JPH02113898A - アンモニアの定量方法およびそれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、体液または他の試料中のアンモニアの定貧方
法、および該方法を行うのに使用する試薬含有キットに
関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）血中
アンモニアレベルの決定は、数多くの病的状聾の臨床診
断において重要である。血中アンモニアレベルが上界し
ていることは、肝＠疾屯、肝性昏睡、ライエ症候群、心
不全および胎児赤芽球症と関連している。アンモニアレ
ベルをモニターすることはまた、叶臓移植を受けた６者
および過栄ｊｔのΦ各の臨床管理において有用である。

試料中のアンモニアし・ベルを決定することはまた、化
学工業から食品産業に至る種々の産業分野で行なわれて
いる。化学品、肥料のような原料物質、パン製品やフル
ーツノユースのような食糧品などの試料か定期的に分析
されている。

アンモニアの臨床決定のための従来法では、般に、アン
モニウムイオンから揮発形のアンモニアへの変換をもと
にしたアンモニアの滴定分析または分光分析が行なわれ
ていｆこ。しかしながら、系中にアンモニア以外の揮発
成分が含まれている場合には困維が伴った。加えて、ア
ンモニアを決定するときのアッセイ条件はアミド分解反
応および脱アミ、ノ化反応を促進するためアッセイ結果
が不正確なものとなっていた。たとえ、ｆ１ヘルテロソ
ト反応によるアンモニアの分光的決定では、分析に先立
って除タンパク質する必要がある。除タノバク質は酸性
ｐＨで行なわれる工程であり、正常部位にアンモニアが
生成され、間違った高いアンモニア値が得られろ。

アンモニアの決定のために酵素法を導入することにより
、上記の不都合がなくなった［スカンド（Ｓｃａｎｄ）
のＪ　、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　Ｉ　
６（１９６４）４４３参照］。そのような酵素系におい
ては、過剰のα−ケトグルタレート、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、および■７−グル
タミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）が用いられていた。

そのような酵素系では、アンモニアをα−ケトグルタレ
ートと接触させてグルタメ−１・を生成させ、それと同
時にＮＡ　Ｄ　Ｔ−（をＮＡＤに酸化していた。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの減少は試料中のアンモニアの濃変に正
比例しており、３４０ｎｍにおけるＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの吸
光、空の減少を決定することにより都合よく測定するこ
とができる。

臨床化学の実験室では、初期の酵素法で試料として酸に
より除タンパク質した全血を用いた。上述したように、
そのような除タンパク質は間違った高いアンモニア値を
与えるので、測定の正確さに影響が出る。モンドザック
（Ｍｏｎｄｚａｃ）ら［Ｊ、Ｌａｂ、ｃｌｉｎ、Ｍｅｄ
、６６（１９６５）５２６参照コは、除タンパク質した
試料の代わりにヘパリン化した血塁を用いた改良ＧＬＤ
Ｈ法を記載している。この方法の不利な点は、他の血漿
成分（酵素など）がＮ　Ａ　Ｄ　ｌ（と反応するため真
の終点が存在しないように、思われることである。この
ことを回避するために、前インキュベーンヨン時間を１
５〜２０分間と長くし、これらの交差反応物質を前以て
反応さけておくことが行なわれた。しかしながら、その
ような前インキュベーションも、これらの交差反応を完
全に除くことはできなかった。

米国特許下３．９２９，５８１号明細書には、モンドザ
ブクの改良法であり、初期の方法の不都合ろくなくなっ
たとされている酵素法が記載されている。この米国特許
は、試料として除タンパク質しない血漿を使用すること
を教示している。試料を還元型ニコチンアニドアデニン
ジヌクレオチド化合物（ＮＡＤＰＨ）およびＧ　Ｌ　Ｄ
　Ｈと接触させろ。

加えて、Ｇ　Ｌ　Ｄ　Ｔ−１を安定化し酵素反応を促進
するためにアデノノンニリン酸（ＡＤＰ）が含まれてい
る。特許権者は、アッセイを行うのに杓５分間かかると
報告しており、これは前インキュベーノヨン朋間を必要
としないという事実に一部よってい・Ｓｏ上記アッセイ
成分を組み合わせると、木質的に交差反応がなく、それ
ゆえアンモニアに特Ｗ的なアッセイが得られる。

