JPS5814200B2 - グルコ−ス・デヒドロゲナ−ゼによるグルコ−ス濃度の反応速度論的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、グルコースをグルコース・デヒドロゲナー
ゼで反応速度論的に定量する方法に用いる試薬に関する
。

試料、例えば生物の体液中のグルコース濃度をグルコー
ス・デヒドロゲナーゼで反応速度論的に定量する方法は
周知である。

バナウヒら（Ｄ．Ｂａｎａｕｃｈ，Ｗ． Ｂｒｕｍｍｅ
ｒ， Ｗ． Ｅｂｅｌｉｎｇ， Ｈ ．Ｍｅｔｚ ，
Ｈ． Ｒｉｎｄｆ ｒｅｙ ， ａ Ｌｅｙｂｏｌｄ
ａｎｄ Ｗ． Ｒｉｃｋ ”，Ｚ ．Ｋｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ ． Ｋｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ， １ ３
： １０１（１９７５）．）はグルコース・デヒドロ
ゲナーゼを用いたグルコースの反応速度論的速定法を報
告した。

バナウヒらの試薬は１６０ｍＭ／ｌのトリス緩衝液（
ＰＨ＝７．８ ） ， ｏ．６Ｕ／ｍ！！のグリコ゛ー
ス・デヒドロゲナーゼ、および２１ｍＭ／ｌのＮＡＤか
らなっている。

この試薬を反応速度論的方法に用いた時に、１０００■
／ｄｌまで直線である検定曲線が得られたことが報告さ
れている（試料と試薬の割合は特定されていない）。

ルツツら〔 Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ ． ， Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ， ２ １ （ １
０ ） ： １ ３ ７ ２（１９７５ ））もグルコ
ース・デヒドロゲナーゼ反応を用いてグルコースを反応
速度論的に測定する方法を開示した。

彼等の採用したグルコース・デヒドロゲナーゼは５０ｍ
７！のトリス緩衝液（ｐＨ＝７．８中にに８６．５■の
ＮＡＤと６〜のグリコース・デヒドロゲナーゼからなっ
ている。

そして彼等の補正しないグルコース・デヒドロゲナーゼ
法による直線性からの偏差は、試料／試薬の比１／４１
の場合に３ ０ ０７ｑ％で４係、５ ０ ０７ｎｆ１
％で８転そして１０００■係で１９係であったと報告し
ている。

彼等の研究に基いて、ルツソらは前記バナウヒら（ Ｂ
ａｎｕｃｈ ｅｔ， ａｌ ）の主張した直線性に達す
ることは不可能と思われると結論している。

ルツツ〔Ｌｕｔｚ ； Ｃ ｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ， ２ ２（６ ）；９２９ （１９７６
））は、反応の直線性を“増すために酵素試薬にＧＤ
Ｈ用の拮抗阻害剤を添加することによってグルコースの
反応速度論的測定法の直線性を改良する試みを開示した
。

非直線性を補正する式を用いて、ルツツは試料／試薬の
比をｌ／４１にして直線性領域を約５００〜／ｄｌに広
げることができた。

リンドフライら〔 Ｈ．．Ｒｉｎｄｆｒｅｙ ， Ｒ．
Ｈｅｌｇｅｒ ，およびＨ． Ｌａｎｇ ； Ｋｉｎ
ｅｔｉｃ ＧｌｕｃｏｓｅＤｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｏ
ｎ Ｗｉ ｔｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅ
ｎａｓｅ ，Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，，２７９ ：
１ ９６ （１９７６）：］は、直線性領域に関するバ
ナウヒらの論文の主張が間違いであったというルツツら
の主張を確認した。

リンドフライらは、グルコース・デヒドロゲナーゼでの
グルコースの反応速度論的測定は３ ０ ０１１１ｆｌ
／ｄｌまで直線であって５００〜／ｄｌにおいて−１０
係の誤差があったと報告している（試料／試薬の比は１
／５０であった）。

本発明は、緩衝液、ピリジン補酵素およびグルコース・
デヒドロゲナーゼからなるタイプであって前記緩衝液が
約７．９〜９．０のｐＨを有することを特徴とする反応
速度論的グルコース試薬を含む。

グルコースの反応速度論的測定に前記グルコース試薬を
使用することによって、直線性領域が先行技術ニヨル約
３００〜５００■／ａから約１２００ｍｇ／ｄｌに拡大
された（試料／試薬の比が１／４１の場合）。

本発明の反応速度論的グルコース試薬は、試料例えば血
清や尿のような生物の体液のグルコース含量を測定する
だめの反応速度論的分析に使用される。

この反応速度論的分析は次の反応（Ｉ）に基いている： 試料中のグルコース濃度はその目安となる還元されたど
りジン補酵素の生成に伴う吸光度の増加率（または速度
）を測定することによって決定される。

本発明によれば、分析されるグルコースの量が速度限定
であることが必須である。

従って、本発明の反応速度論的グルコース試薬の各種成
分の量は、上記反応式（１）に対して観察される反応速
度が試料中のグルコース濃度が特有でありかつその濃度
によって決定されることを保証するのに適当な量存在し
なければならない。

