CN107974485B - 氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置 - Google Patents

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Abstract

一种氨定量方法，所述方法包括：进行第一反应，其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP和L‑谷氨酸反应，以产生ADP；进行第二反应，其中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应，以产生葡萄糖‑6‑磷酸；进行第三反应，其中，在葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖‑6‑磷酸与氧化型NAD化合物反应，以产生还原型NAD化合物；并对所述还原型NAD化合物进行定量以定量氨。

Description

氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置
相关申请的交叉引用
本申请根据35 USC 119要求日本专利申请2016-208760和日本专利申请2017-118045的优先权，并通过援引将其公开内容并入本文。
出于所有目的将本文中所提到的所有出版物、专利申请和技术标准都通过援引并入本文中，其程度如同各个单独的出版物、专利申请或技术标准都具体地且单独地标明通过援引并入一样。
技术领域
本发明涉及一种氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置。
背景技术
氨定量方法的已知实例包括化学测量法和酶测量法。主要使用的化学测量法是吲哚酚法。酶测量法的实例包括使用谷氨酸脱氢酶的方法，以及使用谷氨酰胺合成酶、NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)合成酶、氨基甲酸激酶或氨甲酰磷酸合成酶等的方法。
已提出的使用谷氨酰胺合成酶的酶测量法的实例包括以下方法：使谷氨酰胺合成酶作用于氨、三磷酸腺苷(ATP)和L-谷氨酸，并且使激酶作用于所产生的二磷酸腺苷(ADP)和激酶底物磷化合物，然后对所生成的激酶反应产物进行定量，由此定量氨(参见例如专利文献1)。更具体地，已提出以下方法：使丙酮酸激酶作用于所产生的ADP和磷酸烯醇丙酮酸以产生丙酮酸，并使丙酮酸氧化酶作用于所产生的丙酮酸，然后通过基于过氧化物酶的显色反应来对所产生的过氧化氢进行定量，由此定量氨。
已提出的使用谷氨酰胺合成酶的酶测量法的其它实例包括以下氨定量法：在ATP和L-谷氨酸(它们不是所要定量的组分)的存在下使谷氨酰胺合成酶作用于含有氨的测试液，并在嘌呤核苷酸的存在下使嘌呤核苷酸磷酸化酶作用于所产生的无机磷酸，然后用黄嘌呤氧化酶对所产生的嘌呤化合物进行定量(参见例如专利文献2)。
已提出的使用NAD合成酶的酶测量法的实例包括以下方法：在ATP、脱酰胺-NAD、作为酰胺供体的氨和Mg2+的存在下，使NAD合成酶作用于测试液以进行主要反应，并对由该主要反应产生的NAD进行辅酶循环反应，然后对由该循环反应消耗或产生的组分进行定量，由此测量氨(参见例如专利文献3)。
现有技术文献
[专利文献]
[专利文献1]日本专利申请特开(JP-A)昭62-3800号公报
[专利文献2]日本专利申请特开(JP-A)昭S62-142272号公报
[专利文献3]日本专利申请特开(JP-A)昭S59-198995号公报
发明内容
本发明所要解决的问题
在专利文献3所述的氨测量法中，通过循环法扩增了底物。由于反应以加快的速度进行，即使使用少量样品也是如此，因此反应容易达到平台期，所以难以根据样品的浓度来控制反应，这造成了问题。此外，在使用酶促反应的情况下，反应容易受到测量温度等的影响。因此，当测量环境容易发生变化时，循环法中测量结果可能发生变化。此外，由于专利文献3所述的方法使用了非常昂贵的NAD合成酶，因此需要一种能够以低成本定量氨的方法。
专利文献1和2所述的氨测量法是利用终点法来定量氨的方法。此处，专利文献1所述的方法容易受到溶解氧的影响，这是因为进行了利用氧化酶的显色反应，由此造成了问题。
在专利文献1所述的方法中，当使丙酮酸氧化酶作用于所产生的丙酮酸时，反应中使用了在产生L-谷氨酰胺时产生的磷酸和氧来产生乙酰磷酸、二氧化碳和过氧化氢。因此，在专利文献1所述的方法中，在反应过程中使用磷酸作为底物，这与专利文献2所述的方法相似。由于磷酸是存在于测试液(例如血液(2.5mg/dL至4.5mg/dL)、尿(0.3g/天至2.2g/天)和唾液(约16.8mg/dL))中的物质，测量结果可能具有取决于测试液中的磷酸浓度的正误差。因此，需要一种能够在不使用磷酸作为反应底物的情况下定量氨的方法。
本发明的目的是提一种氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置，其能够在不使用磷酸作为反应底物的情况下高度灵敏地定量氨。