一ヒ記特許権咎は、Ｎ・〜ＤＨの代わりにＮＡ　Ｄ　Ｐ
ＩＩを使用することは１つのニコチンアニドアデニンジ
ヌクレオチド化合物を他のニコチンアニドアデニンジヌ
クレオチド化合物で自明に置き換えたしのではないと議
論した。Ｎ　Ａ　Ｄ　＋−１の使用で交差反応の問題が
見られたので、同じ間厘がＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ［−（でも起
こることが予想された。さらに、ＧＬＤｌ−（は、Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈに比べてＮ　、Ａ　Ｄ　Ｈと遥かに速や
かに反応するため、ＮＡＤＰＨでは望ましくない’ＦＪ
遅い反応となることが教示された。しかしなう（ら、米
国特許下３．９２９，５８１号の方法では、これらの問
題のいずれら生じなかったつ（、′２題を解決するため
の手段） 本発明の目的は、除タンパク質する必要なく、またＮ　
Ａ　Ｄ　ｒ−＋を使用することなく血中アンモニアレベ
ルを試験する別の方法を提供することにある。

本発明の池の目的は、自動化診断システムでも使用可能
なほど充分速く行うことのできる血中アンモニアアッセ
イ法を開発することにある。とりわけ、本発明の他の目
的は、血中アンモニアを試験するための自動化診断シス
テムに使用することのできる試薬試験キットを提供する
ことにある。

すなわち、本発明は、試料中のアンモニアの定量方法で
あって、 （ａ）試料を、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
タレートおよび還元型ニコチンアミドヒボキサンチンジ
ヌクレオチドリン酸と、存在ずろアンモニアを使い冬く
ずのに充分な時間接触させ、（ｂ）分光光度計または他
の手段により吸光度の変化をホ１１定することにより試
料中に存在するアンモニアの９を決定Ｊ゛る、ことを特
徴どする方法試１ト中のアンモニアの定量方法でちって
、（ａ）試料を、α−ケトグルタレートおよび還元型ニ
コヂンアミドヒボキサンヂンノヌクレオチドリン酸と接
触させ、 （ｂ）！ｒ！Ｌ初の吸光度を測定し、 （Ｃ）実質的にすべてのアンモニアを使い尽くすまで充
分な時間グルタミン酸脱水素酵素を加え、ついで （ｄ）最終の吸光度を測定し、最初と最終の間の吸光度
の変化を計算することにより試料中のアンモニアの量を
決定する、ことを特徴とする方法：（ａ）バッファー中
のグルタミン酸脱水素酵素およびα−ケトグルタレート
。

（ｂ）還元型ニコ壬ンアミドヒボギサンチンノヌクレオ
ヂドリン酸；および （ｃ）希釈バブファー からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）！成分を別々の
区画に収納しであることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット： （ａ）約０　、０　ｆ〜１ｐ０．２５＼１のリン酸バッ
ファーｐ！１７〜７．４；約１ｉＭ〜約１〜１のα−ケ
トグルタレート、約１００〜約ｔｏ、０ＯＯＵ／８！ジ
のグルタミン酸脱水素酵素：およびグリセ【ノール（ｂ
）約０．５〜約１０ｍ？ｖｉのニコチンアミドヒボキサ
ンチン５ｊヌケレオチドリン酸水溶液（ｐＨ約１０）、
および安定化剤、および （ｃ）約００１〜約０．２５Ｍのトリス−（ヒドロキノ
メチル）アミノメタノバッファー（ｐ　Ｉ■約８，２〜
約８．６） からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納しであることを特徴とｆろ試料中のアンモニ
アレベル測定用キット。

（ａ）約１６ズｇ／Ｉｌジのα−ケトグルタレート、約
５７２０、／ｖ＋７！のグルタミン酸脱水素酵素、約０
０５〜１のリン酸バッファー（ｐｌ−（約７．０〜７，
４）、約３３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約０．０５
ｍｇ／ｉＱのウノガンマグロプリン、および約０　、５
　ｍ！７／　−、、（！のアノ化ナトリウム。

