JP5843072B2 - 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、試料中の特定物質の測定方法および特定物質測定用キットに関する。更に詳しくは、試薬ＡＴＰを用いた酵素反応でＡＤＰを発生させる試料中の特定物質の測定方法、および特定物質測定用キットに関する。

生体試料中には、試薬ＡＴＰを用いた酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質、すなわち、ＡＴＰよりＡＤＰを生成する酵素またはその基質が存在する。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼがある。このような特定物質を測定するため、発生するＡＤＰを測定する方法があり、これに関し、種々の方法が開発されてきている（例えば、特許文献１、特許文献２）。
例えば、ＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸を補酵素としてＮＡＤＨ存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてＮＡＤを生成させ、波長３４０ｎｍの吸光度をもつＮＡＤＨの減少量からＡＤＰを測定する方法が知られている（非特許文献１）。しかし、この方法は、検体中のＡＤＰが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるＡＤＰの上限値が試薬中のＮＡＤＨにより制限されたりする場合がある。
また、ＡＤＰの測定方法として、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献３）。しかし、この方法は試料中の尿酸、アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビン、ヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。

さらに、ＡＤＰに、マグネシウムイオン存在下でグルコースとＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−６−リン酸をＮＡＤ（Ｐ）存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量から、ＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献２）。この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができるとされている（特許文献２）。しかし、特定物質を、試薬ＡＴＰを用いた酵素反応によりＡＤＰを生成させ、このＡＤＰを上記のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを用いて測定すると、試薬のＡＴＰには、ＡＤＰが混在するため、正確な測定ができにくい。また、ＡＴＰは水溶液でＡＤＰに非酵素的に変換しやすく、測定試薬のロット間で測定値の誤差が生じやすいという問題があった。そこで、そのような問題を解決するため、あらかじめ、キナーゼ等により試薬ＡＴＰに混在するＡＤＰを除去する方法が知られている（特許文献４）。しかし、この方法は、キナーゼ等の基質も高価であることに加え、試薬の安定性に問題があった。

特開平９−２８５２９７号公報 特開平９−２３４０９８号公報 特開平５−２４４９９４号公報 特開平１０−２６２６９７号公報

Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８５，７（４−５），３０３−３１０

本発明の課題は、ＡＴＰを用いる酵素反応によりＡＤＰを発生する試料中の特定物質を測定する際、発生するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸を測定することにより、試料中の特定物質を測定する方法において、測定ブランクを減少させ、また、検量線の傾きを小さくすることにより、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定する方法およびそれに使用する安定で安価な特定物質測定用キットを提供することにある。

本発明者らは、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ、次いで、生成するＡＤＰに、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を作用させてＡＤＰを正確に測定できるとされている前記の方法を、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を併用して高濃度の尿素等の特定物質の測定に用いることを検討した。しかし、この前記の方法では、試料中の特定物質が高濃度になったり、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて測定したりすると、ブランクが高くなったり検量線の傾きが大きくなり、特定物質を測定できる濃度範囲が狭くなる問題があり、実用性に問題が発生する場合があることを発見した。さらに、その問題を解決するため種々検討した結果、試薬としてのＡＴＰ中に存在するＡＤＰを、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−６−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてＡＤＰを除去した後に、特定物質を測定すると、測定ブランクが低くなり検量線の傾きが小さくなるため特定物質の測定可能な濃度範囲を広くなり、正確に測定できることを見出した。本発明は、かかる経過によりなされたものである。

