JPS584915B2 - アデノシンジホスフェ−トを測定する方法 - Google Patents
アデノシンジホスフェ−トを測定する方法Info
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- JPS584915B2 JPS584915B2 JP54100322A JP10032279A JPS584915B2 JP S584915 B2 JPS584915 B2 JP S584915B2 JP 54100322 A JP54100322 A JP 54100322A JP 10032279 A JP10032279 A JP 10032279A JP S584915 B2 JPS584915 B2 JP S584915B2
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- kinase
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアデノシンジホスフエート(ADP)を水溶液
中の酵素によって定量測定するための方法に関する。
中の酵素によって定量測定するための方法に関する。
生化学においては以前からADPの測定及びADPを生
成する反応の測定に大きな関心が持たれている。
成する反応の測定に大きな関心が持たれている。
ADP形成はATP変換の尺度、すなわち生体の中心的
なエネルギー運搬体の評価の尺度である。
なエネルギー運搬体の評価の尺度である。
しかし臨床化学においても心臓、肝臓及び腎臓の病気を
診断する際にADP−測定が重要である。
診断する際にADP−測定が重要である。
ADP生成反応の経過におけるADP検出は生化学及び
臨床化学において同様に重要である。
臨床化学において同様に重要である。
本明細書においてピルバートキナーゼ及びクレアチンキ
ナーゼの検出を酵素測定と、かつクレアチニン及びグリ
セリン検出を代謝産物測定と名づける。
ナーゼの検出を酵素測定と、かつクレアチニン及びグリ
セリン検出を代謝産物測定と名づける。
したがって生理的液体、例えば血清、組織、細菌で汚染
された水性物質又は他の水性液体中のADPの測定は大
きな実地的な意味を有する。
された水性物質又は他の水性液体中のADPの測定は大
きな実地的な意味を有する。
ADPの酵素による検出には3つの異なる方法が使用さ
れた。
れた。
第一の方法はADPをPEP(ホスホエノールピルベー
ト)及びPK(ピルバートキナーゼ)でホスホリル化し
てATPとし、かつ先成するピルベートをNADH/L
DH(ラクタートデヒドロゲ゛ナーゼ)で検出する。
ト)及びPK(ピルバートキナーゼ)でホスホリル化し
てATPとし、かつ先成するピルベートをNADH/L
DH(ラクタートデヒドロゲ゛ナーゼ)で検出する。
この力法は以前から公知であり、”ネーチュア( Na
ture )”誌(178巻、632頁。
ture )”誌(178巻、632頁。
1956年)に記載されている。
他の2方法も同様にADPを例えばクレアチンホスフエ
ート及びCKでホスホリル化し、かつ形成されるATP
を検出することに基づく。
ート及びCKでホスホリル化し、かつ形成されるATP
を検出することに基づく。
PGKニホスホグリセリンキナーゼ
GAPDH−グリセリンアルデヒドホスファートデヒド
ロゲナーゼ この反応も以前から公知であり、BBA(ビオヒミカ・
工・ビオフイジ力・アクタ)″(第1巻、292頁。
ロゲナーゼ この反応も以前から公知であり、BBA(ビオヒミカ・
工・ビオフイジ力・アクタ)″(第1巻、292頁。
1947年)に記載されていいる。
HK−へキソキナーゼ
G−6−PDHニグルコース−6−ホスファートデヒド
ロゲナーゼ この反応は既に少なくとも1955年から使用され、例
えば“メソツヅ・オブ・エンチーム( Methods
of E nzym ) ” (第2巻、497頁
。
ロゲナーゼ この反応は既に少なくとも1955年から使用され、例
えば“メソツヅ・オブ・エンチーム( Methods
of E nzym ) ” (第2巻、497頁
。
コーンベルク( A − Kom berg )著〕に
記載されている。
記載されている。
ところでこれらの方法はその使用を困難にする、あるい
は高い費用につかせる種々の欠点を持っている。
は高い費用につかせる種々の欠点を持っている。
Aによる検出はATPからADPを生成する反応の指示
系として用いるのに原則的には適し、かつその目的には
成功したのだが、NADH吸光の減少が認められる。
系として用いるのに原則的には適し、かつその目的には
成功したのだが、NADH吸光の減少が認められる。
かかる試験では測定技術的な理由からNADHで限定さ
れた初期吸光が存在し得るにすぎない。
れた初期吸光が存在し得るにすぎない。
その結果使用される指示酵素LDHがその基質NADH
で飽和されず、したがってその最犬の反応速度が得られ
ない。
で飽和されず、したがってその最犬の反応速度が得られ
ない。
これを酵素の投入量を高めることにより調整しなくては
ならない。
ならない。
これは非経済的であるのみならず、他の障害的な酵素活
性が試験系中に大きな程度で入り込む危険も包含する。
性が試験系中に大きな程度で入り込む危険も包含する。
もう一つの欠点は、完全な変換が始まる前に高いADP
濃度でNADHが既に消費される可能性から生じる。
濃度でNADHが既に消費される可能性から生じる。
その場合には誤って低い値が測定される。
力法Bのより重大な欠点は、先行の指示反応の原理によ
り一定量のADPが化学量論的に算定可能なNADH形
成の原因となるのであるが、整数の化学量論的数量が存
在しないので、計算がきわめて複雑であることである。
り一定量のADPが化学量論的に算定可能なNADH形
成の原因となるのであるが、整数の化学量論的数量が存
在しないので、計算がきわめて複雑であることである。
その上に、ATPの存在が平衡の付加的な変化の原因と
なり、このことが計算を更に困難にする。
なり、このことが計算を更に困難にする。
したがってこの方法は実地では殆ど使用されていない。