（１））約４＊ｇ／ｍ（のニコチンアミトヒボキサンチ
ンノヌクレオヂドリン酸、約５０％のプロピレングリコ
ール、約１ｑｇ／Ｍ（ｊのアジ化ナトリウム、約３１＊
ｇ／−ＩＣのホウ酸、約１６２９７　ＨＱのヒノンバソ
ファ、ｐｉ−１約１０．２．および （ｃ）約０．０１Ｍのトリスバッファー、約５　ｍｇ　
／　ｍＱのポリオキンエヂレンラウリルエーテル、約０
゜２ｎ／−Ｑの分子ｍ約５００，０００の硫酸デキスト
ラン、ｐＩ−（約８２ からなり、（ａ）、（ｂ’）および（Ｃ）各成分を別々
の区画に収納しであることを特徴とする試料中・）アン
モニア′ｖｌ＼ル、ｉｌ’ｌ定用キット、および（ｒ動
量のグルタミン酸脱水素酵素、α−ケトクルタＬ−−１
−１還元型ニコチンアミドヒボキサンヂノジヌクレオチ
トリノ酸の８）末とバッファーとを１パツケージ中に納
めたことを特徴とする、試料中、つアンモニアレベルｌ
ｕす走用キットを提（；（するらの゛ごある。

・ド発明は、試料中のアンモニアの量を決定するのに用
いる方法およびキットに［シコオるものである。

、！−発明の方法は、試料を、ＧＬＤＨ１ｌχ−ケ）、
グルタレート、および還元型ニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドリン酸（Ｎ　Ｉ−Ｉ　ＸＤ　Ｐ　Ｈ
）と接独さ口、ついてそれから拭ｔ４中に存在するアン
モニアの虫を決定することを含む。

本発明の方法に用いる試２は、キット・′、）形に組ｇ
；イ’）せ、キ・ノドの成分、すなわち々゛ルタミン酸
脱水素酵素／α−ケトグルタレート、ＮＨＸＤＰ）（お
よびバッファーを別々に・（１ケーノングし、本発明方
法において試薬システムとして容易に組合わＵ゛て用い
ることかできる。特に、本発明の試薬はま１こ自動託：
断ンステムに容易に適用することができ、それにより試
験の再現性と正確さが保証されろ。

以下、・ド発明をさらに詳しく説明４”る。

本発明は、試料中に存在するアンモニアの噴を決定する
た、・うり：）一方法およびキットに関４−る。本発明
の方法；よ、試料を、Ｇ　１．、　Ｉ）　Ｈ２Ｃ−ケト
グルタレートおよびＮＩＩ　ＫＤ　Ｐ　Ｉ−ｔと、存在
するアンモニアを使い尽＜　Ｌ　：’Ｊ　＋−Ｉ　ＸＤ
　Ｐ　）ＩをＮＨｘＤＰに酸化するのに充分な゛１ν間
接触させ、吸・上空こ・）変化を分光光度計上た：よ他
の手段によｌ）測定し、ついてそれかろ試料中に（ｊ在
するアンモニアのり１を決定する−とからなるや反応は
詳しく記載′Ａ−ると次の、Ｊン“）になる。

（ン１、Ｄｉｌ Ｎｉｌ＋、　　＋　　ａ−ケトグルタレ）十′１ＩＩＸ
ｒ）Ｐ１１＝−一−−＝−−−−＝−ンク゛唄タメー）
　　−Ｎｉ１ｘＤｉ’ Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを含有する試薬システムに比べて、
ＮＨｘＤＰＩで１工］製した試薬：ｊ終へに達するのか
速く、その７ｒこめ一層効率的な反応ンステＪ、か得ら
れる。第１図に示すように、アンモニア濃度が１０　ｕ
　９／　＊ｆ２（ｖ／ｖ）の標皇水溶液を用いて本発明
の方法を行った。同じ方法を用い、ＮＩＩにＤ　Ｐ　Ｉ
−１の代わりにＮ　Ａ　Ｉ）　Ｐ　ｌ−（を用いた一連
の比較試験ら行−・た。二Ｎ　ＡＩ）　りＩ＋反応では
、約１７５秒すなわち約３分間で事由および安定な終Ｉ
ｊ入に達しゾこ。ＮｉＩＸＤ　Ｐ　Ｉ（を含有する方法
では、約１２５秒すなわち杓１分間またはそれより速く
平衡に達した。

