JPS584558B2 - グルタミン酸塩の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 生物の体液中のグルタミン・トランスアミナーゼの比色
測定は多くの研究所で各種の方法で行なわれている。

心筋梗塞症および肝細胞の壊死の鑑別における助けとし
てのこの測定の価値は充分に確立されている（ Ｒｅｉ
ｔｍａｎおよびＦ ｒａｎｋｅ ｌ著、Ａｍ．Ｊ， Ｃ
ｌｉｎ， Ｐａｔｈｏｌ．２８、５６（１９５７）］ｏ
最も重要な酵素は Ｌ−アスパルテート＋α−オキソグルグル酸塩材オキサ
ル酢酸塩＋Ｌ−グルタミン酸塩の反応に触媒として作用
するグルタミン・オキサル酢酸・トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）、およびＬ−アラ二ン＋α−オキソグルタル酸
塩＝ピルビン酸塩＋Ｌ−グルタミン酸塩の反応に触媒と
して作用するグルタミン・ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ）酵素である。

これらの方法はα−オキソグルタル酸塩と適当なアミノ
酸とを含有する基質の酵素を触媒としたアミノ基転移に
基き、グルタミン酸塩と他の酸（ＧＰＴの場合はピルビ
ン酸塩、ＧＯＴの場合はオキサル酢酸塩）を生成するも
のである。

ある種の比色定量方法は生成された酸に係わる発色反応
に基へ最近では、アミン基転移反応で生成されたグルタ
ミン酸塩を水性硫酸アンモニウム中のグルタミン酸脱水
素酵素（ＧＩＤＨ）および酸化ニコチンアミド・アデニ
ン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）助酵素を用いて脱水素化
し、α−オキソグルタル酸塩、アンモニウムおよび還元
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ
）を生成する方法が記載されている： 生成されたＮＡＤＨは電子担体を触媒とした下記の反応
でＮ−メチルフエナゾニウムメソスルフエ−｝（ＰＭＳ
） のごとき電子担体の助けで無色のテトラゾリウム染
料である２−ｐ−ヨードフエニルー３−ニトロフエニル
−５−フエニルテトラソリウムクロライド（ ＩＮＴ）
と反応し、着色染料（ＩＮＴホルマザン）を生成す
る： 次いで発生した色の強度を測定してトランスアミナーゼ
活性を測定する（ＬｉｐｐｉおよびＧｕｉｄｉ著、Ｃｌ
ｉｎ ．Ｃｈｉｍ， Ａｃｔａ ， ２ ８、４３１（
１９７０）］。

このトランスアミナーゼ測定は普通肝臓および心臓疾病
の鑑別診断における血清のごとき生物の体液上で行なわ
れる。

試料体液の一定量を約７，４のｐＨに緩衝し、かつα−
オキソグルタル酸塩およびアスパルテート（ＧＯＴ の
場合）またはアラ二ン（ＧＰＴの場合）のいずれかを含
有する基質組成物の一定量と混合する。

ＧＩＤＨ，ＩＮＴおよびＮＡＤを含む発色溶液も使用さ
れる。

この基質、試料および発色剤とを比色計の発色剤クベッ
トまたは試験管のごとき容器中で混合する。

この混合物を通常、一定期間、約４５−６０分に亘り水
浴または３７℃の加熱ブロック中でインキユベートする
。

このインキュベーションは酸の添加をもって終了し、得
られた色の強度を４９０ないし５５０ナノメーターの波
長で分光光度計または比色計で測光し、対照血清、目盛
り定め曲線などと比較する。

本発明はＮＡＤＨとテトラゾリウム指示薬との反応によ
るグルタミン酸塩測定方法の改良に関し、グルタミン酸
脱水素酵素をＮＡＤによりアミノ基転移反応をＮＡＤＨ
とテトラゾリウム塩指示薬との反応へ結合させることに
よるグルタミン酸トランスアミナーゼの改良測定方法を
含むものである。

本発明はトランスアミナーゼ基質、ＮＡＤ，グルタミン
酸脱水素酵素、およびテトラゾリウム染料試薬からなる
単一の液体組成物としての試薬一基質組成物を提供する
ものである。

