ou engendré dans cette réaction.

Les exemples du système de réaction d'oxydation-réduction avec la coenzyme NAD sont des systèmes de réaction formant une déshydrogénase (E 1) qui consomme NAD pour engendrer NADH et son substrat ( 51), ou une déshydrogénase (E 1) avec la coenzyme NAD ou NADP et son substrat Si Les origines de la déshydrogénase ne sont pas limitées et l'enzyme doit réagir avec le substrat

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spécifique et pouvoir consommer la coenzyme NAD pour former NADH. Des exemples de ces enzymes et des substrats sont mentionnés dans "Enzyme Handbook" Les exemples sont notamment les suivants: lactatedéshydrogénase (EC 1 1 1 27) et L-lactate, alcool-déshydrogénase (EC 1 1 1) et éthanol, glycérol-déshydrogénase (EC 1 1 1 6) et glycérol, glycérol3-phosphate-déshydrogénase (EC 1 1 1 8) et 3-phosphate de glycérol, glucose-déshydrogénase (EC 1 1- 47) et glucose, malate-déshydrogénase (EC 1 Q 1 1 37) et L-malate, glutamate-déshydrogénase (EC 1 41 e 2) et Lglutamate 3-a-hydroxystéroide-déshydrogénase (EC 1 1 1 50) et

3-î-hydroxystéroide.

On fait varier la quantité de l'enzyme utilisée dans la réaction d'oxydation-réduction selon l'activité de l'enzyme,

la nature du substrat et le rapport du cyclage des coenzymes.

La quantité de substrat doit être en excès molaire par rapport

à la coenzyme de cyclage en raison de la consommation d'un rap-

port molaire du substrat par cycle, et on détermine cette quantité par le nombre de cycles à l'heure et par la durée de

réaction Une nouvelle concentration du substrat est avantageuse-

ment déterminée pour le taux maximal de réaction d'oxydo-réducta-

se et elle est de 0,1 à 100 m M. Le système de réaction pour la coenzyme NADH est un système de réaction de la substance fonctionnelle (E 2) qui au moins consomme NADH et engendre NAD, et son substrat ( 52)' 1 1

Comme exemples on peut citer un système de réaction d'oxydo-

réductase qui consomme au moins NADH et engendre NAD et son substrat; ainsi qu'un système de réaction con Eortant une substance

de transfert d'électrons et un sel de tétrazolium.

Comme exemples d'oxydoréductase ci-dessus, on citera une déshydrogénase qui catalyse, au moins avec la coenzyme NADH, une réaction ou une quantité excédentaire d'un substrat spécifique ( 52) pour former NAD et un substrat réduit (P 2) de 52 ou bien l' oxyréductase NADH (accepteur) dans laquelle au moins NADH est la coenzyme alors que l'accepteur est le cytochrome, un composé disulfuré, une quinone et ses analogues et dont l'origine n'est pas limitée Ces enzymes, substrats et accepteurs sont mentionnés dans "It Enzyme Handbook" Comme exemples de déshydrogénase et de son substrat, on peut citer: lactate-déshydrogénase (EC 1 1 1 27) et pyruvate alcool-déshydrogénase (EC 1 1 1) et acétaldéhyde, et

glycérol-déshydrogénase (EC 1 1 1 6) et dihydroxyacétone.

Comme exemples de NADH (accepteur), on peut citer les oxydoréductases comme cytochrome-b -réductase (EC 1 6 2 2) et

diaphorase.

Comme exemples d'accepteurs, on peut citer le bleu

de méthylène, les flavines, les quinones et le 2,6-dichlorophénol-

indophénol. La combinaison de NADH, d'oxyréductase et d'accepteur

n'est pas limitée à une enzyme avec la coenzyme NADH et un ac-

cepteur d'électrons et on Préfère les combinaisons: désaphorase (EC 1 6 4 3) et sel de tétrazoliumainsi que bleu de méthylène,