この反応速度の北昇は、本発明の方法を自動診断ンステ
ムに用いる場合にはとりわけ重要である。

たとえば、アポットスベクトラムハイパーフォーマンス
ダイアグノスティックンステＪ、（ＡｂｂｏｔｔＳｐｅ
ｃｔｒｕｍ　Ｉ［ｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ　５ｙｓｔｅｌ１１）（アボット・
ラボラトリーズ、アボットバーク、イリノイ）は、種々
の診断アッセイを行い、その効率が予定している試験の
全反応時間に依存４゛るランダムアクセス分析システム
である。反応時間の短縮により試料の処理量が劇的に増
加ずろ。

このようなＮＡＤＰＨの代わりにＮ　ＨＸＤ　Ｐ　Ｉを
用いることによる反応速度の増加は、１こだ単にこイ′
″Ｌろ２つのジヌクレオヂドリン酸化合物の構造４二の
類似性に着眼すれば予期されなかったしのでｐ　ｉ−）
、とりわけ、ある場合には反対の結果さえ観察されたの
で予期されなかったものであった。たとえば、ストーン
（Ｓｔｏｎｅ）ら［Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　２３　（１９
８４）、・１３４０参照］は、ノヒドロ葉酸すグクタゼ
の場合にはＮ　ｉｔ　ＸＤ　Ｐ　Ｉ−１はＮ　、Ａ　Ｄ
　Ｐ　Ｈよりら反応が遅かったと報告している。

試料としては、面漿、血清、尿または他の体液ｈ・、ら
選ばれたしのを用いることができる。本発明の方法は生
物学的試料に特に適しているらのである（月１どし、化
学プロセスのための原料物質、化学製品および食糧品の
ような産業上または商業上の使用から得られた試料に使
用することができるか、もしくは使用すべく適合するこ
とができろということも千１ｔＪＩされる。

本発明の方法は中性からややアルカリ性のｐ　Ｈで行う
が、これはＧＬＤＨの活性がこのｐＨ範囲で最適である
からである。このｐＨ範囲は、約６から約９．５、好ま
しくは約８から９である。本発明の７ノセイ法は、約８
３から約８５のややアルカリ性の範囲、とりわ（土ｐＨ
８，４で行うのが特に好ましい。ｐＨをこのアルカリ性
のｆ！囲に保持するために、トリス−（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタンバッファーを用いるが、池の適当な
バー２７７−またはバッファー系、たとえばリン酸バッ
ファーやトリエタノールアミンバッファーを用いること
（、できる。

試￥；調製物中のＧＬＤＩ（の濃度は、少な（ともＩＵ
／’１ｆｆ（活性１１１位／１ｇ）であり、反応混合物
中のα−ナトグルタレート：）α９は少なくとも１ｍ〜
１て−５る５さ：Ｉ−ｆＤ　Ｐ　Ｈの濃度は、約Ｏ，Ｏ
Ｓ−約０５ｍ″Ｎ７１の範囲でちる。

Ｃ（ζ液試ｔ↓、特に血液、血景、および血、・８７ト
リツクス成分を安定化させるために、安定化剤を任きに
用いろことができる。安定化剤は、界面活性剤と硫酸ギ
キスランの混合物であり、好ましくは、ポリエヂレンラ
ウリルエーテルとエチレノオキントおよび分子噴が約５
００，０００の硫酸デキスラン２３モルとの混合物であ
る。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明４−
ろが、本発明はこｔｌらに限られるらのではｆ工いっな
お本発明の方法は、少なくと６２つの異なるやり方で行
う二とができる。実施例１は、１王程アンモニア試験法
であり、アンモニア（票鵡試ｒ−１２試＜：ｙシｆこ、
実施例２は、本発明の方法の他の態様を示すしのである
。実施例３は、本発明方法と公知方法と′Ｊ）相関関係
を決定したしのである。