本発明の試薬は、約７．９〜９．０のｐＨをもつ緩衝液
と、ピリジン補酵素と、グルコース・デヒドロゲナーゼ
からなる。

その緩衝液は約８．０〜８．５、望ましくは約８．２の
ｐＨを有することが望ましい。

その緩衝液は試薬の他成分と相溶性で所望の範囲内のｐ
Ｈを有するならばいずれの緩衝液も使用可能である。

例えが、トリエタノールアミン、ナトリウム５：５−ジ
エチルバルビツレート、ト９（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、ジエタノールアミンおよびリン酸塩緩衝液な
どがある。

リン酸塩緩衝液は本発明用に望ましい緩衝液である。

リン酸塩緩衝液の例としてはリン酸カリウムおよびリン
酸ナトリウム緩衝液がある。

使用緩衝液の正確な量は決定的なものではないが、前記
緩衝液は試薬１１当り約０．１〜１モル、望ましくは約
０．５モル存在することが望ましい。

本発明の試薬に含まれるピリジン補酵素としてはニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）または
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸塩
（ＮＡＤＰ）、特に前者のＮＡＤが望ましい。

他の適当なピリジン補酵素の例としてはチオーＮＡＤ，
チオーＮＡＤＰ，ニコチンアミド、プリン・ジヌクレオ
チド、ニコチンアミドー（６−メチループリン）一ジヌ
クレオチドまたはニコチンアミドー（２−クロロー６ー
メチループリン）一ジヌクレオチドがある。

ピリジン補酵素の厳密な濃度は分析される試料中のグル
コースが速度を限定する限り重要でない。

しかし、前者補酵素は試薬１１当り約０．０１〜０．０
２５モル、望ましくは約０．００２７モル存在すること
が望ましい。

本発明に使用するグロコース・デヒドロゲナーゼは微生
物から生成することができる。

そして巨大菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍ ） やセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｅｒ
ｅｕｓ ）微生物源から生成することが望ましい。

本発明のグルコース試薬に用いるグルコース・デヒドロ
ゲナーゼの厳密な量は分析される試料中のグルコースが
速度を限定する限り重要でない。

しかし、そのグルコース・デヒドロゲナーゼの量は試薬
１ｌ当り約１００〜３０００国際単位（ＩＵ）存在する
ことが望ましい。

グルコース・デヒドロゲナーゼの望ましい量は試料と試
薬との割合によって変わるが、一般に約３００〜２ ０
０ ０ Ｉ Ｕ／ｌの範囲内にあり、最適には約１６
００ＩＵ／ｌである。

試薬のイオン強度は重要ではないが、グルコース・デヒ
ドロゲナーゼの熱安定性を増すために本発明の試薬は約
０．５〜７Ｍ，望ましくは約２〜４Ｍのイオン強度を有
することが望ましい。

試薬のイオン強度を調節するために試薬の他成分と相溶
性である塩はいずれも使用することができる。

そのような塩の例としては、例えばリチウム、ナトリウ
ムおよびリチウムの塩化物のようなアルカリの塩化物；
リン酸ナトリウム；リン酸アンモニウム；およびそれら
の混合物がある。

塩化カリウムが望ましい塩がある。

また、本発明の反応速度論的グルコース試薬は（エチレ
ンジニトリル）テ士ラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことが望
ましい。

そのＥＤＴＡの厳密な量は重要でないが、新薬１ｌ当り
約〜０．０２モル、望ましくは約０．００５モルが望ま
しい。

本発明の試薬系は水溶液の形で保存することができる或
いはその溶液を通常の方法で冷凍乾燥して使用時に水で
再生することができる。

また、該試薬系は粉末状にして使用時に水で溶かすこと
もできる。

還元ピリジン補酵素の生成速度および該速度のグルコー
ス濃度への転化は周知の方法で行なうことができる。

例えば、その１つの方法は分光光度計を使用して温度約
１５〜５０℃、波長約３００〜３７０ｎｍ（１ｎｍ−１
０−９ｍ）で還元されたピリジン補酵素の生成に起因す
る吸光度の変化を測定する方法である。

前記の波長は約２５〜３７℃の温度で約３４ｎｍが望ま
しい。

試料のグルコース濃度を本発明の酵素試薬で測定する１
つの便利な方法を以下に説明する。

方法 １． ５ ｏｑ／ｄｌ， ｔ ５ ０ｙｎｔｉ／ｄ／！
， ３ ｏ ｏｖｔｇ／ｄｌ．および６００〜／ｄｌな
るグルコース標準溶液茶使用して標準曲線を次のように
作製する：（ａ） 適当なマークを付けた各セルに本
発明の範囲内の試薬をピペットで１．０コ入れて３０℃
または３７℃で平衡さす。