NAD-déshydrogénase (EC 1 o 6 99 3) et cytochrome c La concentra-

tion est habituellement de 0,05 à 100 U/ml La concentration du sel de tétrazolium dépend de sa solubilité et de la formazane ultérieurement et elle est en général de 1 à 100 microgrammes par ml du réactif. Comme exemple de ubstance de transfert d'électrons, on mentionnera une substance qui possède de l'activité pour oxyder NADH en NAD sans effet fâcheux sur le cyclage des coenzymes, par exemple,

le méthosulfate de phénazine, le bleu de Meldola ou la pyro-

cyanine Sa concentration dépend du rapport de cyclage et on uti-

lise normalement 5 microgramm E à O M 5 mg par ml de mélange de réac-

tion. On effectue normalement la réaction de cyclage ci-dessus à une température comprise entre la température ambiante et 370 C de préférence entre 30 et 370 C La durée de la réaction n'est

pas limitée mais est en général de plus d'une minute, de préfé-

rence de plus de 5 minutes On peut arrêter la réaction en ajou-

tant un acide tel que l'acide chlorhydrique ou phosphorique.

Après l'achèvement de la réaction cyclique, on mesure la substance consommée ou engendrée pendant cette réaction Comme exemples on citera le produit de réduction (P 1) provenant du substrat réduit ( 51) de (E 1) ou le produit réduit (P 2) provenant du substrat oxydé ( 52) de (E 2) pour le composant engendré, et le substrat réduit ( 51) de (E 1) ou le substrat oxydé ( 52) de (E 2)

et on mesure l'un des composants Pi, P 2, 51 ou 52.

De façon particulièrement préférée/ on mesure par voie colorimétri-

que,en utilisant les changements du pouvoir absorbant, le produit lorsqu'il est incolore à l'état de substrat et est coloré ou fluorescent à l'état de produit Par exemple, on réduit la formazane engendrée du substrat ( 52)detétrazolium pour obtenir un produit réduit P 2 qu'on mesure par voie colorimétrique D'autre

part, quand on utilise comme substrat 52 des flavines ou des qui-

nones, il est préférable de mesurer colorimétriquement la quanti-

té consommée du substrat ( 52)o Dans la réaction ci-dessus, on ajoute avantageusement un agent tensio-actif pour empêcher la precipitation de formazone à partir du sel tétrazoliumo Comme exemple d'agents tensioactifs, on peut citer les surfactifs non ioniques tels que Triton X-100 ou Adekatol 50-145 (marques déposées) La concentration est de

i 5 0,01 à 3 % par rapport au réactif L'addition de l'agent tensio-

actif assure une meilleure sensibilité de mesure et une plus grande stabilité du pigment de formazane,

Le titrage colorimétrique du pigment de formazane en-

gendré peut se faire par la mesure de la densité optique (DO) à sa longueur spécifique d'onde d'absorption telle que

500 à 550 nm.

Dans le procédé de la présente invention, on peut avantageusement utiliser une technique de titrage telle que le procédé du point final, le procédé de titrage du taux ou le

procédé chimique à sec (procédé à la pellicule, solide immobi-

lisé) Le procédé de la présente invention convient pour un titrage de haute sensibilité de ATP et -il peut être appliqué à la mesure de ATP libérée de l'échantillon, de ATP engendrée à partir de ADP dans une réaction enzymatique avec la kinase, ADP et un composé de phosphore comme substrat pour la kinase, un ti- trage d'activité de kinase et un titrage de l'un quelconque des

composés ADP et phosphore dans le substrat de kinase ou le pro-

duit de réaction avec la kinase En outre, le procédé selon l'in-

vention convient pour le titrage de haute sensibilité pour NH 3 et on peut l'appliquer pour mesurer le NH 3 libéré de l'échantillon, le NHI engendré ou consommé dans une réaction enzymatique sur le substrat pour l'action enzymatique génératrice de NH 3, l'tactivité enzymatique de l'enzyme génératrice de NH_ et l'un quelconque des composants du substrat pour l'enzyme génératrice de NH ou du

produit de la réaction enzymatique prodiuisant le NH 3.

En outre, le procédé de linvention convient pour le titrage de haute sensibilité de GLN ou ASN Et on peut l'appliquer pour mesurer ces deux composés quand ils sont libérés, engendrés ou consommés dans une réaction enzymatique sur un substrat pour L'enzyme génératrice de GLN ou ASN ou l'un des composants du

substrat pour l'enzyme génératrice de GLN ou ASN ou du produit.

C'est la Demander-esse qui a découvert la NAD-synthétase utilisée dans la présente invention et provenant de Bacillus

licheniformis B-0844 et cette enzyme est plus stable que la NAD-

synthétase déjà connue et convient parfaitement comme enzyme

pour diagnostiques médicaux.