解决问题的手段
在专利文献1所述的使用谷氨酰胺合成酶的方法中，通过使用氧化酶的显色反应来定量氨。因此，迄今为止尚未公开使用脱氢酶的方法。在对基于使用谷氨酰胺合成酶然后使用脱氢酶的还原体系的检测系统进行了大量研究后，本发明人利用ADP依赖性己糖激酶成功地建立了基于使用脱氢酶的还原体系的检测系统。也就是说，在使用谷氨酰胺合成酶的方法中，本发明人完成了一种基于使用脱氢酶的还原体系的新型氨检测系统，由此完成了本发明，该新型氨检测系统与将基于氧化的着色性色素与氧化酶一起使用的常规已知的氨检测系统不同。
更具体而言，所述目标可通过以下手段来实现。
<1>本发明的一个实施方式是一种氨定量方法，所述方法包括：进行第一反应，其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP和L-谷氨酸反应，以产生ADP；
进行第二反应，其中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应，以产生葡萄糖-6-磷酸；
进行第三反应，其中，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应，以产生还原型NAD化合物；和
对所述还原型NAD化合物进行定量以定量氨。
<2>本发明的一个实施方式是<1>所述的氨定量方法，其中，对所述还原型NAD化合物进行定量以定量氨的步骤是通过定量色素来进行的，所述色素是通过使所产生的还原型NAD化合物与着色剂反应而获得的。
<3>本发明的一个实施方式是<1>或<2>所述的氨定量方法，其中，第一反应还包括镁离子(Mg2+)或锰离子(Mn2+)中的至少一种作为催化剂，以产生ADP。
<4>本发明的一个实施方式是一种定量试剂盒，其包含：包含葡萄糖的第一试剂；和包含谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的第二试剂，其中，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物各自独立地包含在第一试剂或第二试剂中的至少一个中。
<5>本发明的一个实施方式是<4>所述的定量试剂盒，其中，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物包含在第一试剂中。
<6>本发明的一个实施方式是<4>或<5>所述的定量试剂盒，其中，第一试剂还包含着色剂，第二试剂还包含电子载体。
<7>本发明的一个实施方式是一种测试片，其包含：葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸、和氧化型NAD化合物。
<8>本发明的一个实施方式是一种氨定量装置，其包括：反应部，其中设置有包含氨、葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物的测试对象，其中，在所述测试对象中：作为第一反应，在谷氨酰胺合成酶的存在下使氨与ATP和L-谷氨酸反应以产生ADP；作为第二反应，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应以产生葡萄糖-6-磷酸；作为第三反应，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应以产生还原型NAD化合物；和定量部，其中对在反应部中产生的还原型NAD化合物进行定量。
<9>本发明的一个实施方式是<8>所述的氨定量装置，其中，在反应部中，使还原型NAD化合物与着色剂反应以产生色素，并且，在定量部中，对所产生的色素进行定量。
发明效果
根据本发明的一个实施方式，可以提供一种氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置，其能够在不使用磷酸作为反应底物的情况下高度灵敏地定量氨。
附图说明
图1是显示出实施例1中的氨量和K/S值之间的关系的图。
图2是图示了本发明一个实施方式的定量装置100的示意性构造图。
具体实施方式
以下描述作为本发明的一个实施方式的定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置。
在本说明书中，使用“……至……”表示的每个数值范围都是指包括分别作为下限和上限的“至”前、后的值的范围。
在本说明书中，“含氨测试液”是指包含氨或铵离子中至少一种的测试液，“氨浓度”和“氨量”分别指氨和铵离子的总浓度和总量。
在本说明书中，L-谷氨酸、磷酸和四唑化合物各自可以是盐或离子。
[氨定量方法]
本发明的一个实施方式是一种氨定量方法，所述方法包括：进行第一反应，其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP和L-谷氨酸反应，以产生ADP(腺苷二磷酸)；进行第二反应，其中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应，以产生葡萄糖-6-磷酸；进行第三反应，其中，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)化合物反应，以产生还原型NAD化合物；和对所述还原型NAD化合物进行定量以定量氨。