更には後続のホルマザン反応による測定シグナルの強化
が可能ではない。
が可能ではない。
方法Cは前記の欠点を持たない。
その代わりに他の2つの欠点を持つ。
方法Cは、ADPをホスホリル化してATPにし、次い
でこのATPを検出することより成るので、この方法が
組合せ試験でATPから形成されるADPを検出するの
には適当ではないことは明白である。
でこのATPを検出することより成るので、この方法が
組合せ試験でATPから形成されるADPを検出するの
には適当ではないことは明白である。
下記で詳説されるように、ATPからADPを生成する
多数の反応を測定することが重要である。
多数の反応を測定することが重要である。
しかしこの検出には常に同一の指示系を使用するように
しなければならない。
しなければならない。
それというのも産生バッチを大きくすればするほど、必
要とする酵素及び試薬をそれだけ有利に産生することが
できるからである。
要とする酵素及び試薬をそれだけ有利に産生することが
できるからである。
更に測定をUV一光で実施するのは基本的には不利であ
る、それというのもUV一光中で測定するための装置は
可視光中の測定のための装置よりも常に著しく高価であ
るからである。
る、それというのもUV一光中で測定するための装置は
可視光中の測定のための装置よりも常に著しく高価であ
るからである。
したがって本発明の課題は、公知方法の欠点を持たない
、ADPの測定方法を見出すことである。
、ADPの測定方法を見出すことである。
特に本発明の目的は、短かい測定時間と吸収増加又は酵
素測定の際には1分当りの吸収増加のある恒温保持のみ
とを必要とし、より簡単な光度測定装置を利用し得るた
めに可視光線中での測定を可能にし、かつ同時にATP
からADPを生成する種々の反応に適用することのでき
る方法を見出すことである。
素測定の際には1分当りの吸収増加のある恒温保持のみ
とを必要とし、より簡単な光度測定装置を利用し得るた
めに可視光線中での測定を可能にし、かつ同時にATP
からADPを生成する種々の反応に適用することのでき
る方法を見出すことである。
該課題は本発明によりキナーゼを用いて該キナーゼに対
するホスホリル化された基質の存在でATP及び脱ホス
ホリル化された基質の形成下にホスホリル化することに
より水溶液中のアデンシンジホスフエート(ADP)を
酵素によって定量測定する方法により解決され、該方法
は脱ホスホリル化された基質を、場合によりもう一つの
助反応を介在させ、デヒドロゲナーゼの存在でNAD(
P)と反応させ、かつ形成されるNAD(P)Hを直接
測定するか又は電子逓伝体の存在でホルマザンの形成下
にテトラゾリウム塩と反応させ、かつホルマザンを測定
することより成る。
するホスホリル化された基質の存在でATP及び脱ホス
ホリル化された基質の形成下にホスホリル化することに
より水溶液中のアデンシンジホスフエート(ADP)を
酵素によって定量測定する方法により解決され、該方法
は脱ホスホリル化された基質を、場合によりもう一つの
助反応を介在させ、デヒドロゲナーゼの存在でNAD(
P)と反応させ、かつ形成されるNAD(P)Hを直接
測定するか又は電子逓伝体の存在でホルマザンの形成下
にテトラゾリウム塩と反応させ、かつホルマザンを測定
することより成る。
したがって本発明による方法の基本思想はNADHが消
費される反応と関連する従来の方汐法と異なり、逆にN
AD又はNADPを還元してNADHもしくはNADP
Hにする反応と関連することである。
費される反応と関連する従来の方汐法と異なり、逆にN
AD又はNADPを還元してNADHもしくはNADP
Hにする反応と関連することである。
本発明の方法に関して多数の実施形が可能である。
それというのも数種のかかる反応は定量的な反応経過と
組合わせ可能であることが判明したからである。
組合わせ可能であることが判明したからである。
しかしながらADPをホスホリル化してATPとする第
一反応の燐を含まない基質を直接NAD又はNADP及
びデヒドロゲナーゼと反応させることは必ずしも可能で
はない。
一反応の燐を含まない基質を直接NAD又はNADP及
びデヒドロゲナーゼと反応させることは必ずしも可能で
はない。
かかる場合には助反応、特に脱カルボキシル化反応、ア
ミノ基転移反応又はヘキソース又はペントースとのカッ
プリングを介在させなければならない。
ミノ基転移反応又はヘキソース又はペントースとのカッ
プリングを介在させなければならない。
同様に形成されるNAD(P)を直接測定せず、色素に
変えるのが屡々有利であり、その際好適なテトラゾリウ
ム塩と電子逓伝体、例えばジアホラーゼの存在で反応さ
せて相応する着色したホルマザンとし、かつ得られる色
を測定する。
変えるのが屡々有利であり、その際好適なテトラゾリウ
ム塩と電子逓伝体、例えばジアホラーゼの存在で反応さ
せて相応する着色したホルマザンとし、かつ得られる色
を測定する。
好適なテトラゾリウム塩及び電子逓伝体は当業者には公
知である。
知である。
ここでは単に例えば次のものを挙げる:3−(4.5−
ジメチルチアゾリル−2)−2,5−ジフエニルテトラ
ゾリウムブロミド、ニトロブルー、テトラゾリウムクロ
リド及び2−(p−ヨードフエニル) − 3 − (
p−ニトロフエニル)−5−フエニルーテトラソリウム
クロリド。
ジメチルチアゾリル−2)−2,5−ジフエニルテトラ
ゾリウムブロミド、ニトロブルー、テトラゾリウムクロ
リド及び2−(p−ヨードフエニル) − 3 − (
p−ニトロフエニル)−5−フエニルーテトラソリウム
クロリド。
本発明の方法の優れた実施形によれば、ガラクトースキ
ナーゼ及びガラクトースデヒドロゲナーゼを用いて次の
式により明らかである反応順序で実施される: Gal−1−p=ガラクトース−1−ホスフエートGa
l−キナーセ゛=ガラクトースーキナーゼGal−DH
=ガラクトースーデヒドロゲナーゼこれらの式は以前か
ら公知である〔゜゛バイオケミカル・ジャーナル( B
iochem.J− ) ”第44巻、460頁(19
49年)及び0ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリ(JLBiol.Chem−)’一第227巻