本発明の方法ではこの基質試薬組成物をトランスアミナ
ーゼ活性またはグルタミン酸塩の分析用標本と混合し、
酸でインキュベーションを終了し、色を測定する迄約１
５分以下のごとき比較的短時間インキユベートする。

本発明の試薬一基質組成物および方法によりグルタミン
酸塩およびグルタミン酸トランスアミナーゼの測定にお
けるいくつかの利点が得られる。

測定の標準化および簡略化のため本発明の各成分は予め
混合して、その測定用組成物を多量に製造できるという
利点を有している。

本発明によるトランスアミナーゼの測定に要するインキ
ュベーション時間は従来の方法による測定に要する時間
よりもはるかに少く、たとえば測定は従来技術の４５分
間に対して１５分以下のインキュベーションで実施でき
る。

本発明の方法および組成物は非常に特殊であり、色と酵
素活性の好ましい直線的関連性を提供する。

さらに、本発明はインキュベーション中に生成されたグ
ルタミン酸塩によるトランスアミナーゼ活性を測定する
ものであるから、本発明は純粋な標準グルタミン酸塩水
溶液の使用を許し、かつ公知の酵素活性を有する対照血
清を使用する必要性を除くものである。

試薬一基質組成物はアミノ基転移が敏速に進行するｐＨ
に緩衝した水溶液中にトランスアミナーゼ基質成分、即
ちα−ケトグルタル酸塩および基質アミノ酸；発色反応
成分、即ちテトラゾリウム染料および酵素ジアフオラー
ゼまたはＰＭＳのごとき電子担体；およびカンプリング
反応成分一ＧＩＤＨおよびＮＡＤを含む。

さらに詳細には、試薬一基質は基質、およびグルタミン
酸トランスアミナーゼとのインキュベーションより生じ
るトランスアミナーゼ活性を示す測定しうる色を生成す
るに充分な量の発色反応およびカップリング反応成分か
らなる。

試薬一基質組成物はさらに本質的にアンモニアまたはア
ンモニウムイオンを含まない点で特徴づけられる。

本発明の組成物はこれらの成分をいかなる便利な順序ま
たは方法で混合しても製造できる。

いかなる鑑別試薬組成物としても、高純度かつ高品質の
成分を使用せねば１ならない。

この組成物は上記の成分の他に少量のその他の成分を含
有することができる。

たとえは、．界面活性剤、キレート剤（たとえばエチレ
ンジアミンテトラ酢酸またはＥＤＴＡ）またはアデノシ
ンニ燐酸（ＡＤＰ）のごとき酵素活性剤を用いてもよい
。

一般にポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル界
面活性剤のごとき界面活性剤の少量が望ましい。

１リットル当り約０．０１ないし０．０５モルのＡＤＰ
も一般に望ましい。

基質アミノ酸の同定は特定のトランスアミナーゼのため
の組成物および方法を決定する。

従って、基質アミン．酸を選択することによってＧＯＴ
の存在下のＧＰＴの測定方法（Ｌ−アラニン使用）また
は所望によりＧＯＴおよびＧＰＴの全体の活性の測定方
法（Ｌ−アスパルギン酸塩およびＬ−アラニンの双方を
併用）を規定することができる。

ＧＰＴ測定用にはＬ−アラニンをＬ−アラニンとしてあ
るいはラセミ体混合物ＤＬ−アラニンとして使用できる
。

後者の場合、Ｄ−アラニンは測定において本質的に不活
性であり、稀釈剤としてのみ作用する。

ＧＯＴ測定においてＤ−アスパルテートがＧＯＴアミノ
基転移反応を阻止することが発見された。

ＧＯＴ測定用にはＬ−アスパルテートの方をその光学異
性体であるＤ−アスパルテートまたはラセミ体混合物よ
りも使用すべきである。

グルタミン酸塩脱水酵素はグリセロール中の懸濁液とし
て便利に用いられる。

ＧＩＤＨとジアフオラーゼの両方とも本質的に、多くの
酵素製剤に繁頻に付随するアンモニウム塩を含有しては
ならない。

テトラゾリウム染料成分は電子担体を触媒とするＮＡＤ
Ｈ 還元反応で着色生成物を形成し、かつ他の成分ある
いはアミノ基転移反応中に混在する他の物質と望ましく
ない反応を行なうことのないいかなるテトラゾリウム塩
染料でもよい。