在本实施方式的氨定量方法中，因进行第一反应(其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP(腺苷三磷酸)和L-谷氨酸反应)而产生的磷酸并未被用作反应底物。而是使用与磷酸同时产生的ADP作为反应底物。因此，在本实施方式的氨定量方法中，可以不使用磷酸作为反应底物而高度灵敏地定量氨。
由于本实施方式的氨定量方法是通过定量最终反应产物来定量氨的终点法，因此可以简单地对反应进行控制。
由于本实施方式的氨定量方法不使用昂贵的试剂材料(例如NAD合成酶或磷酸烯醇丙酮酸)而是使用廉价的试剂材料葡萄糖，因此可以以低成本进行氨的定量。
由于本实施方式的氨定量方法在反应中不使用溶解氧，因此，可以通过例如在封闭体系中进行本实施方式的氨定量方法而避免溶解氧的影响。即使测试液和/或试剂等中含有溶解氧，反应也不太可能受溶解氧的影响，因为氨的定量是在不使用氧化酶的还原体系中进行。
在本实施方式的定量方法中，使用含有氨的测试液。测试液不受限制，只要测试液含有氨即可。测试液的实例包括含有由酶促反应产生的氨的测试液，以及含有由化学反应(例如水解)产生或释放的氨的测试液。测试液的更具体实例包括血液、血清、尿液和唾液。在本实施方式的定量方法中，氨的定量可以通过将下文所述的组分添加到待分析的测试液中来进行，或者氨的定量可以通过将含氨测试液附着到浸渍有下文所述的组分的滤纸等上来进行。
在本实施方式的定量方法中，在谷氨酰胺合成酶的存在下，使含氨测试液与ATP和L-谷氨酸反应以产生ADP(第一反应)。例如，在谷氨酰胺合成酶存在下，使含氨(NH3)测试液与ATP和L-谷氨酸反应。结果，如以下反应式(1)所示产生了ADP、正磷酸和L-谷氨酰胺。
在本实施方式的定量方法中，从高效地进行ADP合成反应的角度考虑，优选第一反应还包括镁离子(Mg2+)或锰离子(Mn2+)中的至少一种作为催化剂，以产生ADP。
在本实施方式的定量方法中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应(第二反应)。例如，通过进行第二反应(在ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)的存在下使所产生的ADP与D-葡萄糖反应)，产生了葡萄糖-6-磷酸(G6P)和AMP(腺苷一磷酸)，如以下反应式(2)所示。
随后，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)化合物反应(第三反应)。例如，通过进行第三反应(在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD(NAD+)反应)，产生了还原型NAD(NADH)和D-葡糖酸-1,5-内酯-6-磷酸(6-磷酸葡萄糖酸内酯)，如以下反应式(3)所示。
NAD化合物不限于上述NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，NAD化合物的实例还包括硫代NAD(硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯)和硫代NADP(硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯)。
如上所述，通过进行第三反应(在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应)，产生了还原型NAD化合物。通过对还原型NAD化合物(例如NADH)进行定量来定量氨。这种方法的实例包括：通过对还原型NAD化合物本身进行定量来定量氨的方法，以及通过对还原型NAD化合物与着色剂反应所获得的色素进行定量来定量氨的方法。前一种方法的实例包括：测量在产生还原型NAD化合物时所观察到的电流值的方法，以及测量由还原型NAD化合物的消耗引起的源自还原型NAD化合物的吸光度(340nm)的减小的量的方法。后一种方法的实例包括：测量由色素的产生引起的源自色素的吸光度的增加的量的方法。此处，由于还原型NAD化合物所吸收的特定波长(340nm)处的吸光度的减小(由还原型NAD化合物的消耗引起)的量与氨浓度成比例关系，并且由产生的色素吸收的特定波长处的吸光度的增加的量与氨浓度成比例关系，因此可以通过测量特定波长处的吸光度来进行氨的定量。
从色调的目视识别角度考虑，并且从即使在氨浓度低时也得到高测量准确度的角度考虑，优选的方法是通过对还原型NAD化合物与着色剂反应获得的色素进行定量来定量氨的方法。