、745頁(1957年)〕。
ナーゼ及びガラクトースデヒドロゲナーゼを用いて次の
式により明らかである反応順序で実施される: Gal−1−p=ガラクトース−1−ホスフエートGa
l−キナーセ゛=ガラクトースーキナーゼGal−DH
=ガラクトースーデヒドロゲナーゼこれらの式は以前か
ら公知である〔゜゛バイオケミカル・ジャーナル( B
iochem.J− ) ”第44巻、460頁(19
49年)及び0ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリ(JLBiol.Chem−)’一第227巻
、745頁(1957年)〕。
しかしながら意想外にも前記の反応を相互にかつATP
からADPを形成する反応と組合せることができること
が判明した。
からADPを形成する反応と組合せることができること
が判明した。
これにより形成されるNADHによる吸収増加がADP
の量の尺度となり、組合わされる、ATPからADPを
形成する反応で酵素活性を測定する場合には形成される
NADHによる単位時間当りの吸収増加が目的の酵素活
性の尺度となる。
の量の尺度となり、組合わされる、ATPからADPを
形成する反応で酵素活性を測定する場合には形成される
NADHによる単位時間当りの吸収増加が目的の酵素活
性の尺度となる。
かかる組合せは、20年以上も昔から任意の方法により
ADPを測定することが探求され、かつ反応も久しく知
られていたことから明らかであるように、従来は可能で
あると思われていなかった。
ADPを測定することが探求され、かつ反応も久しく知
られていたことから明らかであるように、従来は可能で
あると思われていなかった。
特に有利には電子逓伝体の存在でテトラゾリウム塩を用
いて着色ホルマザンの同時形成下に、形成されたNAD
Hの逆酸化をする反応を更に後接続する。
いて着色ホルマザンの同時形成下に、形成されたNAD
Hの逆酸化をする反応を更に後接続する。
ホルマザンは可視光線中で容易に測定することができる
。
。
この反応は次の式に相当する:
電子逓伝体としては前記のジアホラーゼが優れている。
しかし当業者に公知の他の電子逓伝体も使用することが
できる。
できる。
その際特にフエナジンメトスルフエート(PMS)及び
フエナントロリンメトスルホネートがきわめて好適であ
ると示された。
フエナントロリンメトスルホネートがきわめて好適であ
ると示された。
テトラゾリウム塩としては前記のMTTが優れている。
しかし他のテトラゾリウム塩も使用することができる。
良好な結果は特にニトロブルーテトラゾリウムクロリド
(NET)及び2一(p−ヨードフエニル)−3−(p
−ニトロフエニル)−5フエニルーテトラツリウムクロ
リド(INT)を用いても達成される。
(NET)及び2一(p−ヨードフエニル)−3−(p
−ニトロフエニル)−5フエニルーテトラツリウムクロ
リド(INT)を用いても達成される。
テトラゾリウム塩の選択は形成されるホルマザン色素の
溶解性を考慮して行なう。
溶解性を考慮して行なう。
ホルマザン色素が小さな溶解性を持つ場合には高いAD
P一濃度で色素の沈澱が起る場合があり、これは測定困
難に導く。
P一濃度で色素の沈澱が起る場合があり、これは測定困
難に導く。
このことから本発明方法をホルマザン色素の測定下に実
施する際には有利に色素の溶解性挙動を改良する界面活
性剤を添加する。
施する際には有利に色素の溶解性挙動を改良する界面活
性剤を添加する。
好適な界面活性剤の例はデソキシコール酸、サポニン、
アルキルアリールーポリエチレングリコールエステル及
びエーテル、ソルビタンエステル、例えばソルビマクロ
ゴロエート、ポリエチレングリコールラウリルエーテル
等である。
アルキルアリールーポリエチレングリコールエステル及
びエーテル、ソルビタンエステル、例えばソルビマクロ
ゴロエート、ポリエチレングリコールラウリルエーテル
等である。
界面活性剤の濃度は試験中で一般に0.3〜3%である
。
。
許容可能な変動範囲
緩衝液の種類は重要ではない。
例えばトリス緩衝液、トラ(TRA)緩衝液、イミダゾ
ール緩衝液、サクシネート緩衝液、グリシン緩衝液、グ
リシクルグリシン緩衝液が好適である。
ール緩衝液、サクシネート緩衝液、グリシン緩衝液、グ
リシクルグリシン緩衝液が好適である。
緩衝液濃度 0.005〜0.5モル/lpH
6〜10.5 Gal−キナーゼ 0.1〜20U/TrLlGal
−DH 0.05 〜20U/ml本発明の下
記に記載する他の実施形はホルマザン形成と組合せるこ
とができる。
6〜10.5 Gal−キナーゼ 0.1〜20U/TrLlGal
−DH 0.05 〜20U/ml本発明の下
記に記載する他の実施形はホルマザン形成と組合せるこ
とができる。
これらの反応のいくつかでは組合せる方が平衡の理由か
ら有利でさえある。
ら有利でさえある。
次に他の実施形を記載する。F−DH=ホルマートーデ
ヒドロゲナーゼ許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Dの記載が該当す
る。
ヒドロゲナーゼ許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Dの記載が該当す
る。
pH 6。
θ〜10.0ホルマートキナーゼ゛0.05〜50U/
rILlホルマート−DH 0.1〜100U/ml許
容し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度:実施形Dの記載が該当 pH 4.5〜7.5PK
0.0 5〜5 0U/mlAl− DH
0.0 5 〜5 0U/mJPyr−D
C 0.0 5〜5 0U/m1本発明による
方法の次の実施形が特に優れている。
rILlホルマート−DH 0.1〜100U/ml許
容し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度:実施形Dの記載が該当 pH 4.5〜7.5PK
0.0 5〜5 0U/mlAl− DH
