JPS59198999A - クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 - Google Patents
クレアチンキナ−ゼ測定用組成物Info
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- JPS59198999A JPS59198999A JP7477583A JP7477583A JPS59198999A JP S59198999 A JPS59198999 A JP S59198999A JP 7477583 A JP7477583 A JP 7477583A JP 7477583 A JP7477583 A JP 7477583A JP S59198999 A JPS59198999 A JP S59198999A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
す）を測定するだめの長期間水溶液として安定な組成物
を扶供せんとするものであり、更に詳しくに下式（１）
における反応の触媒として酵素Ｃ Ｋ ２ 測定するた
めの基質クレアチンリン酸塩刃１間水浴液として安定化
すると共に酵素ＣＫの賦活剤て也るスルフヒドリル基含
有化合物（以下ＳＨ化合物と称する）を長期間水浴液と
して安定化する紹１夕物に関するものである。
を扶供せんとするものであり、更に詳しくに下式（１）
における反応の触媒として酵素Ｃ Ｋ ２ 測定するた
めの基質クレアチンリン酸塩刃１間水浴液として安定化
すると共に酵素ＣＫの賦活剤て也るスルフヒドリル基含
有化合物（以下ＳＨ化合物と称する）を長期間水浴液と
して安定化する紹１夕物に関するものである。
クレアチンリン酸＃Ｘ ＋ＡＤＰ ｄクレアチンリン酸
Ｐ ・・曲（１）但しＡＤＰけアデノシン−５′一二リ
ン酸， ＡＴＰはアデノシン−５′一三リン酸である。
Ｐ ・・曲（１）但しＡＤＰけアデノシン−５′一二リ
ン酸， ＡＴＰはアデノシン−５′一三リン酸である。
臨床検査において、ＣＫの活性を測定することによって
、その活性の一ヒ昇に伴って進行性ジストロフィー１急
性心筋硬塞、心筋炎などの筋疾患を診断する上で重要な
意味を有している。
、その活性の一ヒ昇に伴って進行性ジストロフィー１急
性心筋硬塞、心筋炎などの筋疾患を診断する上で重要な
意味を有している。
上Ｍｅ（１）式の反応において触媒とするＣＫの活性を
…ｌ定する方法としては種々の方法が公知であるが、そ
の中でもＬ．Ｔ．０１ｉｖｅｒ，Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａ
ｌＪｏｕｒｎａｌ． １９ ５ ５ 、６ １巻、１１
６頁に記載された方法が一般に用いられている。この方
法は下式（２）及び（３）に示す如く反応によってＮＡ
Ｄ （Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ） Ｈに変換される際のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの３４０瓢の波長光吸収を測定することによ
り活性を測定するものである。
…ｌ定する方法としては種々の方法が公知であるが、そ
の中でもＬ．Ｔ．０１ｉｖｅｒ，Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａ
ｌＪｏｕｒｎａｌ． １９ ５ ５ 、６ １巻、１１
６頁に記載された方法が一般に用いられている。この方
法は下式（２）及び（３）に示す如く反応によってＮＡ
Ｄ （Ｐ）がＮＡＤ（Ｐ） Ｈに変換される際のＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの３４０瓢の波長光吸収を測定することによ
り活性を測定するものである。
ヘキソキナーゼ
ＡＴＰ＋グルコースｇＡＤＰ＋グルコースー６リン酸・
・・・・（２）６ホスホグルコン酸＋ ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ・・・・・・（３）但しＮＡＤ（Ｐ）はニコチナミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）またＮＡＤ （Ｐ）
Ｈは還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）である。