Ainsi, l'invention englobe également un procédé de

production de NAD-synthétase qui consiste à cultiver un micro-

organisme producteur de NAD-synthétase et appartenant au genre Bacillus dans un milieu et à isoler la NAD-synthétase du milieu cultivé. On isole une souche Bacillus licheniformis B-0844 d'un échantillon de sol prélevé au Japon dans la région Ohno,

Shuzenji-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken et les propriétés taxino-

mniques sont comme suit: O 10 (a) propriétés morphologiques: observées au microscope sur un milieu nutritif agar-agar penché

à 30 Cc pendant 18 à 24 heures de culture.

( 1) forme et agencemnt: bordure arrondie, bacilles droits ou légèrement recourbes, en

chaînes simples ou binaires, rarement des chalnes courtes.

( 2) dimensions: 0,6-0,8 x 1-5-3,0 microns ( 3) motilité: motiles par flagelles péritriches ( 4) spores: formant le centre ou les parties subterminales de

0,8 à 1,5 micron, en gonflant les sporanges.

(b) croissance sur divers milieux (à 50 C) ( 1) plaquette nutritive d'agar-agar: colonies d'un blanc gristre avec des bords arrondis et ondulés, sans interruptions Parfois des plissements Pas de formation de

pigments solubles.

( 2) agar-agar nutritif penché: bonne croissance de bactéries échinulées Blanc grisâtre Pas de

formation de pigments solubles.

( 3) Bouillon agar-agar: -

bonne croissance, uniformément trouble Formation ultérieure de

pellicules Précipitation villeuse.

( 4) Lait BCP: est coagulé en une à deux semaines, peptonisation partielle (c) propriétés physiologiques:(+: positif,: négatif) tache de Gram + production de catalase + production d'oxydase + l O formation d'uréase (milieu SSR) (milieu Chris) hydrolyse de gélatine + hydrolyse d'amidon + hydrolyse de caséine ( 3 jours) hydrolyse d'esculine + hydrolyse de cellulose production d'indole production de H 2 S + production d'acétoine + test MR + (faible) réduction de nitrate + réaction de dénitrification utilisation de citrate + croissance sur milieu ajouté à 7,0 % Na Cl + croissance à& 500 C + croissance à 20 C + formation d'acide adonito Jl L(+)arabinose + cellobiose + dulcitol méso- erythrito Jl fructose + fuc ose galactose + glucose + glycérine + inositol + inuline lactose maltose + mannitol + mannose +

mélézitose-

mélibiose + raffinose + L(+)rhamnose + 1 salicine +

L-sorbose-

sorbitol + amidon saccharose + tréhalose + xylose + à partir du sucre (x) (pas de formation de gaz): test OF (méthode de Hucker) test OF (modifié)X NT (pas de changement) F (fermentation) x milieu de base:

(NH 4)2 HPO 4

Mg 504 7 H 20 Agar-agar 1,0 g 0,2 g 3,0 g Eau distillée Test d'utilisation

D-alanine -

L-alanine + fructose

propanol -

éthanol -

éthylamine -

lactate +

a-aminobutyrate -

glucose +

inositol -

KC 1 0,2 g ex levure 1,0 g BTB 0,02 g 1000 ml p H 7,0 de carbone: saccharose +

cellobiose -

L(+)arabinose -

mannose + maltose +

rhamnose -

tréharose +

acétate -

propionate + Teneurs en DNA (%) dans cytosine et guanine:

45,6 % (procédé Tm).

Conformément aux propriétés taxinomiques ci-dessus, on peut faire pousser la souche des B-0844 à 50 C et il s'agit d'une bactérie ayant les caractéristiques de bacilles à bord arrondi,

droit ou légèrement courbe, Gram-positifs, sporulants et pro-

venant de la dégradation de fermentation du sucre Si l'on consulte les renseignements concernant ces propriétés taxinomiques dans "Berg" 's Manual, 8 ème Ed, 1974 ", "Manual of Medicinal Bacterio logy, 2 ème Ed, 1974 " et "Agriculture Handbooko, p 427, The genus Bacillus", la présente souche est une croissance aérobie formant

des spores et on l'appelle genre Bacillus Parmi les souches ap-

partenant au genre Bacillus que l'on peut faire pousser à 50 C,

on peut mentionner (a) Bacillus coagulance, (b) Bacillus liheni-

formis, (c) Bacillus subtilis, (d) Bacillus brevis et (e) Bacillus stearothermophilus La comparaison entre ces souches se fait comme suit: l+ : positive,: férentel:

B-0844

croissance à 50 C + croissance à 20 CC + croissance anaérobie + utilisation de:oropionate + croissance sur milieu à 7 %o Na Cl + croissance sur milieu à 5 % Na Cl + utilisation de citrate +

négative, d:de souche dif-

(a) (b) (c) (d) (e)

+ + J + +

+ + + + -

+ + _ _ _

+ _

+ +

+ + + d d + + d d La présente souche ressemble à Bacillus licheniformis et est désignée par Bacillus licheniformis B-0844 La souche a été déposée au Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M I T I, Japon et a reçu la référence

FERM P-6809.

Dans la présente invention, parmi les micro-organismes produisant les NADsynthétases appartenant au genre Bacillus, la souche ci-dessus constitue un exemple et on peut utiliser toutes les souches appartenant au genre Bacillus et donnant une

NAD-synthétase.

On cultive le microorganisme produisant une NAD-

synthêtase et appartenant au genre Bacillus dans un milieu classique pour la production d'enzymes On effectue la culture dans un milieu liquide ou solide et on préfère dans le domaine

industriel la culture submergée avec aération.

Les sources nutritive pour le milieu peuvent être

classiques dans le domaine de la culture des microorganismes.

Comme exemples de sources de carbones, on peut citer les composés de carbone assimilables et notamment le glucose, le saccharose, le lactose, le maltose, l'amidon, la dextrine, la mélasse ou la glycérine Comme exemples de sources dgazote on citera les sources assimilables d'azote telles que la liqueur de macération du mais, la poudre de graines de soja, la poudre de graines de coton, le gluten de blé, la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure ou l'hydrolysat de caséine On peut aussi utiliser un sel

tel que le sel de magnésium, potassium, sodium, zinc, fer, manga-

nèse, et phosphate ou un halogène.

On peut régler la température de culture pour la croissance de microorganismes produisant la NAD-synthétase et pour la production de l'enzyme, de préférence de 26 à 50 C On peut varier la durée de la culture selon les conditions de

culture et cette durée est en général de 15 à 40 heures Natu-

rellement, on doit arrêter la culture à la production maximale de l'enzyme L'agitation d'aération se fait normalement à 200 à

400 tours/min.

Etant donné que l'enzyme est une endo-enzyme, on col-

lecte les cellules cultivées par filtration ou centrifugation et on rompt mécaniquement les cellules collectées par ultrasons, le pressage French ou le traitement par perles de verre, ou bien

on effectue une digestion enzymatique avec la lysozye en ajou-

tant si nécessaire des surfactifs tels que Triton X-100 ou

Adekatol 50-120 (marques déposées).

On soumet la solution enzymatique, avec ou sans concen-

tration à un traitement de relarguage en ajoutant des sels solu-

blesltels que le sulfate d'ammonium ou on traite avec un solvant organique miscible à l'eau tel que le méthanol, l'éthanol, ' acétone ou l'isopropanol pour précipiter l'enzyme On dissout le précipité dans l'eau ou dans une solution-tampon, on dialyse

si nécessaire et on chromatographie à l'aide d'une résine échan-

geuse d'ions telle que DEAE-Séphadex, DEAE-Sépharose, carboxy-

méthylcellulose, carboxyéthyl-Sépharose ou carboxyméthyl-Séphadex ou par filtration sur gel en utilisant un tamis moléculaire tel que Séphadex G200, Séphadex CL-6 B ou Séphacryl S-200 (marques déposées

Les propriétés biochimiques de la NAD-synthétase ci-

dessus sont comme suit: ( 1) poids moléculaire: env 62 000 (filtration sur gel par Séphadex G-150) ( 2) Point Isoélectrique: approx p H 4,6 (électrophorèse utilisant l'Ampholite) ( 3) Action: ATP + Désamide-NAD + NH AMP + P Pl + NAD 3- ( 4) spécificité du substrat:

NH 3, L-GLN, L-ASN,

M++ ATP + dêsamide-NAD + GLN (ou ASN) Mg AMP + P Pl + NAD + Glu (ou Asp) ( 5) p H optimal: On mélange le milieu de réaction I dans un procédé de titrage d'activité enzymatique avec un acétate-tampon (p H 3,8-6,6), un dim&thylglutarate-Na OH tampon (p H 5,1-= 6,8 et un Tris-H Cl tampon (p H 6,5-8,8) et on mesure l'activité de l'enzyme Comme on le

voit sur la figure 1, le p H optimal est de 8,0 à 8,7.