0.0 5 〜5 0U/mJPyr−D
C 0.0 5〜5 0U/m1本発明による
方法の次の実施形が特に優れている。
GPT グルタマートーピルバートトランスアミナー
ゼ゛ α一KG−α−ケトグルタレート SS−AI−DH−サクシネートセミアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ 許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Dの記載が該当 pH 6、0〜10.5 PK ,GOT ,GAB−GT ,SS−AI 一D
Hそれぞれ0.05〜50U/ml 最後に次の実施形も同様に優れている。
ゼ゛ α一KG−α−ケトグルタレート SS−AI−DH−サクシネートセミアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ 許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Dの記載が該当 pH 6、0〜10.5 PK ,GOT ,GAB−GT ,SS−AI 一D
Hそれぞれ0.05〜50U/ml 最後に次の実施形も同様に優れている。
NDPK ヌクレオシドジホスファートキナーゼ許容
し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度は実施形Dの記載が該当.pH
6〜10.5 UDPG O.0 1〜1 5U/ml
NDPK 1〜50U/TLlサツカ
ロースーSynt. 0.05 〜IOU/ml実施
形の実施の詳細は下記の実施例で記載す.る。
し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度は実施形Dの記載が該当.pH
6〜10.5 UDPG O.0 1〜1 5U/ml
NDPK 1〜50U/TLlサツカ
ロースーSynt. 0.05 〜IOU/ml実施
形の実施の詳細は下記の実施例で記載す.る。
既述した様に本発明の方法はATPからADPを形成す
る反応に対して特に有利である。
る反応に対して特に有利である。
次の表に本発明を適用することのできる、測定すべきA
DPをATPから形成する酵素及び基質の例を挙げる。
DPをATPから形成する酵素及び基質の例を挙げる。
実施例で詳説するが、この場合にも組合せた反応を挙げ
ることができる。
ることができる。
酵素も記載の基質もそれぞれ本発明により測定可能であ
る。
る。
個々にどの本発明による方法を適用すベきかは、証明す
べき反応に本質的には左右されない。
べき反応に本質的には左右されない。
表1
酵素 (EC屑) 基質
ヘキソキナーゼ 2.7.1.I ATP/ヘキソ
ースダルコキナーゼ 2・7・1・2 ATP/グレ
コースf フルクトキナーゼ 2・7・1.4 ATP/フルク
トースガ゛ラクトキナーセ゛ 2・7・1・6 AT
P/ガラクトースマンノキナーゼ゛ 2.7.1.7
ATP/マンノースグ)レコサミンキナ 2.7.
1.8 ATP/2−アミノー2一一ゼ゛
デソキシーD−クラレコース
ホスホグ)レコキナ 2.7.1.10 ATP/グ>
L/:l−スー1一一ゼ゛ P ホスホフルクトキナ 2.7.1.11 ATP/フル
クトース−6一ゼ ーP ク゛)レコノキサー〜ビ 2.7.1.12 AT
P/D−ク)レコネートアデノシンキナービ 2.7.
1.20 ATP/’7’デノシンNAD キナーゼ, 2.7.1.23 ATP/N
ADグリセリンキナーゼ゛ 2.7.1.30 ATP
/ク刃セリングリセラートキナ− 2.7.1.31
ATP/ク刃セレートゼ コリンキナーゼ゛ 2.7.1.32 ATP/コ
リンピL//+−トキナーゼ2.7.1.40 ATP
/ビルベートク゛)レクロノキナーゼ 2.7.1.4
3 ATP/クラレクロネートガラクトロノキナ−
2.7.1.44 ATP/ガラクトロネートゼ゛ アラビノキナーゼ 2.7.1.54 ATP/アラ
ビノースマニトールキナ− 2.7.1.57 ATP
/マンニットセ゛ イノシンキナーゼ 2.7.1.73 ATP/イノシ
ンアセタートキナー 2.7.2.I ATP/アセ
テートゼ カルバマートキナ2.7.2.2 ATP/NH3/
Co2一ゼ アスパラートキナ 2.7.2.4 ATP/アスパ
レートーゼ カルバモイルホス ファートジンタ− 2.7.2.5 2ATP/NH3
/CO2ゼ /H20酵素
(EC/16) 基質 ?ルマートキナーゼ 2.7.2.6 ATP/ホル
メートカルバモイルホスフ 2.7.2.9 2AT
P/グルタミンアートジンターゼ /CO
/H20グアニジノアセタ− 2.7.3.I AT
P/グアニジンアトキナーゼ セテ
ートクレアチンキナーゼ 2.7.3.2 ATP/
クイアチンアルギニンキナーゼ 2.7.3.3 AT
P/L−アルギニンアンモニアキナーゼ 2.7.3.
8 ATP/NH3ポリホスファートキ 2.7.4
.I ATP/(ホスフエナーゼ
ート) アデニラートキナー 2.7.4.3 ATP/AM
Pゼ゛ ヌクレオシドモノホ 2.7.4.4 ATP/ヌク
レオシドスファートキナーゼ゛ モノホスフ
エートヌクレオシドホスフ 2.7.4.5 ATP
/ヌクレオシドアートキナーゼ ジホス
フエートグアニラートキナ− 2.7.4.6 AT
P/GMPゼ シチジラートキナ− 2.7.4.14ATP/CMP
ゼ サクシニルーCoA− 6.2.1.5 ATP/サ
クシネートジンテターゼ /CoA グルタリルーCoA 6.2.1.6 ATP/グ
ルタレートージンテターゼ /CoA マリルーCoA−ジ 6.2.1.9 ATP/マレ
ート/ンテターゼ CoA ク)レタミンージンテタ 6.3.1.2 ATP/
グ)レタメ一一トーゼ /NH
3 アスパラギンージン 6.3.1.4 ATP/アス
パルテーテターゼ ト/NH3
γ−グルタミル・−シ 6.3.2.2 ATP/グ
ルタメートステインージンテタ /システイ
ンーゼ グ)レタチオンージン 6.3.2.3 ATP/γ
−グ)レクミルテターゼ −
システイン/グリ〃D−アラニルアラニ 6.3.2.
