JP3674450B2 - Gpt測定用試薬 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明はグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(以下、GPTと略す)測定用試薬に関する。より詳細には、長期間に亘って安定に保存することが出来るGPT測定用の改良されたキットに関する。
【0002】
【従来の技術】
GPTは、日常臨床検査で種々の臓器の細胞障害、なかでも心、肝疾患を検出するための鋭敏な検査法として重要な項目となっており、古くから用いられている。
GPTの測定法としては、分析機器の性能の向上に従い、UV法といわれる方法が広く使用されている。このUV法は、GPTの基質であるL−アラニンとα−ケトグルタル酸に、GPTを作用させて生成されるピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NADHと略す)の共存下に乳酸脱水素酵素(以下、LDHと略す)を作用させて乳酸に変換し、このときのNADHの減少量を波長340nm付近で測定することによりGPTを測定する方法である。
【0003】
この測定法を反応式で表すと以下の通りである。
【化1】
【0004】
広くGPTが測定されるようになると、測定者間で測定値が異なり、その測定値の互換性がないため患者データの比較ができず、診断に支障をきたす恐れがあるといった問題が発生し始めた。そこで各国において、試薬濃度などが規定された勧告法と呼ばれる測定方法が提唱されるようになった。国際的には、国際臨床化学連合(IFCC)が、標準測定法として、ピリドキサールリン酸の存在下にL−アラニンとα−ケトグルタル酸にGPTを作用させるIFCC勧告法(IFCC Scientific Committee:Expert panel on Enzymes, IFCC method for alanine aminotransferase, Clinica Chemica Acta, 105, 147F-157F (1980))を提示し、また日本臨床化学会(JSCC)も1989年に、ピリドキサールリン酸を用いないでGPTを測定するJSCC勧告法を公表した(日本臨床化学会:ヒト血清中酵素活性測定の勧告法−アラニンアミノトランスフェラーゼ−(1989−08−30), 臨床化学, 18(4), 250-262 (1989))。
【0005】
以下に、IFCC勧告法とJSCC勧告法とを比較して示す。
【0006】
【表1】
【0007】
IFCC勧告法に用いられるピリドキサールリン酸は、ビタミンB6リン酸エステル化合物の一つであり、熱、光に不安定とされている。生体内では、アミノ酸代謝にあずかる酵素(GPTなど)のリシンのε−アミノ基とシッフ塩基を形成し結合して、補酵素として働くもっとも重要な化合物である。GPTは補酵素と結合した状態で酵素として働くが、何らかの原因で補酵素の外れ去ったものをアポ型GPTという。一方、補酵素の結合しているものはホロ型GPTという。従って、ピリドキサールリン酸を試薬に添加することにより、アポ型GPTが活性化されるため、ホロ型GPTと合わせて測定することができる。したがって、IFCC勧告法ではアポ型、ホロ型GPTを共に測定することができるが、JSCC勧告法では、ピリドキサールリン酸を添加しないため、ホロ型GPTを主に測定している。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
近年、臨床検査薬を液状化する技術が発展し、長期間安定性を有する液状試薬を提供できるようになってきている。これに対して、ピリドキサールリン酸の存在下で、GPTを測定する試薬では、ピリドキサールリン酸が不安定であるため、液状化を達成できていない。例えば、ピリドキサールリン酸を錠剤として添付し使用前に試薬で溶解するキットや、凍結乾燥品とした試薬などが現在用いられている。IFCC勧告法では、ピリドキサールリン酸水溶液を2週間ごとに調製することになっている。また、溶液状態ではピリドキサールリン酸特有の黄色に呈色しているが、安定性の劣化と共に無色となってしまう。このように、GPT測定系で使用するピリドキサールリン酸は、現状では溶液状態で長期間安定化させるのが困難であり、溶解後数日程度しか安定性を有していない。