従って、本発明は、
［１］．ＡＴＰを用いた酵素反応によりＡＤＰを発生させる試料中の特定物質の測定方法であって、
ｉ）試薬成分としてのＡＴＰ中に不純物として存在するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
ｉｉ）生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ類を作用させる工程、および
ｉｉｉ）生成するＮＡＤＨ類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させＮＡＤＨ類を消去させる工程
により試薬成分としてのＡＴＰ中のＡＤＰを除去させるＡＤＰ除去反応；次いで
ｉｖ）上記ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応によりＡＤＰが除去された試薬成分としてのＡＴＰを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程、
ｖ）生成するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程、
ｖｉ）生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させる工程、および
ｖｉｉ）生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定する工程
により試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応
からなることを特徴とする特定物質の測定方法；
［２］．試薬成分としてのＡＴＰ中のＡＤＰを除去させるＡＤＰ除去反応後、該ＡＤＰ除去反応における工程ｉｉｉ）の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応を行う、上記［１］記載の特定物質の測定方法；
［３］．工程ｖｉ）において用いるＮＡＤ（Ｐ）類がＮＡＤＰ類であり、かつ工程ｖｉｉ）において測定するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類がＮＡＤＰＨ類である、上記［２］に記載の特定物質の測定方法；
［４］．工程ｖｉ）において用いるグルコース−６−リン酸脱水素酵素の基質親和性がＮＡＤ類よりＮＡＤＰ類の方が高い、上記［３］に記載の特定物質の測定方法；
［５］．試薬成分としてのＡＴＰ中のＡＤＰを除去させるＡＤＰ除去反応後、特定物質測定反応におけるｖｉ）からｖｉｉ）のいずれもの工程での反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記［２］から［４］のいずれかに記載の特定物質の測定方法；
［６］．乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、上記［５］に記載の特定物質の測定方法；
［７］．工程ｖｉ）において、ＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）とチオＮＡＤ（Ｐ）を共存させて使用し、かつ、工程ｖｉｉ）において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定する工程が、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することにより行う、上記［１］から［６］のいずれかに記載の特定物質の測定方法；
［８］．特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程ｉｖ）が、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを発生させる工程である、上記［１］から［７］のいずれかに記載の特定物質の測定方法；
［９］．ＡＴＰを用いた酵素反応によりＡＤＰを発生させる特定物質を測定するためのキットであり、かつ、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびＡＴＰを必須成分として含む第一試薬；およびＮＡＤ（Ｐ）類を必須成分として含む第二試薬から構成され、かつ第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外である試薬成分を他の試薬成分と独立に含む、特定物質測定用キット；
［１０］．特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、上記［９］に記載のキット；および
［１１］．第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、上記［９］または［１０］に記載のキット
に関する。

本発明においては、ＡＴＰを用いる酵素反応によりＡＤＰを発生する試料中の特定物質を測定する際、試薬としてのＡＴＰ中に存在するＡＤＰを、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−６−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてＡＤＰを除去した後に、特定物質を測定することにより、測定ブランクが低く検量線の傾きも小さくなるため広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。また、特定物質測定反応の補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を併用したときには、高濃度の特定物質を測定しやすくなる。

図１は、本発明において、チオＮＡＤＰとＮＡＤＰを用い阻害剤（シュウ酸）を用いない実施例１−７の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。 図２は、乳酸脱水素酵素を用いない比較例１−７の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。 図３は、本発明において、チオＮＡＤＰとＮＡＤＰを用い阻害剤（シュウ酸）を用いない実施例１−７の条件で尿素を測定したとき検量線の結果を示したものである。 図４は、本発明において、チオＮＡＤとＮＡＤを用いさらに阻害剤（シュウ酸）を用いた実施例８−１４の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。 図５は、乳酸脱水素酵素を用いない比較例８−１４の条件で尿素を測定したときのブランク値の減少を示したものである。 図６は、本発明において、チオＮＡＤとＮＡＤを用いさらに阻害剤（シュウ酸）を用いた実施例８−１４の条件で尿素を測定したときの検量線の結果を示したものである。

本発明に用いられる試料としては、酵素反応でＡＴＰをＡＤＰに変換する特定物質を含むサンプルであり、好ましくは液体であれば特に限定しないが、血清、血漿、尿等の生体試料、または、それらのモデルサンプルが好ましい。
本発明において、特定物質とは、ＡＴＰを用いる酵素反応によりＡＤＰを生成する物質、すなわち、ＡＴＰよりＡＤＰを生成する酵素またはその基質であれば特に限定しない。そのような特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼを例示できる。
本明細書においては、そのような特定物質とＡＴＰとよりＡＤＰを生成する酵素反応を特定物質酵素反応ともいうものとする。
特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、尿素、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼを作用させるウレアアミドリアーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