・・・・（２）６ホスホグルコン酸＋ ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ・・・・・・（３）但しＮＡＤ（Ｐ）はニコチナミド
アデニンジヌクレオチド（リン酸）またＮＡＤ （Ｐ）
Ｈは還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）である。
又ＣＫ活性の測定装置としては通常自動化学分析装置に
よる初速非測定によって行われているものであるが、Ｃ
Ｋの測定は先にも記載した如く急性心筋価基等の急性疾
患の診断に使用されるためその測定には常に準備可能な
状態にしておかなければならず、そのためには常時即応
体制のある緊急用自動化学分析装置を使用するものであ
る。この場合測定用組成物は長期安定性のものが要求さ
れる。
よる初速非測定によって行われているものであるが、Ｃ
Ｋの測定は先にも記載した如く急性心筋価基等の急性疾
患の診断に使用されるためその測定には常に準備可能な
状態にしておかなければならず、そのためには常時即応
体制のある緊急用自動化学分析装置を使用するものであ
る。この場合測定用組成物は長期安定性のものが要求さ
れる。
然るに従来のＣＫ測定用組成物は溶液状態において不安
定な基質、酵素、補酵素及び活性賦活剤よシなっている
ため、粉末、錠剤、凍結乾燥状態にて保存し、使用時に
おいて溶解し水溶液としているものである。従って用ｆ
Ｊｋ物は活性の変化が認めらｔｌない短時間のうちに使
用しているものである。このような組成物は比較的長時
間にわたａｔ急性の）痛い小数検体を不定期に測定する
緊急用自動化学分析装置には不適蟲である。
定な基質、酵素、補酵素及び活性賦活剤よシなっている
ため、粉末、錠剤、凍結乾燥状態にて保存し、使用時に
おいて溶解し水溶液としているものである。従って用ｆ
Ｊｋ物は活性の変化が認めらｔｌない短時間のうちに使
用しているものである。このような組成物は比較的長時
間にわたａｔ急性の）痛い小数検体を不定期に測定する
緊急用自動化学分析装置には不適蟲である。
なおＣＫ測定用絹１ｊｙ物の不安定成分としては基質、
活性賦活剤、共役酵素及び補酵素に大別される。これら
の内共役酵素ｄヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素でありこれらの酵素の安定化にはゼラチ
ン等の不活性たんＫｆ、 （′ηを共存せしめることに
より可能である。又補酵素ＮＡＤ（Ｐ）の安定化はｐｉ
−１の微酸性溶液にすることによって可能であることが
知られている。
活性賦活剤、共役酵素及び補酵素に大別される。これら
の内共役酵素ｄヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素でありこれらの酵素の安定化にはゼラチ
ン等の不活性たんＫｆ、 （′ηを共存せしめることに
より可能である。又補酵素ＮＡＤ（Ｐ）の安定化はｐｉ
−１の微酸性溶液にすることによって可能であることが
知られている。
然しなから基質及び活性賦活剤については、これらを安
定化にせしめることが出来ないものであった。
定化にせしめることが出来ないものであった。
即ち一般に酵素活性の測定は水溶液により行われるか、
この溶液のｐｌ−１を一定にするため緩衝液を１史用し
ている。ＣＫの活性？ｔｌｌ＋定においても緩衝液を用
いているが、その選択において共役酵素へキソキナーゼ
の活性にはマグネシウムイオンが必須であるため、リン
酸緩衝液を用いた場合、電離度の低いマグネシウムリン
酸塩となりへキソキナーゼの活性に影響を及ぼすため、
これにかえてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝液（以下トリス緩衝液と称す）を用込ている。然し
クレアチンリン酸塩はトリス緩衝液中において速やかに
分解をおこしＣＫの活性測定値に影響を及ぼすものであ
った。
この溶液のｐｌ−１を一定にするため緩衝液を１史用し
ている。ＣＫの活性？ｔｌｌ＋定においても緩衝液を用
いているが、その選択において共役酵素へキソキナーゼ
の活性にはマグネシウムイオンが必須であるため、リン
酸緩衝液を用いた場合、電離度の低いマグネシウムリン
酸塩となりへキソキナーゼの活性に影響を及ぼすため、
これにかえてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝液（以下トリス緩衝液と称す）を用込ている。然し
クレアチンリン酸塩はトリス緩衝液中において速やかに
分解をおこしＣＫの活性測定値に影響を及ぼすものであ
った。