ＩＮＴ、ＴＮＢＴ（テトラニトローブルー・テトラゾリ
ウム）、ＮＢＴ （ブルー・テトラゾリウム）の全て
が本発明の方法で測定可能な色を形成する。

しかしながら、ＩＮＴは予想外の、その他のテトラゾリ
ウム塩染料よりも強度な色を形成し、また殆んどのテト
ラゾリウム塩よりも試験混合物によく溶解する。

従って、ＩＮＴが好ましいテトラゾリウム染料である。

試薬一基質組成物は本質的にアンモニウムイオンとして
アンモニアを含有してはならない。

例えば不純物としてまたは懸濁剤として、あるいは一種
またはそれ以上の成分の担体として存在する場合、ある
いはある種の緩衝系中に存在する場合のごとく、少量の
アンモニウム塩の存在は測定の総体的進行を非常に妨害
することが発見された。

緻密な混合物中リットル当りのアンモニウム・イオン濃
度が約０．００１モル以下（例えばリットル当りゼロま
たは検出限度以下乃至約０．００５モル）となるように
成分を選択使用せねばならない。

アンモニウムイオン濃度は好ましくはリットル当り０．
００１以下である。

血清からのアンモニウムイオンは正常の血清レベルある
いは正常の１０または１２倍のレベルであっても測定に
悪影響を及ぼさない。

試薬一基質組成物は下記の成分を下記の割合で含有する
ことができる： 基 質 α−ケトグルタル酸塩０．０００５−０．０
０１２モル 基質アミノ酸０．０１−０．５モル 色、試薬 テトラゾリウム染料０． ０ ０ ５ −０
．００ ５電子担体、ジアフオラーゼ（または同 等物、例えばＰＭＳ ０．００１− ０．０００２モル） １００−３２００国際単位 好ましい組成物は下記のごとき成分からなる：α−ケト
グルタル ０．０ ０ ０ ５−０．０ ０ ７ ５モ
ル酸塩 基健アミノ酸 ０．０１−０．５モルＩＮＴ
Ｏ．０ ０ ０ ５−０．０ ０ ５モ
ルジアフオラーゼ ２５０−２０００ＩＵＧＩＤ
Ｈ ２０００−４００００ＩＵＮＡＤ
Ｏ．０ ０ ２−０．０ ０ ４モル界
面活性剤 約５ｇ ＧＯＴまたはＧＰＴのごとぎ特定のグルタミン酸トラン
スアミナーゼの測定用に特定的に適用する場合、基質ア
ミノ酸の好ましい量は使用するアミノ酸によって異なる
。

ＧＰＴ測定用にはアミノ酸はＬ−アラニンであり、好ま
しくは試薬一基質組成物のリソトル当り約０．０２乃至
０．４モルの量で用いる。

ＧＯＴ測定には基質アミノ酸はＬニアスパルテートで、
好ましくはリットル当り約０．０１乃至約０，１６モル
の濃度で存在する。

本発明の方法に於て、基質成分、発色反応成分お
よびカンプリング反応成分を少量のトラジスアミナーゼ
活性分析用標本と混合し、得られた混合物を酵素触媒性
アミノ基転移に適したｐＨおよび温度条件下で予め定め
た短時間に亘りインキユベートした後、得られた色の深
さを測定する。