特定物質としてクレアチンまたはクレアチンキナーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、クレアチン、ＡＴＰ、マグネシウムイオンとクレアチンキナーゼを作用させるクレアチンキナーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

特定物質としてコリンまたはコリンキナーゼを測定するときには、特定物質酵素反応として、コリン、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、コリンキナーゼを作用させるコリンキナーゼ反応を用いることができる。その反応式を下記に示す。

本発明において、ＡＤＰとは、アデノシン二リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をいう。本発明において、ＡＴＰとは、アデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をいう。
本発明において、ＮＡＤ（Ｐ）類とは、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのいずれかを意味し、ＮＡＤ類とは、ＮＡＤ、チオＮＡＤのいずれかを意味し、ＮＡＤＰ類とは、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤＰのいずれかを意味するし、脱水素酵素反応に用いる補酵素として働く化合物のことを指す。ここで、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオＮＡＤとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオＮＡＤＰとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本発明において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とは、ＮＡＤ（Ｐ）類の対応する還元型であり、ＮＡＤ（Ｐ）類がＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
本発明において、ＮＡＤ（Ｐ）とは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ、ＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを意味する。本発明において、チオＮＡＤ（Ｐ）とは、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、チオＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）がチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。

本発明において、試料中の特定物質の測定方法は、以下のｉ）からｉｉｉ）の工程からなる試薬成分としてのＡＴＰ中のＡＤＰを除去させるＡＤＰ除去反応と、以下のｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる試料中の特定物質を測定する特定物質測定反応を必須要件とする。
本発明においては、ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応は、それぞれ、ワンポットで、すなわち一気に行うことが好ましい。

ＡＤＰ除去反応：
ｉ）試薬成分としてのＡＴＰ中に不純物として存在するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程
この工程ｉ）においては、下記反応式（本明細書ではこの反応をＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある）において、ＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成させる。この工程においては、ＡＤＰは、試薬成分としてのＡＴＰに不純物として存在するＡＤＰである。

金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。

ｉｉ）生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ類を作用させる工程
工程ｉｉ）においては、工程ｉ）で生成するグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）が酵素反応に付される。下記反応式（本明細書では、グルコース−６−リン酸脱水素酵素が関与する反応をグルコース−６−リン酸脱水素酵素反応ともいう）のように、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）とＮＡＤ類を作用させると、グルコノラクトン−６−リン酸（６−ＰＧＬ）とともに、ＮＡＤＨ類が発生する。

次の工程ｉｉｉ）では乳酸脱水素酵素反応を用いるが、この乳酸脱水素酵素反応は、補酵素としてＮＡＤＨ類を用いると反応が進行し、ＮＡＤＰＨ類を用いると反応が進行しないので、本工程ｉｉ）で用いる補酵素は、ＮＡＤ類とし、ＮＡＤＨ類が生成するようにして、次の工程ｉｉｉ）の乳酸脱水素酵素反応が進行するようにすることが必要である。

ｉｉｉ）生成するＮＡＤＨ類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させＮＡＤＨ類を消去させる工程
特定物質測定反応における工程ｖｉ）で発生するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を工程ｖｉｉ）で測定する際、工程ｉｉ）で生成するＮＡＤＨ類は、ブランクの上昇の原因となるので、この工程ｉｉｉ）においては、工程ｉｉ）で生成するＮＡＤＨ類をピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させる乳酸脱水素反応によりＮＡＤＨ類をＮＡＤ類に変換させ消去させる。

以上に説明したｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応によりＡＤＰが除去された試薬成分としてのＡＴＰが得られ、このＡＴＰを用いて、次の特定物質測定反応が行われる。

特定物質測定反応：
ｉｖ）上記ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応によりＡＤＰが除去された試薬成分としてのＡＴＰを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程
本工程ｉｖ）においては、特定物質酵素反応を進行させるための試薬成分を用いた特定物質酵素反応により、測定対象である試料中の特定物質と、上記ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応によりＡＤＰが除去された試薬成分としてのＡＴＰとよりＡＤＰを生成させる。