作为选择，氨的定量可以通过测量将生成的色素附着在滤纸等上而获得的试纸的反射率来进行。例如，氨的定量可以如下进行：用含有用于定量氨的底物和酶等的液体浸渍滤纸等而获得试纸，将氨溶液附着到该试纸上，并测量附着有氨溶液的位置的反射率。
在通过定量色素来定量氨的方法的一个实例中，在电子载体心肌黄酶(DI)的存在下使产生的NADH(其为还原型NAD化合物)与着色剂四唑紫(TV)反应(第四反应)。结果，如以下反应式(4)所示产生了甲臜染料，导致560nm处的吸光度增加。
对于着色剂没有限制，只要与还原型NAD化合物反应产生色素即可，即，只要色素是通过接受来自还原型NAD化合物的电子而产生的即可。着色剂的实例包括四唑化合物。
对四唑化合物没有限制，只要该化合物具有四唑环即可。该化合物优选为在四唑环的至少两个位置上具有环状取代基的化合物。该化合物更优选为在四唑环的至少三个位置上具有环状取代基的化合物。
在四唑化合物在四唑环的至少两个位置上具有环状取代基的情况下，这些环状取代基优选位于四唑环的2位和3位。在四唑化合物在四唑环的至少三个位置上具有环状取代基的情况下，这些环状取代基优选位于四唑环的2位、3位和5位。环状取代基的实例包括可以具有取代基的苯环(苯环结构取代基)、可以具有取代基的噻吩基、以及可以具有取代基的噻唑基。
在四唑环的2位、3位和5位具有环状取代基的四唑化合物的实例包括：2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3,3'-(1,1'-联苯-4,4'-二基)-双(2,5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3,3'-[3,3'-二甲氧基-(1,1'-联苯基)-4,4'-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2,3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐，2,5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2,5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐、和2,5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐。
四唑化合物也可以是在两个位置具有苯环结构取代基并在四唑环的一个位置具有另一种环状取代基的化合物。这样的化合物的实例包括：2,3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2,2'-二苯并噻唑基-5,5'-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3'-(3,3'-二甲氧基-4,4'-亚联苯基)二四唑鎓盐、和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓盐。
四唑化合物也可以是在两个位置具有苯环结构取代基并在四唑环的一个位置具有非环状取代基的化合物。这样的化合物的实例包括：2,3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2,3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、和2,3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐。
在上述四唑化合物中，优选具有三个环状取代基的化合物。更优选的是具有三个苯环结构取代基以及吸电子性官能团的化合物。进一步优选2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
电子载体的实例包括心肌黄酶、吩嗪甲硫酸盐(或酯)、甲氧基吩嗪甲硫酸盐(或酯)和氯化二甲基氨基苯并吩噁嗪鎓(麦尔多拉蓝)。在这些电子载体中，优选心肌黄酶。
在本实施方式的定量方法中，反应温度优选为10℃至50℃，更优选为15℃至40℃，进一步优选为20℃至30℃。反应时间优选为1分钟至60分钟，更优选为2分钟至30分钟，进一步优选为5分钟至15分钟。
在本实施方式的定量方法中，缓冲剂可以用于将含氨测试液的pH调节至适于酶促反应的pH(例如，pH 6.0至9.0)。可使用的缓冲液的pH的实例包括优选为6.0至9.0、更优选为6.0至8.0的pH。缓冲液的实例包括：Good氏缓冲液，例如N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)和N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)；磷酸盐缓冲液；咪唑酸缓冲液；Tris缓冲液；和甘氨酸缓冲液。
在本实施方式的定量方法中，必要时可以向含氨测试液中添加上述组分以外的其他组分。其他组分的实例包括表面活性剂、防腐剂和稳定剂。
[定量试剂盒和测试片]