この混合は血清、血漿、組織エキス、酵素製剤等のごと
き標本と本発明や水性組成物とを直接混合することによ
り便利に行なわれる。

標本と基質−試薬組成物の相対的量は標本中の公知ある
いは推定される酵素濃度、組成物中の成分の濃度などの
ごとき要素に幾分か左右される。

便宜的方法として、組成物の容量部当り約０．０２ない
し約０．５部の標本を使用する。

インキュベーションｐＨは７．２ないし高くても９．０
の範囲である。

最良の結果を得るには、ｐＨは７．９ないし８．３の範
囲内であり、好ましくは基質−試薬組成物中に緩衝剤を
含有させることにより調節する。

インキュベーションは約２５°−４０°、好ましくは約
３７℃の温度で実施する。

好ましい方法としては、組成物を標本に加える前に予め
インキュベーション温度に加温する。

色を測定する前のインキュベーション時間は本発明の充
分な実施に対しては厳密である。

このインキュベーション時間は連続流量分析器あるいは
記録用分光光度計のごとき公知の装置を用いる従来方法
で調節することができる。

インキュベーシヨンは酸の添加により、便利には混合物
を塩酸で稀釈してｐＨを０．１ないし４．５に下げるこ
とにより容易に終了でき、その後、色は３０分またはそ
れ以上安定であり、この間に吸収能を測定できる。

予め定めるインキュベーション時間は測定可能な色を生
成するのに充分でなければならず、約１５分以下である
。

２０または３０分のごとき長いインキュベーション時間
であると、敏速な測定という利点が損われるのみならず
、測定の感度および比例性に悪影響を及ぼす。

好ましい方法としては、ｐＨ８．０−８．２でインキュ
ベーションを３５°−４０℃で約５ないし約１５分間行
ない、塩酸を添加して終了させる。

形成された色の深さは約４５０−５５０ノナメーターの
波長を有する光を用いて比色計または分光光度計で吸収
能を測定することにより測定する。

酵素活性は対照血清、公知量のグルタミン酸塩を含有す
る標準溶液、標準曲線等で得られた吸収能測定結果と比
較して測定する。

本発明のトランスアミナーゼ基質、酸化ニコチンアミド
・アデニン・ジヌクレオチド・グルタミン酸塩脱水素化
酵素、テトラゾリウム染料および電子担体からなる溶液
は各成分の添加順序、添加方法に関係なく製造できる。

そのためこのような溶液を予め大量に製造することがで
きるという利点を有する。

本発明を下記の実施例により説明する。

実施例 １ アンモニアを含有しない水溶液中に下記の成分を下記の
割合で含有した基質−試薬組成物を製造した。

ＩＮＴ ８×１０−４モル／リットルＮＡＤ
２１．４×１０−４モル／リットルＬ−
アラニン ０．１モル／リットル ジアフオラーゼ ０．５ ＩＵ／ｍｌ この組成物の１ミリリットルを一連のバイアルの各々に
入れ充分混合した。

このバイアルを標本の対照血清中または同一の対照血清
の０．８５％塩類水溶液での稀釈物中のＧＰＴ測定に利
用した。

各バイアルを３７℃の加熱ブロック中で標本を添加する
迄５分間予備加熱した。

適当な液体（対照血清またはその稀釈物）の１００マイ
クロリットルを５つのバイアルの各々に添加し、内容物
を混合した。

０．８５％塩類水溶液の１００マイクロリットルをもう
１つのバイアルの中身と混合してブランクとして供した
。

約３７℃で１０分間インキユベートした後、各バイアル
の内容物を塩酸（約０．１規定）の２ミリリットルで稀
釈してインキュベーションを止めた。

次いで各バイアルの色の強度を光電比色計を用いて５０
０ノナメーターでの吸収能を測定することにより測定し
た。

（器械は蒸留水を使用して予めゼロ吸収に調整してお匂
）同一の一連の対照血清および血清稀釈物もまた市販の
紫外線酵素測定方法を用いて分析した。

得られた結果のプロットと標本の血清の濃度とを比較す
れば、紫外線測定で得られる比色定量の優れた直線性お
よび良好な対応性が示された。

実施例 ２ リットル当り１ｇの牛の血清アルブミンを含有するリン
酸塩緩衝界面活性溶液中に１．６×１０−４モル／リッ
トルのＰＭＳ、 ８×１０ ’モル／リットルのＩＮ
Ｔ，２１．４×１０−４モル／リットルのＮＡＤ，１Ｏ
ＯＯ×１０−４モル／リットルのＬ−アラニン、１０×
１０−４モル／リットルのα−ケトグルタル酸塩、０．
２×１０−４モル／リットルのＥＤＴＡおよび２７０Ｏ
ＩＵ／リットルのＧＩＤＨを含有する試薬基質組成物を
製造した。