例えば、特定物質として尿素またはウレアアミドリアーゼを測定するときには、前記したウレアアミドリアーゼ反応から明らかなとおり、特定物質酵素反応のための試薬成分として、ウレアアミドリアーゼまたは尿素、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンを用いる。特定物質として、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼを測定するときには、同様に、前記したクレアチンキナーゼ反応、コリンキナーゼ反応から特定物質酵素反応のための試薬成分を決めることができる。

ｖ）生成するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる工程
この工程は、前記工程ｉｖ）で生成するＡＤＰを、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応に付す工程である。

金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。

ｖｉ）生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させる工程
この工程においては、工程ｖ）により生成したグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を作用させてグルコース−６−リン酸脱水素酵素反応を行い、グルコノラクトン−６−リン酸（６−ＰＧＬ）とともにＮＡＤＨ類が生成する。なお、補酵素としては、工程ｉｉ）とは異なり、工程ｉｉ）の後の乳酸脱水素酵素反応を進行させることを考慮する必要がないので、ＮＡＤ類に限定されず、ＮＡＤ（Ｐ）類を用いることができる。

ｖｉｉ）生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定する工程
本工程においては、ＮＡＤ（Ｐ）類では吸光度がほとんどなくＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類で吸光度がある波長を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類由来の吸光度の増加を測定する。そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類由来の吸光度の増加量から、あらかじめ作成した検量線と比較して、特定物質の濃度を測定することができる。
工程ｖｉ）において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する３４０ｎｍ付近、例えば、波長３３０〜３５０ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。
本発明において、工程ｖｉ）において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する４０５ｎｍ付近、例えば、波長３９０〜４１５ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。本発明においてこのチオＮＡＤ（Ｐ）を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、特定物質の測定領域を著しく改善できる点などで好適である。

また、特定物質の測定領域をさらに広くするため、工程ｖｉ）において、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を共存させてグルコース−６−リン酸脱水素酵素反応を行い、チオＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ（Ｐ）Ｈを発生させ、生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することによりＡＤＰを測定することが特に好ましい。
この場合、用いるＮＡＤ（Ｐ）の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオＮＡＤ（Ｐ）の量の０．１〜３０倍モル数が好ましく、０．５〜２５倍モル数がさらに好ましい。

本発明においては、ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応で試薬成分中のＡＤＰを除去させた後、工程ｉｉｉ）の乳酸脱水素酵素反応が進行しない条件下で、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応を行うことが好ましい。特定物質測定反応において工程ｉｉｉ）の乳酸脱水素酵素反応が進行すると、工程ｖｉ）で生成するＮＡＤＨ類をＮＡＤ類にする逆反応が工程ｖｉｉ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定する際の誤差の原因となるからである。
本発明においては、工程ｉｉｉ）の乳酸脱水素酵素反応はＮＡＤ依存性なので、特定物質測定反応においてこの乳酸脱水素酵素反応を進行させないためには、工程ｖｉ）で用いるＮＡＤ（Ｐ）類は、ＮＡＤＰ類であることが好ましい。その際、グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、基質親和性がＮＡＤ類よりＮＡＤＰ類の方が高いものが好ましい。この場合、グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、ＮＡＤＰ類に対するＫｍが、ＮＡＤ類に対するＫｍの０．０１〜０．５倍が好ましい。
また、乳酸脱水素酵素反応を特定物質測定反応において進行させないためには、試薬成分中のＡＤＰを除去させたＡＤＰ除去反応後、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応において、反応液に乳酸脱水素酵素阻害剤を存在させて乳酸脱水素酵素反応を阻害することも好ましい。乳酸脱水素酵素阻害剤としては、シュウ酸、オキサミン酸およびこれらの塩を例示することができ、中でも、シュウ酸が好ましい。