46) stabilité de p H: On dissout l'enzyme dans 50 m M d'acétate-tampon (p H 3,9 à 6,8) de diméthylglutarate-Na OH tampon ( 4,1-7,1), un phosphate -tampon (p H 6,3-7,9) ou un Tris-H Cl tampon (p H 6,4-8,9), on incube à 37 C pendant 60 minutes On mesure l'activité de l'enzyme

restante par un procédé de titrage de l'activité d'enzyme Le ré-

sultat est indiqué sur la figure 2 et l'enzyme est stable à

p H 5,5-9,0.

( 7) stabilité thermique: On dissout l'enzyme dans 50 m M de Tris-H Cl tampon (p H 6,8) et on traite à diverses températures pendant 10 minutes

puis on mesure l'activité enzymatique restante Le résultat ap-

parait sur la figure 3 et l'enzyme reste stable jusqu'à 40 C.

( 8) effet de l'agent tensio-actif: Dans le titrage d'activité de l'enzyme, on ajoute l'

agent tensio-actif indiqué dans le Tableau I au milieu de réac-

tion I, on chauffe à 37 C et on ajoute la solution enzymatique ( 5 pl), on incube à 370 C pendant 10 minutes et ensuite on ajoute le mélange de réaction II ( 0,8 ml), on incube à 37 C pendant exactement 5 minutes et on ajoute 2,0 ml de H Cl au dixième pour arrêter la réaction cyclique et on mesure colorimétriquement Le résultat apparait sur la figure 1 et l'enzyme est inhibée par

des agents tensio-actifs cationiques et anioniques.

Tableau I

Agent tensio-actif pas d'addition Adekatol 50120 If 50-145 Brig 35 Eation DT-205

" FB

Chlorure de cétylpyridinium Dodécylsulfate de sodium Tween-80 Chblolate Chlorure de cétyl-triméthylammonium Span 85 Laurylbenzène-sulfonate de sodium Activité relative (%) 1 o 8,2 106,9 107,5 ,5 11,8 1,6 2,3 102,3 ,6 4,2 104,6 6,5 ( 9) effet de l'ion métallique: On ajoute chaque sel métallique au milieu de réaction I ( 20 m M contenant Mg C 12) on règle jusqu'à 1 ml et on mesure 1 '

activité relative Le résultat est indiqué dans le Tableau II.

Tableau II

sel métallique pas d'addition Ni C 2 Ba C e 2 Sn Cp 2 A 1 C es AI Cgs Cd S 04 Mn Ce 2 Zn CC 2 C O Ce 2 Mg C e 2 PCMB Ca Ce 2 activité relative en % 1 0 0 1,06 1 0 6

9 9 8

94,1 96

*2, 4 1 8 2 8 6 51 a 8

9 4 X 2

1 0 2 94,2 ( 10) procédé de titrage de l'activité d'enzyme: titrage d'activité d'enzyme: milieu de réaction I m M de Tris-H Cl-tampon p H 8,0 20 m M de K Cl m M de Mg C 12 0,05 % d'albumine de sérum bovin 2 m M de ATP 0,5 m M de désamide-NAD m M de (NH 4)2504 milieu de réaction II m M de Tris-H Cl-tampon p H 8,0 U diaphorase (Toyo Jozo Co depuis genre bacille) 3 % d'éthanol U d'alcool-déshydrogénase/ml (Toyo Jozo, levure) 0, 025 % NTB (bleu de nitrotétrazolium) 0,1 % de Triton X-100 10 m M d'EDTA On préincube à 37 C 0,2 ml du milieu de réaction I dans un tube d'essai et on ajoute 5 microlitres de la solution d'enzyme/

puis on incube à 37 C pendant 10 minutes exactement.