本発明者らは、こうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討した結果、液状試薬としての充分な保存安定性を有するGPT測定試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、GPT測定用試薬の試薬組成を種々検討した結果、使用する酵素や基質のうち、L−アラニンとピリドキサールリン酸を共存させておいた場合に、保存中にピリドキサールリン酸特有の黄色の呈色が失われ、測定値も低下するといった安定性の低下が起こることを見出した。特に、2試薬系で構成する場合には、一方の試薬は、L−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、L−アラニンを含有する、2試薬系のキットとすることで、安定な液状GPT測定試薬を供給することが可能となった。
従って、本発明は、ピリドキサールリン酸の存在下、L−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の共存下で乳酸脱水素酵素(LDH)の作用により乳酸に変換し、このときのNADH減少量に基づいてGPTを測定するGPT測定用キットであって、
1)第一試薬と第二試薬からなる2試薬系のキットであり;
2)第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサールリン酸、L−アラニン、α−ケトグルタル酸、LDH及びNADHが必須成分として含有され;
3)一方の試薬が、L−アラニンを含まずピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸を含まずL−アラニンを含有する、
GPT測定用キットである。
【0010】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のGPT測定用キットは、一方の試薬は、L−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、L−アラニンを含有する、2つの試薬から構成される2試薬系の測定用キットである。
本発明のGPT測定用キットは、凍結乾燥品の形態であってもよいが、液状の形態にした場合であっても、長期間安定であり、ピリドキサールリン酸特有の黄色も長期間維持される。
【0011】
一般的に、第一試薬として、ピリドキサールリン酸と共に、LDH及びNAPDHを必須成分として含有する試薬を調製し、第二試薬として、L−アラニンとα−ケトグルタル酸を必須成分として含有する試薬を調製してキットとするのが好ましい。第一試薬に含有させるLDHとその補酵素であるNADHは、GPTの測定誤差の原因となる検体中のピルビン酸を消去できる利点がある。
【0012】
L−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する第一試薬のpHは、pH7〜10に調整するのが好ましい。そして、第二試薬のpHおよび緩衝液濃度を適当に調節し、第一試薬と混合してGPTの測定の際に、GPT反応時のpHが7〜8、好ましくは7.3付近となるように設定するのが好ましい。このようにpHを調整した第一試薬と第二試薬を調製することにより、各試薬中の構成成分を長期間安定に保存することができる。
【0013】
第一試薬の緩衝液は、pHを前記の範囲内にすることができれば、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、IFCC及びJSCC勧告法に使用されるトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンやpH7〜10に緩衝能を持つ緩衝液であれば何ら問題なく使用することができる。また、複数の緩衝液を組み合わせて第一試薬のpHをpH7〜10に設定することもできる。第一試薬のpHは、前記したようにpH7〜10、NADHの安定性を鑑み、pH8.5〜9.0が特に好ましい。
【0014】
第二試薬の緩衝液は、GPT反応時のpHを前記範囲内にすることができる公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、第一試薬と同様にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンなどが使用できる。また、緩衝液のpHは特に規定されないが、第一試薬と混合した際にpH7〜8付近となるようにpHおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
【0015】
第一試薬中のピリドキサールリン酸の添加量は、通常0.01〜1mM、好ましくは0.1〜0.3mMである。また、NADHは通常0.05〜5mM、好ましくは、0.1〜1mMである。本発明に用いられるLDHとしては、その由来は特に限定されない。LDHの添加量としては、通常1000U以上を適宜選択して使用すればよい。
第二試薬に用いるL−アラニンの添加量は、通常10〜2000mM、好ましくは、500〜1500mMである。また、α−ケトグルタル酸の添加濃度は、通常1〜200mM、好ましくは、10〜50mMである。