4 ATP/2D−アラニンージンテターゼ
ン 尿素カルボキシラー’6.3.4.6 ATP/尿素
/CO2ゼ ピルバートカルボキ 6.4.1.1 ATP/ピル
ベート/シラーゼ H20/C02酵素
(EC廃) 基質 5′−ヌクレオシ 3.1.3.5 ATP/A
SN/ダーゼ NH
3/ク゛)レクメートアデノシンデア 3.5.4.4
ATP/ASN/ミナーゼ
■SN/NH3/−ク゛)レタメート 本発明の方法において、キナーゼ、該キナーゼに対する
、ATP以外のホスホリル化された基質及び緩街液を含
有する、ADPを測定するための試薬が使用され、該試
薬は脱ホスホリル化された形状の前記基質に対して又は
そのアミノ基転移された、脱カルボキシル化された、又
はヘキソース添加された生成物に対して特異的なデヒド
ロゲナーゼ及ひNAD(P)を包含することより成る。
ースダルコキナーゼ 2・7・1・2 ATP/グレ
コースf フルクトキナーゼ 2・7・1.4 ATP/フルク
トースガ゛ラクトキナーセ゛ 2・7・1・6 AT
P/ガラクトースマンノキナーゼ゛ 2.7.1.7
ATP/マンノースグ)レコサミンキナ 2.7.
1.8 ATP/2−アミノー2一一ゼ゛
デソキシーD−クラレコース
ホスホグ)レコキナ 2.7.1.10 ATP/グ>
L/:l−スー1一一ゼ゛ P ホスホフルクトキナ 2.7.1.11 ATP/フル
クトース−6一ゼ ーP ク゛)レコノキサー〜ビ 2.7.1.12 AT
P/D−ク)レコネートアデノシンキナービ 2.7.
1.20 ATP/’7’デノシンNAD キナーゼ, 2.7.1.23 ATP/N
ADグリセリンキナーゼ゛ 2.7.1.30 ATP
/ク刃セリングリセラートキナ− 2.7.1.31
ATP/ク刃セレートゼ コリンキナーゼ゛ 2.7.1.32 ATP/コ
リンピL//+−トキナーゼ2.7.1.40 ATP
/ビルベートク゛)レクロノキナーゼ 2.7.1.4
3 ATP/クラレクロネートガラクトロノキナ−
2.7.1.44 ATP/ガラクトロネートゼ゛ アラビノキナーゼ 2.7.1.54 ATP/アラ
ビノースマニトールキナ− 2.7.1.57 ATP
/マンニットセ゛ イノシンキナーゼ 2.7.1.73 ATP/イノシ
ンアセタートキナー 2.7.2.I ATP/アセ
テートゼ カルバマートキナ2.7.2.2 ATP/NH3/
Co2一ゼ アスパラートキナ 2.7.2.4 ATP/アスパ
レートーゼ カルバモイルホス ファートジンタ− 2.7.2.5 2ATP/NH3
/CO2ゼ /H20酵素
(EC/16) 基質 ?ルマートキナーゼ 2.7.2.6 ATP/ホル
メートカルバモイルホスフ 2.7.2.9 2AT
P/グルタミンアートジンターゼ /CO
/H20グアニジノアセタ− 2.7.3.I AT
P/グアニジンアトキナーゼ セテ
ートクレアチンキナーゼ 2.7.3.2 ATP/
クイアチンアルギニンキナーゼ 2.7.3.3 AT
P/L−アルギニンアンモニアキナーゼ 2.7.3.
8 ATP/NH3ポリホスファートキ 2.7.4
.I ATP/(ホスフエナーゼ
ート) アデニラートキナー 2.7.4.3 ATP/AM
Pゼ゛ ヌクレオシドモノホ 2.7.4.4 ATP/ヌク
レオシドスファートキナーゼ゛ モノホスフ
エートヌクレオシドホスフ 2.7.4.5 ATP
/ヌクレオシドアートキナーゼ ジホス
フエートグアニラートキナ− 2.7.4.6 AT
P/GMPゼ シチジラートキナ− 2.7.4.14ATP/CMP
ゼ サクシニルーCoA− 6.2.1.5 ATP/サ
クシネートジンテターゼ /CoA グルタリルーCoA 6.2.1.6 ATP/グ
ルタレートージンテターゼ /CoA マリルーCoA−ジ 6.2.1.9 ATP/マレ
ート/ンテターゼ CoA ク)レタミンージンテタ 6.3.1.2 ATP/
グ)レタメ一一トーゼ /NH
3 アスパラギンージン 6.3.1.4 ATP/アス
パルテーテターゼ ト/NH3
γ−グルタミル・−シ 6.3.2.2 ATP/グ
ルタメートステインージンテタ /システイ
ンーゼ グ)レタチオンージン 6.3.2.3 ATP/γ
−グ)レクミルテターゼ −
システイン/グリ〃D−アラニルアラニ 6.3.2.