′Ｊミ璋滑１↓。

下記成分ｌ、２および３を調製した。

成分１；・ ＮＩＩｙＤＰＨ（４ｔｇ／ｌ（り ５０％プロピレングリコール アジ（ヒナト′Ｉウム（］　−）ｃ１．．／プ（★／゛
ν）゛）ホウ酸（３、ｌ　＝？／　、１ｆ！ｈ／ｖ））
ビシンベッフｙ　　（１６、Ｍ／　ｘＱ（ｗ／ｖ））ｐ
Ｉｌｌｏ、２ ［成分２］ α−ケトグルタレート（＋６専ｇ／籾（ｗ／〜・））ゲ
ルタミン酸脱水素酵素（５７２Ｕ／　＋Ｊりリン酸バッ
ファー（０，０５Ｍ５ｐＨ７，０〜７　・１）３３％（
ｖ　、／　ｖ　）グリセロールランガンマグロプリン（
０、０５ｔｑ９／　＝０（ｗｒ′い）アジ化ナトリウム
（０３１７″打（ン、／Ｖ））−成分３′２ ＋１−ノｒ　Ｉ−グルタし一ト（２，６ｖＮ４：ｉトリ
スバッファー（０，０ＩＭ） Ｂｒｉｊ−３５（ＩＣＩアメリカ（Ｉ　ＣＴ　　Ａｍｅ
ｒｉｃａｓｌｎｅ、、）製、ボリオキシエヂレン（２３
）ラウリルエーテルＸ　５　ｌ１１９／ｘｃｈ／ν））
硫酸デキストラン（平均分子９５００，０００ＸＯ２Ｒ
９／　Ｉ＆（ｗ／ｖ）） ｐ）（８，２ ト記成分１，２および３を試薬系として【：１：２０　
（ｖ／ｖ）の比で１昆合した。ついで、本発明のアッセ
イを自動２色診断用アナライザー上で行った。

上記試薬系の２５０μＱアリコートを、３０℃に保持し
たキュベツト中に分配した。アンモニアを０．１．２．
４．６．８．１０．１２、Ｉ４．１６および１８μ９／
ｘｃ（ｗ／ｖ）自存する各アンモニア標亭液の試料（２
５μＣ）を、試薬系を含む＠々のキュベツト中に直ちに
分配した。５．６秒後に３＝１０１５６０ｎｍでの分光
光、実計での最初の読み取りを行った。最初の読み取り
の３分後に２回目の分光光度計での読み取りを行い、２
つの値の間の吸光度の違いを得、各試料中のアンモニア
レベルを計算ずろのに用いた。

このアッセイの結果を第２図に示す。第２図は、アッセ
イで実際に得られたアンモニア値と予測されたアンモニ
ア値との間の相関係数が１，００であることを示してい
る。第２図の直線の傾きは０９９３であり、切片は０．
００１である。

上記成分１．２および３では、記載した濃度のらのを用
いたが、実質的に同様の結果を得るために当業台はこれ
らのａｔを変えることができる。

寒施ダ壮 成分＋１２および３は、実施例１と同じである。

成分１（１００７１（りを成分３　（Ｉ　ｘｌりと混合
する。

この混合物（０，５ｐ、２）を厚さＩＣＪＩの２個のキ
ュベツトのそれぞれに分配し、３７℃に平衡化する。つ
いで、一方の干ユヘソトには血漿（０，０５＝Ｃ）を加
え、他方のキュベツトには水（０，０５ｓ＆）を加えて
試料ブランクとする。キュベツトを混合し、３４０ｎｍ
での吸光度の最初の読み取りを行う。ついで、６キユベ
ツトに成分２（０，０５ｙＣ）をＩ〕ｎえ、３７°Ｃで
約３分間反応さ仕ろ。再び吸光度を測定し、２工程間で
の吸光度の違いを得、各試料中でのアンモニアレベルを
計算するのに用いる。