On ajoute 0,8 ml du milieu de réaction II pour ar-

rêter la réaction et on commence en même temps la réaction de cyclage à 37 C pendant 5 minutes exactement Après l'arrêt de la réaction de cyclage par addition de 2,0 ml de H Cl au dixième, on mesure le pouvoir absorbant à 550 nm pour calculer l'activité de l'enzyme On calcule l'activité de l'enzyme par l'équation suivante: activité de NAD-synthétase (m U/ml) b A 550 1,0 f

= X X

A 5550 0,005 10

dans laquelle à A: pouvoir absorbant pour l'échantillon ai S: pouvoir absorbant pour une solution normalisée ( 0,1 m M NAD) 0,005: volume de l'échantillon (ml) : durée de réaction

f: rapport de dilution.

Les exemples suivants dans lesquels toutes les propor-

tions sont en poids servent à illustrer l'invention sans aucune-

A ment en limiter la portée'

Exemple 1

On stérilise à 120 C pendant 20 minutes un milieu li-

quide ( 20 litres, p H 7,3) comprenant 1 % de peptone, 1 % d'ex-

trait de viande, 0,2 % d'extrait de levure et 0,3 % de Na Cl dans une cuve de fermentation d ' une capacité de 30 litres On inocule un milieu de culture de semences préalablement cultivé ayant la même composition ( 200 ml) et on cultive à 50 C pendant 16 heures avec une aération de 20 litres/minute et une agitation de 300

t/min Après lacu Lure, on recueille par centrifugation les cel-

lules, on met ces cellules en suspension dans 2 litres de Tris-HC 1 de 10 ml (p H 8,0) contenant 0,1 % de lysozyme et on incube à 37 C pendant 30 minutes pour lyser les cellules On soumet à une centrifugation la solution lysée à 5000 t/min pendant 10 minutes pour obtenir 1,9 litre d'une solution surnag E nte On ajoute du sulfate d'ammonium pour fractiomer la solution (saturation 0,44-0,54) et on dissout le précipité obtenu dans m M de Tris-H Cl-tampon et on dialyse ensuite ( 200 ml, 473 U)

contre le même tampon ( 12 litres) On élimine les matières inso-

lubles précipitées par centrifugation ( 12000 t/min, 10 minutes).

On charge la solution qui surnage ( 462 U sur une colonne de x 30 cm) de DEAE-Sépharose C-6 B tamponnée avec 10 m M de Tris- H Cl tampon (p H 8,0) et on élue avec le gradient O à 0,5 M de Na Cl On recueille les fractions qui éluent avec 0,15-0,2 M de Na Cl ( 120 ml, 399 U), on concentre à l'aide d'une membrane d'

ultrafiltration PM-10 (Amicon Co,)/on chromatographie par Sépha-

dex G-150 ( 3,6 x 80 cm) et on recueille la fraction active pour obtenir la solution purifiée ( 80 ml, 324 U)o, On ajoute l'albumine de sérum bovine le glucose, le maltose, le mannitol, le saccharose et le fructose chacun jusqu'à une concentration de 1 % et on lyophilise Le produit lyophilisé avec addition du stabilisant indiqué est stable sans perdre de l'

activité alors que l'enzyme ne contenant pas de stabilisant su-

bit une perte d'activité jusqu'à 86 %.

Exemple 2 O

Milieu de réaction I: m M de Tris-H Cl-tampon p H 8 ï O m M de Mg C 12 0, 05 % d'alumine de sérum bovin 1 m M de désamide-NAD 50 m M de (NH 4)2504 400 m U NAD-synthétase/ml Milieu réaction II: m M de Tris-H Cl tampon (p H 8,0) U de diaphorase/ml 3 % d'éthanol 20 U d'alcool-déshydrogénase/ml 0, 05 % de NTB 0,1 % de Triton X-100 On préincube à 370 C le mélange de réaction I ( 0,2 ml) dans un tube d'essai et on ajoute O, 5, 10, 20, 30 et 40 M de solution ATP ( 5 11 l), respectivement puis on incube à 370 C pendant 10 minutes On ajoute le milieu de réaction II ( 0,3 ml),

on incube o 370 C pendant 5 minutes exactement, on arrête la réac-

tion en ajoutant 2,0 ml de H Cl au di ième et on mesure le pouvoir absorbant à 550 n M Le résultat apparait sur la figure 4 Comme on peut le voie sur cette figure, on obtient une linéarité qui

est bonne Le rapport de cyclage est de 4800 tours/heure.