4 ATP/2D−アラニンージンテターゼ
ン 尿素カルボキシラー’6.3.4.6 ATP/尿素
/CO2ゼ ピルバートカルボキ 6.4.1.1 ATP/ピル
ベート/シラーゼ H20/C02酵素
(EC廃) 基質 5′−ヌクレオシ 3.1.3.5 ATP/A
SN/ダーゼ NH
3/ク゛)レクメートアデノシンデア 3.5.4.4
ATP/ASN/ミナーゼ
■SN/NH3/−ク゛)レタメート 本発明の方法において、キナーゼ、該キナーゼに対する
、ATP以外のホスホリル化された基質及び緩街液を含
有する、ADPを測定するための試薬が使用され、該試
薬は脱ホスホリル化された形状の前記基質に対して又は
そのアミノ基転移された、脱カルボキシル化された、又
はヘキソース添加された生成物に対して特異的なデヒド
ロゲナーゼ及ひNAD(P)を包含することより成る。
該試薬は付加的にテトラゾリウム塩及び好適な電子逓伝
体並びに場合により界面活性剤又は/及びATPからA
DPを形成するための系並びにその都度使用される酵素
により必要とされる塩を含有していてよい。
体並びに場合により界面活性剤又は/及びATPからA
DPを形成するための系並びにその都度使用される酵素
により必要とされる塩を含有していてよい。
ATPからADPを形成するための系はATPとその都
度ADP形成下に測定し得る、ATPに対して特異的な
キナーゼとから、又は該キナーゼの活性の測定に使用す
る場合にはATPと該キナーゼの第二の基質とから成る
。
度ADP形成下に測定し得る、ATPに対して特異的な
キナーゼとから、又は該キナーゼの活性の測定に使用す
る場合にはATPと該キナーゼの第二の基質とから成る
。
本発明による試薬は無水の親液化された形状で又は即使
用可能な水溶液で存在し得る。
用可能な水溶液で存在し得る。
特別な実施形では好適なキャリャ上に含浸されて又は装
入されて試験体として存在していてもよい。
入されて試験体として存在していてもよい。
下記の実施例では次の省略形を使用する:Al−DH
アルデヒドデヒドロゲナーゼホルマート−DH
ホルマートデヒドロゲナーゼGPT グ
ルタマートーピルバートトランスアミナーゼ GAB−GT γ−アミノブチラートーα−ケト
グルタラートトランスアミナーゼ SS−AI−DH サクシナートセミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ GOT グルタマートーオキサルアセター
トトランスアミナーゼ NDPK ヌクレオシド−5−ジホスファー
トキナーゼ UTP ウリジン−5−トリホスフェート
ADP アデノシン−5−ジホスフエート
ATP アデノシン−5′一トリホスフエ
ートPEP ホスフェノールピルベートP
K ピルバートキナーゼNAD
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、還元型 NADP ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート NADPH ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート、還元型 CK クレアチンキナーゼMTT
3−( 4t 5−ジメチルチアゾリル−2)
−2,5−ジフエニルテトラ ゾ刃ウムブロミド Gal−1−P D−ガラクトース−1−ホスフエ
ート Gal−キナーゼ ガラクトースキナーゼGal−DH
ガ゛ラクトースデヒドロゲ゛ナーゼ゛UDP
G−DH ウリジン−57−ジホスホーグリコース
デヒドロゲナーゼ Pyr−DC ピルバートデカルボキラーゼA
DA アデソシンデアミダーゼ次に実施例
につき本発明を詳説する。
アルデヒドデヒドロゲナーゼホルマート−DH
ホルマートデヒドロゲナーゼGPT グ
ルタマートーピルバートトランスアミナーゼ GAB−GT γ−アミノブチラートーα−ケト
グルタラートトランスアミナーゼ SS−AI−DH サクシナートセミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ GOT グルタマートーオキサルアセター
トトランスアミナーゼ NDPK ヌクレオシド−5−ジホスファー
トキナーゼ UTP ウリジン−5−トリホスフェート
ADP アデノシン−5−ジホスフエート
ATP アデノシン−5′一トリホスフエ
ートPEP ホスフェノールピルベートP
K ピルバートキナーゼNAD
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、還元型 NADP ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート NADPH ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート、還元型 CK クレアチンキナーゼMTT
3−( 4t 5−ジメチルチアゾリル−2)
−2,5−ジフエニルテトラ ゾ刃ウムブロミド Gal−1−P D−ガラクトース−1−ホスフエ
ート Gal−キナーゼ ガラクトースキナーゼGal−DH
ガ゛ラクトースデヒドロゲ゛ナーゼ゛UDP
G−DH ウリジン−57−ジホスホーグリコース
デヒドロゲナーゼ Pyr−DC ピルバートデカルボキラーゼA
DA アデソシンデアミダーゼ次に実施例
につき本発明を詳説する。
例I
Gap−キナーゼを用いてNADH形成下にADPの測
定 温度25℃、測定波長365nm, クベット1儒、
試験容量2.02ml を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
の吸光に対十る検体の吸光を測定する。
定 温度25℃、測定波長365nm, クベット1儒、
試験容量2.02ml を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
の吸光に対十る検体の吸光を測定する。
検体のADP一含量が差から次式により得られる。
ADP(ミリモル/l)=△E・29.71例2
PK/ピルバートDCを用いてNADH形成下にADP
の測定 温度25℃、測定波長3 6 5 nm、試験容量2m
l、クベット1cm。
の測定 温度25℃、測定波長3 6 5 nm、試験容量2m
l、クベット1cm。
を混合し、次いで
で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
に吸光に対する検体の吸光を測定する。
に吸光に対する検体の吸光を測定する。
ADP含量は式:
ADP(ミリモル/l)=△E・29.71例3
ホルマートキナーゼを用いてNADH形成下にADPの
測定 測定温度25℃、測定波長365nm,クベット1cm
、試験容量2.02ml を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
値に対する検体の吸光を測定する。
測定 測定温度25℃、測定波長365nm,クベット1cm
、試験容量2.02ml を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
値に対する検体の吸光を測定する。
ADPの含量は式:
ADP(ミリモル/l)=△E・29.71により計算
する。
する。
例4