この組成物を水性グルタミン酸塩標準水溶液の種々の公
知量を用いて実施例１に記載と同様の方法で試験し、基
質の直線性および添加蛋白質の存在下における本発明の
方法を評価した。

添加蛋白質の濃度に対する吸収能のプロットは優れた直
線性を示した。

（試験混合物中０．４×１０−４モルから４×１０−４
モル迄のグルタミン酸塩について１０回測定を行なった
）。

実施例 ３ 下記の成分を下記の濃度で含有するＧＯＴ試薬一基質組
成物を製造した： α−ケトグルタル酸塩 ０．００１モル／リットルＬ−
アスパラギン酸 ０．０２０モル／リットルＩＮＴ
Ｏ．０ ０ ０ ８モル／リットルＮＡ
Ｄ ０．００３モル／リットルジアフ
オラーゼ ５ ０ ０ ＩＵ／リットルＧＩＤＨ
８０００ＩＵ／リットルリットル
当り０．０５モルのＬ−アラ二ンを含有し、アスパラギ
ン酸を含有しない他は上記と同じ成分を同じ濃度で含有
するＧＰＴ試薬一基質組成物を製造した。

これ等の組成物をバイアル当り１ミリリットルの量で別
々のバイアルにそれぞれ配分した。

これらをＧＯＴおよびＧＰＴの測定にそれぞれ使用した
。

この方法では、組成物を３７℃にて加熱ブロック中で１
０分間予備加熱し、次いで血清試料、対照血清、蒸留水
ブランク、またはグルタミン酸標準水溶液の０．１ミリ
リットルと混合した。

この混合物を３７℃で１０分間培養し、次いで０．ＩＮ
塩酸の２．０ミリリットルと混合して酵素反応を終了さ
せた。

得られた色を約５００ナノメーターの波長の光を用いて
比色計で測定した。

実施例 ４ ０．５％界面活性剤（Ｂｒｉｊ−３５）を含有するリッ
トル当り０．０５モルのリン酸塩緩衝剤（ｐＨ約８．１
）中にリットル当り０，０５モルのＬ−７スパルテート
、リットル当り０．００７５モルのα−ケトグルタル酸
塩、リットル当り０．００２８モルのＮＡＰ，リットル
当り０．０２モルのＩＮＴ，リットル当り８００ＩＵの
ジアフオラーゼおよびリットル当り４０００ＩＵのＧＩ
ＤＨを含有する試薬一基質組成物を製造した。

この組成物を実施例１および３の記載と実質的に同じ方
法を用いて４２の人の血清試料の部分標本におげるＧＯ
Ｔ活性の測定に使用した。

また同じ血清試料の部分標本に対するＧＯＴ活性をＨｅ
ｎｒｙ，Ｃｈｉａｍｏｒｉ，ＧｏｌｕｂおよびＢｅｒｋ
ｍａｎ著、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｐａｔｈ．３ ４、３
８１（１９６０）の方法で測定した。

結果の統計的分析はこれ等の方法の良好なる相関関係を
示した。

同様な方法で、３４の血清試料を用いてＧＯＴ組成物と
実施例３の方法と同様の方法とを試験して上記引用の方
法との相関関係を調べたところ、これ等の２方法には優
れた相関関係のあることがわかった。

特に有用な具体例としては、試薬一基質組成物を別々の
組成物の形で、即ち一方は基質アミノ酸を含有し、他方
は色試薬とカップリング成分を含有する組成物として製
造することができる。

α−ケトグルタル酸塩は組成物中に含有しても、あるい
は別個に添加してもよい。

上記の割合で色試薬とカップリング成分を含有する別個
の試薬組成物はグルタミン酸塩の定量測定に直接使用す
ることができる。

酵素活性の測定において、成分の個別便用は生物の体液
標本を個々のブランクとして使用するのに用いられる。

このような方法では、色試薬とカップリング試薬を得ら
れた混合物の吸収能が安定な不変値に達するに充分な時
間、標本と共にインキユベートする。

この時間は一般に短かく、約１ないし３分間である。

このインキュベーション中、標本中に存在する少量のグ
ルタミン酸塩または基質アミンが消費され、得られた安
定な吸収値はブランク値または基本線として比較のため
に使用できる。