本発明の特定物質の測定方法においては、ｉ）からｉｉｉ）の工程からなるＡＤＰ除去反応を進行させるための第一試薬、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応を進行させるための第二試薬から構成される特定物質測定用キットを用いることが好ましい。この場合、例えば、第一試薬としては、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤ類、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびＡＴＰを必須成分として含むことが好ましい。一般に、このようなＡＴＰを含む第一試薬は、必須成分を混合した後、前処理としてＡＴＰ中のＡＤＰを除去するため、例えば、室温から３７℃、好ましくは室温で１時間以上放置しておくことが好ましい。この放置操作によりｉ）からｉｉｉ）の工程を、ワンポットで、すなわち一気に達成することができる。
第二試薬には、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程からなる特定物質測定反応を進行させるための成分として、ＮＡＤ（Ｐ）類を必須成分として含むが、第一試薬に含まれている成分は省略してもよい。第一試薬または第二試薬には、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外である試薬成分は、独立に含まれることが必要であり、さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。
例えば、特定物質が尿素の場合、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外である試薬成分は、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼであり、これらが独立に第一試薬または第二試薬に含まれていることが必要である。さらに少なくともその必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることが好ましい。

本発明の特定物質測定用キットの各成分は、例えば、ＮＡＤ類、ＮＡＤ（Ｐ）類、金属イオン、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等は、本発明の特定物質の測定方法で述べたものを適宜効果に併せて選択して使用することができる。
例えば、第二試薬には、乳酸脱水素酵素阻害剤を含むことが好ましい。第一試薬または第二試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。

自動分析装置や可視部測定装置を用いてこのキットにより特定物質を測定することができる。
例えば、ｉ）からｉｉｉ）の工程を経た第一試薬を２０〜４０℃好ましくは３７℃で混合し３〜１０分好ましくは５分で放置する。ついでそれに、試料および第二試薬を加え、ｉｖ）からｖｉｉ）の工程を含む特定物質測定反応を、ワンポットで、すなわち一気に行い、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を適当な波長の吸光度を測定することにより、特定物質を測定することができる。

実施例１−７および比較例１−７
チオＮＡＤＰとＮＡＤＰを用い阻害剤（シュウ酸）を用いない本発明による尿素の測定
１．方法
ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素、チオＮＡＤＰ、ＮＡＤＰを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のＡＴＰ中に含有されるＡＤＰから、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるＮＡＤＨの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりＮＡＤＨをＮＡＤに酸化して消去することにより防止した。この方法により、ブランク値、尿素の測定可能の濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、ＮＡＤＨをＮＡＤに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。

２．試料
ブランク試料は生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として２００ｍｇ／ｄＬとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。

３．試薬
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬：
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
１００ｍＭ ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−２−
アミノエタンスルホン酸）ｐＨ７．５
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
５ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ（種々の濃度のＡＤＰを含む）
１０ｍＭ ピルビン酸
５ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
６ＫＵ／Ｌ ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２００Ｕ／Ｌ 乳酸脱水素酵素

第二試薬：
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
１００ｍＭ ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−２−
アミノエタンスルホン酸）ｐＨ７．５
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
５ｍＭ ＮＡＤＰ
１ｍＭ チオＮＡＤＰ
０．１％ 界面活性剤

試薬組成について：
本実施例では、表１に示すように試薬成分のＡＴＰ中にＡＤＰが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はＡＤＰより発生したＮＡＤＨが乳酸脱水素酵素によりＮＡＤとなるように１時間以上放置し、十分な時間を置きＡＴＰ中のＡＤＰを除去した。また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）による逆反応の影響を防ぐため、ＡＤＰ測定系（特定物質測定反応における工程ｖｉ））に用いる補酵素はＬＤＨと反応するチオＮＡＤではなく、ＬＤＨと反応しないチオＮＡＤＰを用いた。なお、このとき、その補酵素としてＮＡＤＰを加えず、チオＮＡＤＰ単独では、測定ブランクが２倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、５０ｍｇ／ｄＬ以下となるため、チオＮＡＤＰとＮＡＤＰを併用することにした。
表１に示したとおり、比較例１から７に用いた第一試薬はＬＤＨを添加せず、ＡＤＰの消去反応が起きない組成を用いた。加えて、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、ＮＡＤＰとチオＮＡＤＰの終濃度比が５：１となるような試薬組成を用いた。

４．測定
測定は以下のように行った。可視部測定装置（吸光度信頼範囲２．５以下）を用い、試料３．０μＬと第一試薬１００μＬとを３７℃、５分間混合した後、第二試薬１００μＬを加え同温度で５分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により波長４０５ｎｍで測定した。