GPT ,GAB−GT及びSS−AI−DHを用いて
NADPH形成下にADPの測定 測定温度25°C、測定波長365nm、クベット1c
m,試験容量2.22ml を混合し、恒温保持し、 で開始し、混合し、吸光増加の停止を待つ。
NADPH形成下にADPの測定 測定温度25°C、測定波長365nm、クベット1c
m,試験容量2.22ml を混合し、恒温保持し、 で開始し、混合し、吸光増加の停止を待つ。
検体と盲検の吸光の差からADPの含量を計算する。
ADP(ミリモル/l)=△E・30.29例5
ホルマザン形成下のクレアチニンの測定
測定温度25℃、測炬波長5 7 6 nm ,クベッ
ト1cm、試験容量2. 5 ml を混合し、次いで で開始し、15分恒温保持し、吸光増加の終結後盲検値
に対する検体の吸光を測定し、クレアチニン含量を式: クレアチニン(ミリモル/l)=△E・2.994によ
り計算する。
ト1cm、試験容量2. 5 ml を混合し、次いで で開始し、15分恒温保持し、吸光増加の終結後盲検値
に対する検体の吸光を測定し、クレアチニン含量を式: クレアチニン(ミリモル/l)=△E・2.994によ
り計算する。
反応条件は最適にしたクレアチニン測定により決める。
ADP測定の本発明による適用には例4の記載が該当す
る。
る。
例6
NADPH形成下にCKの測定
測定温度25゜C、測定波長365nm、クベット1c
m、試験容量2.2ml を混合し、2分恒温保持し、次いで各1分後に△Eを読
み取り、かつ検体中のCK一量を式二C K ( U/
ml) =△E /分−3.143により計算する。
m、試験容量2.2ml を混合し、2分恒温保持し、次いで各1分後に△Eを読
み取り、かつ検体中のCK一量を式二C K ( U/
ml) =△E /分−3.143により計算する。
反応条件は最適にしたクレアチンキナーゼ測定により決
められる。
められる。
ADP測定の本発明による適用には例4の記載が該当す
る。
る。
例7
NADH形成下のADPの測定
測定温度25℃、測定波長3 6 5 nm、クベント
1cm、試験容量1.6ml を混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。
1cm、試験容量1.6ml を混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。
を混合し、吸光増加の停止後盲検値に対する検体の吸光
を測定し、かつADP含量を次の式:ADP ( ミ
リモノレ/l )△E ・ 2.353により計算す
る。
を測定し、かつADP含量を次の式:ADP ( ミ
リモノレ/l )△E ・ 2.353により計算す
る。
許容可能な変動範囲:
緩衝液の種類及び濃度二例1参照
p H 6.0〜10.5UDPG
−DH 0.01〜15U/mgNDPK
0.2〜50U/TrLlサツカロース
ジンテターゼ 0.05〜10U/Ttl例8 NADH形成下のクレアチニンの測定 測定温度25℃、測定波長365nm,マイクロクベッ
ト1cm、試験容量1.55ml試薬混合物の製造 を混合し、ピペットでマイクロクベット中に入れる。
−DH 0.01〜15U/mgNDPK
0.2〜50U/TrLlサツカロース
ジンテターゼ 0.05〜10U/Ttl例8 NADH形成下のクレアチニンの測定 測定温度25℃、測定波長365nm,マイクロクベッ
ト1cm、試験容量1.55ml試薬混合物の製造 を混合し、ピペットでマイクロクベット中に入れる。
吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
し、かつ試料のクレアチニン含量を式:クレアチニン(
ミリモル/l)二△E・9.12により計算する。
し、かつ試料のクレアチニン含量を式:クレアチニン(
ミリモル/l)二△E・9.12により計算する。
反応条件は最適にしたクレアチニン測定により決められ
る。
る。
ADP測定の本発明による適用についてに例7の記載が
該当する。
該当する。
例9
NADH形成下のアンモニアの測定
測定温度25℃、測定波長3 6 5 nm、マイクロ
クベット1cm、試験容量1.6ml 使用される酵素は十分にアンモニウムイオンを除くべき
である。
クベット1cm、試験容量1.6ml 使用される酵素は十分にアンモニウムイオンを除くべき
である。
試薬混合物の製造:
混合し、ピペットでマイクロクベット中に入れる。
吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
し、かつ試料のアンモニア含量を式:アンモニア(ミリ
モル/l)二△E・2.253により算定する。
し、かつ試料のアンモニア含量を式:アンモニア(ミリ
モル/l)二△E・2.253により算定する。
許容可能な変動範囲
緩衝液の種類及び濃度二例1参照
pH 6.9〜7.8UDPG−D
H 0.02 〜15 U/mlサツカロ
ースジンテターゼo.i〜10 U/ralNDPK
O.2 〜5 0 U/mlグ
ルタミンジンテター−M O.0 2 〜10 U
/ml例10 NADH形成下のアンモニアの測定 測定はカルバマートキナーゼ〔例えばストレプトコカス
・ファエカリス( streptococcus fa
eca−1is)から〕を用いても実施することができ
る。
H 0.02 〜15 U/mlサツカロ
ースジンテターゼo.i〜10 U/ralNDPK
O.2 〜5 0 U/mlグ
ルタミンジンテター−M O.0 2 〜10 U
/ml例10 NADH形成下のアンモニアの測定 測定はカルバマートキナーゼ〔例えばストレプトコカス
・ファエカリス( streptococcus fa
eca−1is)から〕を用いても実施することができ
る。
測定温度37℃、測定波長365nm、マイクロクベッ
ト1cm、試験容量1、6ml 試薬混合物の製造: 混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。
ト1cm、試験容量1、6ml 試薬混合物の製造: 混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。
37℃で約20分放置する。
吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
する。
する。
アンモニア含量ハ式:アンモニア(ミリモル/l)=△
E・4.706たより計算する。
E・4.706たより計算する。
例11
NADPH形成下のNH3の測定
測定温度25℃、測定波長3 6 5 nm、1 cm
−クベット、試験容量2.25ml 混合し、前反応を経過させ、 で開始し、混合し、約20分恒温保持し、吸光増加の終
結後検体の吸光を盲検値に対して測定し、NH3含量を
式: NH3(ミリモル/l)二△E・ 3.214により計
算する。
−クベット、試験容量2.25ml 混合し、前反応を経過させ、 で開始し、混合し、約20分恒温保持し、吸光増加の終
結後検体の吸光を盲検値に対して測定し、NH3含量を
式: NH3(ミリモル/l)二△E・ 3.214により計
算する。
許容可能な変動範囲:
緩衝液の種類及び濃度:燐酸塩緩衝液、
サクシネート緩衝液、イミダゾール緩衝液、条件付きで
トリス緩衝液及びTRA緩衝液:pH 6.8〜7.