本发明的一个实施方式是一种定量试剂盒，其包含：包含葡萄糖的第一试剂；和包含谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的第二试剂，其中，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物各自独立地包含在第一试剂或第二试剂中的至少一个中。本实施方式的定量试剂盒用于例如定量氨。本实施方式的定量试剂盒可用于对除氨以外的其他目标进行定量。
本发明的一个实施方式是一种测试片，其包含：葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸、和氧化型NAD化合物。本实施方式的测试片用于例如定量氨。本实施方式的测试片可用于对除氨以外的其他目标进行定量。
因此，使用本实施方式的定量试剂盒和测试片，能够在不使用磷酸作为反应底物的情况下高度灵敏地定量氨(氨和铵离子的总体)。
在本实施方式的定量试剂盒中，从避免试剂中的底物与酶反应的角度考虑，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物优选包含在第一试剂中。
在本实施方式的定量试剂盒中，从定量由还原型NAD化合物与着色剂反应而获得的色素以定量氨的角度考虑，第一试剂优选还含有着色剂，且第二试剂优选还含有电子载体。
本实施方式的定量试剂盒中的第一试剂和第二试剂以及测试片可以含有缓冲剂和/或氨定量方法中描述的其它组分。因为本实施方式的定量试剂盒和测试片中的着色剂和电子载体与氨定量方法中描述的着色剂和电子载体相同，因此省略了对该着色剂和电子载体的描述。本实施方式的测试片可以是滤纸等，和/或可以是浸渍有组分的滤纸等。
[氨定量装置]
本发明的一个实施方式是一种氨定量装置，所述装置：进行第一反应，其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP和L-谷氨酸反应，以产生ADP；进行第二反应，其中，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应，以产生葡萄糖-6-磷酸；进行第三反应，其中，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应，以产生还原型NAD化合物；并对所述还原型NAD化合物进行定量以定量氨。
在本实施方式的氨定量装置中，因进行第一反应(其中，在谷氨酰胺合成酶的存在下使含氨测试液与ATP(腺苷三磷酸)和L-谷氨酸反应)而产生的磷酸并未被用作反应底物。而是使用与磷酸同时产生的ADP作为反应底物。因此，在本实施方式的氨定量装置中，可以不使用磷酸作为反应底物而高度灵敏地定量氨。
本实施方式的定量装置的具体实例在下文描述。本实施方式的定量装置的具体实例是下述定量装置，其包括：反应部，其中设置有包含氨、葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物的测试对象，其中，在所述测试对象中：作为第一反应，在谷氨酰胺合成酶的存在下使氨与ATP和L-谷氨酸反应以产生ADP；作为第二反应，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应以产生葡萄糖-6-磷酸；作为第三反应，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应以产生还原型NAD化合物；和定量部，其中对所述还原型NAD化合物进行定量。例如，如图2所述，本发明的一个实施方式的定量装置100可以至少具有用于执行上述反应的反应部1、和用于定量由反应部1中的反应产生的还原型NAD化合物的定量部2。
具体实例的定量装置具有上述反应部。该反应部具有可以在其中设置测试对象的构造。例如，反应部可以具有以下构造，其包含：设置有储存待测测试液的血液收集管或尿液收集管等的场所；储存测试液的容器；浸渍有用于定量氨的组分的滤纸，其上附着有含氨测试液；等等。
该反应部优选具有以下构造：通过该构造可以控制反应条件(反应温度和/或测试液的pH值等)，从而可以使反应式(1)至反应式(3)中所示的上述反应高效地进行。
具体实例的定量装置具有定量部，其中对在反应部中产生的还原型NAD化合物进行定量。定量部具有通过定量还原型NAD化合物本身来定量氨的构造，以及通过定量还原型NAD化合物与着色剂反应所获得的色素来定量氨的构造。
在定量部通过定量反应部中产生的还原型NAD化合物本身来定量氨的情况下，优选的是，定量部测量在产生还原型NAD化合物时所观察到的电流值，或定量部测量由还原型NAD化合物的消耗引起的源自还原型NAD化合物的吸光度(340nm)减小的量。
在定量部通过定量还原型NAD化合物与着色剂反应所获得的色素来定量氨的情况下，优选的是，反应部具有使还原型NAD化合物与着色剂反应以产生色素的构造，并且定量部具有对反应部中产生的色素进行定量的构造。在这种情况下，定量部优选测量因色素的产生而引起的源自色素的吸光度的增加的量。