これらの試薬の添加量は、第一試薬と第二試薬の混合比によって変動するため、上記範囲外であってもよい。
【0016】
第一試薬および第二試薬には、上記の成分の他に、必要により、一般的に添加される成分である、EDTA等のキレート化剤やアジ化ナトリウムなどの防腐剤、各種界面活性化剤等を適宜添加することができる。
【0017】
このように構成されたGPT測定用キットを用いて検体中のGPTを測定することによって、検体中のGPTはピリドキサールリン酸の作用でアポ型GPTがホロ型GPTへと活性化される。そして、検体中に存在しているホロ型GPTに、GPTの基質であるL−アラニンとα−ケトグルタル酸を作用させると、グルタミン酸とピルビン酸が生成される。ピルビン酸は、共役酵素であるLDHにより、NADHを酸化して乳酸とNADになる。この反応で酸化されるNADHの減少量を波長340nm付近の吸光度で測定することで、GPT活性を求めることができる。
【0018】
【実施例】
以下に、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
ピリドキサールリン酸のL−アラニンに対する安定性
ピリドキサールリン酸のL−アラニンに対する安定性を検証した。
36.6mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH8.70)にピリドキサールリン酸を0.125mM添加し、さらにLDH、β−NADH、界面活性剤を添加した試薬に、L−アラニンを200mM又は400mM添加後、pHを4N−NaOHにてpH8.70に再調整した第一試薬と、対照としてL−アラニンを添加しない第一試薬を調製した。
第二試薬は、366mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH4.00)に、L−アラニン、α−ケトグルタル酸及び界面活性剤を添加し、2N−HClにてpHを調整した。試薬組成は下記に記した。
【0019】
第一試薬組成
トリス(ハイドロキシメチル)アミノメタン 36.6mM pH8.70
β−NADH 0.02mM
LDH 2567U/L
界面活性剤 0.01%
ピリドキサールリン酸 0.125mM
L−アラニン 0、200又は400mM
【0020】
第二試薬組成
トリス(ハイドロキシメチル)アミノメタン 366mM pH4.00
α−ケトグルタル酸 77mM
L−アラニン 1000mM
界面活性剤 0.01%
【0021】
GPTの活性は日立7150型自動分析装置を用い、試料として血清または生理食塩水10μLに対し第一試薬300μL、第二試薬75μLを反応させ、主波長340nm、副波長405nmとし、該分析装置の機能で30〜50測光ポイント間(R2添加後1分後から5分後に相当)において吸光度変化率を追跡した。試料中のGPTの活性値は下記式より算出した。
【0022】
【式1】
GPT活性値(IU/L)=(ΔE/min)/ε×(V/v)×106
ΔE/min:1分間あたりの吸光度変化率
ε:モル分子吸光係数(NADHの場合、6.22×103L/mol・cm)
V:全反応液量(試料+第一試薬+第二試薬)
v:試料液量
【0023】
ピリドキサールリン酸の安定性は、調製当日のコントロール血清の測定値を100%として、第一試薬を4℃および37℃保存し、測定値の変化率を算出した。結果を表2に示す。ピリドキサールリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表3に示す。
【0024】
【表2】
【0025】
表2は、コントロール血清の測定値を調製当日と比較した相対活性として示した表である。表2に示されるように、37℃保存では、L−アラニンを第一試薬に添加し、ピリドキサールリン酸と共存させておいた場合、コントロール血清の測定値が測定日ごとに低下していき、試薬の安定性が失われていることが分かる。しかし、L−アラニン無添加の試薬では37℃保存においても、ほとんど測定値に変化は見られず試薬が安定性を保っていることがわかる。
【0026】
【表3】
【0027】
表中の記号「++」は黄色の呈色を示し、「+」は淡黄色、「−」は無色を表す。表3からも同様に、濃度に関わらずL−アラニンが試薬中に存在する場合には、呈色が失われ無色となってしまい、ピリドキサールリン酸が変化してしまったものと推測できる。しかしながら、L−アラニンを含まない試薬では、呈色も維持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、L−アラニンによって失われることは明らかであり、L−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する試薬が安定性において優れていることがわかる。