又ＣＫの活性測定にシスティン、Ｎ−アセチルシスティ
ン、グルタチオン、メルカプトエタノール等のＳＨ化合
物を不可欠とするものであるが、これらの物質の水溶液
は酸化されやすくＳＨ基は速やかに消失し、それに伴っ
てＣＫ活性の測定値は低下するものであった。
ン、グルタチオン、メルカプトエタノール等のＳＨ化合
物を不可欠とするものであるが、これらの物質の水溶液
は酸化されやすくＳＨ基は速やかに消失し、それに伴っ
てＣＫ活性の測定値は低下するものであった。
本発明はかかる現状に鑑み鋭意研究を行った結果、基質
とするクレアチンリン酸及び活性賦活剤とするＳＨ化合
物を安定化せしめうるフレア５− チンキナーゼ測定用組成物を開発したものである。即ち
本発明ｔよりレアチリン酸塩に無機リン酸塩水溶液と、
これにシスティン、Ｎ−アセチルシスティン、グルメチ
オン、メルカプトエタノールの内から選ばれた少くとも
１種のスルフヒドリル基含有化合物のエチレングリコー
ル又はグロビレングリコール水溶液とを添加したことを
特徴とするものである。
とするクレアチンリン酸及び活性賦活剤とするＳＨ化合
物を安定化せしめうるフレア５− チンキナーゼ測定用組成物を開発したものである。即ち
本発明ｔよりレアチリン酸塩に無機リン酸塩水溶液と、
これにシスティン、Ｎ−アセチルシスティン、グルメチ
オン、メルカプトエタノールの内から選ばれた少くとも
１種のスルフヒドリル基含有化合物のエチレングリコー
ル又はグロビレングリコール水溶液とを添加したことを
特徴とするものである。
本発明はクレアチンリン酸塩にリン酸緩衝液を添加する
もこれらが平衡によシ安定化することを見出したもので
ある。即ちクレアチンリン酸の濃度７０〜１００ｍＭと
リン酸緩衝液の濃度３０〜Ｊ Ｏ１）ｍＭ （ＦＪ′１
７．０ ）ノ割合ｖｃて混和ｆることによってＣＫの活
性測定に何等影響を及はさないものである。
もこれらが平衡によシ安定化することを見出したもので
ある。即ちクレアチンリン酸の濃度７０〜１００ｍＭと
リン酸緩衝液の濃度３０〜Ｊ Ｏ１）ｍＭ （ＦＪ′１
７．０ ）ノ割合ｖｃて混和ｆることによってＣＫの活
性測定に何等影響を及はさないものである。
又この安定化きれたクレアチンリン酸溶液全測定する際
に、共役酵素のへキソキナーゼ活性において、トリス緩
衝液を添加するも何等影響を及ばずことがなかった。こ
の場合安定化されたクレアチンリン酸塩に混合されるト
リス緩衝６− 液の９度は５ （１〜１００ ｍＭ （ｐＨ７，０）及
びマクネシウム塩濃度は２０〜３０ ｍ、Ｍとし、これ
ら両名の混合比は安定化クレアチンリン酸塩溶液１に対
しトリス緩衝液４とすることが好ましい。
に、共役酵素のへキソキナーゼ活性において、トリス緩
衝液を添加するも何等影響を及ばずことがなかった。こ
の場合安定化されたクレアチンリン酸塩に混合されるト
リス緩衝６− 液の９度は５ （１〜１００ ｍＭ （ｐＨ７，０）及
びマクネシウム塩濃度は２０〜３０ ｍ、Ｍとし、これ
ら両名の混合比は安定化クレアチンリン酸塩溶液１に対
しトリス緩衝液４とすることが好ましい。
又本発明はＳＨ化合物を安定化せしめるためにエチレン
グリコール又ハノロビレングリコールを含有する水溶液
を使用するものて゛あり、２０〜５０ （ｖ／ｖ ）
％エチレングリコール又はプロピレングリコール溶液を
用いることにより１０〜２０ｍＭのＳＨ化合物は安定化
される。
グリコール又ハノロビレングリコールを含有する水溶液
を使用するものて゛あり、２０〜５０ （ｖ／ｖ ）
％エチレングリコール又はプロピレングリコール溶液を
用いることにより１０〜２０ｍＭのＳＨ化合物は安定化
される。
このＳＨ化合物の安定化方法は、前記の基質クレアチン
リン酸塩の安定化方法と組合せて同一の溶液とすること
が出来る。即ち２０〜５０％エチレングリコール又はプ
ロピレングリコールを含有する３０〜１００ ｍＭのリ
ン酸緩衝液に７０〜１． ＯＯｍＭのクレアチンリン酸
塩及び２０〜３０ｍＭのＳＨ化合物を溶解してうるもの
である。
リン酸塩の安定化方法と組合せて同一の溶液とすること
が出来る。即ち２０〜５０％エチレングリコール又はプ
ロピレングリコールを含有する３０〜１００ ｍＭのリ
ン酸緩衝液に７０〜１． ＯＯｍＭのクレアチンリン酸
塩及び２０〜３０ｍＭのＳＨ化合物を溶解してうるもの
である。
次に本発明の実施例について説明する。
実施例（１）
第１液の組成は第１表に示す如くである。
第１ 表
トＩＪ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ６０