8 PK ,GPT ,GAB−GT , SS −DH
:各O.05〜5oUArLl グルタミンジンテターゼ:0.02〜10U/ml例1
2 NADPH形成下の5′−ヌクレオチダーゼの測定 測定温度25℃、測定波長365nm1cI1l−クベ
ット、試験容量2.25ml 混合し、約10分恒温保持し、次いで、 AMP 80ミリモル/i 10.05 1−1
1.sミリモル/lで開始する。
トリス緩衝液及びTRA緩衝液:pH 6.8〜7.
8 PK ,GPT ,GAB−GT , SS −DH
:各O.05〜5oUArLl グルタミンジンテターゼ:0.02〜10U/ml例1
2 NADPH形成下の5′−ヌクレオチダーゼの測定 測定温度25℃、測定波長365nm1cI1l−クベ
ット、試験容量2.25ml 混合し、約10分恒温保持し、次いで、 AMP 80ミリモル/i 10.05 1−1
1.sミリモル/lで開始する。
5′−ヌクレオチオダーゼ( U/ml)一△E/分・
6.43許容可能な変動範囲: 緩衝液二燐酸塩、サクシネート pH 6.8〜7.3
6.43許容可能な変動範囲: 緩衝液二燐酸塩、サクシネート pH 6.8〜7.3
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 キナーゼを用いて該キナーゼに対する、ホスホリル
化された基質の存在でATPと脱ホスホリル化された基
質の形成下にホスホリル化することにより水溶液中でア
デノシンジホスフエートを酵素で定量測定する方法にお
いて、脱ホスホリル化された基質を、必要によりもう一
つの助反応の介在下に、デヒドロゲナーゼの存在でNA
D(P)と反応させ、かつ形成されるNAD(P)Hを
直接測定するか又は電子逓伝体の存在でホルマザンの形
成下に反応させ、かつホルマザンを測定することを特徴
とする、アデノシンジホスフエートを測定する方法。 2 脱ホスホリル化された基質としてガラクトース、ホ
ルメート、ピルベート又はヌクレオシドジホスフエート
を使用する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 介在される助反応として脱カルボキシル化、アミノ
基転移又はヘキソース添加を使用する、特許請求の範囲
第1項又は第2項記載の方法。 4 ADPを a)ガラクトキナーゼ及びガラクトースー1−ホスフエ
ートと反応させ、かつ形成されるガラクトースを用いて
NADをガラクトースデヒドロゲナーゼの存在で還元し
、又は b) ホルマートキナーゼ及びホルミルホスフエート
と反応させ、かつ形成されるホルメートを用いてホルマ
ートデヒドロゲナーゼの存在てNADを還元し、又は C)ピルバートキナーゼ及びホスホエノールピルベート
と反応させ、形成されるピルベートをピルバートデカル
ボキシラーゼで脱カルボキシル化し、かつ形成されるア
セトアルデヒド及びアルデヒドデヒドロゲナーゼを用い
てNADを還元し、又は d) c)により形成されるピルベートをグルタメー
ト及びグルタマートーピルバートトランスアミナーゼを
用いてアミノ基転移させてアラニン及びα−ケトグルタ
レートにし、該α−ケトグルタレートをγ−アミノブチ
レート及びγ−アミノブチラートトランスアミナーゼを
用いてグルタメート及びサクシネートセミアルデヒドC
こ変え、かつ該サクシネートセミアルデヒドをサクシナ
ートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼと一緒にNADP
の還元に使用し、又は e)UTP及びヌクレオシドジホスファートキナーゼと
反応させ、形成されるUDPをサツカロース及びサツカ
ロースジンテターゼを用いてフラクトース及びウリジン
ジホスフエートグルコースに変え、かつ該ウリジンジホ
スフエートグルコースとウリジンジホスファートグルコ
ースデヒドロゲナーゼを用いてNADを還元する特許請
求の範囲第1〜3項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19782834704 DE2834704A1 (de) | 1978-08-08 | 1978-08-08 | Verfahren zur quantitativen enzymatischen bestimmung von adp |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5526896A JPS5526896A (en) | 1980-02-26 |
JPS584915B2 true JPS584915B2 (ja) | 1983-01-28 |
Family
ID=6046493
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP54100322A Expired JPS584915B2 (ja) | 1978-08-08 | 1979-08-08 | アデノシンジホスフェ−トを測定する方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4923796A (ja) |
EP (1) | EP0009076B1 (ja) |
JP (1) | JPS584915B2 (ja) |
AT (1) | AT362532B (ja) |
AU (1) | AU514885B2 (ja) |
CA (1) | CA1129316A (ja) |
DD (1) | DD145328A5 (ja) |
DE (2) | DE2834704A1 (ja) |
DK (1) | DK315679A (ja) |
YU (1) | YU191479A (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5206146A (en) * | 1983-04-25 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Assay method using NAD synthetase |
JPS59198995A (ja) * | 1983-04-25 | 1984-11-10 | Toyo Jozo Co Ltd | Nad合成酵素を用いる測定法 |
US4767699A (en) * | 1985-05-02 | 1988-08-30 | Allied Corporation | Diagnostic reagent, kit and method employing polynucleotide displacement, separation, enzymatic cleavage and adenosine phosphate detection |
US4735897A (en) * | 1985-05-02 | 1988-04-05 | Allied Corporation | Method and kit for detecting polyriboadenosine segments and messenger RNA |
JPS623800A (ja) * | 1985-06-27 | 1987-01-09 | Takara Shuzo Co Ltd | アンモニアまたはatpの定量法 |
US4795701A (en) * | 1985-07-17 | 1989-01-03 | Allied Corporation | Homogeneous polynucleotide displacement assay method kit and reagent complex |
JPS62142272A (ja) * | 1985-12-17 | 1987-06-25 | Takara Shuzo Co Ltd | アンモニアまたはatpの定量法 |
US5334507A (en) * | 1991-09-20 | 1994-08-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Composition for measurement of potassium ion concentration and composition for elimination of ammonium ions |
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