実施例３ 実施例１に記載した手頃に従い、８つの血漿試料につい
てアンモニアレベルを測定した。ｒ８１時に同じ試料を
デュポンへ〇Ａアンモニアアッセイ法を用いて分析した
。デュポン法は、非常に正確な方法として当業音に知ら
れているしのである。第３図は、本発明の方法をデュポ
ンＡ　ＣＡアンモニア値・ｌセイ法と比較しｆこ場合に
高い相関関係を示す試験結果が得られることを示してい
る。なお第３図の直線の傾きは１．０６４であり、切片
は−００１９であり、相関係数は０．９９８である。

試験を行った全部で８９の血漿試料のうち１０の代表的
な試料についてのアンモニア測定の結果を下記第１表に
示す。

試料２　　１　０，５４　　　　０．４８試料３　　　
、　１．：３８　　　　１．３１試料、１　　　’　　
１．３３　　１　　１．２７試１１５　　　１　２．０
０　　　　　　！、９２試料６ｊ５，８６　　　□　　
５，５９試料７　１　・１．５３　　　：　　４．２６
試料８　　　５．９″３　　　ｉ　　　５．６５１拭薬
のキット中での配置は、敬多くの異なるやり方で行うこ
とができる。すべての試薬を粉末とし、これらを１）τ
１以て測定した量で１つの容器中に入れ、ついて水また
はバッファーまたはバッファー系を加えて作動試薬とす
ることができる。別法として、キットを種々の粉末およ
び液体試薬の組合わせからなるようにし、これらを使用
音が、昆合十ろかまたはこのアッセイを使用する診断器
具システムによりｌ混合するようにすることらでとる。

１゛〜、ての試薬は、いかなる形態であれ、適当な安定
化剤または安定化システムを含んでいてよい。

試薬をキット中にバッケーノングすることができ、その
場合は、キットの個々の成分を別々に貯蔵しておき使用
１１ｊにそれらを組合わせる。

キット中の試薬の組合わせの一例として３つの別々の区
画からなるものが挙げられ、各区画は次のし）ずれかを
含んでいる。

（ａ）バッファー中のＧＬＤＨおよびα−ケトグルタレ
ート （ｂ）バッファー中のＮ　Ｉ（Ｘ　Ｄ　Ｐ　Ｈｌおよび
（ｃ）希釈バッファー キ７　ｌ・中の試薬のパブケーンングの他の方法は、Ｇ
ＬＤＨ，α−ケトグルタレート、ＮＨｘＤＰＨおよびバ
ッファーまたはバッファー系を粉末状とし、すべての成
分を１つのパッケージ中で前以て混合しておくらのであ
る。使用者はまた、希釈バッフ７−を支給されるかまた
は使用者自身のバブファーまたは水を用いて試薬システ
ムを使用に適するように元に戻すことができる。ＡＮ以
て決められた比ｉ貝で組合わせると作動アンモニア試薬
が得られ、゛吏験室ｌにより最小の時間消費でアンモニ
アアッセイを行うことができる。キｔ　）□中の各試薬
に対して適用できる前辺て決められた比率の一例として
は、各別々の区画中に以下のものを含むしのが挙げられ
る。

（ａ）約０．０１〜約０．２５Ｍのリン酸バッファーｐ
Ｈ７〜？、ＪＩ：約１ｍＭ〜約ＩＭのα−ケトグルタレ
ート、約１００〜＋０，０００ｔＪ／ｍｃのグルタミン
酸脱水素酵素：およびグリセロール （ｌ〕）水溶液中の約０．５〜約１０ｍＭのＮ　ＨＸ　
Ｄ　Ｐ　ｌ−１（ｐｔ−ｉ約１０）、および安定化剤：
および（ｃ）約００１〜約０２５Ｍのトリス−（ヒドロ
キンメチル）−アミノメタンバッファー（ｐＨ約８．２
〜約８６）