Exemple 3:

On mélange les milieux de réaction I et II en volumes égaux et on préincube à 37 Co On place le mélange ( 1,Oml) dans une cellule à quartz d'un spectrophotomètre ( 1,0 ml) qu'on règle à 370 C et on ajoute la solution de ATP ( 5 Fl) à la même concentration que dans l'exemple 2 On mesure l'absorption en

2 minutes, entre 5 et 7 minutes après l'addition de ATP à 550 nm.

Comme on le voit sur la figure 5, on observe une bonne linéarité

avec une haute sensibilité par la technique de titrage cynétique.

Le rapport de cyclage est d'environ 2800 tours/heure.

Exem_ 2 e On remplace les 50 m M de (NH 4)2 SO 4 dans le milieu de réaction I de l'exemple 2 par 5 m M de ATP pour préparer le milieu

de réaction On ajoute diverses concentrations de sulfate d'am-

monium, de L-GLN ou de 1-asparagine et on traite comme dans 1 X

exemple 2 On voit sur la figure 6 qu'on obtient une bonne linéa-

rité pour le sulfate d'ammonium, la L-GLN et la L-ASP Sur les dessins annexes: la figure 1 représente le p H optimal de NAD-synthétase proveant de Bacillus licheniformis B-0844; la figure 2 indique la stabilité du p H; la figure 3 indique la stabilité thermique; la figure 4 indique le procédé de titrage par point final pour ATP; la figure 5 représente le titrage pour ATP par le procédé cynétique; et la figure 6 représente le titrage pour L-glutamine et

L-asparagine par le procédé par point final.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1 Procédé de titrage d'un composant dans un échantillon contenant l'un quelconque des composants ATP, désamide-NAD et un donneur d'amide, caractérisé en ce qu 'il consiste: à titre de stade principal de réaction, à incuber l'échantillon avec NAD-synthétase en présence de ATP, désamide NAD, un donneur d'amides et Mg++ pour engendrer NAD; à titre de stade de réaction de cyclage de la coenzyme, à établir la réaction de cyclage de la coenzyme en combinant le système de réaction d'oxydation-réduction

avec la coenzyme NAD et le système de réaction d'oxydation-

réduction avec NAD réduite par la coenzyme; et à mesurer un

composant consommé ou engendré dans ladite réaction de cyclage.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' on engendre ATP par la réaction enzymatique suivante: (a) créatine-kinase: agent réducteur phosphate de créatine + ADP > créatine + ATP Mg++ agent réducteur: 0-mercapto éthanol ou un composé réduit choisi parmi la glutathione, la cystéine, la N-acétylcystéine, et le dithiothréitol; (b) pyruvate-kinase Mn++ ou Mg++, K pyruvate de phosphénol + ADP > pyruvate + ATP; (c) acétate-kinase Mg++ ou Mn++ phosphate d'acétyle + ADP t acétate + ATP; (d) carbamate-kinase Mg++ phosphate de carbamyle + ADP NH 3 + C 02 + ATP; (e) aspartate-kinase Mg 4-phospho-L-aspartate,+ ADP >L-aspartate + ATP (f) phosphoglycérate-kinase Mg ++ou Mn+

1,,3-diphospho-D-glycérate + ADP >L -arginine + ATP.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que