（ｂ） 正確な時間で、上記セルに上記第１標準溶液
の２５μｌを添加し、パラフィンで被覆してゆるやかに
反転することにより混合する。

標準溶液の添加３０秒後に零点調整をした吸光光度計に
おける吸光度を波長３ ４ ０ ｎｍで記録する。

この値がＡ３６である。選定した温度で反応をもう６０
秒間行なわせる。

標準溶液の添加９０秒後に波長３ ４ ０ ｎｍで吸光
度を記録する。

この値がＡｌ）。である。６０秒の反応期間に対する吸
光度の変化を次のようにして求める： ΔＡ／６０秒二Ａ，ｏ一Ａ３ｏ （ｃ） 同様に、全ての標準溶液を分析して各標準溶
液に対するΔＡ／６０秒の値を求める。

（ｄ）標準溶液の既知グルコース濃度に対するΔＡ／６
０秒で得られた値をプロットすることにより標準曲線を
作製する。

２．標準溶液と同じ方法で全ての試料を分析して各試料
に対するΔＡ／６０秒の値を求める。

計算 グルコースのレベルを次のようにして計算する：工程２
で得たΔＡ／６０の値を用いて標準曲線からグルコース
濃度（〜／ｄｌ）を直接読みとる。

次の例は本発明をさらに説明するだめのものであって本
発明を限定するものではない。

例１ 下記に示すのは本発明の望ましい試薬の組成である： ｐＨは約８．０〜８．５、最適には８．２に調整するこ
とが望ましい。

例２ ５ ０ ０ ｏｖｑ％のグルコース標準溶液を調製して
室温で一晩中放置した。

この標準溶液を希釈することによシ既知濃度をもつ一連
の試料を得た。

セルに例１の最適試薬１．０コをピペットで分注した。

そのセルを水浴に入れ３７℃で平衡させた。次にそのセ
ルに既知量のグルコースを含む試料２５μｌを入れた。

反応はベツクマンｏ２５型の分光光度計で行なった。

３０秒と９０秒間の傾斜を記録計で連続的にとりその傾
斜の読みからΔＡ／分の値を得た。

この方法を既知濃度のグルコースを含む各試料の分析に
採用し、それから得たデータを第１表に示し第１図にプ
ロットした。

第１図か呟グルコース・デヒドロゲナーゼ含有の試薬を
用いてグルコースの分析を行なうことによって希釈時（
試料／試薬の比が１／４ １ ）において約１２００７
ｖ％まで直線性が得られることを示す。

第『表は本発明法による直線性と先行技術の方法による
直線性との比較を示す。

第■表の調査から明らかなように、本発明はグルコース
・デヒドロゲナーゼを有の試薬を用いたグルコース分析
の直線性の範囲を著しく増す。

第■表の１最終濃度”の欄は、本発明の方法および試薬
を採用したものが従来の方法および試薬を採用したもの
よシも２倍以上のグルコース濃度を有する試料に存在す
るグルコースの量を正確に測定できることを示す。

この開示に基いて、本発明の範囲を逸脱することなく本
発明には種々の改良および変化があシうることは明らか
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬を使用して得たΔＡ／分一グルコ
ース基質濃度の関係線図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 緩衝液、ピリジン補酵素、およびグルコース・デヒ
   ドロゲナーゼからなるタイプであって、前記緩衝液が約
   ７．９〜９．０のｐＨを有することを特徴とする、反応
   速度論的グルコース試薬。 ２ 前記緩衝液で約８．０〜８．５のｐＨを有するとこ
   ろの特許請求の範囲第１項のグルコース試薬。 ３ 前記緩衝液で約８．２のｐＨを有するところの特許
   請求の範囲第１項のグルコース試薬。 ４ 前記緩衝液をトリエタノールアミン、５ナトトウム
   ：５−ジエチルバルビツレートーＨＣｌ１トリス（ヒド
   ロキシメチル）アミノメタン、ジエタノールアミン、お
   よびリン酸塩の緩衝液からなる群から選択するところの
   特許請求の範囲第１項乃至第３項のグルコース試薬。 ５ 前記緩衝液がリン酸カリウムおよびリン酸ナトリウ
   ムからなる群から選択したリン酸塩緩衝液であるところ
   の特許請求の範囲第１項乃至第４項のグルコース試薬。 ６ 試薬１ｌ当り、 （ａ） 約０．１〜１モルの前記緩衝液と、（ｂ）
   約０．１〜１モルのアルカリ塩化物と、（ｃ） 約
   ０．０２モル以下のＥＤＴＡと、（ａ） 約ｏ．ｏｏ
   ｔ〜０．０２５モルの前記ピリジン補酵素と、 （ｅ） 約１ ０ ０〜３０００国際単位のグルコー
   ス・デヒドロゲナーゼ からなる、特許請求の範囲第１項乃至第５項のグルコー
   ス試薬。 一７ 試薬１ｌ当り、 （ａ） 約０．５モルの前記緩衝液と、（ｂ） 約
   ０．５モルの前記アルカリ塩化物と、（ｃ） 約０．
   ００５モルのＥＤＴＡと、（ａ） 約０．００２７モ
   ルの前記ピリジン補酵素と、（ｅ） 約１６００国際
   単位のグルコース・デヒドロゲナーゼ、 からなる特許請求の範囲第１項乃至第６項のグルコース
   試薬。