【0028】
実施例2
ピリドキサールリン酸のpHに対する安定性
ピリドキサールリン酸のpHによる安定性の変化を検証した。
100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液にピリドキサールリン酸を0.205mM添加し、さらにLDH、β−NADH、塩化ナトリウム、界面活性剤を添加した試薬のpHを4N−NaOHおよび2N−HClにてpH7〜10に調整した第一試薬と、105mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH4.20)にL−アラニンおよびα−ケトグルタル酸、界面活性剤を添加し、2N−HClにてpHを調整した第二試薬を調製した。試薬組成は下記に記した。
【0029】
【0030】
第二試薬組成
トリス(ハイドロキシメチル)アミノメタン 105mM pH4.2
α−ケトグルタル酸 30.75mM
L−アラニン 1025mM
界面活性剤 0.01%
【0031】
GPTの活性は日立7150型自動分析装置を用い、試料として血清または生理食塩水10μLに対し第一試薬200μL、第二試薬200μLを反応させ、主波長340nm、副波長405nmとし、該分析装置の機能で30〜50測光ポイント間(R2添加後1分後から5分後に相当)において吸光度変化率を追跡した。GPT活性値は、実施例1と同様に求めた。
【0032】
実施例1と同様に、ピリドキサールリン酸の安定性は、保存当日のコントロール血清の測定値を100%として、第一試薬を37℃保存し、測定値の変化率を算出した。結果を表4に示す。また、ピリドキサールリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表5に示す。
【0033】
【表4】
【0034】
表4は、コントロール血清の測定値を調製当日と比較した相対活性として示した表である。表4に示されるように、pH7〜10、特にpH7〜9ではコントロール血清の測定値も変わらず、安定であることが示される。
【0035】
【表5】
【0036】
表中の記号「++」は黄色の呈色を示し、「+」は淡黄色、「−」は無色を表す。pH7〜10、特にpH7〜9とした第一試薬では、呈色は維持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、特にpH7〜9において保持されることがわかる。
【0037】
【発明の効果】
以上の実施例にも示した通り、本発明の試薬は自動分析装置への適用に即し、しかも液状試薬として供することが可能となり、操作性および安定性が格段に向上したものである。すなわち、本発明の方法により、従来不可能であった液状でのピリドキサールリン酸の安定性を図ることが可能となり、長期間にわたって使用可能な試薬を供給できるようになった。
Claims (3)
- ピリドキサールリン酸の存在下、L−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の共存下で乳酸脱水素酵素(LDH)の作用により乳酸に変換し、このときのNADH減少量に基づいてGPTを測定するGPT測定用キットであって、
1) 液状の形態にある第一試薬と第二試薬からなる液状2試薬系キットであり、
2) 第一試薬が、ピリドキサールリン酸、LDHおよびNADHを必須成分として含み、かつpHが8.5から9.0であり、
3) 第二試薬が、L−アラニンおよびα−ケトグルタル酸を必須成分として含み、かつGPTを測定するために第一試薬と混合した時に、pHが7から8となるようなpHである、
GPT測定用キット。 - 第二試薬が、GPTを測定するために第一試薬と混合した時にpHが7.3となるようなpHである請求項1のGPT測定用キット。
- ピリドキサールリン酸の存在下、L−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の共存下で乳酸脱水素酵素(LDH)の作用により乳酸に変換し、このときのNADH減少量に基づいてGPTを測定するGPT測定用キットの安定化方法であって、
液状の形態にある第一試薬と第二試薬からなる液状2試薬系キットであって、第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサールリン酸、L−アラニン、α−ケトグルタル酸、LDHおよびNADHを必須成分を含み、一方の試薬が、L−アラニンを含まずピリドキサール酸が含み、他方の試薬がピリドキサールリン酸を含まずL−アラニンを含むように、液状2試薬系キットを調製する、
ことを特徴とするGPT測定用キットの安定化方法。
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