ｍＭ酢酸マグオシウム ２５〃グ
ルコース ３ｏ 〃ゼラチン
０１％（ｖ’ｖ）ＡＡ（
Ｐ
６ ｍＭアジ化ナナトリウム
０．０５％（ｗ／Ｖ）ＮＡＤＰ
１ ｍＭただしＡ
ＭＰけアデノシン−５′〜リン酸の溶液をリンゴ酸でｐ
ｔｌ ７０にコ１Ｍ整したものである。
ｍＭ酢酸マグオシウム ２５〃グ
ルコース ３ｏ 〃ゼラチン
０１％（ｖ’ｖ）ＡＡ（
Ｐ
６ ｍＭアジ化ナナトリウム
０．０５％（ｗ／Ｖ）ＮＡＤＰ
１ ｍＭただしＡ
ＭＰけアデノシン−５′〜リン酸の溶液をリンゴ酸でｐ
ｔｌ ７０にコ１Ｍ整したものである。
第２液の組成は２Ｐ、２表に示す如くである第２表
リン酸緩衝液 ５０ ｍＭ（リン
酸カリ１ニリン酸ナトリウム２）エチレングリコール
３ｏ％（ｖ／ｖ ）クレアチンリン酸ナ
トリウム ８５ ｍＭゼラチン
０．１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ ２Ｎａ
５ｍＭＡＤＰ
６ 。
酸カリ１ニリン酸ナトリウム２）エチレングリコール
３ｏ％（ｖ／ｖ ）クレアチンリン酸ナ
トリウム ８５ ｍＭゼラチン
０．１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ ２Ｎａ
５ｍＭＡＤＰ
６ 。
ＡＭＰ ７．５ ＮＮ
−アセチルシスティン ３７．６ｍＭへキン
キナーゼ １２，０００ ｖ／１グル
コース−６−リン酸脱水素酵素 ６．０００ ＃
アジ化ナトリウム ０．０５東ｗ／
／ｖ）ただしＥＤＴＡ、２Ｎａはエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウムであシ、ヘキソキナーゼ及びグルコース
６−リン酸脱水素酵素は酵母由来のものである。
−アセチルシスティン ３７．６ｍＭへキン
キナーゼ １２，０００ ｖ／１グル
コース−６−リン酸脱水素酵素 ６．０００ ＃
アジ化ナトリウム ０．０５東ｗ／
／ｖ）ただしＥＤＴＡ、２Ｎａはエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウムであシ、ヘキソキナーゼ及びグルコース
６−リン酸脱水素酵素は酵母由来のものである。
而して検体３０μｔを分取し、第１液８００μｔと第２
液２００μｔを混合した本発明組成物によシ東芝自動生
化学分析装Ｍ ＴＢＡ〜３８０を使用して３４０ ｎｍ
の吸光度変化を測定し活性を算出した。
液２００μｔを混合した本発明組成物によシ東芝自動生
化学分析装Ｍ ＴＢＡ〜３８０を使用して３４０ ｎｍ
の吸光度変化を測定し活性を算出した。
その結果約ｔ、ｏｏｏ国際単位／ｌまでの検体の測定が
可能であることを確認した。
可能であることを確認した。
又本発明組成物と第３表に示す従来のクレアチンキナー
ゼ測定用組成物とについて人血清４４の相関性を測定し
た。その結果は第４表に示す通りである。
ゼ測定用組成物とについて人血清４４の相関性を測定し
た。その結果は第４表に示す通りである。
９−
第３表
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
クレアチンリン酸ナトリウム １７〃グルコー
ス ２０〃Ｎ−アセチルシス
ティン ５．０〃酢酸マグイシウム
１０．Ｏ＃ヘキソキナーゼ
２，０００ ｖ／Ｌグルコース−６−リン酸脱水素
酵素 １，０００ ｖ／ＩＡＤＰ
１．ＯｍＭＡＭＰ
５．０ ＃ＮＡＤＰ
Ｑ、８ｚ第４表 相関係数 γ＝０．９９９本発明組成物に
よる測定値 ｘ＝７８．５ 従来組成物ｙｃよる測定値 ｙ＝７２．０ ｙ ＝ ０．９８ｘ −５，２１ 上表から明らかの如く本発明組成物は良好なる結果を示
した。
クレアチンリン酸ナトリウム １７〃グルコー
ス ２０〃Ｎ−アセチルシス
ティン ５．０〃酢酸マグイシウム
１０．Ｏ＃ヘキソキナーゼ
２，０００ ｖ／Ｌグルコース−６−リン酸脱水素
酵素 １，０００ ｖ／ＩＡＤＰ
１．ＯｍＭＡＭＰ
５．０ ＃ＮＡＤＰ
Ｑ、８ｚ第４表 相関係数 γ＝０．９９９本発明組成物に
よる測定値 ｘ＝７８．５ 従来組成物ｙｃよる測定値 ｙ＝７２．０ ｙ ＝ ０．９８ｘ −５，２１ 上表から明らかの如く本発明組成物は良好なる結果を示
した。
１０−
又本発明組成物と従来組成物とについて保存日数とＣＫ
活性値との経時的変化を測定した。
活性値との経時的変化を測定した。
その結果は第１図に示す通りである。
又本発明組成物と従来組成物とについてＳＨ基含有化合
物の経時的変化を５，５′−ジチオビス（２−二トロ安
息香酸）による比色定量によって測定した。その結果は