次いで残りの成分を添加して緻密な基質−試薬組成物を
形成し、培養を続行し、吸収能を測定してブランクと比
較する。

酵素活性は上記のごとく測定する。

この具体例を下記の実施例でさらに説明する。

実施例 ５ ＧＯＴとＧＰＴの別々の測定用に試薬一基質組成物を製
造した。

１色試薬一カップリング成分組成物は濃縮物の形で製造
し、その２ミリリットルを適当な基質の１ミリリットル
で稀釈した場合、１リットル当り０．１モル、ｐＨ８．
０のリン酸塩緩衝水溶液中にリツドル当り０．００６モ
ルのＮＡＤ．、リットル当り０．０００８モルのＩＮＴ
、リットル当り０．ＯＯＯ０２モルのテトラ酢酸エチレ
ンジアミン、リットル当り１．０１０モルのＡＤＰ１リ
ットル当り５０ＩＵのジアフオラーゼ、リットル当り８
０００ＩＵのＧＩＤＨを含有するようにした。

ＧＯＴおよびＧＰＴ基質組成物を別々に濃縮物の形で製
造し、ｐＨ８のリットル当り０．１モルのリン酸地緩衝
剤中４ミリモルのα−ケトグルタル酸塩およびリットル
当り０．０６０モルのＬ−アスパル酸（ＧＯＴ基質の場
合）、またはリットル当り０．１モルのＤＬ−アラニン
（ＧＰＴ基質の場合）を含有する緻密な混合物を得た。

これ等の組成物を４３の人の血清標本でのＧＯＴ，ＧＰ
Ｔ双方の測定に使用し、結果を実施例４で引用のＨｅｎ
ｒｙ他の方法により同じ４３０部分標本を分析して得ら
れた結果と比較した。

測定において、色試薬−カップリング試薬濃縮物の２ミ
リリットルを３７℃に加熱し、血清標本の１００マイク
ロリットルと混合した。

次いでこの混合物を３７℃で２分間インキユベートし、
次いで吸収能（約５００ナノメーターにて）を測定して
血清ブランク値として記録した。

適当なＧＯＴまたはＧＰＴ基質濃縮物の１ミリリットル
を次いで添加し混合した。

得られた緻密な混合物を３７℃で１０分間インキユベー
トした。

このＩＯ分間の後、吸収能を測定して記録した。

この場合、時間の設定は酸によるインキュベーション停
止の必要のないように制御した。

インキユベートされた完全な混合物とブランクとの吸収
能の差から、グルタミン酸塩標準溶液から得られた吸収
能測定値との比較によって酵素活性を計算した。

ＧＯＴの測定において、結果は引用方法で得られた結果
と充分な相関関係にあり、相関関数は０．９９３２であ
り、直線相関プロットは０．９５４７の勾配を有した。

得られた結果は血清のミリリットル当り約２００ＩＵの
ＧＰＴに対する優れた直線性を示した。

α−ケトグルタル酸塩を色試薬−カップリング成分濃縮
物の中に含ませるか、あるいは別個に添加するか、また
は各成分間の比率は保ったまま濃縮物中の成分の濃度を
変更することなどにより上記の方法内で各種の変更を行
なえることは明きらかである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 分析用サンプルをトランスアミナーゼ基質、酸化ニ
   コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、グルタミン
   酸塩脱水素化酵素、テトラゾリウム染料および電子担体
   の溶液と混合し、その溶液は１ｌ当り０．００１モル以
   下のアンモニウムイオンを含み、測定可能な色を発色さ
   せるｐＨおよび温度条件下でその混合物を１５分以下イ
   ンキユベーションし、インキュベーション時間後に発色
   した色を測定することからなるサンプル中のグルタミン
   酸塩量の測定方法。