５．結果
ａ）ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図１と表２に示す。

図１、表２の結果から、第一試薬に添加したＬＤＨにより予め試薬中のＡＤＰを消去した実施例の組成では、ＬＤＨの添加が無い比較例の組成よりも、ブランクでの吸光度が低減されていることが判明した。

ｂ）直線性の比較
比較例１−７の検量線を図２に、実施例１−７の検量線を図３に示す。
図２で示すように比較例１−７の組成では、尿素窒素濃度２００ｍｇ／ｄＬの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である２．５を越え、測定不能であった。一方、図３が示すように実施例１−７では尿素窒素濃度２００ｍｇ／ｄＬの試料を測定しても得られる吸光度は２．５を越えず、本発明により尿素の測定可能範囲が拡大されることが判明した。

実施例８−１４および比較例８−１４
チオＮＡＤとＮＡＤを用いさらに阻害剤（シュウ酸）を用いた本発明による尿素の測定
１．方法
ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素、チオＮＡＤ、ＮＡＤを用いた尿素窒素測定系において、試薬中のＡＴＰ中に含有されるＡＤＰから、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素の反応によって生じるＮＡＤＨの発色を、前もって試薬中の乳酸脱水素酵素を用いた反応によりＮＡＤＨをＮＡＤに酸化して消去することにより防止した。その後、乳酸脱水素酵素阻害剤（シュウ酸）によりその酵素反応を停止させた。この方法による、ブランク値、尿素の測定可能な濃度範囲を検討した。更に、乳酸脱水素酵素を用いることなく、ＮＡＤＨをＮＡＤに酸化して消去しないで測定する比較例と比較した。

２．試料
ブランク試料は生理食塩水を用いた。測定のための試料は尿素窒素として２００ｍｇ／ｄＬとなる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。

３．試薬
試薬は、以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
第一試薬：
第一試薬は、以下の組成のものを用いた。
１００ｍＭ ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−２−
アミノエタンスルホン酸）ｐＨ７．５
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
５ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ（種々の濃度のＡＤＰを含む）
１０ｍＭ ピルビン酸
５ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
６ＫＵ／Ｌ ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２００Ｕ／Ｌ 乳酸脱水素酵素

第二試薬：
第二試薬は、以下の組成のものを用いた。
１００ｍＭ ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル−２−
アミノエタンスルホン酸）ｐＨ７．５
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
１００ｍＭ シュウ酸カリウム・一水和物
１ｍＭ チオＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤

試薬組成について：
本実施例では、表３に示すように試薬成分のＡＴＰ中にＡＤＰが存在している試薬を用いた。本実施例に用いた第一試薬はＡＤＰより発生したＮＡＤＨが乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によりＮＡＤとなるように十分な時間を置き用いた。また、試料中の尿素窒素から生成されたＮＡＤＨがＬＤＨによって消去されないように、ＬＤＨに対するインヒビターであるシュウ酸を第二試薬組成中に添加した。表３に示すように比較例に用いた第一試薬はＬＤＨを添加せず、ＡＤＰを消去しない組成を用いた。加えて、チオＮＡＤ単独では、測定ブランクが２倍以上で傾きが高く測定濃度範囲は、５０ｍｇ／ｄｌ以下となるため、測定系の測定可能範囲を広げることを目的とし、ＮＡＤとチオＮＡＤの終濃度比が５：１となるような試薬組成を用いた。

４．測定
測定は以下のように行った。可視部測定装置（吸光度信頼範囲２．５以下）を用い、試料３．０μＬと第一試薬１００μＬとを３７℃、５分間混合した後、第二試薬１００μＬを加え同温度で５分間反応させた。発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により波長４０５ｎｍで測定した。
５．結果
ａ）ブランク吸光度の比較
ブランクの吸光度の結果を図４と表４に示す。

図４と表４の結果から、第一試薬に添加したＬＤＨにより予め試薬中のＡＤＰを消去した組成では、ＬＤＨの添加が無い組成よりも、ブランクでの吸光度が軽減されていることが判明した。