第２図に示す通りである。
物の経時的変化を５，５′−ジチオビス（２−二トロ安
息香酸）による比色定量によって測定した。その結果は
第２図に示す通りである。
以上詳述した如く本発明組成物によれば基質のクレアデ
ンリン酸塩及び活性賦活剤のスルフヒドリル基含有化合
物を長期間水溶液として安定化せしうるため１緊急用自
動化学分析装置によって常時ＣＫの活性を測定すること
が出来る。
ンリン酸塩及び活性賦活剤のスルフヒドリル基含有化合
物を長期間水溶液として安定化せしうるため１緊急用自
動化学分析装置によって常時ＣＫの活性を測定すること
が出来る。
従って急性心筋梗塞、心筋炎等の急性疾患の診断を行う
に極めて有用なものである。
に極めて有用なものである。
第１図は本発明組成物及び従来組成物とについてＣＫ活
性値と保存時間との関係曲線図、第２図は本発明組成物
と従来組成物とについてＳＨ含有化合物の濃度と保存時
間との関係曲線図である。 １１− 凹１ ６１６− 牙さ−
性値と保存時間との関係曲線図、第２図は本発明組成物
と従来組成物とについてＳＨ含有化合物の濃度と保存時
間との関係曲線図である。 １１− 凹１ ６１６− 牙さ−
Claims (1)
- クレアチンリン酸量機リン酸塩水浴液と、これにシステ
ィン、Ｎ−アセチルシスティン、グルタチオン、メルカ
グトエタノールの間から選はれた少くとも１種のスルフ
ヒドリル基含有化合物のエチレングリコール又はノロピ
レングリコール水溶液とを添加したことを特徴とするク
レアチンキナーゼ測定用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7477583A JPS59198999A (ja) | 1983-04-27 | 1983-04-27 | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7477583A JPS59198999A (ja) | 1983-04-27 | 1983-04-27 | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59198999A true JPS59198999A (ja) | 1984-11-10 |
Family
ID=13556996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7477583A Pending JPS59198999A (ja) | 1983-04-27 | 1983-04-27 | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59198999A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| WO1996041164A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Abbott Laboratories | Buffer composition for reagents for immunoassay |
| US5773473A (en) * | 1997-04-15 | 1998-06-30 | Green; Jerold L. | Creatine supplement |
-
1983
- 1983-04-27 JP JP7477583A patent/JPS59198999A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| WO1996041164A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Abbott Laboratories | Buffer composition for reagents for immunoassay |
| US5773212A (en) * | 1995-06-07 | 1998-06-30 | Abbott Laboratories | Buffer composition for reagents for immunoassay |
| US5773473A (en) * | 1997-04-15 | 1998-06-30 | Green; Jerold L. | Creatine supplement |
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