【図面の簡単な説明】

第１図は、アンモニア漂ω試料を用い、本発明により測
定した結果とＮ）ｌｘＤＰＨの代わりにＮＡ　Ｄ　Ｐ　
Ｈを用いた比較法により測定した結果とを比較して示す
グラフ、第２図は、実施例１のアッセイにおいて、アッ
セイで実際に得られたアンモニア値と予測されたアンモ
ニア値との間の相関係数が１００であることを示すグラ
フ、第３図は、本発明の方法とデュポンＡＣＡアンモニ
アアッセイとの間の相関関係を示すグラフである。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ代理に弁理士前
出 葆はか１名 ＦｉＧＵＲＥ　２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のアンモニアの定量方法であって、（ａ）
   試料を、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタレー
   トおよび還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
   オチドリン酸と、存在するアンモニアを使い尽くすのに
   充分な時間接触させ、（ｂ）分光光度計または池の手段
   により吸光度の変化を測定することにより試料中に存在
   するアンモニアの量を決定する ことを特徴とする方法。
2. （２）試料と、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
   タレートおよび還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
   ヌクレオチドリン酸との接触を、ｐＨ範囲を約６〜約９
   ．５に保持したバッファー溶液中で行う請求項（１）記
   載の方法。
3. （３）アンモニアの量の決定をｐＨ約６〜約９．５の範
   囲にあるバッファー溶液中で行う請求項（２）記載の方
   法。
4. （４）試料中のアンモニアの定量方法であって、（ａ）
   試料を、α−ケトグルタレートおよび還元型ニコチンア
   ミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸と接触させ、 （ｂ）最初の吸光度を測定し、 （ｃ）実質的にすべてのアンモニアを使い尽くすまで充
   分な時間グルタミン酸脱水素酵素を加え、ついで （ｄ）最終の吸光度を測定し、最初と最終の間の吸光度
   の変化を計算することにより試料中のアンモニアの量を
   決定する ことを特徴とする方法。
5. （５）（ａ）バッファー中のグルタミン酸脱水素酵素お
   よびα−ケトグルタレート； （ｂ）還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
   チドリン酸；および （ｃ）希釈バッファー からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
   区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
   アレベル測定用キット。
6. （６）（ａ）約０．０１〜約０．２５Ｍのリン酸バッフ
   ァ−、ｐＨ７〜７．４；約１ｍＭ〜約１Ｍのα−ケトグ
   ルタレート；約１００〜約１０，０００Ｕ／ｍｌのグル
   タミン酸脱水素酵素；およびグリセロール（ｂ）約０．
   ５〜約１０ｍＭのニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
   レオチドリン酸水溶液（ｐＨ約１０）、および安定化剤
   ；および （ｃ）約０．０１〜約０．２５Ｍのトリス−（ヒドロキ
   シメチル）アミノメタンバッファー（ｐＨ約８．２〜約
   ８．６） からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
   区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
   アレベル測定用キット。
7. （７）（ａ）約１６ｍｇ／ｍｌのα−ケトグルタレート
   、約５７２Ｕ／ｍｌのグルタミン酸脱水素酵素、約０．
   ０５Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ約７．０〜７．４）、
   約３３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約０．０５ｍｇ／
   ｍｌのウシガンマグロブリン、および約０．５ｍｇ／ｍ
   ｌのアジ化ナトリウム； （ｂ）約４ｍｇ／ｍｌのニコチンアミドヒポキサンチン
   ジヌクレオチドリン酸、約５０％のプロピレングリコー
   ル、約１ｍｇ／ｍｌのアジ化ナトリウム、約３．１ｍｇ
   ／ｍｌのホウ酸、約１６ｍｇ／ｍｌのビシンバッファー
   、ｐＨ約１０．２；および （ｃ）約０．０１Ｍのトリスバッファー、約５ｍｇ／ｍ
   ｌのポリオキシエチレンラウリルエーテル、約０．２ｍ
   ｇ／ｍｌの分子量約５００，０００の硫酸デキストラン
   、ｐＨ約８．２ からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
   区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
   アレベル測定用キット。
8. （８）有効量のグルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
   タレート、還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
   レオチドリン酸の粉末とバッファーとを１パッケージ中
   に納めたことを特徴とする、試料中のアンモニアレベル
   測定用キット。