在定量部通过定量还原型NAD化合物与着色剂反应所获得的色素来定量氨的情况下，定量部可以具有在其中测量附着有色素的试纸的反射率的构造。
在本实施方式的定量装置中待分析的含氨测试对象还可以含有催化剂、缓冲剂和/或上文在氨定量方法中描述的其它组分。
含氨和上述组分的测试对象可以预先提供，并且本实施方式的定量装置可以具有将所提供的测试对象设置在反应部中的构造。
本实施方式的定量装置还可以具有用于储存定量试剂、用于储存第一试剂和第二试剂、或用于储存上述组分的储存部，并且可以具有将试剂或组分供应至设置在反应部中的含氨测试液的构造。作为选择，本实施方式的定量装置可以具有如下构造：其中，使含氨测试液附着到设置在反应部中的浸渍有用于定量氨的组分的滤纸等上。
实施例
下文通过实施例来描述本发明的一个实施方式，但本发明并不限于这些实施例。
[实施例1]
制备了以下浸渍液1和浸渍液2，并提供了滤纸。
<浸渍液1>
TES-氢氧化钠缓冲液(由Dojindo Molecular Technologies,Inc.制造，pH 7.0)150mmol/L
L-谷氨酸钠(由Nacalai Tesque,Inc.制造)15mmol/L
氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(由Roche制造)15mmol/L
腺苷三磷酸(由Roche制造)15mmol/L
六水合氯化镁75mmol/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(由Toyobo Co.,Ltd.制造)80U/mL
心肌黄酶(由Asahi Kasei Corporation制造)50U/ml
ADP依赖性己糖激酶(由Asahi Kasei Corporation制造)40U/ml
谷氨酰胺合成酶(由Kikkoman Co.,Ltd.制造)45U/mL
<浸渍液2>
一水合葡萄糖(由Merck制造)25mmol/L
四唑紫(由Dojindo Molecular Technologies,Inc.制造)15mmol/L
<滤纸>
3MM HP(由Whatman制造)
随后，用浸渍液1浸渍滤纸，然后在50℃下干燥25分钟。接着，用浸渍液2浸渍已浸渍有浸渍液1的滤纸，然后在50℃下干燥10分钟，获得测试片。在所得的测试片上，用具有图1所示的氨浓度的氨水溶液进行点样，随后将测试片在常温下放置约10分钟，随后读取各氨水溶液的点样位置处的反射率(560nm)，并将反射率转换为下面的K/S值。
K/S值＝(1-R)2/2R(Kubelka-Munk方程；R表示反射率)
如图1所示，可以在氨浓度和560nm处的K/S值之间获得良好的线性关系。
因此，本实施例表明可以高度灵敏地定量氨。
附图标记
1.反应部
2.定量部
100.定量装置

Claims (5)

1.一种氨定量测试片，其包含：葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸、和氧化型NAD化合物，
所述测试片通过以下方式制备：
用第二试剂浸渍滤纸，并干燥，随后用第一试剂浸渍滤纸并干燥，
第一试剂包含葡萄糖；
第二试剂包含谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，
其中，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物各自独立地包含在第一试剂或第二试剂中的至少一个中。
2.如权利要求1所述的氨定量测试片，其中，ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物包含在第二试剂中。
3.如权利要求1所述的氨定量测试片，其中，
第一试剂还包含着色剂，并且
第二试剂还包含电子载体。
4.一种氨定量装置，其具备权利要求1或2所述的测试片，其中，所述氨定量装置包括：
反应部，其中设置有所述测试片，所述测试片是包含氨、葡萄糖、谷氨酰胺合成酶、ADP依赖性己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP、L-谷氨酸和氧化型NAD化合物的测试对象，其中，在所述测试对象中：作为第一反应，在谷氨酰胺合成酶的存在下使氨与ATP和L-谷氨酸反应以产生ADP；作为第二反应，在ADP依赖性己糖激酶的存在下使所产生的ADP与葡萄糖反应以产生葡萄糖-6-磷酸；作为第三反应，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的存在下使所产生的葡萄糖-6-磷酸与氧化型NAD化合物反应以产生还原型NAD化合物；和
定量部，其中对在反应部中产生的还原型NAD化合物进行定量。
5.如权利要求4所述的氨定量装置，其中：
在反应部中，使还原型NAD化合物与着色剂反应以产生色素，并且，
在定量部中，对所产生的色素进行定量。
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