ｂ）直線性の比較
比較例８−１４の検量線を図５に、実施例８−１４の検量線を図６に示す。
図５が示すように比較例８−１４では、尿素窒素濃度２００ｍｇ／ｄＬの試料を測定する場合、得られる吸光度が測定機器の吸光度上限である２．５を越え、測定不能であった。一方、図６が示すように実施例８−１４では尿素窒素濃度２００ｍｇ／ｄＬの試料を測定しても得られる吸光度は２．５を越えず、本発明により尿素の測定範囲が拡大されることが判明した。

本発明においては、ＡＴＰを用いる酵素反応によりＡＤＰを発生する試料中の特定物質を測定する際、試薬としてのＡＴＰ中に存在するＡＤＰを、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応、グルコース−６−リン酸脱水素酵素反応、乳酸脱水素酵素反応の順で反応させてＡＤＰを除去した後に、特定物質を測定することにより、測定ブランクが低く検量線の傾きも小さくなるため広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。また、測定系反応の補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を併用したときには、高濃度の特定物質を測定しやすくなる。したがって、本発明によれば、尿素またはウレアアミドリアーゼ、クレアチンまたはクレアチンキナーゼ、コリンまたはコリンキナーゼなどの試料中の広範囲濃度の特定物質を正確にかつ効率的に測定でき、本発明の測定方法およびそれに用いるキットは各種の疾患の診断などに極めて有用である。

Claims (10)

1. 試料中の、ＡＴＰを用いた酵素反応によりＡＤＰを発生させる特定物質の測定方法であって、
   １）グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤ、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびＡＴＰを含む第一試薬：
   ここで第一試薬は、
   試薬成分としてのＡＴＰ中に不純物として存在するＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させ；生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤを作用させ；生成するＮＡＤＨをピルビン酸と乳酸脱水素酵素を作用させＮＡＤＨを消去させることにより試薬成分としてのＡＴＰ中のＡＤＰを除去させるＡＤＰ除去反応をされている；
   を試料に添加し、ついで
   ２）ＮＡＤ（Ｐ）類を含む第二試薬を添加反応させ；
   上記ＡＤＰ除去反応によりＡＤＰが除去された試薬成分としてのＡＴＰを用いて試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ；生成するＡＤＰに、第一試薬由来のグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させ；生成するグルコース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させ、そして
   ３）生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することより試料中の特定物質を測定することを含み、
   ここで、第一試薬または第二試薬には、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させるのに必須であってＡＴＰ以外である試薬成分が独立に含まれ、その必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれていることを特徴とする、
   特定物質の測定方法。
2. 前記ＮＡＤ（Ｐ）類が、ＮＡＤＰ類である、請求項１記載の特定物質の測定方法。
3. グルコース−６−リン酸脱水素酵素の基質親和性がＮＡＤよりＮＡＤＰ類の方が高い、請求項２に記載の特定物質の測定方法。
4. 前記第二試薬が、乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項１から３のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
5. 乳酸脱水素酵素阻害剤がシュウ酸である、請求項４に記載の特定物質の測定方法。
6. 第二試薬が、ＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）とチオＮＡＤ（Ｐ）を含み、かつ、工程３）において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定する工程が、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することにより行う、請求項１から５のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
7. 特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させるのに必須であってＡＴＰ以外である試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、請求項１から６のいずれかに記載の特定物質の測定方法。
8. 請求項１に記載の特定物質の測定方法のためのキットであり、
   グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤ、ピルビン酸、乳酸脱水素酵素、およびＡＴＰを必須成分として含む第一試薬；および
   ＮＡＤ（Ｐ）類を必須成分として含む第二試薬を含み、
   ここで第一試薬または第二試薬に、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外である試薬成分が独立に含まれ、その必須成分の一部または全部が第二試薬に含まれている、
   特定物質測定用キット。
9. 特定物質が尿素であり、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させる工程に必須であってＡＴＰ以外の試薬成分が、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼである、請求項８に記載のキット。
10. 第二試薬に乳酸脱水素酵素阻害剤を含む、請求項８または９に記載のキット。

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