NH 3 est un sel d'ammonium ou est produit par la réaction enzymati-

que suivante (a) nicotine-amidase nicotine amide + 1120 -)rnicotinate + NH 3 +H (b) glutaminyl-peptide-glutaminase L-glutamninyl-peptîde + H 2 O > -luay-etd + NH 3 (c) arginine-désaminase L-arginine + H 20 >citru 1 ine + NH 3 + H+ (d) guanine-désaminase guanine + H 20 xanthine + NH 3 + (e) adénosine-désamînase adénosine + H 20->inosine + NH 3 + H (f) créatininedésaminase créatinine + H O _N-méthylhydantoine + NH + (g) thréoninedéshydratase L-thréonine + H 20 > 2 'oxobutyrate + + O Ni 3 +H (h) aspartate-ammoniac -lyase L-aspartate- îumarate + N Hl + (i) L-methionine lyase: L-méthionine + H 20-> 2-oxobutyrate + CH 3 SH + NH 3 + H (j) méthylamino-glutamate -méthyl-transférase: glutamate de N-méthyle + NH 3 + H glutamate + méthylamine 4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la L-glutamine est produite par la réaction suivante: (a) glutamate-synthétase (ferredoxyne): L-glutamine + 2- oxoglutamate + 2-ferredoxyne réduite 2-L-glutamate + 2-ferredoxyne oxydée (b) glutamine-transférase L-glutamine + 2-oxo-acide > 2-oxoglutamate + Laminoacide (c) carbamylphosphate-synthétase: L-glutamine + HCO + 2 ATP + H 20 ->phosphate de carbamyle + 2 ADP +

3 2

Pl + L-glutamate (d) hexosephosphate-aminotransférase

D-fructose-6-phosphate + L-glutamine -> 2-amino-2-désoxy-D-glucose-

6-phosphate + L-glutamate (e) glutamine-scyllo-inosose-aminotransférase: 2-oxoglutaramate + 1-amino-1-désoxy-scyllo-inositol >

L-glutamine + 2,4,6/3,5-pentahydroxycyclohexanone.

Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que

NAD-synthétase est dérivée de Escherichia coli ou d'un microorga-

nisme produisant la NAD-synthétase du genre Bacillus.

6 Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme produisant la NAD-synthétase et appartenant au genre Bacillus est Bacillus licheniformis B-0844 FERM P-6809 7 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système de réaction d'oxydationréduction avec la coenzyme NAD est une réaction enzymatique comprenant la déshydrogénase qui

consomme NAD et engendre une NAD réduite, et un substrat de celle-

ci. 8 Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la déshydrogénase et son substrat sont: lactate-déshydrogénase et L-lactate; alcool-déshydrogénase et éthanol; l glycérol-déshydrogénase et glycérol glycérol-3-phosphate-déshydrogénase et 3-phosphate de glycérol glucosedéshydrogénase et glucose; malate-déshydrogénase et L-malate; glutamatedéshydrogénase et L-glutamate; ou 3-a-hydroxystéroide-déshydrogénase et 3a-hydroxystéroid E 9 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système de réaction d'oxydation-réduction avec NAD réduite par la coenzyme est l'oxydoréductase qui consomme NAD réduite et

engendre NAD oxydée, et son substrat.

Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'oxydoréductase et son substrat sont: lactate-déshydrogénase et pyruvate; alcooldéshydrogénase et acétaldéhyde; glycérol-déshydrogénase et hydroxyacétone; glycérol-3-phosphate-déshydrogénase et phosphate de dihydroxyacétone; malate-déshydrogénase et oxaloacétate; ou

3-m-hydroxystéroide-déshydrogénase et 3-cétostéroide.

11 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce

que l'oxydoréductase et son substrat sont NAD réduite: oxydo-

réductase et un accepteur de celle-ci. 12 Procédé selon larevendication 11, caractérisé en ce que l'oxydo-réductase de NAD réduite (accepteur) et son accepteur sont la déshydrogénase réduite de NAD et les flavines, quinones, 2,6-dichlorophénol indophénol, sel de ferricyanure, sel de

tétrazolium, cytochrome c ou l'oxygène.

13 Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'oxydoréductase et son substrat sont la diaphorase et un sel

de tétrazolium.

14 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le système de réaction d'oxydation=réduction avec la NAD réduite par la coenzyme est un système de réaction par transfert d'électrons et avec tétrazoliumo Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce

que le transfert d'électrons se fait par méthosulfate de phéna-

zine, le bleu de Meldola ou la pyrocyanine.

16 Procédé selon la revendicaton 12, caractérisé en ce qu'on effecture la réaction de cyclage avec addition d'un agent tensio-actif. 17 Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce

que l'agent tensio-actif est un surfactif non ionique.

18 Procédé de production de NAD-synthétase, caractérisé en qu'il consiste à cultiver un microorganisme générateur de NAD-synthétase appartenant au genre Bacillus dans un milieu

et à isoler de celui-ci la NAD-synthétase -

19 Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le microorganisme générateur de NAD-synthétase est Bacillus licheniformis B0844 FERM P-6809.